Theresa Antonia Klemm

• Deubiquitinases are regulators of the ubiquitin proteasome system that counteract the ubiquitination cascade by removing ubiquitin from substrates and cleaving ubiquitin chains. Due to their involvment in various important pathways, they are associated with several diseases and may thus present promising drug targets. The two related ubiquitin specific proteases USP25 and USP28 share a highly conserved amino acid sequence but perform distinct biological functions. USP28 plays roles in cell cycle regulation and was also linked to several typesDeubiquitinases are regulators of the ubiquitin proteasome system that counteract the ubiquitination cascade by removing ubiquitin from substrates and cleaving ubiquitin chains. Due to their involvment in various important pathways, they are associated with several diseases and may thus present promising drug targets. The two related ubiquitin specific proteases USP25 and USP28 share a highly conserved amino acid sequence but perform distinct biological functions. USP28 plays roles in cell cycle regulation and was also linked to several types of cancer. It adopts oncogenic functions by rescuing the oncoproteins MYC and JUN from proteasomal degradation, which is induced by the E3-ligase SCF (FBW7). Opposingly, USP28 also regulates the stability of the tumor suppressor FBW7 itself. USP25 contributes to a balanced innate immune system by stabilizing TRAF3 and TRAF6 and lately was found to promote Wnt-signaling by deubiquitinating TNKS. Due to the high level of identity of both proteases, a recent attempt to inhibit USP28 led to cross reactivity against USP25. In our study, we characterized both USP25 and USP28 structurally and functionally using x-ray crystallography, biochemical as well as biophysical approaches to determine similarities and differences that can be exploited for the development of specific inhibitors. The crystal structure of the USP28 catalytic domain revealed a cherry-couple like dimer that mediates self-association by an inserted helical subdomain, the USP25/28 catalytic domain inserted domain (UCID). In USP25, the UCID leads to formation of a tetramer composed of two interlinked USP28-like dimers. Structural and functional analysis revealed that the dimeric USP28 is active, whereas the tetrameric USP25 is auto inhibited. Disruption of the tetramer by a cancer-associated mutation or a deletion-variant activates USP25 through dimer formation in in vitro assays and leads to an increased stability of TNKS in cell studies. Furthermore, in vitro data showed that neither ubiquitin nor substrate binding led to the activation of the USP25 tetramer construct. With the structure of the C-terminal domain of USP25, we determined the last unknown region in the enzyme as a separately folded domain that mediates substrate interactions. Combined the structures of the USP25 and USP28 catalytic domains and the functional characterization of both enzymes provide novel insights into the regulation of USPs by oligomerization. Furthermore, we identified individual features of each protease that might be explored for the development of specific small molecule inhibitors.…
• Deubiquitinasen sind Regulatoren des Ubiquitin-Proteasom-Systems, welche der Ubiquitin-Kaskade entgegenwirken, in dem sie Ubiquitin von Substraten entfernen oder Ubiquitinketten schneiden. Durch ihr umfangreiches Vorkommen in wichtigen Signalwegen, werden sie häufig mit Krankheiten assoziiert und gelten daher als vielversprechender Ansatzpunkt für die Entwicklung von Arzneimitteln. Die zwei verwandten Ubiquitin-spezifischen Proteasen USP25 und USP28 zeichnen sich durch eine sehr hohe Konservierung der Aminosäuresequenz aus, unterscheiden sichDeubiquitinasen sind Regulatoren des Ubiquitin-Proteasom-Systems, welche der Ubiquitin-Kaskade entgegenwirken, in dem sie Ubiquitin von Substraten entfernen oder Ubiquitinketten schneiden. Durch ihr umfangreiches Vorkommen in wichtigen Signalwegen, werden sie häufig mit Krankheiten assoziiert und gelten daher als vielversprechender Ansatzpunkt für die Entwicklung von Arzneimitteln. Die zwei verwandten Ubiquitin-spezifischen Proteasen USP25 und USP28 zeichnen sich durch eine sehr hohe Konservierung der Aminosäuresequenz aus, unterscheiden sich jedoch in ihren biologischen Funktionen. USP28 ist in die Regulierung des Zellzyklus involviert und wurde auch mit mehreren Krebsarten in Verbindung gebracht. Es zeigt onkogene Merkmale, indem es die Onkoproteine MYC und JUN vor dem proteasomalen Abbau schützt, welcher durch die E3-Ligase SCF (FBW7) induziert wird. Im Widerspruch dazu reguliert USP28 jedoch auch die Stabilität des Tumorsuppressors FBW7 selbst. USP25 hingegen stabilisiert TRAF3 und TRAF6 und trägt damit zum Gleichgewicht des angeborenen Immunsystems bei. Außerdem wurde USP25 erst kürzlich eine Funktion nachgewiesen, die den Wnt-Signalweg fördert, indem es TNKS deubiquitiniert. Die hohe Sequenzidentität beider Proteasen führte bisher dazu, dass alle Inhibitoren, die entwickelt wurden, um USP28 spezifisch zu hemmen, auch eine Kreuzreaktion mit USP25 aufweisen. In unseren Studien, haben wir Röntgenkristallographie, sowie biochemische und biophysikalische Methoden angewandt, um strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen USP25 und USP28 zu identifizieren, die bei der Entwicklung von spezifischen Inhibitoren genutzt werden können. Die Kristallstruktur der katalytischen Domäne von USP28 zeigt ein Kirsch-ähnliches Dimer, welches, vermittelt durch die Insertion einer helikalen Unterdomäne, der USP25/USP28 catalytic domain inserted domain (UCID), mit sich selbst assoziiert. In USP25, führt die UCID zu der Bildung eines Tetramers, welches aus zwei USP28-ähnlichen Dimeren besteht. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen zeigten, dass ein USP28 Dimer aktiv ist, wohingegen ein tetrameres USP25 auto-inhibiert vorliegt. In in vitro Experimenten führte die Zerschlagung des USP25 Tetramers, durch eine Krebs-assoziierte Mutation oder eine Deletionsvariante, zu einem Dimer und damit zu einer Aktivierung von USP25. In Zell-studien, induzierten die USP25 Dimere eine erhöhte Stabilität des Substrates TNKS. Außerdem zeigten die in vitro Daten, dass weder Ubiquitin noch die Substratbindung unsere USP25 Konstrukte aktivieren können. Durch die strukturelle Charakterisierung der C-terminalen Domäne von USP25, konnten wir den letzten bisher unbekannten Bereich des Enzyms als eine separat gefaltete Domäne beschreiben, welche Substratinteraktionen vermittelt. Sowohl durch die Strukturen, der katalytischen Domänen von USP25 und USP28, als auch durch die funktionelle Charakterisierung beider Enzyme konnten neue Erkenntnisse zu der Regulation von USPs durch Oligomerisierung gewonnen werden. Außerdem konnten wir individuelle Merkmale in beiden Proteasen identifizieren, die genutzt werden können, um die Entwicklung von spezifischen kleinmolekularen Inhibitoren voran zu bringen.…