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Wasserstoffbrückengesteuerte Ausrichtung von Merocyaninfarbstoffen für photorefraktive Materialien
(2008)
Merocyaninchromophore spielen eine herausragende Rolle bei der Entwicklung von photorefraktiven Materialien für Anwendungen in der Holographie. Der photorefraktive Effekt beruht auf einer Orientierung der dipolaren Merocyanine in einem elektrischen Feld. Diese können umso effektiver ausgerichtet werden, je größer ihr Dipolmoment ist. Folglich sollten Merocyanine mit sehr großen Dipolmomenten den gewünschten Effekt hervorbringen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass solche Merocyanine Dimere mit antiparalleler zentrosymmetrischer Struktur bilden. In dieser Anordnung addieren sich die Dipolmomente destruktiv, so dass die dipolare Eigenschaft des Materials verloren geht. In dieser Arbeit ist es gelungen, Merocyanine über sechsfache Wasserstoffbrückenbindungen zu supramolekularen Strukturen mit großen resultierenden Dipolmomenten zu assoziieren. Diese Komplexe werden in schwach polaren Lösungsmitteln sogar bei sehr niedrigen Farbstoffkonzentrationen gebildet.
Obwohl eine wirksame Schutzimpfung verfügbar ist, sind Masern noch immer weltweit verbreitet. Mit etwa 750.000 Todesfällen jährlich gehören sie zu den gefährlichsten Infektionskrankheiten im Kindesalter überhaupt. Nicht allein wegen der masernvirusinduzierten Immunsuppression treten sekundäre bakterielle Infektionen, darunter Otitiden oder Pneumonien, gehäuft auf. Eine Beteiligung des zentralen Nervensystems kann zur akuten postinfektiösen Masernenzephalitis (APME), die meist mit einer hohen Defektheilungsrate einhergeht, oder zur letal verlaufenden subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) führen. Besonders gefürchtet sind die schweren Komplikationen der Riesenzellpneumonie oder der measles inclusion body encephalitis (MIBE) bei immunsupprimierten Patienten. Viele pathogenetische Aspekte und pathophysiologische Vorgänge sind dabei noch nicht gänzlich verstanden. Vaskuläre Endothelzellen sind neben Epithelzellen, Monozyten und Makrophagen sowie Lymphozyten als wichtige Zielzellen für das Masernvirus bei der Ausbreitung der Masernvirusinfektion und Entstehung ihrer Komplikationen anzusehen. In immunhistochemisch aufbereiteten pathologischen Schnittpräparaten wurden in infizierten und stark entzündlich veränderten Arealen immer wieder infizierte Gefäßendothelzellen gefunden. Eine systematische Untersuchung der Interaktion von Masernviren mit humanen Gefäßendothelzellen in vitro lag allerdings bislang nicht vor. Das Ziel dieser Dissertation war es nun, die Interaktion von attenuierten und virulenten Masernvirusstämmen mit humanen Gefäßendothelzellen grundlegend und systematisch zu untersuchen und eine Basis für die Definition pathogenetisch bedeutsamer molekularer Mechanismen zu schaffen. Hierfür wurde mit primären Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene (HUVEC) und einer humanen mikrovaskulären Hirnendothelzelllinie (HBMEC) ein rein humanes Zellkulturmodell gewählt und unter Verwendung attenuierter und virulenter Masernvirusstämme den natürlichen Bedingungen Rechnung getragen. Als essentielle Grundlage für die Untersuchungsreihen wurden die Endothelzellen auf endothelzellspezifische Markermoleküle hin untersucht und charakterisiert. Einzig die Oberflächenproteine membrane cofactor protein (MCP oder CD46) und signaling lymphocytic activation molecule (SLAM oder CD150) sind bislang als zelluläre Rezeptoren für das Masernvirus identifiziert worden. Es konnte hier eindeutig nachgewiesen werden, dass HUVEC und HBMEC auf verschiedenen zellulären Ebenen konstitutiv CD46, nicht aber SLAM exprimieren. Weder eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien, noch der Kontakt der Endothelzellen mit inaktivierten Masernviren vermochte eine Expression von SLAM zu induzieren, obwohl eine Expression von toll-like receptor 2 (TLR2) klar aufgezeigt werden konnte. Es konnte hier ebenfalls belegt werden, dass sowohl der attenuierte Masernvirusstamm Edmonston (Edm) als auch die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 Endothelzellen infizieren und eine morphologische Zellalteration mit Ausbildung eines zytopathischen Effekts hervorrufen können. Weitere Analysen zeigten für Edm und Wü4797 ein enormes Infektionsausmaß und eine sehr gute Ausbreitungseffizienz, die durch die Anwesenheit CD46-spezifischer Antikörper nur bei Edm klar reduziert werden konnte. Eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien trug keinen eindeutigen begünstigenden oder hemmenden Effekt auf die Masernvirusinfektion mit sich, Interferon-α und -γ schienen das Infektionsausmaß abzuschwächen. Folgeversuche zur Rezeptormodulation durch Masernviren deuten darauf hin, dass CD46 nur für den attenuierten Masernvirusstamm Edm, nicht aber für die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 als zellulärer Rezeptor fungiert. Die Ergebnisse dieser Dissertation belegen eine von den beiden Masernvirusrezeptoren CD46 und SLAM unabhängige Infektion humaner vaskulärer Endothelzellen mit Masernviruswildtypstämmen. Diese Beobachtungen lassen einen weiteren, bislang noch nicht bekannten zellulären Rezeptor oder einen von einem zellulären Rezeptor unabhängigen Aufnahme- und Ausbreitungsmechanismus bei Gefäßendothelzellen vermuten. Es darf weiterhin als sicher angesehen werden, dass Endothelzellen in der Pathogenese von masernvirusinduzierten Komplikationen, sei es direkt oder indirekt, involviert sind.
Klassischerweise ist der Aldosteron-gebundene MR an der Regulation des Blutdruckes und des Wasser-Elektrolyt-Haushaltes beteiligt. Neuere klinische Studien zeigen allerdings, dass Aldosteron auch an pathophysiologischen Remodelingprozessen im kardiovaskulären und renalen System mitwirkt. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind noch weitgehend unbekannt. Der EGFR ist ein Wachstumsfaktor und heterologer Signaltransduktor für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren von beispielsweise Angiotensin II, Phenylephrin und Endothelin-1. In der Literatur gibt es Hinweise für eine Interaktion zwischen den Signaltransduktionswegen von Aldosteron/MR und EGFR. So können Mineralocorticoide nach zerebraler Ischämie zu einem vermehrten vaskulären Remodeling und einem Anstieg der EGFR-mRNA-Konzentration führen und außerdem eine EGF-induzierte Vasokonstriktion verstärken. Daher wäre eine mögliche Erklärung für die pathophysiologische Wirkung von Aldosteron eine Induktion der EGFR-Expression mit vermehrter Wirksamkeit von vasoaktiven Peptiden. Um diese Hypothese zu überprüfen untersuchten wir in verschiedenen Modellsystemen, ob Aldosteron die EGFR-Proteinexpression erhöht. Dies war sowohl im heterologen CHO-Expressionsystem also auch in MR-exprimierenden Zelllinien und Primärkulturen der Fall. Auch in adrenalektomierten Ratten mit osmotischen Minipumpen bestätigte sich die Aldosteron-induzierte EGFR-Expression in der Aorta, im linken Herzen und der Niere. Über den eng verwandten Glucocorticoidrezeptor ließ sich keine EGFR-Expressionssteigerung auslösen, so dass es sich um einen MR-spezifischen Effekt handelt. Zur Charakterisierung des zugrundeliegenden molekularen Mechanismus, der besonders für therapeutische Interventionen von Interesse ist, wurde die Promotoraktivität des EGFR untersucht. Es zeigte sich bei Aldosteroninkubation eine gesteigerte EGFR-Promotoraktivität im Reporter-Gen-Assay. Die beteiligten Promotoranteile konnten mit Deletionskonstrukten auf zwei DNA-Fragmente eingegrenzt werden. Von Seiten des MR ist die A/B-Domäne für die Interaktion bedeutend, denn ein trunkierter MR mit den Domänen C, D, E und F genügt nicht, um den EGFR-Promoter vollständig zu aktivieren. Um Hinweise für die physiologische und pathophysiologische Bedeutung der Interaktion zwischen MR und EGFR zu erhalten, untersuchten wir sowohl den Einfluß auf die Bildung von Extrazellulärmatrix in glatten Gefäßmuskelzellen als auch auf die Natriumresorption im Sammelrohr der Niere. Als Anhaltspunkt für die vermehrte Bildung von extrazellulärer Matrix wie sie bei Remodelingprozessen vorkommt, quantifizierten wir die Fibronektinsekretion in glatten Muskelzellen der humanen Aorta (HAoSMC). Nach Aldosteroninkubation und besonders bei Koinkubation mit EGF zeigte sich eine vermehrte Fibronektinsekretion ins Medium, die sich durch Hemmer der EGFR-Kaskade normalisieren ließ. Dies unterstützt die Hypothese, dass die Aldosteron-EGFR-Interaktion an der Entstehung von Remodelingprozessen im kardiovaskulären und renalen System beteiligt ist. Neben einem Einfluss auf die Entstehung pathophysiologischer Prozesse im kardiovaskulären und renalen System kommt es über eine Aldosteron-induzierte EGFR-Expression im Sammelrohr der Niere auch zu physiologischen Effekten, nämlich einer Hemmung der Natriumresorption. Diese wirkt der klassischerweise durch Aldosteron vermittelten vermehrten Natriumresoprtion über den epithelialen Natriumkanal (ENaC) entgegen und könnte daher als negative Feedbackschleife Dauer und Ausmaß der Aldosteron-induzierten Natriumresorption limitieren. Zusätzlich zu den klassischen genomischen Wirkungen zeigen Steroide nicht-genotrope Effekte. Beim Aldosteron führen diese MR- und EGFR-vermittelt zu einer Aktivierung der ERK1/2- und JNK-1/2-Kinasen. Die nicht-genotrope Aldosteron-induzierte ERK-Aktivierung ist ferner durch c-Src-Inhibitoren hemmbar und führt zu einer Stimulation der Kerntranslokation des MR. Nicht-genotrope Effekte können folglich unter Beteiligung der EGFR-Signalkaskade die genomischen modulieren. Aldosteron führt ebenfalls zu einem Anstieg der zytosolischen Calciumkonzentration, allerdings ist dieser Effekt unabhängig vom MR. Hieraus folgt, dass die nicht-genotropen Effekte teilweise MR-vermittelt und teilweise MR-unabhängig sind. Insgesamt konnte also auf verschiedenen Ebenen eine Interaktion zwischen Aldosteron/MR und der EGFR-Signalkaskade gezeigt werden, mit Hinweisen für eine Bedeutung bei sowohl physiologischen als auch pathophysiologische Vorgängen.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung von künstlichen Rezeptoren für biologisch relevante Oligopeptide und besteht aus drei Teilen. Im ersten Teil wurde auf der Basis von computergestützten de novo Berechnungen ein künstlicher Rezeptor für den D-Alanin-D-Alanin-C-Terminus entwickelt. Diese Peptidsequenz befindet sich in bakteriellen Zellwänden und nimmt eine Schlüsselfunktion in der Wirkungsweise des Antibiotikums Vancomycin ein. Zur Entwicklung dieses Rezeptors wurde ein Guanidiniocarbonylpyrrol als Bindungsmotiv für Carboxylate mit einer Cyclotribenzylen-Einheit verknüpft. Letztere ist entsprechend der theoretischen Berechnungen in der Lage, die Methylreste des Alanins größenselektiv durch hydrophobe Wechselwirkungen zu koordinieren. Dieser Rezeptor wurde in umfangreichen Bindungsstudien bezüglich seiner Affinität in Wasser und seiner Substratselektivität untersucht. Zur Erhöhung der Löslichkeit und zur Bestimmung der Komplexstruktur mit NMR-Techniken in Wasser wurde ein weiteres Derivat des Rezeptors synthetisiert, welches in peripherer Position mit Triethylenglykolseitenketten substituiert ist. Auf diese Weise gelang es, einen hoch affinen (log K = 4,7) und hoch selektiven künstlichen Rezeptor für den D-Ala-D-Ala-Terminus darzustellen und umfassend zu charakterisieren. So konnte gezeigt werden, dass ein de novo Design derartiger Rezeptoren prinzipiell möglich ist. In einem weiteren Teilprojekt wurde ein künstlicher Rezeptor für die interne RGD-Peptidsequenz entwickelt. Diese nimmt eine zentrale Funktion in Zell-Zell- und Zell-Matrix-Erkennungsprozessen ein. Dieses Teilprojekt wurde in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Schrader (Universität Marburg) durchgeführt. Dazu wurde ein Bindungsmotiv für Alkylguanidine (in der Seitenkette von Arg, R) über einen geeigneten Spacer mit einem Bindungsmotiv für Carboxylate (in der Seitenkette von Asp, D) verknüpft. Nach der Synthese und Charakterisierung einer Reihe von vier Rezeptoren konnte die grundsätzliche Anwendbarkeit dieses Ansatzes bestätigt werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass der verwendete Spacer für die Effektivität der Koordinierung von besonderer Bedeutung ist. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde in einem dritten Teilprojekt ein kombinatorisches Festphasenprotokoll zur Optimierung derartiger Spacer entwickelt. Dabei wurde das Carboxylat-Bindungsmotiv (ein Guanidiniocarbonylpyrrol) auf einem polymeren Träger immobilisiert. Zu diesem Zweck wurden umfangreiche Studien zur Synthese von Pyrrol-Tricarboxylaten und zur Verwendung verschiedener Schutzgruppen unternommen. Die Eigenschaften von drei Schutzgruppen unterschiedlicher Sensitivität (basisch, stark sauer und photolytisch spaltbar) auf dem Acylguanidin wurden in Lösung und an der festen Phase untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein umfangreiches HPLC-Protokoll zur Charakterisierung der Reaktion entwickelt. So gelang die Entwicklung und Etablierung eines universell einsetzbaren Protokolls zur Optimierung derartiger Rezeptoren, womit zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten in der kombinatorischen Chemie aber auch in weiteren Teilbereichen wie der Katalyse oder der Chromatographie ermöglicht werden.
Localization of BMP receptors in distinct plasma membrane domains and its impact on BMP signaling
(2006)
Endocytosis of growth factor receptors plays an important role in the activation and propagation as well as the attenuation of signaling pathways. Its malfunctioning can cause several pathologies, e.g. by controlling the level of receptors at the cell surface. BMPs are members of the TGF-ß superfamily and are involved in the regulation of proliferation, differentiation, chemotaxis and apoptosis. BMP signaling is initiated at two types of transmembrane serine/threonine kinases, BRI and BRII. BMP receptor activation occurs upon ligand binding to preformed complexes (PFCs) or BMP2-induced signaling complexes (BISCs) composed of BRI and BRII. Binding of BMP2 to PFCs results in activation of the Smad pathway, whereas BISCs initiate the activation of Smad-independent pathways via p38 resulting in the induction of Alkaline phosphatase (ALP). BMP receptor endocytosis has not been extensively studied and the potential role of localization to different regions of the plasma membrane in determining the signaling pathways activated by PFCs and BISCs was not explored so far. In the present work, the localization of BMP receptors in distinct membrane domains and the consequential impact on BMP signaling were investigated. By separating detergent-resistant membranes (DRMs) from cell lysates and subsequent gradient ultracentrifugation, it could be demonstrated that BRI and BRII cofractionate with cav-1, the marker protein of caveolae. Moreover, both receptor types interacted with cav-1 and showed a partially colocalization with cav-1 at the plasma membrane. Although these results point to a caveolar localization, BMP receptors cofractionated also with DRMs in cells exhibiting no caveolae, suggesting an additional non-caveolar raft localization. Beyond that, BRII could also be localized to clathrin-coated pits (CCPs) by means of immuno-electronmicroscopy studies. The second part of this thesis demonstrated that both membrane regions influence BMP signaling in distinct ways. Smad1/5 was shown to be phosphorylated independently of endocytic events at the cell surface. On the one hand, disruption of DRM regions by cholesterol depletion inhibited specifically BMP2-mediated ALP production, while Smad signaling was unaffected. On the other hand, inhibition of clathrin-mediated endocytosis by specific inhibitors affected BMP2-induced Smad signaling as well as the induction of ALP, suggesting that both Smad-dependent and Smad-independent signaling pathways are required for BMP2 induced ALP production. These findings propose an important regulatory impact of different endocytic routes and membrane regions on BMP signaling as well as that a distinct membrane localization of BMP receptors account for specific signaling properties initiated at PFCs or BISCs.
Eine molekulare Fliegenfalle zur Erkennung von biologisch relevanten (poly)-anionischen Substraten
(2006)
Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein multivalenter Rezeptor auf Basis von Guanidiniocarbonylpyrrolen zur Komplexierung von biologisch relevanten (poly)- anionischen Substraten wie Citrat, Malat und Tatrat dargestellt werden. Der Rezeptor bindet Citrat selbst in Gegenwart eines 1000fachen Überschusses an NaCl und einem 10fachen Überschuss an Bis-tris Puffer mit einer hohen Bindungskonstante von KAss = 86000 M-1 in Wasser. Wenn man Rezeptoren auf Metall- und Boronsäurebasis nicht berücksichtigt, handelt es sich nach meinem Wissen um den besten Citrat-Rezeptor, der in der Literatur bisher publiziert ist. Außerdem zeigt der Rezeptor mit einem Faktor von mindestens 8 eine hohe Selektivität für Citrat gegenüber anderen biologisch relevanten Dicarboxylaten wie Malat und Tatrat. Mithilfe von Bindungsstudien und Molecular Modeling Rechnungen konnte hergeleitet werden, welchen Einfluss die verschiedenen nicht-kovalenten Wechselwirkungen auf die Bindungskonstante haben. Dabei konnte gezeigt werden, dass Flexibilität, Hydroxy-Funktionen, pi-Stacking und Symmetrie bei den Substraten Einfluss auf die Bindungskonstanten zeigen, wobei vor allem die unpolaren Wechselwirkungen und die zusätzliche Hydroxy-Funktionen einen hohen Anteil an der Bindung zu haben scheinen. Neben der selektiven Erkennung von Citrat durch den Rezeptor konnte zusätzlich ein Sensorsystem mit Carboxyfluorescein auf Basis eines indicator displacement assays entwickelt werden, mit dem die Anwesenheit von Citrat im Gegensatz zu anderen Carboxylaten mit dem bloßen Auge (naked eye) erkannt werden kann. Neben den Polycarboxylaten zeigt der Rezeptor außerdem noch hohe Bindungskonstanten für polyanionische Zucker. So konnten z.B. für Glucophosphate mit UV-Spektroskopie Bindungskonstanten von KAss = ca. 20000 M-1 in dem sehr polaren Lösemittelgemisch 10 % DMSO/Wasser (pH = 4, Acetat-Puffer) gefunden werden.
Eine Infektion durch das ausschließlich human-spezifische Pathogen Neisseria gonorrhoeae manifestiert sich bei einer symptomatischen Kolonisierung in der sog. Gonorrhö, einer venerischen Erkrankung, die durch akute Inflammation des befallenen Gewebes und durch die massive Infiltration von Granulozyten charakterisiert ist. Die Gonokokken können im Verlauf einer symptomatischen Infektion über ihre OpaCEA-Adhäsine mit CEACAM Proteinen unterschiedlicher Wirtszellen interagieren. In der vorliegenden Doktorarbeit sollten anhand verschiedener zellbiologischer, biochemischer und genetischer Methoden die molekularen Vorgänge während der OpaCEA-Gonokokken-Phagozyten-Interaktion untersucht werden. Der Kontakt von OpaCEA-Gonokokken mit primären Granulozyten induziert die Formation von Lamellipodien-ähnlichen Membranausstülpungen und führt zur CEACAM-abhängigen Phagozytose der OpaCEA Gonokokken. Schon in früheren in vitro Versuchen konnte die Reorganisation des Zytoskeletts und die Opsonin-unabhängige, CEACAM-vermittelte Aufnahme OpaCEA-exprimierender Gonokokken in differenzierte promyelomonzytären Zellen und Granulozyten mit der Stimulation von Kinasen der Src-Familie und der GTPase Rac in Verbindung gebracht werden. Erste in vitro Infektionsversuche mit CEACAM-exprimierenden 293 Zellen, in denen pharmakologische oder genetische Inhibitoren gegen Kinasen der Src-Familie eingesetzt wurden, deuteten darauf hin, dass ausschließlich die CEACAM3-vermittelte Internalisierung der Gonokokken die katalytische Aktivität von Kinasen der Src-Familie benötigt. Dies konnte auch in CEACAM3-exprimierenden, Src-Kinase defizienten Maus-Fibroblasten bestätigt werden, da nur c-Src rekonstituierte Zellen OpaCEA Gonokokken internalisieren. Die Adhäsion der OpaCEA Gonokokken an CEACAM3 induziert eine Src-abhängige Tyrosinphosphorylierung der zytoplasmatischen CEACAM3-Domäne und die Kinase selbst kann über ihre SH2-Domäne direkt an das phosphorylierte CEACAM3 binden. Auch die Stimulation der GTPase Rac verläuft über das CEACAM3 Protein, da die Expression einer dominant negativen Version der Rho GTPase ausschließlich mit der CEACAM3-, aber nicht mit der CEACAM6-abhängigen Internalisierung der OpaCEA Gonokokken interferiert. Zudem induziert nur die CEACAM3-vermittelte Aufnahme die Rekrutierung und GTP-Beladung des endogenen Rac. Eine zentrale Rolle dabei spielt die Integrität der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3. Die Mutation beider Tyrosinreste innerhalb der ITAM-ähnlichen Sequenz oder die komplette Deletion der zytoplasmatischen Domäne inhibieren die CEACAM3-vermittelte Rac-Stimulation und blockieren die Internalisierung der OpaCEA Gonokokken. Aber nicht nur OpaCEA Gonokokken interagieren mit CEACAM3, sondern auch die CEACAM-bindenden Adhäsine von Moraxella catarrhalis und Haemophilus influenzae führen zur Rac-Stimulation und damit zur Internalisierung der Pathogene. Im letzten Teil der Arbeit konnte das molekulare Bindeglied zwischen der CEACAM3-induzierten Signalkaskade und der Stimulation der kleinen GTPase Rac identifiziert werden. Das Vav Protein fungiert dabei als GEF für die kleine GTPase Rac. Eine dominant negative Version von Vav oder eine spezifische Vav-siRNA inhibieren die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von OpaCEA-Gonokokken bzw. die GTP-Beladung von Rac. Interessanterweise bindet das Vav Protein über seine SH2 Domäne direkt an CEACAM3 und zwar nach Phosphorylierung durch aktive Src Kinasen an den Tyrosinrest 230 der ITAM-ähnlichen Sequenz. Die distinkte CEACAM3-induzierte Signalkaskade erlaubt es, die Bedeutung von CEACAM3 für die Phagozytose CEACAM-bindender Pathogene auch in primären Granulozyten zu untersuchen. Interessanterweise inhibiert PP2 die Aufnahme der Gonokokken dosisabhängig, wohingegen die Blockade der CEACAM1- bzw. CEACAM6-vermittelten Internalisierung der Gonokokken durch Nystatin keine Auswirkungen zeigt. Auch die Proteintransduktion der dominant-negativen Version von Vav (TAT-Vav-dn) bzw. Rac (TAT-Rac-dn) in primäre Granulozyten interferierte effektiv mit der Phagozytose der OpaCEA Gonokokken. Dementsprechend verhindert ausschließlich die Blockade der CEACAM3-vermittelten Phagozytose, aber nicht der CEACAM1- bzw.CEACAM6-vermittelten Aufnahme durch monoklonale Antikörper die Internalisierung bzw. die Elimination von CEACAM-bindenden Pathogenen. Diese Arbeiten beschreiben das exklusiv auf Granulozyten exprimierte CEACAM3 Protein als einen neuen gegen CEACAM-bindende Erreger gerichteten phagozytischen Rezeptor der angeborenen Immunantwort.
In der vorliegenden Dissertation gelang es, die strukturellen und molekularen Determinanten der PTH-Rezeptoren für die Ankopplung an intrazelluläre Signalwege näher zu charakterisieren. Die Regulation des Kalzium-, Phosphat- und Knochenstoffwechsels wird zum erheblichen Teil über den PTH1-Rezeptor (P1R) vermittelt. Parathormon (PTH) aktiviert am P1R mindestens zwei Signalwege: den durch zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) vermittelten Weg und den Phospholipase C-Signalweg (PLC). Der nahe verwandte PTH2-Rezeptor (P2R) kann außer durch PTH auch über das tuberoinfundibiläre Peptid (TIP39) aktiviert werden. Jedoch besitzt dieser Rezeptor keine Ankopplung an den PLC-Signalweg. Zur Aufklärung der strukturellen und molekularen Determinaten der intrazellulären Signalwegankopplung wurden verschiedene Versuchsansätze ausgewählt, die eine Untergliederung dieser Arbeit in drei Teilprojekte ermöglicht: 1) Die PTH-Rezeptoren sind wichtige Vertreter der Klasse II der G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der siebten Transmembrandomäne dieser Klasse zeigt ein hoch konserviertes, cytosolnahes „YCFXN“-Motiv in diesem Bereich. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte durch Punktmutationen der einzelnen Aminosäuren dieses Motivs gezeigt werden, dass dieser Abschnitt eine entscheidende Determinierungsregion dieser Rezeptorfamilie sowohl für die Ankopplung an den cAMP-Weg, als auch an den PLC-Signalweg darstellt. Die Untersuchungen legen die Vermutung nahe, dass dieser Bereich für die Stabilisierung der Konformation dieser Rezeptoren von großer Bedeutung ist. 2) In einem zweiten Abschnitt dieser Arbeit wurde durch stufenweise Angleichung des P2R an den P1R eine Reihe von funktionell exprimierten P2R/P1R Hybridrezeptoren hergestellt, die eine Übereinstimmung des intrazellulären Bereichs des P1R von bis zu 95 % erreichen. Der Nachweis des PLC-Signalwegs durch die Bestimmung der akkumulierten Gesamtinositolphosphate und des intrazellulären Kalziums zeigte eindrucksvoll, dass trotz einer weitgehenden intrazellulären Übereinstimmung der Aminosäuresequenz des P2R mit dem P1R die Eigenschaft des P1R an den PLC-Signalweg zu koppeln nicht auf den P2R übertragen werden kann. Dies legt nahe, dass auch extrazelluläre Bereiche und Transmembranabschnitte die Ankopplung an intrazelluläre Signalwege steuern. Im Weiteren konnte für den cAMP-Signalweg durch diese Hybridrezeptoren gezeigt werden, dass im Kontext des P2R eingefügte Teilabschnitte des P1R (C-Terminus, zweite und dritte intrazelluläre Schleife ) zusammenwirken und eine effizientere Ankopplung an den cAMP-Weg ermöglichen. Weiterführende Untersuchungen der Membrantranslokation von beta Arrestin2 mit einer anschließenden Internalisierung des Rezeptors zeigten, dass sowohl der P2R als auch die hiervon abgeleiteten Hybridrezeptoren selektiv durch Stimulation mit TIP39, nicht jedoch nach einer Stimulation mit PTH, eine Translokation bewirken. Dieses Ereignis ist von den untersuchten Signalwegen (cAMP-, PLC- und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-Signalweg) unabhängig. Erstmals wurde hier gezeigt, dass der P2R eine Phosphorilierung von MAPK bewirkt, wobei hierfür einer beta-Arrestin2 Translokation nicht notwendig ist. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass der PTH-Rezeptor in unterschiedlichen Rezeptorkonformationen existiert, so dass einzelne Rezeptorabschnitte unabhängig voneinander verschiedene Signale aktivieren können. 3) Der letzte Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Identifikation von intrazellulären Interaktionspartnern des humanen P1R. Neue Protein–Interaktionen mit dem humanen P1R wurden mit einem „Yeast-two-Hybrid“ System identifiziert. Mit Hilfe dieser Methode konnte, als ein potentiell bedeutender intrazellulärer Interaktionspartner des humanen P1R, das PDZ-Protein PDZK1 identifiziert werden. Es gelang mit Hilfe von Koimmunpräzipitations-Experimenten und von GST-pull-down-Assays die Interaktion von PDZK1 mit dem P1R zu verifizieren. PDZK1 bindet an eine Liganden-Bindungsdomäne innerhalb des C-terminalen Abschnitts des P1R, vermutlich an die letzten vier Aminosäuren. Durch einen Hefe-Interaktionstest konnte von den vier in diesem Protein vorkommenden PDZ-Domänen die PDZ1-Domäne als einzige selektiv mit dem P1R interagierende Domäne identifiziert werden. In der Niere interagiert PDZK1 über die PDZ3-Domäne mit dem Na/Pi-Transporter IIa. Eine attraktive Hypothese ist daher die Funktion von PDZK1 als einem Bindeglied zwischem dem Rezeptor und dem Transporter und die damit einhergehende PTH- vermittelte Regulation des Phosphattransports in der Niere. Diese Hypothese bedarf aber nochweiterer funktioneller Analysen (z.B. durch Untersuchungen an PDZK1 Knock-Out Mäusen).
In der vorliegenden Arbeit werden Studien zur Identifizierung und Charakterisierung von Lebensmittelinhaltsstoffen als natürliche Liganden des Ah Rezeptors („aryl hydrocarbon receptor“) vorgestellt. Der Ah Rezeptor ist ein liganden-abhängiger Transkriptionsfaktor, der an der Expression zahlreicher Metabolismusenzyme beteiligt ist. Im Mittelpunkt unserer Untersuchungen anhand von funktionellen AhR-abhängigen Bioassays stand die Klasse der ß-Carboline und ihrer Derivate, deren natürliches Vorkommen bereits in zahlreichen Lebensmitteln und im menschlichen Organismus beschrieben ist. Die ß-Carboline wurden für die Untersuchung auf ihr mögliches AhR Ligandenpotential ausgewählt, da sie von der Aminosäure Tryptophan abgeleitet sind, die selbst als schwacher AhR Agonist identifiziert wurde, und weil das trizyklische 9H-Pyridol[3,4-b]-Ringsystem der ß-Carboline eine strukturelle Ähnlichkeit zum prototypischen AhR Liganden 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) aufweist. Die Schwerpunkte der Untersuchungen zur AhR Ligandenaktivität von ß-Carbolinen lagen auf den Aspekten: 1) Etablierung von rekombinanten, zellbasierten funktionellen Reportergenassays; 2) Identifizierung und Charakterisierung von ß-Carbolinderivaten als Liganden des Ah Rezeptors mittels funktioneller Reportergenassays; 3) Charakterisierung mechanistischer Aspekte im AhR vermittelten Signaltransduktionsweg mittels in vitro und ex vivo Gelretardation Assays am Beispiel ausgewählter ß-Carbolinderivate mit AhR Ligandenaktivität und 4) Beschreibung der AhR Ligandenaktivität von Soja- und Würzsaucen als Modellsysteme für komplexe natürliche Lebensmittel.
Somatostatin ist ein regulatorisches Peptid, das eine Vielzahl von biologischen Prozessen innerhalb des Körpers beeinflußt. Die Wirkung von Somatostatin wird auf zellulärer Ebene über eine Familie von fünf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren vermittelt, die entweder in G Protein-abhängiger Weise oder vermutlich auch über andere interagierende intrazelluläre Proteine auf nachgeschaltete Signaltransduktionswege wirken. Der Somatostatinrezeptor Subtyp 4 (SSTR4) wird hauptsächlich im Gehirn exprimiert und wirkt dort inhibierend auf die exzitatorische Signalweiterleitung. Es sind aber auch stimulierende Effekte des SSTR4 bekannt. Um das subtypspezifische Signalverhalten des SSTR4 weiter zu untersuchen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Proteine gesucht, die intrazellulär mit dem SSTR4 interagieren und so seine physiologischen Effekte beeinflussen. In einem ersten Ansatz konnten drei mögli-che Interaktionspartner mit Hilfe des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems identifiziert werden, die aber in nachfolgenden Untersuchungen als unpezifisch eingestuft wurden. Mit Hilfe einer Affinitätschromatografie wurden dann zwei Proteine identifiziert, die spezifisch mit dem SSTR4 interagieren. Sowohl PSD-95 als auch PSD-93 (Postsynaptic density protein of 95 kDa bzw. 93kDa) wurden mit einem immobilisierten Peptid präzipitiert, das die neun C-terminalen Aminosäuren des SSTR4 enthält. Die Interaktion des SSTR4 mit PSD 95 wurde im Weiteren näher charakterisiert. In einem Bindungsexperiment mit rekombinaten Proteinen konnte gezeigt werden, dass die Interaktion durch die 1. und 2. PDZ-Domäne von PSD-95 vermittelt wird. In humanen embryonalen Nieren-Zellen (HEK293), die den SSTR4 stabil exprimieren, konnte PSD-95 mit dem Rezeptor koimmunpräzipitiert werden. Nach Koexpression von PSD-95 und SSTR4 findet man eine partielle Kolokalisierung beider Proteine an der Zellmembran, wobei aber der Großteil des PSD-95 weiterhin eine diffuse zytoplasmatische Verteilung zeigt. Die Interaktion wurde in vivo sowohl immunhistochemisch in kultivierten Hippocampus-Neuronen als auch durch Koimmunpräzipitation beider Proteine aus Rattengehirn-Lysaten nachgewiesen. Die Interaktion von PSD-95 mit dem SSTR4 beeinflußt weder die Agonisten-induzierte Internalisierung des Rezeptors in HEK293-Zellen, noch die Kopplung des Rezeptors an einen G-Protein-gekoppelten einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanal in Oozyten des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis. Durch die Interaktion mit PSD-95 wird der SSTR4 in physikalische Nähe zu bestimmten Zielproteinen gebracht, über die nachfolgend die Somatostatineffekte weitervermittelt werden. So ermöglicht die Interaktion vermutlich eine Integration des SSTR4 in den postsynaptischen Komplex aus PSD-95 und Glutamatrezeptoren, wo der SSTR4 die bereits beschrieben regulatorischen Effekte auf die Glutamat-vermittelte exzitatorische Signaltransduktion ausüben kann.