Franziska Ehebauer

• Nicotinamide N-methyltransferase (NNMT) is a new regulator of energy homeostasis. Its expression is increased in models of obesity and diabetes. An enhanced NNMT level is also caused by an adipose tissue-specific knockout of glucose transporter type 4 (GLUT4) in mice, whereas the overexpression of this glucose transporter reduced the NNMT expression. Furthermore, the knockdown of the enzyme prevents mice from diet-induced obesity (DIO) and the recently developed small molecule inhibitors for NNMT reverses the DIO. These previous findingsNicotinamide N-methyltransferase (NNMT) is a new regulator of energy homeostasis. Its expression is increased in models of obesity and diabetes. An enhanced NNMT level is also caused by an adipose tissue-specific knockout of glucose transporter type 4 (GLUT4) in mice, whereas the overexpression of this glucose transporter reduced the NNMT expression. Furthermore, the knockdown of the enzyme prevents mice from diet-induced obesity (DIO) and the recently developed small molecule inhibitors for NNMT reverses the DIO. These previous findings demonstrated the exclusive role of NNMT in adipose tissue and further make it to a promising target in obesity treatment. However, the regulation mechanism of this methyltransferase is not yet clarified. The first part of the thesis focus on the investigation whether pro-inflammatory signals are responsible for the enhanced NNMT expression in obese adipose tissue because a hallmark of this tissue is a low-level chronic inflammation. Indeed, the NNMT mRNA in our study was elevated in obese patients compared with the control group, whereas the GLUT4 mRNA expression does not differ between lean and obese humans. To analyze whether pro inflammatory signals, like interleukin (IL 6) and tumor necrosis factor α (TNF-α), regulate NNMT expression 3T3-L1 adipocytes were treated with these cytokines. However, IL 6, TNF α, and leptin, which is an alternative activator of the JAK/STAT pathway, did not affect the NNMT protein or mRNA level in differentiated 3T3-L1 adipocytes. The mRNA and protein levels were measured by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and western blotting. In the second part of this study, 3T3-L1 adipocytes were cultivated with varying glucose concentrations to show whether NNMT expression depends on glucose availability. Further studies with activators and inhibitors of AMP-activated protein kinase (AMPK) and mechanistic target of rapamycin (mTOR) signaling pathways were used to elucidate the regulation mechanism of the enzyme. The glucose deprivation of differentiated 3T3-L1 adipocytes led to a 2-fold increase in NNMT expression. This effect was confirmed by the inhibition of the glucose transports with phloretin as well as the inhibition of glycolysis with 2-deoxyglucose (2-DG). AMPK serves as an intracellular energy sensor and the pharmacological activation of it enhanced the NNMT expression. This increase was also caused by the inhibition of mTOR. Conversely, the activation of mTOR using MHY1485 prevented the effect of glucose deprivation on NNMT. Furthermore, the NNMT up-regulation was also blocked by the different autophagy inhibitors. Taken together, NNMT plays a critical role in autophagy in adipocytes, because an inhibition of this process prevented the augmented NNMT expression during glucose starvation. Moreover, the effect on NNMT protein and mRNA level depends on AMPK and mTOR. However, pro-inflammatory signals did not affect the expression. Further in vivo studies have to clarify whether AMPK activation and mTOR inhibition as well as autophagy are responsible for the increased NNMT levels in obese adipose tissue. In future this methyltransferase emerges as an awesome therapeutic target for obesity.…
• NNMT ist ein neuer Regler der Energiehomöostase. Seine Expression ist in Adipositas- und Diabetesmodellorgansimen erhöht. Ein verstärktes NNMT Level wird auch durch einen fettgewebs-spezifischen GLUT4 Knockout in Mäusen hervorgerufen, wobei die Überexpression des Glukosetransporters die NNMT Expression reduziert. Des Weiteren schützt der Knockdown von NNMT die Mäuse vor Diät-induzierter Adipositas und die kürzlich entwickelten kleinen Molekülinhibitoren gegen NNMT kehren eine durch die Ernährung bedingte Adipositas wieder um. NeuereNNMT ist ein neuer Regler der Energiehomöostase. Seine Expression ist in Adipositas- und Diabetesmodellorgansimen erhöht. Ein verstärktes NNMT Level wird auch durch einen fettgewebs-spezifischen GLUT4 Knockout in Mäusen hervorgerufen, wobei die Überexpression des Glukosetransporters die NNMT Expression reduziert. Des Weiteren schützt der Knockdown von NNMT die Mäuse vor Diät-induzierter Adipositas und die kürzlich entwickelten kleinen Molekülinhibitoren gegen NNMT kehren eine durch die Ernährung bedingte Adipositas wieder um. Neuere Erkenntnisse zeigen die exklusive Rolle von NNMT im Fettgewebe auf und machen das Enzym so zu einem vielversprechenden Target für die Adipositastherapie. Jedoch ist der Regulationsmechanismus dieser Methyltransferase noch nicht geklärt. Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der Untersuchung, ob pro-inflammatorische Signale verantwortlich sind für die erhöhten NNMT Expression im adipösen Fettgewebe, da sich dieses Gewebe durch eine chronische Inflammation auszeichnet. Tatsächlich war die mRNA in unserer Studie verstärkt exprimiert in adipösen Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe, wobei die GLUT4 mRNA Expression zwischen Schlanken und Adipösen nicht verändert war. Um zu untersuchen, ob pro-inflammatorische Signale, wie IL 6 und TNF α, die NNMT Expression regulieren, wurden 3T3-L1 Adipozyten mit diesen Zytokinen behandelt. Jedoch beeinflussten IL 6, TNF α und Leptin, welches ein weiterer Aktivator des JAK/STAT Signalweges ist, NNMT Protein oder mRNA Level in differenzierten 3T3 L1 Adipozyten nicht. Die mRNA und Protein Level wurden mittels qPCR und Western Blot analysiert. Im zweiten Teil dieser Studie wurden 3T3 L1 Adipozyten mit unterschiedlichen Glukosekonzentrationen kultiviert, um zu zeigen, ob die NNMT Expression von der Glukoseverfügbarkeit abhängig ist. Für die Untersuchung des genauen Regulationsmechanismus von NNMT, wurden weitere Studien mit Aktivatoren und Inhibitoren der AMPK und mTOR Signalwege durchgeführt. Der Glukosemangel führte zu einem 2-fachen Anstieg der NNMT Expression in differenzierten 3T3-L1 Adipozyten. Dieser Effekt wurde bestätigt durch die Inhibierung der Glukosetransporter mit Phloretin sowie durch die Inhibierung der Glykolyse mit 2-DG. AMPK ist ein intrazellulärer Energiesensor und dessen pharmakologische Aktvierung erhöhte die NNMT Expression. Dieser Anstieg wurde auch verursacht durch die Inhibierung von mTOR. Hingegen verhinderte die Aktivierung von mTOR mithilfe von MHY1485 den Effekt auf NNMT während des Glukoseentzugs. Des Weiteren wurde die Auswirkungen auf NNMT durch Autophagieinhibitoren unterbunden. Zusammenfassend spielt NNMT eine kritische Rolle für die Autophagie in Adipozyten, da eine Inhibierung des Prozesses die erhöhte NNMT Expression während eines Glukoseentzugs verhinderte. Darüber hinaus ist der Effekt auf die NNMT Protein und mRNA Level abhängig von AMPK and mTOR. Jedoch beeinflussten pro-inflammatorische Signale die Expression nicht. Weitere in vivo Studien müssen klären, ob eine AMPK Aktivierung und eine mTOR Inhibierung sowie die Autophagie in Adipozyten verantwortlich sind für die verstärkte NNMT Expression im adipösen Fettgewebe. Zukünftig wird sich NNMT als ein beeindruckendes Target für die Adipositastherapie herausstellen.…