Jessica Denise Schwarz

• Cellular growth and proliferation are among the most important processes for cells and organisms. One of the major determinants of these processes is the amount of proteins and consequently also the amount of ribosomes. Their synthesis involves several hundred proteins and four different ribosomal RNA species, is highly coordinated and very energy-demanding. However, the molecular mechanims of transcriptional regulation of the protein-coding genes involved, is only poorly understood in mammals. In this thesis, unbiased genome-wideCellular growth and proliferation are among the most important processes for cells and organisms. One of the major determinants of these processes is the amount of proteins and consequently also the amount of ribosomes. Their synthesis involves several hundred proteins and four different ribosomal RNA species, is highly coordinated and very energy-demanding. However, the molecular mechanims of transcriptional regulation of the protein-coding genes involved, is only poorly understood in mammals. In this thesis, unbiased genome-wide knockout reporter screens were performed, aiming to identify previously unknown transcriptional regulators of ribosome biogenesis factors (RiBis), which are important for the assembly and maturation of ribosomes, and ribosomal proteins (RPs), which are ribosomal components themself. With that approach and follow-up (validation) experiments, ALDOA and RBM8A among others, could be identified as regulators of ribosome biogenesis. Depletion of the glycolytic enzyme ALDOA led to a downregulation of RiBi- and RPpromoter driven reporters on protein and transcript level, as well as to a downregulation of ribosome biogenesis gene transcripts and of mRNAs of other genes important for proliferation. Reducing the amount of the exon junction complex protein RBM8A, led to a more prominent downregulation of one of the fluorescent reporters, but this regulation was independent of the promoter driving the expression of the reporter. However, acute protein depletion experiments in combination with nascent RNA sequencing (4sU-Seq) revealed, that mainly cytosolic ribosomal proteins (CRPs) were downregulated upon acute RBM8A withdrawal. ChIP experiments showed RBM8A binding to promoters of RP genes, but also to other chromatin regions. Total POL II or elongating and initiating POL II levels were not altered upon acute RBM8A depletion. These data provide a starting point for further research on the mechanisms of transcriptional regulation of RP and RiBi genes in mammals.…
• Zelluläres Wachstum und Proliferation zählen zu den wichtigsten Prozessen für Zellen und Organismen. Eine der größten Determinanten dieser Prozesse ist die Menge an Proteinen und in der Konsequenz auch die Menge an Ribosomen. Deren Synthese erfordert mehrere hundert Proteine und vier verschiedene ribosomale RNA-Spezies, ist stark koordiniert und sehr energiefordernd. Dennoch sind die molekularen Mechanismen der transkriptionellen Regulation der beteiligten protein-kodierenden Gene in Säugetieren nur schlecht verstanden. In dieser ArbeitZelluläres Wachstum und Proliferation zählen zu den wichtigsten Prozessen für Zellen und Organismen. Eine der größten Determinanten dieser Prozesse ist die Menge an Proteinen und in der Konsequenz auch die Menge an Ribosomen. Deren Synthese erfordert mehrere hundert Proteine und vier verschiedene ribosomale RNA-Spezies, ist stark koordiniert und sehr energiefordernd. Dennoch sind die molekularen Mechanismen der transkriptionellen Regulation der beteiligten protein-kodierenden Gene in Säugetieren nur schlecht verstanden. In dieser Arbeit wurden hypothesenfreie genomweite Knockout-Reporterscreens mit dem Ziel durchgeführt, bisher unbekannte transkriptionelle Regulatoren von ribosomalen Biogenesefaktoren (RiBis), welche wichtig für den Zusammenbau und die Reifung der Ribosomen sind, und ribosomalen Proteinen (RPs), welche selbst ribosomale Bestandteile sind, zu identifizieren. Durch diesen Ansatz und nachfolgende (Validierungs- )Experimente, konnten unter anderem ALDOA und RBM8A als Regulatoren ribosomaler Biogenese identifiziert werden. Eine Depletion des glykolytischen Enzyms ALDOA führte sowohl zu einer Herunterregulation von RiBi- und RP-Promotor-gesteuerten Reportern auf Protein- und Transkriptebene, als auch zu einer Herunterregulation von ribosomalen Biogenesegentranskripten und von mRNAs anderer für die Proliferation wichtiger Gene. Eine Reduktion der Menge des Exon-Junction-Komplexproteins RBM8A führte zu einer deutlicheren Herunterregulation eines der beiden fluoreszierenden Reporter, aber diese Regulation war unabhängig vom Promotor, der die Expression des Reporters steuert. Akute Proteinabbauexperimente in Verbindung mit einer Sequenzierung naszenter RNA (4sU-Seq) zeigten allerdings, dass hauptsächlich zytosolische ribosomale Proteine (CRPs) nach akuter RBM8A-Depletion herunterreguliert waren. ChIP-Experimente zeigten RBM8A-Bindung an Promotoren von RP-Genen, aber auch an andere Chromatinregionen. Gesamt-POL II- oder elongierende und initiierende POL II-Mengen waren nach akuter RBM8A-Depletion nicht verändert. Diese Daten stellen einen Ausgangspunkt für weitere Forschung zu den Mechanismen transkriptioneller Regulation von RP- und RiBi-Genen in Säugetieren dar.…