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Stachys officinalis galt von der Antike bis zur frühen Neuzeit als wichtiges Phy-topharmakon. Zu den bedeutendsten Indikationen zählen die Anwendung bei Er-krankungen der Atemwege, des Gastrointestinaltrakts, der Harnwege und der Ein-satz als Analgetikum bei Schmerzen verschiedenster Art. Über den Zeitraum von fast 1800 Jahren zählte die Pflanze fest zum Arzneischatz. Erst Ende des 18. Jahrhunderts nahm ihre Bedeutung als Arzneimittel ab. Mit dem Beginn des 20. Jahrhundert verschwand sie fast vollständig aus der Phytotherapie. Heute wird sie nur noch selten im Bereich der homöopathischen Medizin oder volksheilkundlich eingesetzt. In der vorliegenden Arbeit wird Stachys officinalis durch ihre 2000 jährige Ge-schichte als Arzneipflanze begleitet. Dabei werden die Indikationen verschiedener Quellen mit aktuellem pharmazeutischem Wissen verglichen und beurteilt. Durch diese Auswertung wird geklärt, ob die jeweiligen Indikationsnennungen pharma-zeutisch nachvollziehbar sind oder nicht. Als Vergleichsweke dienen Hagers En-zyklopädie der Arzneistoffe und Drogen´ und Dr. Duke´s Phytochemical and Ethnobotanical Databases´. , Die inhaltsstoffbezogenen Angaben dieser Wer-ke werden durch weitere aktuelle pharmazeutische Erkenntnisse über die phar-makologischen Eigenschaften der Pflanzeninhaltsstoffe von Stachys officinalis ergänzt. Auf Grundlage der zugeordneten Pflanzeninhaltsstoffe und ihrer individu-ellen Wirkungen wird die Plausibilität der Indikationsangaben der Quellen unter-sucht. Im Rahmen dieser Arbeit werden die Indikationsnennungen von 34 Kräuterbü-chern, Lexika und anderer Quellen betrachtet. Dabei werden die vielfältigen Indi-kationsnennungen zu 142 normierten Indikationen zusammengefasst und ausge-wertet. Unter Berücksichtigung der Angaben beider oben genannter Vergleichs-werke erscheinen 59% der 142 normierten Indikationen für Stachys officinalis plausibel und sind mit der Anwesenheit definierter Pflanzeninhaltsstoffe zu erklä-ren. Es wird deutlich, dass viele Nennungen Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes, der Atemwege und der Leber betreffen. Die analgetischen Indikationsangaben sind wenig einheitlich, betreffen aber häufig Schmerzen des Kopfes und des Be-wegungsapparats. Zusammengefasst haben die verschiedenen analgetischen Indikationsangaben allerdings einen bemerkenswert hohen Anteil von 11% an den insgesamt 801 Indikationsnennungen. Die vorliegende Arbeit gibt 13 Hauptindikationen für Stachys officinalis an. Diese sind mit Ausnahme der Indikationen Bei Milzerkrankungen´ und Bei Epilepsie´ durch die Wirkungen benannter Pflanzeninhaltsstoffe nachzuvollziehen und phar-mazeutisch plausibel. Es gelingt, aus der Fülle der Indikationsnennungen der his-torischen Quellen die meistgenannten belegbaren Anwendungen hervorzuheben. Die Untersuchung der Überlieferungsgeschichte macht deutlich, dass die antiken Autoren, wie zum Beispiel Dioskurides und Plinius, einen großen Einfluss auf die Indikationsangaben von Stachys officinalis haben. Viele spätere Werke orientieren sich an diesen antiken Quellen und nehmen deren Indikationsangaben auf. Ab dem 18. Jahrhundert nimmt der Umfang der Beschreibungen von Stachys officina-lis und ihre Bedeutung als Phytopharmakon deutlich ab. Auf Grund der hohen Plausibilität der 13 Hauptindikationen sowie der analgeti-schen Anwendungen scheint es nicht gerechtfertigt, dass Stachys officinalis voll-ständig aus dem Arzneischatz verschwunden ist.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Wechselwirkungen zwischen natürlichen Cyclodextrinen und den Substanzen Ibuprofen, Ketoprofen, Naproxen, Flurbiprofen, Felbinac und Fenbufen aus der Gruppe der nichtsteroidalen Antiphlogistika charakterisiert. Ausgehend davon sollte beurteilt werden, ob anhand der Grundstruktur oder der funktionellen Gruppen eines Gastes vorhergesagt werden kann, in welchem Ausmaß solche Wechselwirkungen auftreten und welche Struktur die sich bildenden Komplexe aufweisen. Alle Substanzen weisen die stärksten Wechselwirkungen in wässriger Lösung mit β-Cyclodextrin auf. Lediglich Flurbiprofen bildet auch mit γ-Cyclodextrin in größerem Umfang Komplexe. Für die Mehrzahl der Gastmoleküle werden Isothermen vom Bs-Typ, für Fenbufen und Naproxen hingegen A-Typ-Isothermen erhalten. Durch die gute Löslichkeit der Komplexe kann eine deutliche Löslichkeitssteigerung für diese beiden Gastmoleküle in Wasser erreicht werden. Der Vorgang der Komplexbildung ist für alle Gastsubstanzen ein spontan ablaufender Prozess. Die Assoziationskonstanten K1:1 bei 25°C bewegen sich zwischen 1000 M-1 und 5000 M-1, für Flurbiprofen beträgt sie etwa 14000 M-1 und für Ibuprofen sogar über 40000 M-1. Eine Betrachtung des Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten legt nahe, dass die Lipophilie der Gastmoleküle eine entscheidende Größe für das Ausmaß der Komplexbildung darstellen könnte. Eine Untersuchung bei variierenden pH-Werten zeigte, dass steigende pH-Werte und ein damit erhöhter Dissoziationsgrad der Gastmoleküle durchgehend zu abnehmenden Assoziationskonstanten führten. Löslichkeitsstudien bei verschiedenen Temperaturen zeigten entgegen des erwarteten Absinkens der Assoziationskonstanten mit steigender Temperatur keine eindeutige Tendenz. Für Naproxen und Ketoprofen konnten lineare Van’t Hoff Plots erstellt werden. Kalorimetrische Versuche lieferten für Ibuprofen ergänzende Werte für die Assoziationskonstante und die Gibbs’sche Freie Enthalpie, die mit den Ergebnissen der Löslichkeitsstudien vergleichbar waren. Danach ist die Komplexbildung für diese Stoffe enthalpie- und entropiegetrieben. Job’s Plots deuten auf eine Stöchiometrie von 1:1 für Ibuprofen, Flurbiprofen und Felbinac hin. Obwohl es in der Literatur Hinweise darauf gibt, dass für die anderen Moleküle dieselbe Stöchiometrie vorliegt, sind nach den Ergebnissen auch Komplexe höherer Ordnung möglich. Mit Hilfe von Docking-Studien konnten plausible Komplexstrukturen erhalten werden. Sie deuten auf das Auftreten eines Induced-Fit’s des Cyclodextrins und die Ausbildung von intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen hin. Verschiedene Techniken wurden angewendet, um feste Komplexzubereitungen herzustellen, um weitere Informationen über die gebildeten Komplexe im festen Zustand zu erhalten. Mittels thermoanalytischer Verfahren wurde versucht, den im Cyclodextrin eingeschlossenen Gastmolekülanteil zu bestimmen. In lyophilisierten Lösungen lag der noch als ungebunden detektierbare Wirkstoffanteil meistens am niedrigsten. FT-IR-Spektren der Komplexzubereitungen und ihrer physikalischen Mischungen zeigten, dass auch im festen Zustand meist Einschlusskomplexe gebildet werden, bei denen der aromatische Teil des Gastes und die Carbonylgruppe in der Cyclodextrinkavität lokalisiert sind. Lediglich Felbinac weist ein davon abweichendes Verhalten auf. Diese Erkenntnisse werden meist durch die Ergebnisse der zweidimensionalen 1H-NMR-Studien bestätigt, die Einblick in die Komplexstruktur im wässrigen Medium gewährten. Hier nehmen die Modellsubstanzen verschiedene Orientierungen in der Cyclodextrinkavität ein. Möglicherweise liefern diese einen Erklärungsansatz für das besondere Verhalten der Gastmoleküle Naproxen und Fenbufen in den Löslichkeitsstudien. Die Carboxylgruppe nimmt eine Position ein, in der eine Störung der intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen des Cyclodextrins möglich wird, was für die erhöhte Löslichkeit des Wirtes verantwortlich sein könnte. Insgesamt hat sich gezeigt, dass die Grundstruktur und die funktionellen Gruppen des Gastmoleküls erheblichen Einfluss auf die Struktur und die Eigenschaften ihrer Cyclodextrinkomplexe und auf die Stärke der Wechselwirkung zwischen Wirt und Gast haben. Die Lipophilie der Gastmoleküle scheint zudem eine tragende Rolle zu spielen. Da die Ausprägung der Komplexbildung somit eine Summe aus vielen Einzelfaktoren ist, können Vorhersagen für ein vorliegendes System nur unter erheblichen Einschränkungen getroffen werden und es gilt, immer den Einzelfall zu betrachten.
Als Vorlage für diese Inhibitoren diente der kovalent gebundene Inhibitor 9IN aus der Kristallstruktur 2AMD. Die Entwicklung der neuen Leitstruktur (Abbildung 7-1) erfolgte dabei durch Fragmentierung mit dem Programm FRED im Arbeitskreis Prof. Knut Baumann (Univ. Braunschweig). Die dargestellten Verbindungen wurden als nicht-kovalent gebundene Inhibitoren entwickelt und sowohl an SARS-CoV-Mpro als auch an SARSCoV-PLpro getestet. Da die Basisverbindung 34j (R = H) in durchgeführten Dockingstudien die Enzym-Bindetaschen S1, S2 und S4 bereits ausreichend besetzt hatte, war das Ziel v.a. die noch freie Bindetasche S1‘ mit eingefügten Resten R zu besetzen. Dazu wurden in der Reihe 34a-t verschiedene Alkylreste eingefügt. Die Verbindungen 37a-cc bzw. 38a-p besitzen hingegen die Reste C(O)NHR, CO2R, CH2C(O)NHR und CH2CO2R. Im Verlauf der Synthese wurde der teure Baustein 4-Methylcyclohexancarbonsäure durch die günstigere Verbindung Cyclohexancarbonsäure ersetzt. Keine der dargestellten Verbindungen wies eine besondere Hemmung auf. Trotz geringer Hemmung konnte Verbindung 34e mit dem Enzym SARS-CoV-Mpro co-kristallisiert werden. Die genaue Lage des Inhibitors in der Bindetasche ist bislang noch nicht eindeutig geklärt. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung von kovalent-reversiblen Inhibitoren von Cysteinproteasen auf Grundlage von Vinylsulfonen. Bisherige bekannte Vinylsulfone reagieren wie ein Michaelsystem in einer irreversiblen Addition. Es wurden durch QM-Rechnungen in der Arbeitsgruppe Prof. Bernd Engels substituierte Vinylsulfone vorgeschlagen, die fähig sein sollten, mit Cysteinproteasen eine kovalent-reversible Bindung eingehen zu können. Durch die Wahl sowohl eines geeigneten Substituenten als auch einer geeigneten Abgangsgruppe sollte die Reaktion reversibel sein, wenn sie thermoneutral bis schwach endergon verläuft. Um diese Berechnungen zu bestätigen, wurden die dargestellten Verbindungen mit einem Überschuss 2-Phenylethanthiol umgesetzt und der Reaktionsverlauf durch NMR-Spektroskopie verfolgt. Dabei konnte die Einstellung eines Gleichgewichts und damit auch die Reversibilität der Reaktion beobachtet werden. Aus den berechneten Gleichgewichtskonstanten konnten die freien Reaktionsenergien ΔG berechnet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reaktionen nahezu thermoneutral verlaufen und bestätigen damit die QM-Berechnungen.
Die Fließfähigkeit eines pharmazeutischen Schüttguts spielt insbesondere bei der Herstellung von volumendosierten Arzneiformen, wie beispielsweise Tabletten, eine große Rolle. Häufig kommen deshalb sogenannte Fließregulierungsmittel zum Einsatz, um eine ausreichende Fließfähigkeit zu gewährleisten. Der Prozess der Fließregulierung kann mit einer Abnahme der van der Waals Kräfte zwischen den einzelnen Schüttgutpartikeln beschrieben werden. Diese Reduktion der Haftkraft beruht auf der Anlagerung von Adsorbaten des Fließregulierungsmittels an die Oberfläche der Trägerpartikel. Im Rahmen der Arbeit sollten sowohl die Einflussfaktoren des Schüttguts als auch die des Fließregulierungsmittels auf den Prozess der Fließregulierung geprüft werden. Es wurde gezeigt, dass die Morphologie eines Schüttguts großen Einfluss auf den Prozess der Fließregulierung besitzt. Je glatter die Oberfläche eines Schüttguts ist, desto weniger Fließregulierungsmittel wird ungenutzt eingelagert. Es steht demzufolge mehr Fließregulierungsmittel als Abstandshalter zwischen den einzelnen Schüttgutpartikeln zur Verfügung, was wiederum zu einer Reduktion der van der Waals Kräfte und somit zur Fließverbesserung führt. Ein weiterer Schwerpunkt lag auf der Beurteilung des Einflusses der Primärpartikelgröße eines Fließregulierungsmittels auf seine fließregulierende Potenz. Hierzu wurden Kieselsäurenanopartikel synthetisiert, die sich lediglich in ihren Primärpartikelgrößen unterscheiden. Mit Hilfe des Sol-Gel-Prozesses innerhalb einer Mikroemulsion wurden prozesssicher diskrete, sphärische und einheitliche Kieselsäurenanopartikel in einem Größenbereich von 8 nm bis 100 nm erhalten. Um den Einfluss der Primärpartikelgröße zu prüfen, wurden die Schüttgüter Maisstärke und Lactose mit den synthetisierten Kieselsäuren versetzt und in einem Turbula-Mischer gemischt. Die Beurteilung der Potenz der Fließregulierungsmittel in Kombination mit dem jeweiligen Schüttgut erfolgte mittels Messungen am Zugspannungstester. Für beide Schüttgüter wurde eine eindeutige Korrelation zwischen der Primärpartikelgröße und der Potenz des Fließregulierungsmittels festgestellt, wobei je nach Schüttgutmorphologie unterschiedliche Ergebnisse für die optimale Primärpartikelgröße des Fließregulierungsmittels erhalten wurden. Die Auswahl eines Fließregulierungsmittels sollte demnach unter Beachtung seiner Primärpartikelgröße in Anpassung an die Schüttgutbeschaffenheit erfolgen. Somit kann der Fließregulierungsprozess zukünftig systematischer gestaltet werden.
Einen möglichen Ansatzpunkt für eine antivirale Therapie gegen SARS-Coronaviren bildet die Hemmung der Cysteinproteasen SARS-CoV-Mpro und SARS-CoV-PLpro. Diese übernehmen die Polyprotein-Spaltung während der Virusreplikation und sind damit essentiell für das Überleben und die Verbreitung des Virus. Im Rahmen dieser Arbeit wurden potentielle Inhibitoren der SARS-CoV-Mpro synthetisiert, die Pyridin-, Piperidin-, Pyrrolidin-, Pyridylessigsäure- und Thiazol-Derivate als Grundbausteine enthalten. Durch Strukturmodifikationen wurde eine Serie neuer Verbindungen erhalten, deren inhibitorische Aktivitäten in fluorimetrischen Assays (FRET-Assays) an den Enzymen SARS-CoV-Mpro und SARS-CoV-PLpro untersucht wurden. Weiterhin wurden Testungen an Coronaviren, den Protozoen Leishmania major und Typanosoma brucei brucei und an Makrophagen durchgeführt. Die synthetisierten Verbindungen wurden in sechs Strukturklassen eingeteilt. Strukturklasse 1 enthält Pyridin-, Piperidin-, Pyrrolidin- und Pyridylessigsäure-Derivate ohne Seitenkette in α-Position. Diese bestehen aus einem peptidischen Carbonsäure-Fragment mit N-Heterozyklus. Die Strukturklasse 2 bilden Pyridylessigsäure-Derivate mit einer zusätzlichen aliphatischen Seitenkette in α-Position zur Carboxylfunktion. Die Seitenkette sollte durch Adressierung der S1‘- bzw. S2‘-Bindetasche der SARS-CoV-Mpro die Affinität zum Enzym erhöhen. In den Strukturklassen 3 bis 6 bilden Thiazolamide das bestimmende Strukturelement. In der Strukturklasse 3 kamen dabei unterschiedlich substituierte aromatische Carbonsäuren zum Einsatz, die mit einer Reihe 4,5-substituierter Thiazolamine verknüpft wurden. In den übrigen Stoffklassen, in denen ausschließlich 5-Acetyl-4-methylthiazolamin als Amin-Fragment diente, wurde der Einfluss von Säure-Bausteinen ohne Michael-System (Strukturklasse 4) bzw. mit Michael-System (Strukturklasse 5), sowie die Einführung einer Seitenkette am Benzolring oder am Michael-System (Strukturklasse 6) untersucht. Bei den durchgeführten Enzymassays an der SARS-CoV-Mpro zeigten die synthetisierten Verbindungen insgesamt nur eine geringe Hemmung der Protease (<30 %, 20 µM). Daher lassen sich aus den erhaltenen Ergebnissen keine Struktur-Wirkungsbeziehungen ableiten. Dennoch sind in den Ergebnissen Trends erkennbar. Alle aktiven Verbindungen (Hemmung >10 % bei 20 μM) der Pyridin-, Pyrrolidin-, Piperidin- und Pyridylessigsäure-Derivate enthielten als Strukturmerkmal größere Seitenketten wie n-Pentyl, Cyclopropylmethyl und Crotyl (Strukturklasse 2). Bei den Thiazolamiden der Strukturklassen 3-6 führte die Einführung eines Michael-Systems in der Strukturklasse 5 zu etwas aktiveren Verbindungen. Den größten Einfluss auf die Aktivität zeigte jedoch die Einführung einer Seitenkette in α-Postion zur Carboxylgruppe (Strukturklasse 6). In den Strukturklassen 3 und 4 erwiesen sich nur sehr wenige Verbindungen als aktiv.
Schüttgüter in Form von Pulvern oder Granulaten stellen sowohl eigenständige Arzneiformen als auch häufige Zwischenprodukte bei der Arzneimittelherstellung dar. Um die Einheitlichkeit der Dosierung zu gewährleisten, ist die Fließfähigkeit als eines der zentralen Qualitätsmerkmale anzusehen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Veränderung der fraktalen Dimension D der Partikeloberflächen in binären Mischungen von α-Lactose-Monohydrat (GranuLac® 200) und hydrophilem hochdispersem Sili-ciumdioxid (Aerosil® 200) in Abhängigkeit von der Mischzeit untersucht. Hierbei kamen sowohl die Ras-terkraftmikroskopie als auch verschiedene Adsorptionsmethoden zur Anwendung. Ziel war es, die prin-zipielle Durchführbarkeit der beschriebenen Techniken sowie deren Anwendbarkeit auf das vorliegende Modellsystem zu prüfen und die ggf. bestehende Korrelation zwischen D und den Ergebnissen der Zug-spannungstests aufzuzeigen.
Aus pharmakokinetischer Sicht sind neben Parametern wie der oralen Bioverfügbarkeit und der systemischen Clearance, für die Effektivität und Sicherheit eines inhalativ angewendeten Wirkstoffes unter anderem das Ausmaß der pulmonalen Deposition und seine pulmonale Umverteilungskinetik entscheidend. Wird eine topische Wirkung des Arzneistoffes angestrebt, so trägt eine lange Verweilzeit des Arzneistoffes im Zielgewebe, verbunden mit einer langsamen Umverteilung in den systemischen Kreislauf zu einer Wirkungsoptimierung mit gleichzeitiger Minimierung systemischer Nebenwirkungen bei. In-vitro- und ex-vivo-Modelle eignen sich hervorragend zur isolierten Untersuchung solcher pharmakokinetischer Vorgänge ohne den Einfluss verschiedener in-vivo-Faktoren, wie der Verteilung in andere Gewebe, Metabolisierungs- oder Eliminationsprozessen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Modelle der humanen Lunge zu etablieren bzw. weiterzuentwickeln, die möglichst realitätsnah die Untersuchung der Pharmakokinetik pulmonal applizierter Wirkstoffe ermöglichen.
Ziel der Arbeit war die Erstellung eines „Kaliumkanal-Chips“, die Entwicklung einer geeigneten Messmethode und Auswertungsstrategie, die Durchführung von Testmessungen und die Untersuchung eines Knockout-Mausstammes auf den Genexpressionsstatus und die auftretenden Kompensationsmechanismen. Am Beginn der Arbeit stand vor allem die Auswahl der zu untersuchenden Kaliumkanal-Gene und die Sammlung von Sequenz-Informationen. Ausgehend davon konnte die cDNAMicroarray-Technologie als Methode der Wahl bestimmt werden und die entsprechenden Vorbereitungen für die Umsetzung getroffen werden. Die ersten Messungen im Zuge der Methodenentwicklungen zeigten vor allem, dass jeder Microarray seine individuellen Probleme mit sich bringt, ließen jedoch auch schon erahnen, welche umfangreichen Möglichkeiten diese Technologie bietet. Dann folgten Versuchsmessreihen, wie die Untersuchung der lterspezifischen Expression und der Vergleich von bestimmten Gehirnabschnitten mit dem Gesamtgehirn. Den Abschluss bildete die Messung der TRESK-Knockout-Mauslinie im Vergleich zu ihrem Wildtyp. Hier stand die Frage nach möglichen Kompensationsmechanismen im Vordergrund. Mit kcnk16 haben die Messungen einen interessanten Kandidaten aus der gleichen Genfamilie geliefert, dessen Funktion und Kompensationsvermögen nun in weiteren Tests zu untersuchen ist. Die Arbeit hat gezeigt, dass der Einsatz der Microarray-Technologie zur Untersuchung von Genexpressionsdaten bei Ionenkanalfamilien geeignet ist. Das Fundament der Microarrayanalyse von Kaliumkanälen mit einem individuell entwickelten Microarray ist zum einen das Wissen um Genetik und Funktion der Kaliumkanäle und zum anderen die Technologie, die eine solche Analyse möglich macht. Die Tatsache, dass Säugerorganismen wie Maus und Mensch eine solch hohe Zahl an Kaliumkanälen entwickelt haben und im ständigen Zellstoffwechsel in umfassender Form einsetzen, zeigt die Bedeutung dieser Ionenkanalfamilie und macht die Forschung an diesen Kanälen so interessant und wichtig für die medizinische Grundlagenforschung. Eine Vielzahl von Krankheiten kann schon jetzt direkt oder indirekt auf Gendefekte bei Kaliumkanal-Genen zurückgeführt werden. Mit der Microarray-Analyse steht nun eine Technologie zu Verfügung, die es ermöglicht, die Expression dieser Gene direkt zu untersuchen und mögliche Kompensationsvorgänge aufzudecken. Damit können Zusammenhänge ermittelt werden, die die Grundlage für weitere Forschungen sein können, mit deren Hilfe wir Krankheiten wie Depression eines Tages wirklich verstehen und behandeln können.
Bei SARS („Schweres akutes respiratorisches Syndrom“) handelt es sich um eine Infektionskrankheit des Menschen, welche im November 2002 erstmalig auftrat. Als Erreger dieser Krankheit wurde das SARS-assoziierte Coronavirus identifiziert. Dessen viruseigene Reproduktionsmaschinerie wird vor allem durch die katalytische Aktivität einer Cysteinprotease, der SARS-Coronavirus-Hauptprotease (SARS-CoV-Mpro), und die damit verbundene Prozessierung von viralen Polyproteinen, aufrechterhalten. Diese Schlüsselfunktion der SARS-CoV-Mpro macht sie zu einem vielversprechenden Zielobjekt bei der Entwicklung von spezifischen Inhibitoren für diese Protease, welche somit eine Vermehrung des Virus verhindern. In dieser Arbeit wurde die SARS-CoV-Mpro mit optimierten Methoden exprimiert und gereinigt. Mit der Methode der ESI-MS-Analyse konnte ein kovalentes, irreversibles Bindungsverhalten verschiedener Inhibitoren gezeigt werden und erstmals auch die Bindung von Fragmenten von Inhibitormolekülen an die Protease. So zeigten die SARS-CoV-Mpro-Inhibitoren MH211A und UK-VI-1g eine kovalente Bindung des kompletten Moleküls pro Enzym-Monomer: überraschenderweise hatten bis zu vier Moleküle MH211A bzw. zwei Moleküle UK-VI-1g an ein Proteasemolekül gebunden. Die Bindung von UK-VI-1g an die Protease wurde an zwei Peptiden im Bereich von den Aminosäuren 62 bis 76 bzw. 280 bis 298 nachgewiesen, wobei beide nicht in der Nähe der active site lokalisiert sind. Im Falle des Inhibitors Lit1 bindet der 2,6-Dinitro-4-trifluoromethyl-phenyl-Rest, bei TS48 das Zimtsäure-Thioester-Fragment kovalent an jedes Monomer im dimeren Enzym. Die SARS-CoV-Mpro wurde erstmals ohne Abtrennung des C-terminalen His-tag mit spezifischen Inhibitoren co-kristallisiert. Drei mögliche Orientierungen des Inhibitors TS174 wurden in der active site der Protease identifiziert. Aufgrund der schwachen Elektronendichte des Inhibitors konnten diese nicht weiter untersucht werden. Das Iod-Isatin-Derivat IISBT wurde ebenfalls mit der SARS-CoV-Mpro zusammen co-kristallisiert und es konnte erstmalig eine kovalente Bindung eines Isatin-Derivats an die SARS-CoV-Mpro anhand einer Röntgenstruktur klar gezeigt werden. Diese Struktur zeigte dann, dass früher veröffentlichte molekulare docking-Studien, die eine nicht-kovalente Bindung von IISBT und anderen Isatin-Derivaten veranschaulichen, nochmal überdacht werden sollten. Basierend auf einer ESI-MS-Analyse und früheren Ergebnissen von MALDI- und Dialyse-Experimenten, kann man sicher annehmen, dass IISBT in einer kombinierten kovalent-reversiblen Art und Weise an die SARS-CoV-Mpro bindet.
Das Ziel vorliegender Arbeit war die Entwicklung einer HPLC-MS(/MS)-Methode, die im Rahmen der pharmazeutischen Qualitätskontrolle zur direkten Quantifizierung von Aminosäuren (AS) in Infusionslösungen angewendet werden kann. Die Zielset-zung schloss eine Validierung innerhalb der für die Zweckbestimmung vorgesehenen Grenzen ein. Im Rahmen der Methodenentwicklung wurde das ESI-MS/MS-Fragmentierungs-muster von 21 Aminosäuren, von 20 stabil-isotopenmarkierten Aminosäuren, die als interne Standards verwendet wurden, sowie von einigen weiteren Substanzen bestimmt. Nach Kenntnis von Precursor- und Produktionen erstellte man eine SRM-Methode zur spezifischen MS/MS-Analyse. Dabei wurden durch das jeweilige Frag-mentierungsmuster bedingte Interferenzen bei den zu untersuchenden Aminosäuren bestimmt, die bei der zu erarbeitenden HPLC-MS-Methode beachtet werden mussten. Die Methodenentwicklung zur HPLC-MS-Analytik von underivatisierten AS umfasste mit der RP-HPLC unter Verwendung eines Ionenpaarreagenzes (IP) und der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) zwei verschiedene chromatographi-sche Ansätze. Bei der Anwendung der RP-HPLC ergaben sich Probleme. Die Verwendung eines IP, im vorliegenden Fall TDFHA (Tridecafluorheptansäure), führte zu langen Equilibrierungs-, Re-Equilibrierungs- und Spülzeiten und damit bei zwar relativ kurzer HPLC-Laufzeit zu einem aber insgesamt hohen Zeitaufwand. Gleich-zeitig war die LC-MS-Anlage auf diese Anwendung fixiert, da das Ionenpaarreagenz das Gerät stark verschmutzte und dadurch andere Analysen erheblich störte. Zudem waren die Retentionszeiten der Analyten trotz langer Equilibrierungszeiten schlecht reproduzierbar, so dass eine solche Methode im Rahmen der pharmazeutischen Qualitätskontrolle schwer validierbar wäre. Weiterführende Untersuchungen erfolgten daher nicht. In nachfolgenden Studien mit der HILIC wurden verschiedene Einflussparameter (Anteil organischer Phase im Fließmittel, pH-Wert des Fließmittels, Temperatur der Säule, Pufferkonzentration im Fließmittel, Gradientenelution) auf die Trennung der AS an einer ZIC®-HILIC-Säule untersucht. Durch Optimierung der Parameter wurde so eine HILIC-HPLC-Methode entwickelt, bei der 21 AS und 20 ihrer isotopen-markierten Referenz-AS innerhalb von 20 min eluierten. Diejenigen AS, bei denen im Rahmen der Fragmentierungsstudien Interferenzen aufgrund gleicher bzw. ähnlicher Massen der Precursor- bzw. Produktionen aufgetreten waren, wurden chroma-tographisch getrennt. Gleichzeitig hat sich die SIM-Analyse als anwendbar erwiesen. Die Anwendung des spezifischeren SRM-Modus und damit der Tandem-Massenspektrometrie war nicht erforderlich. Im Rahmen der nachfolgenden Studien zur Validierung ergab sich, dass die entwickelte Methode über einen weiten Bereich eine lineare Abhängigkeit zwischen Konzentrations- und Messwerten zeigte. Für drei der 21 AS (NAcCys, NAcTyr, Pro) wurde die quadratische Regression mit dem Anpassungstest nach Mandel als geeig-neteres Regressionsmodell ermittelt. Bei Untersuchungen zur Wiederfindung wurde ein Einfluss der Matrix-Lösung der Infusionslösung festgestellt, der zu Abweichungen hinsichtlich des Quotienten AreaAS / AreaIS führte, so dass eine Quantifizierung innerhalb der geforderten Grenzen bei Kalibrierung über reine Standardlösungen nicht möglich war. Die Validierung wurde daher nachfolgend in der Matrixlösung durchgeführt. Dabei wurde gezeigt, dass mit der entwickelten HILIC-HPLC-MS-Methode Aminosäuren in Infusionslösungen mit hoher Präzision und Richtigkeit bestimmt werden können. Neun der 21 untersuchten AS konnten im Bereich von 30% - 350%, zehn weitere im Bereich von 50% - 350% innerhalb der zur Gehaltsbestimmung von pharmazeutischen Formulierungen vorgeschriebenen Grenzen (Wiederfindung Einzelbestimmung: 98% -102.0%, Mittelwert einer Dreifachbestimmung: 98.5% – 101.5%) quantifiziert werden. Für His und Phe gelang allerdings keine Quantifizierung innerhalb der Akzeptanzkriterien, wobei der Grund hierfür in weiteren Studien geklärt werden müsste. Mit der entwickelten Methode ist damit eine gleichzeitige Quantifizierung verschiedener AS-Infusionslösungsformulierungen möglich, die sich bei gleicher Matrix in der Konzentration an AS unterscheiden. Beispielsweise seien hier die Formulierungen „Aminoplasmal® E 5% / 10% /15%“ genannt, die mit der validierten Methode erfassbar sind. Die Probenvorbereitung beschränkt sich dabei auf den Zusatz der IS-Formulierung zur Infusionslösung und einen Verdünnungsschritt. Die Quanti-fizierung erfolgt über eine 5-Punkt-Kalibriergerade, die aus einer AS- und IS-Standardmischung, nach Zusatz der einfach herzustellenden Elektrolyt-Matrix, erstellt wird. Die Analysenzeit der HPLC-MS-Methode beträgt einschließlich Equilibrie-rungszeit 35 min und ist damit deutlich kürzer als die 120 min, die bei der nach wie vor zur AS-Analytik allgemein gebräuchlichen Ionenaustauschchromatographie mit Ninhydrin-Nachsäulenderivatisierung anzusetzen sind.