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Da in den letzten Jahrzehnten nur geringfügige Verbesserungen der Überlebensraten bei an einem Pankreaskarzinom erkrankten Patienten erzielt wurden, besteht ein dringender klinischer Bedarf für die Entwicklung wirksamer therapeutischer Strategien. Dreidimensionale in vitro Modelle sind für das Screening und die Validierung von Therapeutika essenziell.
In der vorliegenden Arbeit konnte mittels der Methoden des Tissue Engineerings ein biolumineszenzbasiertes dreidimensionales in vitro Testsystem des pankreatischen Karzinoms aufgebaut und charakterisiert werden. Für die Detektion von LumineszenzIntensitäten wurde die pankreatische Krebszelllinie PANC-1 zuvor mit firefly luciferase (FLUC) transduziert. PANC-1 FLUC Zellen wurden auf porziner Pankreasmatrix (PanMa) und Dünndarmmatrix (SISser) kultiviert, um den Einfluss unterschiedlicher Matrizen auf das Verhalten der Zellen im Tumormodell zu untersuchen. Darüber hinaus wurden in dieser Arbeit die PANC-1 FLUC mit einem Standardtherapeutikum der Pankreaskarzinomtherapie, Gemcitabin, behandelt und die Wirkung mittels biolumineszenbasierter Bildgebung detektiert.
Es konnte gezeigt werden, dass die Lumineszenz-Intensität von PANC-1 FLUC Zellen einer bestimmten Zellzahl durch biolumineszenzbasierte Messverfahren zugeordnet werden kann. Weiter wurde nachgewiesen, dass die Extrazellulärmatrix einen Einfluss auf die Expression tumorspezifischer Marker hat und PANC-1 FLUC Zellen ein unterschiedlich invasives Wachstum auf organspezifischen Matrizen aufweisen. Die Wirkung von Gemcitabin auf die Tumorzellen kann durch das hier vorgestellte biolumineszenzbasierte Messverfahren detektiert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse sind die Grundlage für die weitere Validierung eines biolumineszenzbasierten dreidimemsionalen in vitro Testystems des pankreatischen Karzinoms für die präklinische Erforschung neuartiger Therapiestrategien.
Rund 300 Millionen Alveolen sorgen in der menschlichen Lunge für den Gasaustausch. Eine essentielle Rolle spielen dabei die Alveolarepithelzellen, die die erste Barriere der Luft gegenüber dem Blut bilden. Man unterteilt diese in die kubisch förmigen Typ-II-Epithelzellen, die den wichtigen stabilisierenden Surfactant bilden und in die flacheren Typ-I-Zellen, die aufgrund von engen Zell-Zell Kontakten miteinander eine funktionelle Barriere zwischen Luft und Blut (Blut-Luft-Schranke) ermöglichen. In der Pathophysiologie von verschiedenen Lungenerkrankungen, wie z.B. dem ARDS, spielt die Störung dieser Barriere eine essentielle Rolle.
Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war es, ein in vitro-Modell dieser Barriere, basierend auf der humanen Epithellzelllinie NCI H441, zu etablieren. Die Epithelzellen wurden hierzu erfolgreich auf Transwelleinsätzen gezüchtet.
Um die Barriereeigenschaften zu überprüfen, wurden mit TER Messungen und Fluoreszenzpermeabilitätsmessungen zwei verschiedene Verfahren eingesetzt.
Für die Bewahrung der Konfluenz wurden die Zellen mit Dexamethason – einem potenten Glukokortikoid – behandelt. Dexamethason wurde idealerweise bei jedem Medienwechsel ab Tag 5 apikal hinzugefügt und zeigte einen barrierefördernden Effekt. Die optimale hinzugefügte Dexamethason–konzentration erwies sich als 100 nM. Hierunter bildete die Zellschicht – sowohl mittels TER-Messung als auch mittels Fluoreszenzpermeabilitätsmessung überprüft – eine starke Barriere aus, die am Tag 14-15 nach Zellaussaat ihr Maximum erreichte.
Auf mRNA Ebene konnten zu diesem Zeitpunkt unter 100 nM Dexamethason jeweils relevante Mengen zellspezifischer Proteine von Alveolarepithelzellen Typ-I und II nachgewiesen werden. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie konnte zusätzlich visualisiert werden, dass die zwei Zelltypen koexistieren.
Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie zeigte sich weiterhin ein ausgeprägtes Netz an Occludensjunktionsproteinen (Claudin -1,-3,-4, Occludin, ZO-1). In weiteren Versuchen wurde der Einfluß von Endothelzellfaktoren auf das epitheliale Lungenkulturmodell untersucht. Es zeigte sich ein stark ausgeprägter gewebsspezifischer Effekt: Die Faktoren der Lungenendothelzellen stärkten die Barriere des Modells, hingegen die Hirnendothelzellfaktoren sie stark schwächten. Dieser Effekt zeigte sich sowohl durch die gemessenen TER-Werte als auch durch die gemessenen Fluoreszeinpermeabelitätswerte.
Erste Belastungsversuche des Modell durch Hypoxie und reaktive Sauerstoffspezies zeigten eine gewisse Widerstandsfähigkeit der Barriere gegenüber Noxen.
Das vorliegende Zellkulturmodell des Lungenalveolarepithels, basierend auf der NCI H441 Zelllinie, kann folglich genutzt werden, um die Regulation der Barriere genauer zu erforschen und mögliche neue Therapiestrategien zu entwickeln.