Effekte von Parathormon auf die Struktur und Komplexierung des Parathormonrezeptors 1

Effects of parathyroid hormone on the structure and complexation of parathyroid hormone receptor 1

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:20-opus-47288
  • Der Parathormonrezeptor Typ 1 (PTHR) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor der Gruppe 2 und wichtigster Regulator des Kalziumstoffwechsels. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neuartige posttranslationale Modifikation des PTHR in Form einer proteolytischen Spaltung der Ektodomäne identifiziert, charakterisiert und deren Regulation beschrieben. Nach langanhaltender Stimulation des Rezeptors mit Agonisten – aber nicht mit Antagonisten – wurde eine Massen- und Mengenzunahme des Rezeptorproteins beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass derDer Parathormonrezeptor Typ 1 (PTHR) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor der Gruppe 2 und wichtigster Regulator des Kalziumstoffwechsels. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neuartige posttranslationale Modifikation des PTHR in Form einer proteolytischen Spaltung der Ektodomäne identifiziert, charakterisiert und deren Regulation beschrieben. Nach langanhaltender Stimulation des Rezeptors mit Agonisten – aber nicht mit Antagonisten – wurde eine Massen- und Mengenzunahme des Rezeptorproteins beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor unter basalen Bedingungen einer Spaltung unterliegt. Der Massenunterschied entsteht durch die proteolytische Spaltung der Ektodomäne des PTHR, was nachfolgend die Stabilität des Rezeptors beeinträchtigt. Die Spaltung erfolgte innerhalb einer unstrukturierten Schleife der Ektodomäne, welche die Bereiche für die Ligandenbindung miteinander verbindet. Hierbei handelt es sich um eine Region, die im Vergleich zu anderen Gruppe 2-Rezeptoren spezifisch für den PTHR ist. Das durch die Spaltung entstandene N-terminale Fragment bleibt durch eine Disulfidbrücke mit dem Transmembranteil des Rezeptors verbunden. Durch Versuche mit verschiedenen Proteaseinhibitoren konnte die verantwortliche Protease der Familie der zinkabhängigen extrazellulären Proteasen zugeordnet werden. Diese Ergebnisse beschreiben einen Mechanismus wie die Homoöstase des PTHR reguliert sein könnte. In einem zweiten Abschnitt wurde die Interaktion der Adapterproteine NHERF1 und beta-Arrestin2 mit dem PTHR untersucht. Beide Proteine interagierten unabhängig mit dem Rezeptor, wobei NHERF1 über eine PDZ-Domäne konstitutiv an den C-Terminus des Rezeptors bindet. beta-Arrestin2 hingegen bindet nach Aktivierung des Rezeptors und führt zur Desensitisierung des Rezeptors. Mittels biochemischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass beide Proteine gemeinsam einen ternären Komplex mit dem PTHR bilden, welcher durch die direkte Interaktion zwischen NHERF1 und beta-Arrestin2 vermittelt wird. Dies hat zur Folge, dass beta-Arrestin im basalen Zustand durch NHERF1 an den Rezeptor gekoppelt wird. Durch Analyse der Assoziationskinetik mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen zeigte sich, dass diese Kopplung zu einer zweifach erhöhten Rekrutierungsgeschwindigkeit von beta-Arrestin2 an den PTHR führt. Somit stellt unterstützt NHERF1 die beta-Arrestin2-vermittelte Desensitisierung des PTHR.show moreshow less
  • The Parathyroid hormone receptor type 1 (PTHR) belongs to the class 2 of G-protein coupled receptors (GPCRs) and is the main regulator of calcium homeostasis of the body. The first part of the dissertation describes a novel mechanism of receptor regulation based on a proteolytic cleavage of the receptor’s extracellular domain. Prolonged stimulation with PTH led to an apparent increase in molecular mass and in stability of the PTHR. Biochemical analysis of the receptor protein revealed that the PTHR undergoes posttranslational cleavage.The Parathyroid hormone receptor type 1 (PTHR) belongs to the class 2 of G-protein coupled receptors (GPCRs) and is the main regulator of calcium homeostasis of the body. The first part of the dissertation describes a novel mechanism of receptor regulation based on a proteolytic cleavage of the receptor’s extracellular domain. Prolonged stimulation with PTH led to an apparent increase in molecular mass and in stability of the PTHR. Biochemical analysis of the receptor protein revealed that the PTHR undergoes posttranslational cleavage. Agonistic but not antagonistic PTH-peptides prevented this cleavage, thereby stabilizing the molecular mass and also increasing the half life of the receptor. The cleavage was shown to occur within an unstructured stretch of the extracellular domain of the receptor, which connects two parts required for ligand binding and which is unique in the PTHR amongst all class 2 GPCRs. The cleaved N-terminal fragment was further connected by a disulfide bridge and could only be released by reducing agents. By testing a panel of different protease inhibitors, a protease belonging to the family of zinc-dependent metalloproteases could be identified to be responsible for the PTHR cleavage. Thus, these findings describe a new mechanism how PTHR homeostasis may be regulated. In the second part, the interaction between the adaptor proteins NHERF1 and beta-arrestin2 with the PTHR was assessed. Both proteins interacted independently with the receptor. While NHERF1 formed a constitutive interaction with the PTHR C-terminus, beta-arrestin2-binding required activation of the receptor. Using biochemical and microscopic methods it was shown that both proteins formed a ternary complex with the receptor. This complex was mediated by a direct interaction between NHERF1 and beta-arrestin2 which has been identified in this work. As a consequence, NHERF1 leads to a coupling of beta-arrestin2 close to the PTHR. Association kinetics of beta-arrestin2 with the PTHR measured by fluorescent resonance energy transfer were two-fold increased in the presence of NHERF, suggesting that the ternary complex facilitates the desensitization of the PTHR by beta-arrestin2.show moreshow less

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Metadaten
Author: Johann Christoph Klenk
URN:urn:nbn:de:bvb:20-opus-47288
Document Type:Doctoral Thesis
Granting Institution:Universität Würzburg, Graduate Schools
Faculties:Graduate Schools / Graduate School of Life Sciences
Medizinische Fakultät / Institut für Pharmakologie und Toxikologie
Date of final exam:2010/03/19
Language:German
Year of Completion:2009
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 50 Naturwissenschaften / 500 Naturwissenschaften und Mathematik
GND Keyword:Parathormon; Proteolyse; Endokrinologie; Calcium; Rezeptor; Retinales S-Antigen
Tag:G-Protein; GPCR; Matrix-Metalloprotease; NHERF; Signaltransduktion
G-protein; GPCR; Matrix-Metalloproteinase; NHERF; signal transduction
Release Date:2010/04/07
Advisor:Prof. Dr. Martin J. Lohse