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Aufgrund ihrer Charakteristika stellen die Lentiviren besonders gut geeignete Vektoren für den Gentransfer in eukaryotische Zellen dar. Lentivirale Vektoren sind in der Lage ruhende und sich nicht teilende Zellen zu infizieren und ihr genetisches Material in das Zielzellgenom zu integrieren. Dies führt zu einer stabilen Expression des Zielgens in den infizierten Zellen und deren Tochterzellen. In den vergangenen Jahren wurden eine Reihe replikationsinkompetenter lentiviraler Vektoren für verschiedene Studien, meist für gentherapeutische Ansätze, hergestellt. Replikationsinkompetente Vektoren sind in der Lage Zielzellen einmalig zu infizieren, können aber in den Zielzellen nicht weiter replizieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein auf HIV-1 basierendes replikationsinkompetentes Vektorsystem etabliert. Mit Hilfe des replikationsinkompetenten Vektorsystems wurde eine rasch durchführbare phänotypische Resistenztestung etabliert, welche für die Messung der Sensitivität von HIV gegen antivirale Inhibitoren geeignet ist. Die Transduktionseffizienz wurde durch den Einbau eines Markergens in das Vektorsystem untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass mit dem Vektorsystem Zielzellen mit hoher Effizienz transduziert werden können. Inhibitoren gegen die virale Protease, Reverse Transkriptase und Integrase waren in der Lage die Transduktion auf konzentrationsabhängige Weise zu reduzieren. In das Vektorsystem konnten PR- und RT-Sequenzen sowohl von viralen Isolaten als auch von Patienten eingesetzt werden und deren Sensitivität bzw. Resistenz gegen die zur Zeit zur Verfügung stehenden Medikamente konnten nachgewiesen werden. Da das hergestellte Vektorsystem den wichtigen Sicherheitsmaßnahmen entspricht, stellt dieses eine sichere Alternative zur Testung der Wirksamkeit von antiviralen Substanzen bei HIV-infizierten Patienten dar. Unter Verwendung des replikationsinkompetenten Vektorsystems konnte die Testung unter biologischer Sicherheitstufe 2 innerhalb von zwei Wochen ausgeführt werden. Damit wurden die bislang zur Verfügung stehenden phänotypischen Resistenztestungen deutlich verbessert. In dieser Arbeit wurde außerdem untersucht, ob das Foamyvirus (FV) Hüllprotein (Env) in der Lage ist, lentivirale Partikel zu pseudotypisieren und welche Bereiche des Hüllproteins für die Pseudotypisierung notwendig sind. Es wurde festgestellt, dass HIV-Kapside mit dem Hüllprotein des Felinen Foamyvirus (FFV) mit sehr hoher Effizienz pseudotypisiert werden können. Das Hüllprotein der Primaten Foamyviren konnte die Pseudotypisierung von lentiviralen Partikel nicht unterstützen. Mit Hilfe verschiedener Mutanten wurde gezeigt, dass bei der Pseudotypisierung das Signalpeptid (SP) eine wichtige Rolle spielt. Die Unterschiede in der Effizienz der Pseudotypisierung zwischen Hüllproteinen von FV verschiedener Spezies wurden primär durch das jeweilige SP bedingt. Aufgrund seines breiten Wirtsspektrum und der Konzentrierbarkeit bietet das FFV-Env eine attraktive Alternative zu herkömmlich verwendeten Hüllproteinen bei der Produktion und Anwendung von HIV-Vektoren.
Die Isolierung von Phagosomen ermöglicht die biochemische Analyse der Phagosomen-Zusammensetzung sowie der an der Phagosomenreifung beteiligten Moleküle. Deshalb wurde im Rahmen dieser Promotionsarbeit eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, Bakterien-enthaltende Phagosomen zu isolieren. Diese Methode erzielt im Vergleich zu anderen in der Literatur beschriebenen Methoden eine gute Ausbeute (fast 40 Prozent) und vor allem eine höhere Reinheit an Bakterien-enthaltenden Phagosomen. So besteht keine Kontamination mit Teilen des Golgi-Apparates und nur eine sehr geringe Kontamination mit endosomalen und lysosomalen Proteinen sowie Plasmamembranbestandteilen. Allerdings wurde eine Kontamination mit Mitochondrien und ER detektiert. Letzteres muss nicht unbedingt eine Kontamination darstellen, sondern könnte ein wichtiger Bestandteil von Phagosomen sein. Afipia felis ist ein Gram-negatives Bakterium, das für einige Fälle der Katzen-Kratz Krankheit verantwortlich ist. Es kann innerhalb von Makrophagen überleben und sich vermehren. Die genaue Kompartimentierung der Afipia felis-enthaltenden Phagosomen in Makrophagen war allerdings unbekannt und sollte deshalb in der vorliegenden Promotionsarbeit analysiert werden. Ovalbumin Texas Red, mit dem Lysosomen vor der Infektion markiert wurden, gelangt nicht in die Afipien-enthaltenden Phagosomen, und die Afipien-enthaltenden Phagosomen sind auch nicht zugänglich für Ovalbumin Texas Red, mit dem das gesamte endozytische System nach der etablierten Infektion markiert wurde. Außerdem sind etablierte, isolierte Afipia felis-enthaltende Phagosomen nur in geringem Umfang positiv für spät endosomale/lysosomale Markerproteine und negativ für früh endosomale Markerproteine. Die Afipien, die ein nicht endozytisches Kompartiment etablieren, werden vom Makrophagen in ein EEA1-negatives Kompartiment aufgenommen, das auch zu späteren Zeitpunkten negativ für LAMP-1 ist. Nur die circa 30 Prozent der Afipien, die sich in einem Kompartiment befinden, das zum endozytischen System gehört, gelangen nach der Aufnahme durch den Makrophagen in ein EEA1-positives Kompartiment, das zu einem späteren Zeitpunkt positiv für LAMP-1 wird. Tötung der Afipien oder Opsonisierung mit Antikörpern vor der Infektion normalisiert die Reifung der Afipia felis-enthaltenden Phagosomen in den J774E-Makrophagen. Somit konnte nachgewiesen werden, dass die Mehrzahl der Phagosomen (70 Prozent), die Afipia felis enthalten, nicht zum endozytischen System gehören. Diese ungewöhnliche Kompartimentierung besteht bereits bei der Aufnahme und kann nur von lebenden Afipien etabliert werden. Rhodococcus equi ist ein Gram-positives Bakterium, das unter anderem Bronchopneumonien beim Fohlen verursacht. Aber auch Menschen und andere Säugetiere sind von Infektionen mit R. equi betroffen. Die Fähigkeit der Rhodokokken, innerhalb der Makrophagen zu überleben und sich zu vermehren, ist mit dem Vorhandensein eines 85 kbp Plasmids assoziiert. Da über die genaue Kompartimentierung von R. equi im Mausmakrophagen wenig bekannt war, und der Frage, ob es einen Unterschied zwischen der Kompartimentierung von R. equi(+)- und R. equi(-)-enthaltenden Phagosomen gibt, noch nicht nachgegangen wurde, war beides Thema dieser Promotionsarbeit. Dabei zeigt sich, dass R. equi(-)-enthaltende Phagosomen wesentlich stärker mit den spät endosomalen/lysosomalen Markerproteinen vATPase und LAMP-1 assoziiert sind sowie eine höhere ß-Galaktosidase-Aktivität aufweisen als die R. equi(+)-enthaltenden Phagosomen. Da sowohl die isolierten R. equi(-)- als auch die R. equi(+)-enthaltenden Phagosomen mit dem früh endosomalen Markerprotein rab5 assoziiert sind, ist anzunehmen, dass Rhodokokken unabhängig vom Vorhandensein des 85 kbp Plasmids in der Lage sind, die Phagosomenreifung zu verzögern. Aber R. equi(-) kann die Reifung zwar verzögern, aber letztendlich nicht verhindern. Wahrscheinlich reifen die Phagosomen, die R. equi(-) enthalten, zu einem späteren Zeitpunkt zu Phagolysosomen, wohingegen R. equi(+) ein ungewöhnliches Kompartiment etabliert und dadurch die Phagosomenreifung endgültig zu verhindern scheint. Somit ist anzunehmen, dass mindestens ein vom 85 kbp Plasmid kodiertes Molekül für die Etablierung dieses ungewöhnlichen, R. equi(+)-enthaltenden Kompartimentes, verantwortlich ist. Da eine Infektion mit Rhodococcus equi zytotoxisch für die infizierte Zelle sein kann, wurde die von den Rhodokokken vermittelte Zytotoxizität näher analysiert. Die in dieser vorliegenden Promotionsarbeit dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich, dass nur die Plasmid-enthaltenden Rhodokokken zur Nekrose, aber nicht zur Apoptose ihrer Wirtszellen führen, während R. equi(-) keinen Einfluss auf die Vitalität ihrer Wirtszellen haben. Dieses Phänomen ist allerdings abhängig vom Wirtszelltyp. So sind R. equi(-) als auch R. equi(+) für humane Monozyten nur geringfügig zytotoxisch.
Umstellungsosteotomien des Unterkiefers Eine retrospektive Analyse des Patientengutes von 1981-1995 an der Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer-, Gesichtschirurgie der Universität Würzburg Die retrospektive Betrachtung des Krankengutes von 1981-1995 bezüglich der Diagnostik, Therapie und Verläufe von Patienten mit Fehlbildungen und Entwicklungsstörungen des Unterkiefers war nach der Erstellung eines standardisierten Datenerhebungsbogen und der Verwendung eines relationalen Datenbank-Managementsystemes, MS-Access 2.0, möglich. Statistische Berechnungen wurden mit dem Chi²-Test sowie dem t-Test mit einem Signifikanzniveau von p<0,05 durchgeführt. 465 Patienten hatten sich einer sagittalen Spaltung des Unterkiefers und 35 weitere einer anterioren subapikalen Segmentosteotomie des Unterkiefers unterzogen. Auffallend war ein geschlechtsunabhängiger signifikanter Anstieg des Durchschnittsalters von 21,3±6,9 auf 27,4±7,8 Jahre sowie das mit 71,0 Prozent deutliche Überwiegen weiblicher Patienten gegenüber 29,0 Prozent männlicher Patienten. Die Auswertung der Daten ergab in 67,8 Prozent der Fälle eine Distalbiss- und bei 11,8 Prozent der Patienten eine Progeniekorrektur. Es konnte eine Gesamtosteoplastikrate nach anteriorer Segmentosteotomie des Unterkiefers von 40,0 Prozent festgestellt werden, die statistisch signifikant höher war als die entsprechende Quote von 8,0 Prozent nach sagittaler Spaltung des Unterkiefers. Ein Richtwert des Ausmaßes der Verlagerung für die Entscheidung pro oder contra Osteoplastik konnte allerdings nicht ermittelt werden. In 28 Fällen, 5,6 Prozent, wurden Mittelgesichtshypoplasien durch Augmentation korrigiert. 1985 wurde die zentrale Kondylenpositionierung und eine rigide Osteosynthese mit übungsstabilen Positionsschrauben eingeführt. Der stationäre Aufenthalt wurde signifikant von 22,2 ±7,6 auf 10,8±2,4 Tage gekürzt. Es wurden alle Komplikationen und Besonderheiten ermittelt, die während oder nach dem operativen Eingriff zur Dysgnathiekorrektur oder zur Entfernung des Osteosynthesematerials eintraten. Das Risiko einer Verletzung des Nervus alveolaris inferior ist im Rahmen einer Segmentosteotomie mit 5,7 Prozent höher, aber nicht signifikant, als bei sagittalen Spaltungen des Unterkiefers. In 2 Fällen (0,0 Prozent) wurde nach der operativen Korrektur zeitweilig eine Fazialisparese dokumentiert. Die Wundinfektionsrate (2,2 Prozent) ist mit antibiotischer Prophylaxe sehr gering.
Zur Messung von visuell evozierten Potentialen ist eine gute Aufmerksamkeit während der Messung notwendig, die jedoch vor allem bei Kindern nicht immer gewährleistet ist. Unser Ziel war es, unter standardisierten Meßbedingungen im klinischen Routinebetrieb eine kindgerechte Meßmethode zu entwickeln, die eine Verbesserung der Aufmerksamkeit ermöglicht. Gleichzeitig sollte die Kontrolle der Aufmerksamkeit verbessert werden. Zusätzlich prüften wir die Meßergebnisse auf ihre Reproduzierbarkeit und untersuchten, ob das VEP bei Kindern unter klinischen Routinebedingungen in unserem Labor eingesetzt werden kann. Wir entwarfen dazu eine Bildergeschichte, die zur Ablenkung während der Meßvorbereitungen dient und die Kinder auf die Meßbedingungen einstimmt. Zusätzlich entwickelten wir ein sog. Aufmerksamkeits-Spiel, das eine gute Fixation auf den Bildschirm erfordert. Die Schwierigkeit der dabei zu lösenden Aufgaben wurde adaptiv angepaßt. Die bei der Aufgabe berechenbare Schwellenzeit war ein Maß zur Beurteilung der Aufmerksamkeit. Die an der Untersuchung teilnehmenden Schielpatienten unserer Sehschule wurden in eine Kindergruppe und eine Erwachsenengruppe eingeteilt. Eine Gruppe von Normalpersonen diente als Vergleichsgruppe zu den erwachsenen Patienten. Abgeleitet wurde ein bipolares VEP nach dem Standard der ISCEV. Die absoluten Werte von Amplitude und Latenz entsprachen den in der Literatur beschriebenen Werten und bei der monokularen Ableitung des Muster-VEPs entsprachen die Meßergebnisse der Schielpatienten denen der Normalpersonen. Zur Beurteilung der Reproduzierbarkeit der Meßergebnisse werteten wir den relativen Variationskoeffizienten aus. Dieser lag für die Latenz fast um das Zehnfache niedriger als der relative Variationskoeffizient der Amplitude. Bei Kindern war der relative Variationskoeffizient doppelt so groß wie bei Normalpersonen. Die Reproduzierbarkeit der Meßergebnisse war demnach nur halb so gut. Der Variationskoeffizient der Erwachsenen lag etwas höher als bei den Normalpersonen. Das Aufmerksamkeits-Spiel konnte von fast allen Kindern ab 6 Jahren gelöst werden. Die kindgerechte Gestaltung der standardisierten Versuchsbedingungen mit der Bildergeschichte und dem Aufmerksamkeits-Spiel ermöglicht deshalb den Einsatz der Muster-VEP-Messung im klinischen Routinebetrieb für Kinder ab 6 Jahren. In Einzelfällen können auch jüngere Kinder gemessen werden. Die Schwellenzeit war bei Kindern im Mittel wesentlich höher als bei Erwachsenen und Normalpersonen, d.h. die Aufmerksamkeit war bei ihnen wesentlich schlechter. Die Reproduzierbarkeit der Amplitude nahm mit zunehmender Schwellenzeit ab, die Reproduzierbarkeit der Latenz war unabhängig von der Schwellenzeit. Standardisierte VEP-Messungen unter klinischen Routinebedingungen können damit durch die kindgerechte Gestaltung der Untersuchungsbedingungen auch bei Kindern ab 6 Jahren durchgeführt werden. Die Beurteilung der Aufmerksamkeit konnte durch das Aufmerksamkeits-Spiel verbessert werden.
Ophtalmologische Krankheitsbilder, die mit Degeneration oder erblichen Dystrophien der Retina einhergehen, führen in vielen Fällen zur Erblindung und stellen daher ein großes Problem in der Augenheilkunde dar. Als Korrelat des Zellverlustes wurde der apoptotische Zelltod identifiziert. Die Schritte, die zwischen der Genmutation und dem funktionellen Defizit in der Zelle liegen sowie die Signalketten, die letztlich zur Entscheidung zum Zelltod führen, sind noch relativ unklar. Im Zusammenhang mit der Frage, welche Gene die molekulargenetische Grundlage für den Vorgang der Apoptose in Zellen der menschlichen Netzhaut bilden, wurde in dieser Arbeit die Frage untersucht, ob in der humanen Pigmentepithelzellinie ARPE-19 die Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase produziert werden und ob die Genexpression dieser Metalloproteinasen durch eine Behandlung der Zellen mit humanen Interferonen stimuliert werden kann. Der Nachweis sollte auf der mRNA-Ebene erfolgen. Als Nachweismethoden dienten die Northern-blot-Analyse, wobei für die Hybridisierung Digoxigenin-markierte antisense-RNA verwendet wurde, die durch in vitro-Transkription gewonnen wurde, sowie die RT-PCR. Als Modell diente die ARPE-19-Zelle, die sich durch ihre epitheliale Morphologie und rasche Proliferationsrate von anderen primären RPE-Kulturen unterscheidet . Als Kontrolle wurden humane Fibroblasten sowie Gliomazellen verwendet. Mit der Northern-blot-Analyse konnte in der ARPE-19-Zelle die mRNA der Metalloproteinase Collagenase nicht nachgewiesen werden. Der Versuch, eine eventuell sehr geringe mRNA-Menge durch Behandlung mit Interferon alpha und gamma über die Nachweisgrenze zu erhöhen, erbrachte ebenfalls ein negatives Ergebnis. Für die Untersuchung von Stromelysin 1 wurde auf die sensiblere Methode der RT-PCR übergegangen. Während Stromelysin 1 in den Kontrollzellen nachgewiesen werden konnte, konnte auch mit der RT-PCR-Methode in der ARPE-19-Zelle Stromelysin 1 nicht nachgewiesen werden. Daher muss davon ausgegangen werden, dass die ARPE-19-Zelle durch die Anzahl der Passagen, der sie während der Zellkultur unterzogen wurde, zwar nicht immortalisierte, jedoch eine gewisse Zahl von Genen abschaltete, zu denen auch die Gene der hier untersuchten Metalloproteinasen Collagenase und Stromelysin gehören, oder dass die Zellinie nicht den komplett identischen Chromosomensatz einer originären retinalen Pigmentepithelzelle besitzt. Die Tatsache, daß hochspezialisierte Zellen bei oftmaligem Passagieren ihre spezialisierten Eigenschaften verlieren, kann in der Forschung häufig beobachtet werden. Offenbar ist die in Kultur gehaltene ARPE-19-Zelle eine in ihrer transkriptionellen Aktivität extrem reduzierte Zelle, bei der auch die Transkription der Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase abgeschaltet ist.
Einhundertvierundvierzig STEC-Stämme von Patienten mit hämolytisch-urämischem Syndrom (68 Stämme), von Durchfallpatienten (42 Stämme) und von asymptomatischen Ausscheidern (44 Stämme) wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Antibiotika-empfindlichkeit hin untersucht. Zu den insgesamt 13 getesteten Antibiotika zählten die ß-Laktam Antibiotika Ampicillin, Piperacillin, Cefotaxim, Ceftazidim, Cefotiam und Imipenem, die Aminoglykoside Gentamicin und Streptomycin, die Gyrasehemmer Ofloxacin und Ciprofloxacin sowie Tetracyclin, Chlorampenicol und die Sulfamethoxazol/Trimethoprim-Kombination Cotrimoxazol. Alle E. coli O157 Stämme, die von Patienten mit HUS isoliert wurden, waren sensibel gegen die getesteten Antibiotika. Lediglich ein E. coli O157 Stamm, der von einem Durchfall-Patienten isoliert wurde, zeigte eine Resistenz gegen Tetracyclin. Allgemein häufiger wurden Antibiotikaresistenzen bei non-O157 Stämmen gefunden. Fünf von 22 non-O157 Stämmen, die von HUS-Patienten isolierten wurden, zeigten mindestens eine Resistenz gegen die getesteten Antibiotika. Vierzehn von fünfunddreißig non-O157 E. coli Stämmen, die sowohl von Durchfall-Patienten als auch von asymptomatischen Ausscheidern stammten, konnten sowohl Einfachresistenzen als auch Multiresistenzen aufweisen. Die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) zeigte, daß alle resistente Stämme einen extrem hohen Resistenzstatus besitzen. Sowohl ß-Laktam als auch Tetracyclin Resistenzen konnten mittels Konjugation auf einen E. coli-Laborstamm übertragen werden. Dies läßt die Anwesenheit von R-Plasmiden vermuten. Die Tatsache, daß über 12 Prozent Shigatoxin produzierender E. coli Stämme aus humanen Stuhlproben Antibiotikaresistenzen aufweisen, hat klinische und epidemiologische Bedeutung. Resistente STEC-Stämme hätten einen selektiven Vorteil gegenüber anderen koliformen Bakterien in Mastbetrieben, die Antibiotika dem Futtermittel beimengen. Hieraus wiederum steigt die Gefahr einer potentiellen Übertragung resistenter Pathogene auf den Menschen. Auf der anderen Seite könnte die ansteigende Anzahl Antibiotika-resistenter Stämme zu einer rasch durchführbaren epidemiologischen Nachweismethode führen.
Candida dubliniensis ist eine 1995 erstmals beschriebene pathogene Hefespezies mit enger phylogenetischer Verwandtschaft zu Candida albicans. Sie wird mittels routinemäßig angewendeter Verfahren nicht von C. albicans unterschieden, weil sie als einzige Spezies im Genus Candida neben C. albicans Chlamydosporen ausbilden kann. C. dubliniensis ist bisher vor allem aus dem Oropharynx HIV-positiver Patienten isoliert worden. PHR1 und PHR2 sind funktionell homologe, pH-abhängig exprimierte Gene von C. albicans, deren Produkte essentiell für die Verknüpfung von b-1,3- und b-1,6-Glukan in der Zellwand sind. Die Deletion jedes dieser Gene führt zu einem pH-abhängigen Phänotyp mit aberranter Morphogenese in vitro und reduzierter Virulenz im Tiermodell. In dieser Arbeit werden PHR homologe Gene im Genom von C. dubliniensis charakterisiert. CdPHR1 weist eine Homologie von 90,5 Prozent zu PHR1 und CdPHR2 eine Homologie von 91,7 Prozent zu PHR2 auf. Wie PHR1 wird auch CdPHR1 nur unter neutralen und alkalischen Bedingungen exprimiert, während sich CdPHR2 Transkript, wie das von PHR2, nur unter sauren Bedingungen nachweisen lässt. Die funktionelle Homologie von CdPHR1 zu PHR1 wird durch Komplementation des Phänotyps einer C. albicans phr1 Mutante mit CdPHR1 gezeigt. Dabei erweist sich der native Promoter von CdPHR1 als funktional in C. albicans. Im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae wird CdPHR1 unter Kontrolle seines nativen Promotors dagegen pH-unabhängig exprimiert. Auch die zusätzliche Einführung eines mutierten, dominant aktiven Allels von RIM101, das in C. albicans für die pH-abhängige Genexpression verantwortlich ist, hat darauf keinen Einfluss. In C. glabrata und Aspergillus nidulans findet sich keine Expression von CdPHR1. Basierend auf Sequenzunterschieden zwischen PHR1 und CdPHR1 wird ein PCR-Schnelltest zur Speziesunterscheidung entwickelt. Dieser wird in einer epidemiologischen Studie mit 133 chlamydosporenpositiven klinischen Isolaten evaluiert. 21 oropharyngeale Isolate von 14 HIV-positiven Patienten können so retrospektiv als C. dubliniensis klassifiziert werden, dies entspricht einer Prävalenz von C. dubliniensis in diesem Kollektiv von 30 Prozent. Die Ergebnisse der PCR werden durch Sequenzierung ribosomaler Gene (V3, ITS1, ITS2) bestätigt. Parallel werden phänotypische Tests zur Identifizierung von C. dubliniensis auf ihre diagnostische Validität getestet. Während sich die Chlamydosporenmorphologie der Isolate und die Koloniefärbung auf dem Farbindikatormedium CHROMagar Candida als unzulänglich für die Unterscheidung erweisen und das für C. dubliniensis beschriebene Wachstumsdefizit bei 45°C zwar sensitiv, nicht aber spezifisch für die Identifizierung dieser Spezies ist, korreliert die Koloniemorphologie auf Staib-Agar zu 100 Prozent mit den molekularen Daten. Alle C. dubliniensis Isolate werden in einem biochemischen Assay (Micronaut RC) untersucht, dabei zeigt der Test auf b-Glukosidase Aktivität hohes diskriminatorisches Potenzial. In Resistenztestungen zeigen sich die C. dubliniensis Isolate sensibler als die oropharyngealen C. albicans Isolate gegen gebräuchliche Antimykotika. In dieser Studie kann gezeigt werden, dass C. dubliniensis und C. albicans auf teilweise austauschbare Mechanismen zur Reaktion auf Alterationen des pH-Milieus verfügen. Die pH-abhängige Regulation zellwandassoziierter Gene ist dabei eng mit morphogenetischen Prozessen verbunden. Trotz dieser Ähnlichkeit ist C. dubliniensis nicht nur weniger virulent als C. albicans, sondern zeigt auch ein unterschiedliches epidemiologisches Spektrum, das durch eine Spezialisierung auf oropharyngeale Kolonisation und Infektion bei HIV-positiven Patienten gekennzeichnet ist. Um die Gründe für diese Unterschiede aufzeigen zu können, ist eine verlässliche Identifizierung von C. dubliniensis notwendig. Dazu stellen die präsentierten Daten einerseits einen schnellen und verlässlichen PCR Test, andererseits eine sorgfältige Evaluierung derzeit gebräuchlicher phänotypischer Verfahren vor. Phänotypisch und genotypisch exzellent charakterisierte Isolate beider Spezies stehen für weitere Untersuchungen zur Verfügung.
Die Abschätzung des individuellen Rezidiv- und Progressrisikos eines Patienten mit einem Nierenzellkarzinom gelingt durch Bestimmung von Staging und Grading nur unzureichend. Ziel der durchgeführten Untersuchung war es neben etablierten Prognoseparametern wie Staging und Grading eines Nierentumors die VEGF-Immunreaktivität zu untersuchen und auf seine Tauglichkeit als Prognoseparameter zu überprüfen. Hierzu wurden parafin-fixierte Präparate von 200 Patienten, die an der Urologischen Universitätsklinik Würzburg zwischen 1985 und 1994 tumornephrektomiert wurden, immunhistochemisch untersucht. Zu allen Patienten ist ein postoperativer Verlauf bekannt. Die Präparate wurden zunächst nach der Avidin-Biotin-Methode gefärbt und zur Auswertung vorbereitet. Für jedes Präparat wurde nun der prozentuale Anteil der VEGF-positiven Zellen im Tumor durch zwei unabhängige Untersucher bestimmt. Als Mass der Prognose (abhängige Variable) wurden Überlebenszeit und rezidivfreie Zeit nach Tumornephrektomie gewählt. Als prognostische Parameter (unabhängige Variable) dienten die etablierten Faktoren wie Staging und Grading sowie der potentiell relevante Faktor VEGF. VEGF erwies sich, im Präparat immunhostochemisch gemessen, als statistisch signifikanter Prognosefaktor, der aber den klassischen Faktoren unterlegen ist. In einer multivariaten Prognoseanalyse und in einer Berechnung von Prognoseindizes sowie Receiver Operating Characteristics (ROC)-Kurven konnte gezeigt werden, dass eine Kombination der etablierten Prognosefaktoren mit VEGF eine statistisch signifikante Steigerung der Vorhersagegenauigkeit erreicht
Die vorliegende Arbeit untersucht, ob mit zunehmendem Alter während der Mitose häufiger Geschlechtschromsomen verlorengehen. Die Beobachtungen erfolgten an Lymphozytenkulturen gesunder weiblicher und männlicher Probanden aus drei verschiedenen Altersgruppen. Unter Zugabe von 5-Azadeoxycytidin, einem Nukleosidanalogon, ergab sich in den höheren Altersgruppen ein verstärktes Auftreten von Mikronuklei. Mikronuklei enthalten Chromosomen oder -bruchstücke, die während der Mitose nicht in die Tochterzellkerne integriert wurden. Mittels in situ Hybridisierung konnte in den Mikronuklei der Frauen zu 5,5 Prozent ein X-Chromosom, bei den Männern mit 10,7 Prozent überzufällig häufig ein Y-Chromosom nachgewiesen werden. Zwischen den einzelnen Altersstufen änderte sich dieser Anteil nicht wesentlich. 5-Azadeoxycytidin wird als Nukleosidanalogon während der Replikation in die DNA eingebaut und verhindert die Methylierung des Tochterstrangs, da ein Kohlenstoffatom im Pyrimidinrings durch ein Stickstoffatom substituiert ist. Wahrscheinlich resultiert aus der Hyomethylierung eine falsche "Verpackung" des Gonosoms während der Mitose, dadurch erfolgt eine fehlerhafte Aufteilung des Chromosoms mit Bildung eines Mikronukleus.
Phytoprostane F1
(2001)
Isoprostane F2 sind Autoxidationsprodukte der Arachidonsäure, die über radikal-katalysierte Oxidation entstehen. Bei einigen Erkrankungen im Tier konnte gezeigt werden, daß die Konzentration von Isoprostanen F2 mit dem verstärkten Vorkommen von freien Radikalen korreliert, weshalb Isoprostane heute als Marker des oxidativen Streß genutzt werden. Darüber hinaus weisen einige Isoprostane eine biologische Aktivität auf, weshalb sie heute als Signalstoffe des oxidativen Streß im Tier diskutiert werden. Pflanzen hingegen können keine Isoprostane F2 synthetisieren, da ihnen der Precursor Arachidonsäure fehlt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, daß analog zu den Isoprostanen F2 Phytoprostane F1 in Pflanzen aus Linolensäure gebildet werden. Hierfür wurden HPLC- und Gaschromatographie-Massenspektroskopie-Methoden entwickelt, die eine Quantifizierung von Phytoprostanen F1 in Pflanzen ermöglichten. In frischen Pflanzenorganen wurden Phytoprostane F1 sowohl in freier als auch in veresterter Form detektiert. Darüber hinaus stieg die Konzentration sowohl freier als auch veresterter Phytoprostane F1 in Pfefferminzblättern nach Verwundung und in pflanzlichen Zellkulturen nach Zusatz von Agentien, von denen bekannt ist, daß sie pflanzliche Zellen oxidativ schädigen, an. In getrockneten Pflanzenmaterialien wurden extrem hohe Konzentrationen an Phytoprostanen F1 quantifiziert. Daher steht die Vermutung nahe, daß Phytoprostane F1 ähnlich wie die Isoprostane F2 im Tier als sensitiver Marker der oxidativen Zellverletzung in der Pflanze eingesetzt werden können. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß der Zusatz von Phytoprostanen F1 zu Eschscholzia californica-, Crotalaria cobalticola- and Thalictrum tuberosum-Zellsuspensionskulturen zu einer Phytoalexinakkumulation führte.