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In der vorliegenden Dissertation wurden verschiedene Themenbereiche bearbeitet, die zur Charakterisierung der intrazellulären, bakteriellen Endosymbionten im Mitteldarm von Ameisen der Gattung Camponotus beitrugen. Es wurden phylogenetische Untersuchungen mit Hilfe der 16S rDNA-Sequenzen der Symbionten und der Sequenzen der Cytochrom-Oxidase-Untereinheit I (COI-Sequenzen) ihrer Wirte durchgeführt, die zur näheren Klärung der Fragen zu Übertragungsweg und Stellung der Camponotus-Endosymbionten verhalfen. Untersuchungen an dreizehn verschiedenen Camponotus-Arten brachten folgende Ergebnisse. Die intrazellulären Bakterien der Ameisen gehören zur g-Subklasse der Proteobakterien. Innerhalb des 16S-Stammbaumes der Symbionten kann man drei Untergruppen unterscheiden, in denen die einzelnen Arten enger miteinander verwandt sind. Bei den nächstverwandten Bakteriennachbarn der Camponotus-Endosymbionten handelt es sich um die ebenfalls symbiontisch lebenden Bakterien der Gattungen Wigglesworthia und Buchnera. Die Ameisen-Symbionten besitzen in ihren rrs-Genen intervenierende DNA-Sequenzen (IVS), die stabile Sekundärstrukturen ausbilden können. Ihre 16S-Gene sind nicht strangaufwärts von den 23S-Genen lokalisiert. Durch diese genetische Besonderheit ähneln die Camponotus-Symbionten den Buchnera-Symbionten, deren rRNA-Gene auf zwei Transkriptionseinheiten verteilt sind. Innerhalb des Stammbaumes der untersuchten Wirtsameisen existieren ebenfalls drei Untergruppen, deren einzelne Arten enger miteinander verwandt sind. Die direkte Gegenüberstellung des Symbionten-Stammbaumes mit dem der Ameisen zeigt ein weitgehend gleiches Verzweigungsmuster. Beide Dendrogramme zeigen signifikante Übereinstimmungen bezüglich ihrer taxonomischen Beziehungen und legen eine kongruente Entwicklung von Symbionten und Wirten, die nur durch einen vertikalen Übertragungsweg erzeugt werden kann, nahe. Einzige Ausnahme bildete hierbei der C. castaneus-Symbiont, bei dem ein horizontaler Transfer von Symbionten nicht gänzlich ausgeschlossen werden kann. Die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführten phylogenetischen Untersuchungen ermöglichten die Benennung einer neuen Symbiontengattung innerhalb der gamma-Subgruppe der Proteobakterien: "Candidatus Blochmannia spp." Histologische Studien der Endosymbiose mit Hilfe von licht- und elektronenmikroskopischen Methoden sollten Fragen zur Symbiontenlokalisation innerhalb adulter Individuen beantworten und die Ergebnisse zum Übertragungsweg der intrazellulären Bakterien festigen. Die Endosymbionten sind in den Mitteldarmepithelien von Arbeiterinnen, Königinnen und Männchen in Myzetozytenzellen lokalisiert, die in das Mitteldarmepithel interkalieren. Diese spezialisierten Zellen besitzen kaum Vesikel und tragen keinen Mikrovillisaum. In den Oozyten der Ovarien von Königinnen und Arbeiterinnen wurden ebenfalls große Symbiontenmengen gefunden. Die Spermatheka der Königinnen und die Geschlechtsorgane der Männchen waren symbiontenfrei. Die Abwesenheit von Symbionten innerhalb dieser beiden Organe zeigt, dass eine Bakterieninfektion der weiblichen Tiere nicht durch die Männchen stattfindet, sondern wie schon in den phylogenetischen Untersuchungen postuliert, ein rein maternaler Übertragungsweg der Symbionten vorliegt. Die Detektion der Bakterien in Eiern und Larven der Ameisen mittels In situ-Hybridisierungen trugen zur Aufklärung des Weges der Endosymbionten während der Embryogenese bei. Während sich im abgelegten Ei ein Ring aus Symbionten bildete, kam es in den Larvenstadien 1 bis 3 zur Auswanderung der Bakterien in Meso- bzw. Ektoderm. Im größten untersuchten Larvenstadium 4, das kurz vor der Verpuppung stand, konnten die Symbionten ausschließlich in den Myzetozyten des Mitteldarmes detektiert werden. Die Behandlung der Ameisen mit Antibiotika ermöglichte es, symbiontenfreie Ameisen zu erzeugen, die über einen längeren Zeitraum weiterlebten, ohne ihre Symbionten zu regenerieren. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es erstmals, die intrazellulären Bakterien intakt aus dem sie umgebenden Mitteldarmgewebe zu isolieren. Somit konnten gereinigte Symbionten für Kultivierungs- und Infektionsversuche verwendet werden. Diese Versuche die mit Hilfe von Bakteriennährmedien und Insektenzelllinien durchgeführt wurden, zeigten jedoch sehr deutlich, dass es nicht möglich ist, die Camponotus-Symbionten außerhalb ihrer Wirte zu kultivieren.
Die Positionsklonierung hat sich als erfolgreiche Strategie zur Identifizierung und Isolierung von Genen erwiesen. Da ihre Anwendung im Allgemeinen keine Informationen über den zugrundeliegenden Pathomechanismus einer Erkrankung voraussetzt, eignen sich die Methoden der Positionsklonierung in besonderem Maße für die Erforschung hereditärer Netzhauterkrankungen. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurden sie zur Untersuchung ausgewählter retinaler Degenerationen eingesetzt. Dabei konnten wichtige Beiträge für die Aufklärung der genetische Ursachen dieser Erkrankungen geleistet werden. Die autosomal dominante North Carolina Makuladystrophie (NCMD) oder die zentral areoläre Pigmentepitheldystrophie (CAPED) sind allelische Erkrankungen mit allenfalls gering progredientem Verlauf. Ihr Genlokus liegt in einem etwa 7,2 cM großen Bereich auf 6q14-q16.2 zwischen den DNA-Markern D6S424 und D6S1671. Mit Hilfe von 21 polymorphen DNA-Markern welche den NCMD-Lokus (MCDR1) flankieren, wurden Kopplungsanalysen in drei deutschen NCMD-Familien durchgeführt. Die Analyse der krankheitsassoziierten Haplotypen erbrachte Hinweise auf einen gemeinsamen Vorfahren aller drei Familien. Darüber hinaus konnte der MCDR1-Lokus auf 3,2 cM eingeengt werden und wird von den Markern D6S249 und D6S475 flankiert. Dies bedeutet einen wichtigen Schritt auf dem Weg zur Klonierung des zugrundeliegenden Krankheitsgens. Eine häufige Ursache für den frühzeitigen Verlust der zentralen Sehschärfe bei Jungen ist die X-gebundene juvenile Retinoschisis (RS). Ihr Genlokus wurde in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert, wo er von den DNA-Markern DXS418 und DXS999/DXS7161 flankiert wird. Die Analyse von EST-Sequenzen aus dieser Region ermöglichte die Isolierung eines neuen retinaspezifischen Transkriptes, welches als RS1 bezeichnet wurde. Das RS1-Gen besteht aus sechs Exonen und codiert ein Protein, welches eine in der Evolution hoch konservierte Discoidin-Domäne enthält. Diese Domäne ist in anderen Proteinen u.a. an der Ausbildung von Zell-Zell-Interaktionen beteiligt. Mutationsanalysen in betroffenen Personen aus neun nicht-verwandten RS-Familien ergaben neun verschiedene Sequenzveränderungen die mit dem Krankheitsbild der jeweiligen Familie segregierten. Einen ersten Einblick in die zeitliche und räumliche Expression ergab die Untersuchung des murinen Orthologs Rs1h mit Hilfe von Northern Blot, RT-PCR und RNA in situ-Hybridisierungen. Rs1h wird in der Maus hauptsächlich in den Photorezeptoren exprimiert. Die Expression beginnt erst postnatal und ist mit der Entwicklung der Photorezeptoren korreliert. Das Auftreten zahlreicher weißlich-gelber Flecken, sogenannter Drusen, in radiärer Anordung am hinteren Augenpol ist das charakteristische Merkmal einer Gruppe von Netzhauterkrankungen mit gemeinsamer Ätiologie, die unter dem Begriffen Doynsche Honigwaben Dystrophie (DHRD), Malattia Leventinese (MLVT) oder radiäre Drusen zusammengefasst werden. Der Genlokus dieser Erkrankung wurde auf den kurzen Arm von Chromosom 2 in den Bereich 2p16 kartiert. Die Durchsuchung von EST-Datenbanken führte zur Identifizierung des neuronal exprimerten Gens pNEU60. Dieses besteht aus zwei Exonen, wobei der vollständige codierende Bereich im zweiten Exon liegt. Die Analyse des pNEU60-Proteins ergab eine Struktur aus sieben Transmembrandomänen, dem gemeinsamen Merkmal G-Protein gekoppelter Rezeptoren, wie z.B. Rhodopsin. Patienten mit radiären Drusen zeigten keinerlei Sequenzveränderungen in pNEU60. Die Untersuchung von fast 200 Patienten mit der phänotypisch sehr ähnlichen altersbedingten Makuladegeneration (AMD), führte zur Identifizierung von drei potentiellen Mutationen, darunter eine nonsense-Mutation, sowie zwei polymorphen Veränderungen. Die Assoziation einer einzigen missense-Mutation (R345W) im ubiquitär exprimierten Gen EFEMP1 (EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1) mit der DHRD und MLVT wurde von einer amerikanischen Arbeitsgruppe nachgewiesen. Die R345W Mutation in diesem proximal zu pNEU60 liegenden Gen wurde in den zur Verfügung stehenden zwei MLVT-Familien sowie einer DHRD-Familie nachgewiesen. Bei der Analyse von 14 Patienten mit sporadischen radiären Drusen konnte weder die R345W Mutation, noch irgendeine andere krankheitsassoziierte Mutation nachgewiesen werden. Es wurden jedoch drei polymorphe Sequenzvarianten, sowie zwei polymorphe Di- bzw. Trinukleotidsequenzen identifiziert. Die Klonierung des orthologen EFEMP1-Gens des Rinds diente als Voraussetzung zur Untersuchung der Interaktionsfähigkeit von EFEMP1 mit anderen Proteinen. Mit der Anwendung des Hefe Zwei-Hybrid Systems konnte gezeigt werden, dass die EGF-Domänen von EFEMP1 eine Interaktion mit sich selbst ermöglichen. Die Einführung der R345W Mutation hatte dabei keinen Einfluss auf diese Wechselwirkungen. Die beschriebene Interaktion mit dem zur Familie der Ubiquiline gehörenden Protein DA41 konnte nicht reproduziert werden. Das Gen welches mit der inkompletten Form der X-gebundenen kongenitalen stationären Nachtblindheit (CSNB2) assoziiert ist, codiert die a1-Untereinheit des retinaspezifischen spannungsabhängigen L-Typ Kalziumkanals (CACNA1F). Mit Hilfe von RT-PCR Analysen und RNA in situ-Hybridisierungen wurde die räumliche Expression dieses Gens in der Netzhaut untersucht. Dabei wurde das CACNA1F-Transkript in der äußeren und inneren Körnerschicht, sowie in der Ganglienzellschicht nachgewiesen.
Die kombinierte Mikroperfusions-/Ladungspulstechnik an einzelligen marinen Riesenalgen ermöglicht die getrennte Darstellung der elektrischen Eigenschaften von Plasmalemma und Tonoplast durch gezielte Manipulation des vakuolären und externen Mediums. Dabei kann der für die Physiologie der Zellen wichtige hydrostatische Innendruck (Turgor) ständig kontrolliert werden. Die Applikation eines Ladungspulses resultierte bei Valonia utricularis und Ventricaria ventricosa in einer biphasischen Relaxation des Gesamt-membranpotentials, die durch die Summe zweier Exponentialfunktionen beschrieben werden konnte. Die Zeitkonstanten dieser beiden Relaxationen lagen dabei im Bereich von 0.1 ms und 1 ms (V. utricularis), bzw. 0.1 ms und 10 ms (V. ventricosa). Addition von Nystatin (einem membranimpermeablen und porenbildenden Antibiotikum) zu der vakuolären Perfusionslösung führte bei beiden Spezies zu einem Verschwinden der langsamen Relaxation des Spektrums, während über das Badmedium (extern) dotiertes Nystatin die Zeitkonstante der schnellen Komponente dramatisch verringerte. Die jeweils andere Relaxation blieb dabei unbeeinflusst. Folglich muss die schnelle Relaxation den RC-Eigenschaften des Plasmalemmas und die langsame den Eigenschaften des Tonoplasten zugeordnet werden. Dies ist ein klarer Beweis für das sog. "Zwei-Membranen Modell". In Übereinstimmung damit beeinflussten externe Ionentauschexperimente sowie externe Zugabe von Kanal/Carrier-Inhibitoren wie TEA (Tetraethylammonium), Ba2+ und DIDS (4,4'-Diisothiocyanatostilben-2,2'-Disulfonsäure), nur die schnelle Relaxation des Ladungspulsspektrums, nicht aber die langsame. Dagegen hatte die Zugabe dieser Inhibitoren zu der vakuolären Perfusionslösung keinen signifikanten Einfluss auf das Relaxationspektrum der marinen Algen. Bei der Berechnung der passiven Membranparameter fiel eine ungewöhnlich hohe flächenspezifische Kapazität des Tonoplasten auf, die nach elektronenmikroskopischen Untersuchungen mit einer etwa 9-fachen Oberflächenvergrößerung erklärt werden konnte. Diese resultierte aus tubulären Ausstülpungen des Tonoplasten, die in das Zytosol hineinreichen. Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass - entgegen der Lehrmeinung - der Widerstand des Tonoplasten mariner Algen hoch ist (0.3 bis 1.1 Ohm m²) und somit Werte aufweist, die mit Messungen an Vakuolen höherer Pflanzen vergleichbar sind. Darüber hinaus ergaben Nystatin-Experimente, dass das Zytoplasma von V. ventricosa stark negativ geladen ist (bis zu -70 mV). Neben vielen Gemeinsamkeiten existieren auch klare Unterschiede in der Physiologie dieser Algen. Während bei V. ventricosa die Plasmalemmaleitfähigkeit durch Kalium dominiert wurde, war das Plasmalemma von V. utricularis deutlich permeabler für Chlorid als für Kalium. Variation des externen pH-Wertes wirkte sich nur bei V. utricularis, nicht aber bei V. ventricosa, im Relaxationsspektrum in einer drastischen Erhöhung der schnellen Zeitkonstante aus. Für die Analyse turgorgesteuerter Membrantransportprozesse an marinen Algen bedeuten diese Arbeiten einen methodischen Durchbruch, so dass die vollständige Aufklärung der biophysikalischen Prozesse, die mit der Turgorregulation assoziiert werden, unmittelbar bevorsteht.
Transforming growth factor-ß (TGF-ß) reguliert eine Vielzahl zellulärer Funktionen, wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose. Über membrangebundene Serin/Threonin-Kinase-Rezeptoren werden TGF-ß Signale durch Phosphorylierung an Smad-Proteine, die intrazellulären Signaltransduktoren, weitergeleitet, die im Kern die Transkription spezifischer Gene modulieren. Obwohl die drei TGF-ß Isoformen, TGF-ß1, -ß2 und -ß3, äußerst homologe Proteine sind, unterscheiden sich die Phänotypen ihrer Genknockouts stark. Variabilität und Spezifität können auf vielerlei Arten und Ebenen der TGF-ß Signalübertragung erreicht werden. In der vorliegenden Arbeit wird eine alternativ gespleißte Variante des TGF-ß Typ II Rezeptors (TßRII), TßRII-B, charakterisiert. Dieser Rezeptor ist, im Gegensatz zum bisher bekannten TßRII, in der Lage alle drei TGF-ß Isoformen hochaffin zu binden und in Abwesenheit eines unterstützenden Typ III Rezeptors (TßRIII) Signale über den Smad-Pathway weiterzuleiten. TßRII-B ist außerdem fähig ligandenabhängig mit den verschiedenen TGF-ß Rezeptortypen zu Oligomerisieren. Erste Hinweise auf Besonderheiten der TGF-ß2 Bindung an TßRII-B wurden mittels verschiedener zellbiologischer Ansätzen gewonnen. Aus Untersuchungen zur gewebespezifischen Expression des Rezeptors geht hervor, daß TßRII-B, im Vergleich zu TßRII, ein distinktes Expressionsmuster aufweist und v.a. in TGF-ß2-beeinflußten Geweben nachgewiesen werden kann. In diesen Erkenntnissen spiegelt sich die Bedeutung dieses Rezeptors für eine TGF-ß Isoform-spezifische Signalübertragung wider. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle von TGF-ß und seinen Rezeptoren bei der Entstehung von Tumoren. B-Zellen einiger Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (B-CLL), der häufigsten Form adulter Leukämie in westlichen Ländern, zeigen Resistenz gegenüber TGF-ß-vermittelter Wachstumsinhibierung und ein verändertes Expressionsmuster der TGF-ß Rezeptoren an ihrer Zelloberfläche. In dieser Arbeit wird die Identifizierung und Charakterisierung zweier Mutationen innerhalb der putativen Signalpeptidsequenz des TGF-ß Typ I Rezeptors (TßRI) in B-Zellen TGF-ß resistenter CLL-Patienten beschrieben. Hierbei handelt es sich um einen Aminosäure-Austausch (L12Q) und eine ‚in-frame‘ Alanin-Deletion (A8) innerhalb einer aus 9 Alaninen bestehenden Sequenz. Es konnte gezeigt werden, daß diese Mutationen zwar keinen Einfluß auf Oberflächenexpression und Komplexbildungseigenschaften des TßRI haben, jedoch TGF-ß stimulierte Reportergeninduktion verringern, was eine kausale Beziehung bei der Entwicklung TGF-ß resistenter B-CLL-Zellen vermuten läßt. Ein Auftreten von Mutationen innerhalb der 9-Alanin-Sequenz des TßRI korreliert mit TGF-ß Insensitivität von B-CLL Zellen. Obwohl noch weitere Studien benötigt werden, um den präzisen molekularen Mechanismus zu verstehen, der zu TGF-ß Resistenz in B-CLL Zellen führt, kann spekuliert werden, daß TßRI Mutationen das Voranschreiten von B-CLL und evtl. anderen Tumorarten unterstützen. Gezieltes Screenen nach TßRI Signalpeptidsequenz Mutationen könnte demnach als prognostischer Indikator für Tumorprogression eingesetzt werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass fremde virale Hüllproteine wie das Env Protein des murinen Leukämievirus (MLV) oder das Glykoprotein des Virus der vesiklären Stomatitis (VSV) nicht in der Lage sind, die Funktion des homologen HFV Hüllproteins in Bezug auf die Viruspartikelfreisetzung des Humanen Foamyvirus zu übernehmen. Offenbar werden für die HFV Viruspartikelmorphogenese und -freisetzung spezifische Interaktionen zwischen dem Kapsid und dem homologen Hüllprotein benötigt. Mutationsanalysen ergaben, dass die membranspannende Domäne des HFV Hüllproteins in diesem Zusammenhang spezifische Aufgaben erfüllt, die nicht durch heterologe Formen der Membranverankerung übernommen werden können. Die Analyse der Fusionsaktivität verschiedener Hüllproteinmutanten zeigte, dass die zytoplasmatische Domäne des Proteins nicht essentiell für die Fusionsaktivität benötigt wird. Umfangreichere Deletionen, die auch Teile der langen membranspannenden Domäne des Proteins einschlossen, führten dagegen zum Verlust der Fusionseigenschaften des Hüllproteins. Innerhalb der membranspannenden Domäne des HFV Hüllproteins befindet sich ein konserviertes Lysin-Prolin Motiv, dessen Mutation sich auf den zellulären Transport und auf die Fusionsaktivität des Proteins auswirkte. Es zeichnet sich ab, dass die lange membranspannende Domäne des HFV Hüllproteins nicht nur als Membranverankerung dient, sondern zusätzlich für verschiedene Funktionen des Hüllproteins von Bedeutung ist.
Escherichia coli wird als der häufigste Erreger von Harnwegsinfektionen des Menschen beschrieben. Um die Krankheit auslösen zu können, benötigen die Bakterien ganz bestimmte Eigenschaften, die als Virulenzfaktoren bezeichnet werden und durch die sie sich von apathogenen Stämmen unterscheiden. Der uropathogene E. coli Stamm 536 (O6:K15:H31) exprimiert verschiedene Virulenzfaktoren wie a-Hämolysin, die Adhäsine S-, P-related (Prf) und Typ 1-Fimbrien sowie das Kapselantigen K15. Außerdem wurden auch Enterobaktin- und Yersiniabaktin-Produktion sowie Serumresistenz nachgewiesen. Die Ausprägung der Virulenz hängt unter anderem mit dem Vorhandensein von Pathogenitätsinseln (PAI I536-V536) zusammen, die mit seltenen tRNA-Genen assoziiert sind. Die Deletion der Inseln PAI I536 und PAI II536 führt zum Verlust der Virulenz und zur Zerstörung der entsprechenden tRNA Gene. Es wurde festgestellt, daß die leuX-kodierte tRNA5Leu, die mit der PAI II536 assoziiert ist, einen Einfluß auf die Expression von Typ 1-Fimbrien sowie auf die Serumresistenz, Motilität und die Enterobaktin- und a-Hämolysin-Produktion hat. Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Bedeutung der leuX-kodierten tRNA5Leu und der Pathogenitätsinseln I536 und II536 für die Expression von Proteinen sowie Typ 1-Fimbrien bei dem E. coli Stamm 536. Dazu wurde zunächst eine Proteomanalyse durchgeführt. Mit der Hilfe von 2D-Gelen wurde der Einfluß von leuX-kodierten tRNA5Leu und PAI I536 und PAI II536 auf die Expression verschiedener Proteine im E. coli Stamm 536 (PAI I536+, PAI II536+, leuX+) und seinen Mutanten: 536-21 (PAI I536-, PAI II536-, leuX-), 536D102 (PAI I536+, PAI II536+, leuX-) und 536R3 (PAI I536-, PAI II536-, leuX+) untersucht. Mit Hilfe von präparativen Gelen konnten in den zytosolischen Fraktionen 39 Unterschiede in der Expression von Proteinen nachgewiesen werden. Von diesen differentiell exprimierten Proteinen wurden 37 mit Hilfe von MALDI-TOF-MS identifiziert. Die zwei weiteren Proteine konnten nicht identifiziert werden. In den Kulturüberstandsfraktionen der untersuchten Stämme konnten drei Unterschiede in der Expression von Proteine nachgewiesen werden. Außerdem wurde der Einfluß der leuX-kodierten tRNA5Leu auf die Expression der Membranproteine der jeweiligen Stämme untersucht. Zu diesem Zwecke wurden sowohl ein- wie auch zweidimensionale Gele durchgeführt. Mit Hilfe von zweidimensionalen Gelen konnten zwischen den untersuchten Stämmen mehrere Unterschiede in der Expression von Proteinen festgestellt werden. Dabei konnten vier Unterschiede in der Proteinexpression detektiert werden. Mit Hilfe der 2 D-Gelelektrophorese wurde ein leuX-abhängiges Protein (YgaG), das ein Analogon des LuxS-Proteins ist, gefunden. Das LuxS-Protein ist ein Bestandteil des "Quorum sensing"-Systems von Vibrio harveyi und wird in ähnlicher Form bei vielen Bakterien beschrieben. Sein Einfluß auf die Pathogenität wurde bei vielen Bakterien beschrieben. Aus diesem Grund wurde eine ygaG-Mutante im E. coli Stamm 536 hergestellt. Anschließend wurde der Einfluß des YgaG-Proteins auf die Expression von Virulenzfaktoren überprüft und ein Proteomvergleich zwischen dem Wildtyp Stamm E. coli 536 und der ygaG-Mutante wurde durchgeführt. Die Expression der bekannten Virulenzfaktoren wurde von YgaG nicht beeinflußt. Weiterhin wurden Transkriptionsfusionen zwischen den Promotoren der fimB- und fimE-Gene mit dem promotorlosen ß-Galaktosidase-Gen (lacZ) konstruiert. Es sollte damit die Frage beantwortet werden, ob die leuX-kodierte tRNA5Leu als potentieller Regulator die Transkription von Typ 1-Fimbrien beeinflußt. Es konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Transkription von fimB und fimE zwischen dem Wildtyp Stamm 536 und der leuX-Mutante 536D102 festgestellt werden.
Listeria monocytogenes, ein fakultativ intrazellulärer Krankheitserreger, besitzt die Fähigkeit, Wirtszellen zu penetrieren, sich in ihnen zu vermehren, sich intrazellulär zu bewegen und auch benachbarte Zellen direkt zu infizieren. Die intrazelluläre Fortbewegung erfolgt durch Polymerisation von zellulärem Aktin, wodurch charakteristische Aktinschweife an einem Pol der Bakterien entstehen. Der einzige bakterielle Faktor, der für die Aktinpolymerisation notwendig ist, ist das Oberflächenprotein ActA. ActA allein ist aber nicht in der Lage, Aktin zu polymerisieren, sondern kann dies nur in Assoziation mit Proteinen der Wirtszelle. Die einzigen bisher bekannten Wirtszellproteine, die direkt mit ActA interagieren, sind das Phosphoprotein VASP und der Arp2/3-Komplex. VASP bindet an den zentralen prolinreichen Bereich von ActA und beschleunigt durch die Rekrutierung von Profilin den Prozeß der Aktinpolymerisation. Der Arp2/3-Komplex interagiert mit dem N-terminalen Bereich von ActA und initiiert die eigentliche Aktin-Polymerisation. Um weitere eukaryotische, mit ActA interagierende Proteine (AIPs) zu isolieren, wurde über einen "Yeast Two-Hybrid"-Test mit ActA als Köder eine embryonale Maus-cDNA-Genbank getestet. Dabei wurden drei verschiedene AIPs identifiziert, von denen eines identisch mit dem humanen Protein LaXp180 (auch "CC1" genannt) ist. LaXp180 ist ein 180 kDa Protein mit über 50 theoretischen Phosphorylierungsstellen in der N-terminalen Hälfte, während die C-terminale Hälfte "coiled-coil"-Strukturen ausbilden kann. Darüberhinaus enthält LaXp180 eine Kern-Lokalisations-Sequenz und ein Leucin-Zipper-Motiv. Die Bindung von LaXp180 an ActA wurde in vitro unter Verwendung von rekombinantem His6-Tag-LaXp180 und rekombinantem ActA bestätigt, da rekombinantes ActA nur an einer Ni-Agarose-Säule gebunden wurde, wenn diese vorher mit His6-Tag-LaXp180 beladen war. Über RT-PCR konnte zum ersten Mal die Expression LaXp180-spezifischer mRNA in verschiedenen Säugerzellen nachgewiesen und mit einem polyklonalen anti-LaXp180-Serum durch Immunopräzipitation erstmals ein 194 kDa großes Protein in Säugerzellextrakten detektiert werden. Die intrazelluläre Lokalisation von LaXp180 wurde über Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Immunfluoreszenzfärbungen von Fibroblasten mit dem anti-LaXp180-Serum zeigten eine starke Färbung der Zellkerne und definierter Bereiche direkt neben den Kernen, während das restliche Zytoplasma schwach gefärbt war. Über Immunfluoreszenzmikroskopie mit dem anti-LaXp180-Serum an mit L. monocytogenes infizierten Zellen konnte gezeigt werden, daß LaXp180 mit der Oberfläche vieler, aber nicht aller intrazellulärer, ActA-exprimierender Listerien kolokalisiert. Dagegen wurde nie eine Kolokalisation mit intrazellulären, aber ActA-defizienten Mutanten beobachtet. Darüberhinaus ist LaXp180 asymmetrisch auf der Bakterienoberfläche verteilt und schließt sich gegenseitig mit der F-Aktin-Polymerisation aus. LaXp180 ist ein putativer Bindungspartner von Stathmin, einem 19 kDa Phosphoprotein, das die Mikrotubuli-Dynamik reguliert. Über Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, daß auch Stathmin mit intrazellulären, ActA-exprimierenden L. monocytogenes kolokalisiert.
Die c-Jun-N-terminale Kinase (JNK), ein Mitglied der Familie der MAP-Kinasen (Mi-togen Activated Protein Kinases), wirkt als signalübertragender Effektor, der den klei-nen GTPasen der Rho–Familie Rac und Cdc42 nachgeschaltet ist. Rho-GTPasen spielen eine Schlüsselrolle in der Regulation von zellulären Aktinstrukturen und steuern Prozesse in der Zelle, die Änderungen der Aktinstruktur erfordern, wie z.B. Änderungen der Zellmorphologie, Zellmigration, Wachstum und Differenzierung. Genetische Studien an der Fruchtfliege Drosophila melanogaster konnten eine Rolle des Drosophila-JNK-Homologs DJNK(basket) in der Regulation von Zellbewegungen und Zellmorphologieänderungen während der Drosophila-Embryogenese zeigen. Inhibierung der Funktion von DJNK auf allen Stufen der DJNK-Signaltransduktions-kaskade führt zum sogenannten dorsal closure-Phänotyp der Embryonen mit fehlender Zellstreckung und fehlender Migration dorsaler Epithelzellen. Der molekulare Mechanismus, mit dessen Hilfe Rho-GTPasen Aktinstrukturen regu-lieren und wie JNK Einfluss auf Zellmorphologie und Zellbewegung nimmt, ist bisher nicht bekannt. Die Identifizierung neuer, mit JNK interagierender Proteine könnte zum besseren Verständnis der Funktion und Regulation von JNK führen. In dieser Arbeit wurde ein Yeast-Two-Hybrid-Screen mit dem Drosophila-Homolog DJNK/basket durchgeführt, der zur Entdeckung des Drosophila-Proteins p150-Spir als Interaktionspartner von DJNK führte. Der C-terminus des p150-Spir-Proteins enthält eine JNK-Interaktionsdomäne, ein DEJL-Motiv (Docking Site for Erk and JNK, LxL) und wird von aktivierten JNK-Proteinkinasen phosphoryliert. p150-Spir ist ein Multi-Domänen-Protein, das in seiner aminoterminalen Hälfte eine Aufeinanderfolge von vier WH2-Domänen (Wiskott Aldrich Homology Domain 2) enthält. WH2-Domänen binden monomeres Aktin, Proteine mit WH2 Domänen, wie z.B. WASP oder WAVE sind Aktinreorganisatoren. Die transiente Überexpression von p150-Spir in NIH3T3-Mausfibroblasten führt ebenfalls zu einer Aktinreorganisation. Eine weitere Domäne in p150-Spir ist eine modifizierte FYVE-Zinkfinger-Struktur (mFYVE) im zentralen Bereich des Proteins, die für die subzelluläre Lokalisation von p150-Spir von Bedeutung ist. Mutationen, welche die Zinkfingerstruktur zerstören, führen bei Überexpression in NIH3T3-Zellen zu einer zytoplasmatischen Lokalisation der mutierten p150-Spir-Proteine, während Wildtyp-p150-Spir perinukleär akkumuliert. Spir-Proteine sind evolutionär hoch konserviert. Es konnten Spir-ähnliche Sequenzen auf den humanen Chromosomen 16 und 18, in der Maus und in der Seescheide Ciona savignyi gefunden werden. Der höchste Grad an Konservierung besteht im Bereich der funktionellen Proteindomänen. Ein in allen Spir-Proteinen ent-haltenes, als Spir-Box bezeichnetes hoch konserviertes Sequenzmotiv befindet sich unmittelbar vor dem mFYVE-Zinkfinger. Die Spir-Box zeigt Strukturverwandschaft zur Rab-GTPase-Bindungsregion in Rabphilin 3A, einem Protein, das ebenfalls eine FYVE-Domäne besitzt. Rab-GTPasen sind wie FYVE-Domänenproteine in die Regulation zellulärer Vesikeltransportprozesse involviert. Das Vorhandensein beider Do-mänen in p150-Spir deutet auf eine Rolle des Proteins in zellulären Transportprozes-sen hin. Ein denkbares Modell wäre, daß p150-Spir unter der Kontrolle von JNK-Signalen zelluläre Aktinstrukturen reguliert, die für Transportprozessse in der Zelle von Bedeutung sind; p150-Spir fungiert damit möglicherweise als direktes Bindeglied zwischen MAPK-Signaltransduktionskaskaden und dem Aktinzytoskelett.
In die Region p13 des menschlichen Chromosoms 11 kartieren mehrere krankheitsrelevante Gene wie das Wilms' Tumor Gen WT1 oder das für die Aniridie verantwortliche Gen PAX6. Beide Gene können bei Patienten mit dem WAGR-Syndrom deletiert sein, was das Auftreten von Wilms' Tumoren oder Aniridie bei diesen Patienten erklärt. Die genetische Ursache für weitere Symptome des WAGR-Syndroms, wie beispielsweise die geistige Retardierung, ist bisher nicht geklärt. Des weiteren wurden Allelverluste auf 11p13 in Verbindung mit verschiedenen Tumoren (Lunge, Blase, Brust, Ovar) beobachtet, ohne daß die ursächlichen Gene hierfür beschrieben werden konnten. Eine Kartierung und anschließende Sequenzierung dieser Region dient als Grundlage für die Identifizierung neuer Gene, die möglicherweise im Zusammenhang mit diesen Krankheiten stehen. Mit dem Ziel der Sequenzierung dieser Region wurde ausgehend von einem YAC-Contig, das 8 Mb des Chromosoms 11p13-14.1 abdeckt, eine Feinkartierung der Region 11p13 durchgeführt. Über ein Screening einer humanen PAC-Bibliothek mit 11p13-spezifischen Proben, wurden PAC-Klone erhalten, die aus dieser Region stammen. Mit einem Teil dieser Klone konnte mittels "chromosome walking" ein 4,5 Mb großes PAC-Contig erstellt werden. Zur Sequenzierung des Chromosomenabschnitts 11p13 am Sanger Centre/UK wurden die PAC-Klone des "minimal tiling path" gewählt. Auf der Grundlage des PAC-Contigs wurden auf experimentellem Weg mit Hilfe des Exontrappings neue Transkripte isoliert. Hierfür wurden sechs PAC-Klone, die etwa 700 kb des Chromosoms 11p13 abdecken, herangezogen. Zusätzlich wurden erste Sequenzabschnitte (insgesamt ca. 640 kb) der PAC-Klone über eine computergestütze Auswertung mit dem Programmpaket NIX/HGMP analysiert. Insgesamt konnten mit Hilfe des Exontrappings und der in silico Analyse fünf neue potentielle Transkripte identifiziert werden. Eine erste Untersuchung dieser Transkripte wurde mit Hilfe von Datenbankvergleichen und Expressionsstudien auf Northern Blots und in situ Hybridisierungen durchgeführt. Aussagen über eine mögliche Funktion konnten bei zwei der identifizierten Transkripte anhand von Datenbankvergleichen getroffen werden. Es handelt sich zum einen um ein Transkript mit Homologien zum Gen cca3 aus der Ratte, für das aufgrund der enthaltenen BTB-Domäne eine regulatorische Funktion auf DNA-Ebene postuliert werden kann. Zum anderen wurde ein Gen mit Ähnlichkeiten zu einem Transkript aus Achlya ambisexualis isoliert. Letzteres besitzt möglicherweise die Funktion eines Steroidrezeptors. Zusätzlich zu den hier beschriebenen Transkripten, können aus dem erstellten PAC-Contig neue Gene auf der Basis von cDNA-Selektion, Exontrapping oder, nach Fertigstellung der gesamten Sequenz, über in silico Analysen identifiziert werden.
Typisch für die Alzheimer' schen Erkrankung ist die Bildung unlöslicher Ablagerungen im Gehirn, sogenannter "seniler Plaques". Diese Plaques bestehen im Wesentlichen aus fibrillärem beta-Amyloid, das durch Glykierungen verändert vorliegen kann. Außerdem beinhalten die Plaques, sogenannte AGEs "Advanced Glycation Endproducts", die aus nichtenzymatisch glykierten Proteinen entstehen. Diese AGE-modifizierten Proteine sowie das fibrilläre beta-Amyloid sind in der Lage Mikrogliazellen zu aktivieren. Die sessilen Gehirnmakrophagen wirken in aktiviertem Zustand neurotoxisch, wobei es verschiedene Hypothesen gibt, wie die Mikrogliazellen zu dem neuronalen Zelltod führen. Um dieses zu untersuchen wurden murine Mikrogliazellen herangezogen, die als Merkmal ihrer Aktivierung auf die Translokation des Transkriptionsfaktors NF-kappa-B in den Zellkern überprüft wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden die Rahmenbedingungen näher untersucht, die zu der AGE vermittelten Mikrogliaaktivierung führen. Es wurde in vitro gezeigt, daß die Mikrogliaaktivierung zunächst durch eine hochmolekulare Hyaluronsäure, wie sie nativ in der extrazellulären Matrix vorliegt, verhindert wird. Im Gegensatz dazu konnte NF-kappa-B in Mikrogliazellen aktiviert werden, die in Gegenwart von Hyaluronsäurefragmenten mit AGE behandelt wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, daß die Mikrogliaaktivierbarkeit umgekehrt proportional zu der durchschnittlichen Hyaluronsäuremolekülgröße ist. Andere Glykosaminoglykane aus der extrazellulären Matrix, wie D-Glukuronsäure, N-Azetylglukosamin oder Chondroitin-4-sulfat reduzierten die Aktivierbarkeit der Mikrogliazellen nur geringfügig. Sowohl beta-Amyloid, als auch AGEs setzen während ihres Entstehungsprozesses reaktive Sauerstoffspezies frei, die Hyaluronsäure in kleinere Bruchstücke zerschneiden können. Die Signaltransduktion der AGE-aktivierten Mikrogliazellen wurde mittels unterschiedlicher Inhibitoren gehemmt und die Auswirkung auf die NF-kappa-B Aktivierung untersucht. Hier zeigte sich ein komplexes Netzwerk an aktivierten Signalwegen, so daß kein Rückschluß auf einen bestimmten Rezeptor möglich war. Daher wurde ein "in vitro Modell" entwickelt, um die ausschlaggebende neurotoxischen Komponenten der Mikrogliareaktion aufzufinden. Darin wurden die Signalkaskaden der aktivierten Mikroglia erneut durch pharmakologische Inhibierung unterbrochen, das zellfreie Medium das von diesen Mikrogliazellen sezerniert wurde, wurde als "konditioniertes Medium" für die Kultur muriner Neuronen eingesetzt. Diese wurden bezüglich ihrer Überlebensrate in diesem konditionierten Medium untersucht. Die Hemmung der Transkription oder der Translation in den Mikrogliazellen zeigte keine Reduktion der neurotoxischen Wirkung des konditionierten Mediums. Ebensowenig wirkten Inhibitoren der mitochondrialen Atmungskette, der Radikalquellen Xanthin Oxidase, Lipoxygenase oder Cyclooxygenase. Die Hemmung der NADPH Oxidase reduzierte die Neurotoxizität des konditionierten Mediums auf etwa 30 Prozent. Die NADPH Oxidase ist ein Enzymkomplex, der im Rahmen des "oxidativen bursts" große Mengen Superoxidanionen freisetzt. Um die Bedeutung der NADPH Oxidase Aktivierung für die neurotoxische Wirkung nachzuweisen, wurde eine Untereinheit der NADPH Oxidase, das membranständige gp91phox in den Mikrogliazellen deaktiviert. Dies führte dazu, daß diese Zellen kein Superoxid auf die Stimulation mit beta-Amyloid oder AGE hin abgaben, im Gegensatz zu den Mikrogliazellen mit funktioneller NADPH Oxidase. Das konditionierte Medium der NADPH Oxidase defizienten Zellen war nicht mehr neurotoxisch. Die freien Sauerstoffradikale die aufgrund der NADPH Oxidase Aktivierung entstehen, können zu einer NF-kappa-B Aktivierung führen. NF-kappa-B wurde erfolgreich in den Mikroglia durch exogenes Wasserstoffperoxid stimuliert, wobei aber keine neurotoxische Wirkung im Modellsystem festgestellt wurde. NF-kappa-B scheint damit nicht für die mikrogliavermittelte Neurotoxizität verantwortlich zu sein, im Gegensatz zu der NADPH Oxidase, deren Aktivität unmittelbar mit der Neurotoxizität korreliert ist.