Refine
Has Fulltext
- yes (5)
Is part of the Bibliography
- yes (5)
Document Type
- Doctoral Thesis (5)
Language
- German (5) (remove)
Keywords
- Punktmutation (5) (remove)
Trotz einer Vielzahl neuer Therapieansätze in den letzten Jahren, die ein längeres Überleben der Patienten ermöglichen, stellt das multiple Myelom weiterhin eine unheilbare Krankheit dar. Der Großteil der Patienten entwickelt letztlich ein rezidiviertes oder refraktäres multiples Myelom (RRMM). Bei Erstdiagnose und bei RRMM sind immunmodulierende Medikamente (IMiDs), wie Lenalidomid, eine bedeutende Therapieoption. Durch die Bindung von Lenalidomid an den CRL4CRBN Ligase Komplex entwickelt dieser eine modifizierte Substratspezifität: die Transkriptionsfaktoren IKZF1 (Ikaros) und IKZF3 (Aiolos) werden ubiquitinyliert und proteasomal abgebaut. Von Krönke et al. (2014) wurde eine 30 Aminosäuren lange Sequenz (Degron) am N-Terminus von IKZF1/3 definiert, die essenziell für die Lenalidomid-Sensitivität ist. Durch Next Generation Sequencing (NGS)-Technologien wurde ein signifikanter Anstieg der Mutationsfrequenz unter Therapie verzeichnet und vier Missense-Mutationen in IKZF1 und eine in IKZF3 bei Patienten mit RRMM identifiziert. Die Mutationen IKZF1-A152T und IKZF3-G159R sind innerhalb der Degron-Sequenz lokalisiert, IKZF1-E170D liegt unmittelbar daneben und IKZF1-Y413C bzw. IKZF1-R439H befinden sich am C-Terminus des Proteins. Für diese mutierten IKZF-Proteine wurden im Rahmen dieser Arbeit Expressionsvektoren kloniert und stabil in humane Myelomzelllinien transfiziert. Durch Western Analysen und funktionelle Assays der Zellviabilität (alamarBlue) bzw. des Zelltods (Annexin V-PI) wurden diese polyklonalen Sublinien bezüglich ihrer Implikationen für die Lenalidomid-Sensibilität untersucht. Nur die IKZF1-Mutationen A152T und E170D führten zu einer verminderten, bei A152T geradezu aufgehobenen, Degradierung von Ikaros nach Lenalidomid-Behandlung. In den funktionellen Analysen führte A152T ebenfalls zu stark verminderter Lenalidomid-Aktivität und zu deutlich höherem Überleben. Obwohl Sleeping Beauty Vektoren mit unterschiedlichen Expressionskassetten für Aiolos eingesetzt wurden, war keine eindeutige Überexpression von IKZF3 feststellbar, daher sind diese Ergebnisse nur eingeschränkt zu verwerten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in vivo bei Patienten aufgetretene und in vitro analysierte Mutationen, gezeigt an der in der Degron-Sequenz lokalisierten Mutation IKZF1-A152T, im Zellmodell eine Resistenz vermitteln und damit Einfluss auf mögliche Therapieresistenzen haben können.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung von Punktmutationen in ifng und ncam1 in Hinblick auf eine veränderte Funktionalität von NK-Zellen bei der Interaktion mit A. fumigatus. Die gewonnenen Erkenntnisse sollen langfristig zur Verbesserung der Diagnostik, Prophylaxe und Therapie einer Invasiven Aspergillose, die zum Beispiel im Rahmen einer Stammzelltransplantation auftreten könnte, beitragen.
In dieser Arbeit wurde die DNA von zwanzig gesunden Spendern auf einen ifng-SNP (rs2069705) und einen ncam1-SNP (rs10502171) untersucht. Von je drei ausgewählten Spendern mit SNP und sechs Kontrollspendern wurden NK-Zellen isoliert. Diese wurden unstimuliert belassen, mit Interleukin 2/15 oder A. fumigatus stimuliert. Bei der Versuchsreihe zum ifng-SNP wurde eine qPCR zur Ermittlung der relativen Expression von ifng und ccl4, bei den Versuchen zum ncam1-SNP eine durchflusszytometrische Analyse zur Messung der Expression verschiedener Oberflächenmarker durchgeführt. Bei beiden wurde mittels ELISA die Freisetzung von IFN-gamma bzw. CCL4/MIP-1ß bestimmt.
Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zum ifng-SNP lassen vermuten, dass das Vorliegen dieses ifng-SNP keine durch NK-Zellen vermittelten Auswirkungen auf das Risiko der Patienten, an einer Invasiven Aspergillose zu erkranken, hat. In Bezug auf den ncam1-SNP konnte die Hypothese bestätigt werden, dass der SNP die Interaktion zwischen der NK-Zelle und A. fumigatus verändert. Der SNP korreliert zwar mit einer erhöhten Grundaktivierung von NK-Zellen, jedoch auch mit einem schwächeren Aktivierungspotential bei Stimulation mit dem Pilz.
Bei einem kleinen Prozentsatz (2–3 %) aller molekulargenetisch untersuchten Hä-mophilie-A-Fälle konnte bislang keine kausale Mutation innerhalb der F8-Gen-Region aufgedeckt werden. Die molekularen Ursachen der Hämophilie dieser Patienten sollten im ersten Teil der vorliegenden Doktorarbeit mittels zusätzlicher Methoden aufgeklärt werden. Bei zwei Patienten mit milder Hämophilie A konnte je ein Basenaustausch im Promotorbereich des F8-Gens identifiziert werden. Um die Kausalität dieser Austausche zu überprüfen, wurden für diese und zwei weitere bereits publizierte Promotor-Mutationen Luciferase-Assays durchgeführt. Diese Ergebnisse machten deutlich, dass die nachgewiesenen Promotor-Mutationen die Aktivität des Promotors deutlich herabsetzen und daher als ursächlich einzustufen sind. Weiterhin wurden die übrigen Patienten auf epigenetische Veränderungen in fünf CpG-Inseln im 5’UTR und Intron 1 des F8-Gens untersucht. Hierbei konnten bei drei Patienten auffällige Methylierungsmuster nachgewiesen werden, wobei diese auf ein Klinefelter-Syndrom und genomische Veränderungen im Intron 1 zurückzuführen sind, nicht jedoch auf einen aberranten Methylierungsstatus, der die FVIII-Expression beeinflussen könnte. Mit Hilfe von mRNA-Untersuchungen konnten bei vier Patienten mit mutmaßlichen F8-Spleißmutationen aberrante F8-Transkripte nachgewiesen werden und somit die Kausalität der Mutationen geklärt werden. Des Weiteren wurden aus der Literatur alle bisher als kausal identifizierten stillen Mutationen und Spleißmutationen zusammengestellt, um mit diesen Ergebnissen die Spleißvorhersage-Software Alamut zu validieren. Die große Mehrzahl (78 %) der Spleißvorhersagen stimmte mit den Resultaten der mRNA-Untersuchungen (zumindest im Trend) überein, während es bei 22 % der Vorhersagen und mRNA-Analysen zu unterschiedlichen Resultaten kam. Innerhalb einer vorangegangenen Diplomarbeit konnten zehn Duplikationsbruch-punkte im F8-Gen von nicht verwandten Hämophilie-A-Patienten aufgeklärt werden. Diese wurden nun mit verschiedenen in-silico-Programmen analysiert, um die Sequenzumgebung der Bruchpunkt genauer zu beschreiben. Die Untersuchung ergab, dass verschiedene Mechanismen zur Entstehung von Duplikationen führen können und vermutlich mehrere Sequenzmotive in direkter Nähe der Bruchpunkte hierzu beitragen. Im Rahmen der molekulargenetischen Hämophilie-A-Diagnostik zum Nachweis von Intron-1- bzw. Intron-22-Inversionen sind einige Patienten mit schwerer Hämophilie A aufgefallen, welche ungewöhnliche Bandenmuster in den analytischen PCRs bzw. Southern-Blots aufwiesen. Mittels MLPA-Analysen wurden bei diesen Patienten Deletionen oder Duplikationen (CNVs) aufgedeckt, die meist allein die auffälligen Bandenmuster nicht erklären konnten. Weitere Long-Range-PCR-Untersuchungen belegten dagegen, dass fünf der untersuchten Fälle auf ein kombiniertes Inversions- und Duplikations- bzw. Deletionsereignis zurückzuführen sind. Als zweiter Teil der Arbeit wurden Transkriptions- und Translationsuntersuchungen von Nonsense-Mutationen des F8-Gens in einem zellulären Expressionssystem durchgeführt. Es konnte nachgewiesen werden, dass trotz Nonsense-Mutation eine komplette F8-Tran¬skrip¬tion stattfindet. Antigenanalysen konnten die Expression von trunkierten Proteinen nachweisen, wenn die Nonsense-Mutationen in der leichten Kette, d.h. den distalen Domänen A3, C1 oder C2, lag. Bei Nonsense-Mutationen in der schweren Kette (den proximalen Domänen A1, A2 oder B) war keine Proteinexpression nachweisbar. Diese Daten konnte durch intrazelluläre Immunlokalisation der trunkierten Proteine bestätigt werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die B-Domäne eine wichtige Rolle bei der Proteinprozessierung spielt, vermutlich indem sie die Bindung von Chaperonen ermöglicht und das FVIII-Protein vor Degradation schützt.
Die Arbeitsgruppe Zimmer am Institut für Klinische Biochemie und Pathobiochemie der Universität Würzburg detektierte im Gen der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (DLD) eine bisher nicht bekannte Mutation, die für die Entwicklung einer familiären Form der dilatativen Kardiomyopathie (DCM) verantwortlich ist. Die DLD spielt als Teil von mitochondrialen Enzymkomplexen eine wichtige Rolle im Energie- und Aminosäurestoffwechsel der Zelle. Mutationen im DLD-Gen führen dabei meist zu neurologischen Syndromen mit Erscheinungsbildern wie mentaler Entwicklungsverzögerung, Krampfanfällen und spastischen Bewegungsstörungen. Fälle von Herzinsuffizienz und frühkindlicher Hypertropher Kardiomyopathie wurden ebenfalls beschrieben. Von den zahlreichen Gendefekten, die als Auslöser für die dilatative Kardiomyopathie bekannt sind, ist bisher noch keiner im Gen der DLD beschrieben worden. Vielmehr sind DCM-Mutationen in Genen zu finden, die für muskelspezifische Proteine kodieren. Dadurch führen sie oft zu einer Beeinflussung der Kraftübertragung im Sarkomer. Die durch die Arbeitsgruppe Zimmer beschriebene DLD-Mutation wurde in einer portugiesischen Großfamilie entdeckt, in welcher das Auftreten der dilatativen Kardiomyopathie über mehrere Generationen hinweg zu verfolgen ist. Ähnliche Fälle außerhalb dieser Familie sind nicht bekannt. Demnach gibt es keine Daten, die die Häufigkeit DCM-assoziierter Mutationen im Gen der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase beschreiben. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich damit weitere Zusammenhänge zwischen genetischen Alterationen im DLD-Gen und dem Auftreten einer DCM aufzudecken. In diesem Rahmen wurden DCM-Patienten, die erwiesenermaßen an einer familiären Form dieser Erkrankung leiden, gezielt auf Veränderungen in den Exons des DLD-Gens untersucht. Insgesamt wurden die Exons von 88 Patienten auf das Vorhandensein heterozygoter Mutationen überprüft. Hierfür wurden PCR-Produkte, die die jeweiligen Exons enthielten, mit Hilfe der Denaturing High-Performance Liquid Chromatography (DHPLC) untersucht. Diese Methode ermöglicht eine hochsensitive und gleichermaßen äußerst spezifische Detektion heterozygoter Mutationen. Auffällige Ergebnisse wurden anschließend mittels Sequenzierung verifiziert. Insgesamt wurden bei elf Patienten fünf unterschiedliche Mutationen nachgewiesen. Es handelte sich um vier bereits bekannte Einzelnukleotid-Polymorphismen und eine bisher nicht beschriebene Mutation. Dabei lagen vier Mutationen in nicht näher bezeichneten Intron-Bereichen, eine Mutation in einer 3‘ Spleißstelle und eine weitere Mutation in der 3‘ UTR (untranslated region) der mRNA. Somit befanden sich also einige Mutationen an für die Regulation der Genfunktion strategisch wichtigen Positionen. Da es sich dabei um bekannte Polymorphismen handelte, wurde mit Hilfe der Daten des HapMap Projekts überprüft, ob es bereits Hinweise für eine klinische Assoziation gab. Die Daten zeigten, dass bisher keiner der hier detektierten SNPs mit klinischen Erscheinungsbildern in Verbindung gebracht werden konnte. Es gab auch keine Hinweise dafür, dass die erfassten SNPs im Patientenkollektiv häufiger vorkamen als in der Normalbevölkerung. Einer der hier beschriebenen Mutationen war nicht in den verwendeten Datenbanken aufgeführt. Daher kann ein pathologischer Einfluss dieser Mutation zwar nicht ausgeschlossen werden, erscheint aber aufgrund ihrer Lage in einem weit vom Exon entfernten Intron-Bereich nicht offensichtlich. Es ließen sich also für keine der detektierten Mutationen pathogene Eigenschaften nachweisen. In Protein-kodierenden Sequenzbereichen konnten keine Mutationen nachgewiesen werden. Abschließend lässt sich also sagen, dass eine Assoziation zwischen Mutationen im DLD-Gen und dem Auftreten einer familiären DCM im Rahmen dieser Arbeit nicht bestätigt werden konnte. Es ist jedoch möglich, dass DCM-assoziierte Mutationen im DLD-Gen nur äußerst selten auftreten oder aber die durch die Arbeitsgruppe Zimmer detektierte Mutation im DLD-Gen die bisher einzige ist, die mit DCM in Verbindung gebracht werden kann. Um diese Frage zu klären müssen Untersuchungen mit größeren Patientenkollektiven angeschlossen werden.
Die Periodische Katatonie ist eine diagnostisch gut abgrenzbare Untergruppe der Schizophrenie mit besonders großer familiärer Belastung. Durch Kopplungsuntersuchungen konnte eine Kopplung der Erkrankung mit Chromosom 22q13 gezeigt werden. In der Zielregion befindet sich auch das MLC1-Gen (alternative Bezeichnungen WKL1 oder KIAA0027), für welches bereits eine Assoziation mit einer anderen erblichen Hirnerkrankung, der Megalenzephalen Leukoenzephalopathie mit subkortikalen Zysten (MLC), bekannt ist. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte nun eine Mutationsanalyse von MLC1 als Kandidatengen für die Periodische Katatonie am Material einer mehrfach betroffenen Großfamilie. Durch Verlängerung der bekannten partiellen cDNA-Sequenz von MLC1 mittels 5'-RACE ergab sich unter Annahme des von Nomura et al. (1994) beschriebenen offenen Leserasters ein 377 Aminosäuren großes Protein. Die Strukturanalyse des vorhergesagten MLC1-Proteins zeigt die größte Übereinstimmung für den humanen spannungsgesteuerten Kaliumkanal KCNA1. In der Vergangenheit konnte bereits bei anderen neurologischen Erkrankungen ein Zusammenhang mit veränderten Kaliumkanalproteinen nachgewiesen werden. In der bekannten genomischen DNA-Sequenz konnten 12 Exons annotiert werden. Bei der Sequenzierungsanalyse der codierenden Genabschnitte von MLC1 fand sich bei allen erkrankten Mitgliedern der untersuchten Multiplexfamilie ein heterozygoter Austausch von Cytosin zu Adenin an mRNA-Position 1121 (Gen-Bank Accession-Nummer AF319633). Diese Punktmutation führt zu einem Aminosäureaustausch von Leucin zu Methionin im MLC1-Protein. Bei einigen nicht erkrankten Familienmitgliedern ließ sich die veränderte DNA-Sequenz ebenfalls nachweisen, was jedoch durch eine unvollständige Krankheitspenetranz oder einen späteren Erkrankungszeitpunkt begründet sein könnte. In einem Kontrollkollektiv von 327 Probanden aus der Normalbevölkerung sowie bei je einem erkrankten Mitglied von drei anderen mehrfach von periodischer Katatonie betroffenen Familien konnte die Missense-Mutation nicht gefunden werden. In dieser Arbeit wurde die Assoziation einer sinnverändernden Mutation im MLC1-Gen mit dem Auftreten von periodischer Katatonie in einer mehrfach betroffenen Familie gezeigt. Die Aufklärung der Funktion von MLC1 verspricht somit wichtige Erkenntnisse zur Ätiopathogenese sowohl der Megalenzephalen Leukoenzephalopathie mit subkortikalen Zysten als auch der Periodischen Katatonie.