Laura Müller-Hübner

• Antigenic variation of surface proteins is a commonly used strategy among pathogens to evade the host immune response [63]. The mechanism underlying antigenic variation relies on monoallelic exclusion of a single gene from a hypervariable multigene family combined with repeated, systematic changes in antigen expression. In many systems, these gene families are arranged in subtelomeric contingency loci that are subject to both transcriptional repression and enhanced mutagenesis and recombination [16]. Eviction of a selected gene from aAntigenic variation of surface proteins is a commonly used strategy among pathogens to evade the host immune response [63]. The mechanism underlying antigenic variation relies on monoallelic exclusion of a single gene from a hypervariable multigene family combined with repeated, systematic changes in antigen expression. In many systems, these gene families are arranged in subtelomeric contingency loci that are subject to both transcriptional repression and enhanced mutagenesis and recombination [16]. Eviction of a selected gene from a repressed antigen repertoire can be achieved e.g. by recombination into a dedicated, transcriptionally permissive site or by local epigenetic alterations in chromatin composition of the selected gene. Both processes are ultimately affected by genome architecture. Architectural proteins controlling antigenic variation have, however, remained elusive in any pathogen. The unicellular protozoan parasite Trypanosoma brucei evades the host immune response by periodically changing expression of a single variant surface glycoprotein (VSG) from a repertoire of ~3000 VSG genes – the largest mutually exclusively expressed gene family described today. To activate a selected VSG gene, it needs to be located in a dedicated expression site that becomes subject to relocation into a distinct, transcriptionally active subnuclear compartment, the expression site body (ESB). Whereas this emphasizes the importance of nuclear architecture in regulating antigen expression in T. brucei, the mechanisms underlying spatial positioning of DNA in T. brucei are not well understood. In this study I applied genome-wide chromosome conformation capture (Hi-C) to obtain a comprehensive picture of the T. brucei genome in three dimensions, both in procyclic and bloodstream form parasites. Hi-C revealed a highly structured nucleus with megabase chromosomes occupying distinct chromosome territories. Further, specific trans interactions between chromosomes, among which are clusters of centromeres, rRNA genes and procyclins became apparent. With respect to antigenic variation, Hi-C revealed a striking compaction of the subtelomeric VSG gene repertoire and a strong clustering of transcriptionally repressed VSG-containing expression sites. Further, Hi-C analyses confirmed the spatial separation of the actively transcribed from the silenced expression sites in three dimensions. I further sought to characterize architectural proteins mediating nuclear architecture in T. brucei. Whereas CTCF is absent in non-metazoans, we found cohesin to be expressed throughout the cell cycle, emphasizing a function beyond sister chromatid cohesion in S-phase. By Chromatin-Immunoprecipitation with sequencing (ChIPseq), I found cohesin enrichment to coincide with the presence of histone H3 vari- ant (H3.V) and H4 variant (H4.V). Most importantly, cohesin and the histone variants were enriched towards the VSG gene at silent and active expression sites. While the deletion of H3.V led to increased clustering of expression sites in three dimensions and increased chromatin accessibility at expression site promoters, the additional deletion of H4.V increased chromatin accessibility at expression sits even further. RNAseq showed that mutually exclusive VSG expression was lost in H3.V and H4.V single and double deletion mutants. Immunofluorescence imaging of surface VSGs, flow cytometry and single-cell RNAseq revealed a progressive loss of VSG-2 expression, indicative of an increase in VSG switching rate in the H3.V/H4.V double deletion mutants. Using long-read sequencing technology, we found that VSG switching occurred via recombination and concluded, that the concomitant increase in spatial proximity and accessibility among expression sites facilitated the recombination event. I therefore identified the histone variants H3.V and H4.V to act at the interface of global nuclear architecture and chromatin accessibility and to represent a link between genome architecture and antigenic variation.…
• Antigenvariation ist ein weit verbreiteter Mechanismus der Immunevasion von Pathogenen [63]. Sie beruht auf der transkriptionellen Selektion eines einzelnen Gens aus einer hypervariablen Multi-Gen Familie und dem wiederholten, systematischen Wechsel zwischen der Expression verschiedener Gene dieser Familie. In vielen Organismen sind diese Gene als Kontingenzgene in den Subtelomeren angeordnet, wo sind einerseits transkriptionell reprimiert werden, andererseits erhöhter Mutagenese und Rekombination unterliegen [16]. Monoallelische ExklusionAntigenvariation ist ein weit verbreiteter Mechanismus der Immunevasion von Pathogenen [63]. Sie beruht auf der transkriptionellen Selektion eines einzelnen Gens aus einer hypervariablen Multi-Gen Familie und dem wiederholten, systematischen Wechsel zwischen der Expression verschiedener Gene dieser Familie. In vielen Organismen sind diese Gene als Kontingenzgene in den Subtelomeren angeordnet, wo sind einerseits transkriptionell reprimiert werden, andererseits erhöhter Mutagenese und Rekombination unterliegen [16]. Monoallelische Exklusion eines Gens und die damit einhergehende Eviktion aus seinem reprimierten genomischen Umfeld beruht auf unterschiedlichen molekularen Mechanismen. Sie ist, zum Beispiel, das Resultat einer Rekombination des betreffenden Gens in einen dedizierten, transkriptionell permissiven Lokus oder wird durch epigenetische, bzw. räumliche Umstrukturierung des entsprechenden Gens oder zugrunde liegenden Chromatins erreicht. Beide Prozesse sind letztendlich durch die Architektur des Genoms beeinflusst. Architekturelle Proteine, die ebenfalls Antigenvariation kontrollieren, sind in vielen Pathogenen unbekannt. Der parasitäre Protozoe Trypanosoma brucei entkommt einer Elimination durch die Immunabwehr seines Wirtes durch den periodischen Wechsel in der Expression eines von fast 3000 variablen Oberflächenglykoproteinen (VSGs). VSG-Gene umfassen die größte, monoallelisch exprimierte Genfamilie, die bislang beschrieben wurde. Um exprimiert zu werden, muss das selektierte VSG Gen in eine Expressionsseite transloziert sein. Diese wiederum wird in einem dedizierten Kompartment des Zellkerns, dem Expressionsseiten-Zellkernkörper (ESB), transkribiert. Obgleich diese Gegebenheiten die zentrale Rolle der Zellkernarchitektur in der Antigenvariation in T. brucei verdeutlichen, so ist wenig über die ihr zugrundeliegenden Mechanismen bekannt. Um ein umfassendes Bild der Zellkernarchitektur in Trypanosomen zu bekommen, habe ich in der hier vorliegenden Doktorarbeit Hi-C, eine Methode zur Feststellung chromosomaler Konformationen, in T. brucei Blutstromform und Prozyklen etabliert und angewendet. Die Applikation dieser Technik offenbarte einen hoch strukturierten Zellkern: Chromosome sind territorial angeordnet und gehen spezifische Interaktionen in trans untereinander ein. Dies sind beispielsweise Interaktionen zwischen Zentromeren, Genen für ribosomale RNA und Prozyklinen unterschiedlicher Chromosomen. Auch Interaktionen, die in funktionellem Zusammenhang mit Antigenvariation stehen, wurden gefunden. Dabei handelte es sich zum Einen um strukturelle Verdichtungen des subtelomerischen Chromatins transkriptionell reprimierter VSG Gene und zum Anderen um erhöhte Interaktionen zwischen reprimierten VSG-Expressionsseiten. Hi-C bestätigte außerdem die räumliche Separation der aktiv transkribierten Expressionsseite von den übrigen, stillen VSG-Expressionsseiten. Des Weiteren suchte ich nach Proteinen, die in der Aufrechterhaltung der Zellkernarchitektur in T. brucei wirken. Anders als CTCF ist Cohesin nicht auf Metazoen beschränkt. Ich fand Cohesin über den gesamten Zellzyklus exprimiert, was eine architekturelle Rolle des Proteinkomplexes zuzüglich der Schwesterchromatidkohäsion suggerierte. Mittels Chromatin-Immunpräzipitation konnte ich feststellen, dass Cohesin mit den Histonvarianten H3.V und H4.V an vielen Stellen des Ge- noms kolokalisierte, insbesondere über dem VSG Gen der aktiven und reprimierten Expressionsseiten. Während eine Deletion von H3.V zu erhöhten Interaktionsfrequenzen zwischen Expressionsseiten führte, resultierte eine gleichzeitige Deletion von H3.V und H4.V zu einer additiven Öffnung des Chromatins an Expressionsseiten. RNA Sequenzierungen ergaben, dass in der H3.V/H4.V Doppeldeletionsmutante die Transcription von VSG Genen erhöht war, was auf einen funktionellen Verlust der monoallelischen Expression hindeutete. Immunfluoreszenzaufnahmen der VSGs auf der Zelloberfläche, Durchflusszytometrie und RNA Sequenzierung einzelner Zellen zeigten einen fortschreitenden Verlust der Expression von VSG-2, was auf einen erhöhten Wechsel der VSG-Expression auf dem Einzelzelllevel hindeutete. Durch die Sequenzierung der genomischen DNA der H3.V/H4.V Doppeldeletionsmutante konnten wir feststellen, dass der primäre Mechanismus des Wechsels in der VSG Expression auf eine Rekombination zwischen Expressionsseiten zurückzuführen war. Diese Rekombination wurde vermutlich durch die gesteigerte räumliche Nähe und Öffnung des Chromatins der Expressionsseiten begünstigt. Zusammenfassend konnte ich feststellen, dass die Histonvarianten H3.V und H4.V auf der Schnittstelle zwischen globaler Zellkernarchitektur und lokaler Chromatinzugänglichkeit agieren und funktionell ein molekulares Verbindungsstück zwischen Genomarchitektur und Antigenvariation darstellen.…