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Different effects of conditional Knock-Out of Stat3 on the sensory epithelium of the Organ of Corti
(2024)
The mammalian cochlea detects sound in response to vibration at frequency-dependent positions along the cochlea duct. The sensory outer hair cells, which are surrounded by supporting cells, act as a signal amplifier by changing their cell length. This is called electromotility. To ensure correct electrical transmission during mechanical forces, a certain resistance of the sensory epithelium is a prerequisite for correct transduction of auditory information. This resistance is managed by microtubules and its posttranslational modification in the supporting cells of the sensory epithelium of the cochlea. Stat3 is a transcription factor, with its different phosphorylation sites, is involved in many cellular processes like differentiation, inflammation, cell survival and microtubule dynamics, depending on cell type and activated pathway. While Stat3 has a wide range of intracellular roles, the question arose, how and if Stat3 is involved in cells of the organ of Corti to ensure a correct hearing.
To test this, Cre/loxp system were used to perform conditional Knock-Out (cKO) of Stat3 in outer hair cells or supporting cells either before hearing onset or after hearing onset. Hearing performances included DPOAE and ABR measurements, while molecular were performed by sequencing. Additionally, morphological examination was used by immunohistochemistry and electron microscopy.
A cKO of Stat3 before and after hearing onset in outer hair cells leads to hearing impairments, whereas synapses, nerve fibers and mitochondria were not affected. Bulk sequencing analyzation of outer hair cells out of cKO mice before hearing onset resulted in a disturbance of cellular homeostasis and extracellular signals. A cKO of Stat3 in the outer hair cells after hearing onset resulted in inflammatory signaling pathway with increased cytokine production and upregulation of NF-kb pathway. In supporting cells, cKO of Stat3 only after hearing onset resulted in a hearing impairment. However, synapses, nerve soma and fibers were not affected of a cKO of Stat3 in supporting cells. Nevertheless, detyronisated modification of microtubules were altered, which can lead to an instability of supporting cells during hearing.
In conclusion, Stat3 likely interact in a cell-specific and function-specific manner in cells of the organ of Corti. While a cKO in outer hair cells resulted in increased cytokine production, supporting cells altered its stability due to decreased detyronisated modification of microtubules. Together the results indicated that Stat3 is an important protein for hearing performances. However, additional investigations of the molecular mechanism are needed to understand the role of Stat3 in the cells of the organ of Corti.
Der Hörsinn ist für uns Menschen von entscheidender Bedeutung, um mit der Umwelt kommunizieren zu können. Hörstörungen werden dabei in sensorineurale Erkrankungen der neuronalen Strukturen und nicht-sensorineurale Schallleitungsschwerhörigkeiten unterschieden.
In der vorliegenden Studie sollte es darum gehen zu untersuchen, inwiefern ein neues konditionelles Mausmodell, die Brn3.1 IRES Cre Maus, und ein bestehendes Mausmodell, die pmn-Maus, sich eignen, um die Erkrankung der auditorischen Neuropathie nachzubilden. Die Brn3.1 IRES Cre Maus wurde zur Evaluation der Expression von Cre-Rekombinase unter der Aktivität des Brn3.1 Promotors mit gefloxten Reporter-Mauslinien verkreuzt. Die pmn-Maus ist ein anerkanntes Modell einer Motoneuronerkrankung, hatte aber in vorherigen Untersuchungen erhöhte Hörschwellen gezeigt.
Alle verwendeten Mauslinien wurden mittels ABR und DPOAE frequenzspezifisch untersucht, um die Funktion der Haarzellen im Corti´schen Organ zu evaluieren. Bei der pmn-Linie wurden die audiologischen Untersuchungen wöchentlich zwischen P21 und P35 durchgeführt. Zusätzlich wurde das Corti´sche Organ zu diesen Zeitpunkten morphologisch untersucht.
Es zeigte sich, dass alle verwendeten Mauslinien unauffällige Hörschwellen verglichen zur Backgroundlinie C57BL/6 hatten sowie DPOAE-Antworten zeigten. Die Verkreuzung der Brn3.1 IRES Cre Linie mit den beiden Reporterlinien zeigte eine nachweisbare Cre-Rekombinase-Expression unter der Aktivität des Brn3.1 Promotors nur an den postnatalen Tagen P14 und P21. Diese Expression erfolgte mosaikartig in den äußeren Haarzellen. Mit Hilfe einer RT-PCR wurde eine Diskrepanz zwischen Genotyp und Expression des Reporterproteins im Gewebe festgestellt. Dies ließ vermuten, dass die Expression von Cre-Rekombinase durch gene silencing Prozesse unterdrückt wurde und Brn3.1 als Promotor nicht leistungsstark genug war, um eine Cre-Rekombinase-Expression steuern zu können.
Die pmn-Linie zeigte in ABR-Untersuchungen bereits zum Zeitpunkt P21 erhöhte Hörschwellen in allen untersuchten Frequenzen im Vergleich zum Wildtyp. DPOAE-Antworten waren in der pmn-Linie nur bedingt auslösbar. Es zeigte sich in der morphologischen Evaluation ein Verlust von äußeren Haarzellen über die gesamte Länge des Corti´schen Organes. Durch einen TUNEL-Assay konnte das Absterben dieser Zellen durch apoptotische Vorgänge nachgewiesen werden. Der pmn-Phänotyp entsteht durch eine Mutation im TBCE Gen. Dieses Gen kodiert für ein Protein, welches einen stabilisierenden Einfluss auf die Organisation der Mikrotubuli hat. Die TBCE-Verteilung im Corti´schen Organ zeigte, dass dieses hauptsächlich in den äußeren Haarzellen und inneren Stützzellen exprimiert wird und damit wahrscheinlich einen bedeutenden Einfluss auf die Erhaltung der Haarzellen hat. Eine Analyse des Hörnervs zeigte einen Verlust von Mikrotubuli.
Neben diesen in vivo Untersuchungen sollte außerdem eine gliazellfreie Kultur von dissoziierten auditorischen Neuronen etabliert werden. Hierfür wurden mehrere Faktoren einer Primärzellkultur in Bezug auf ihren Einfluss auf die Gesamtzellzahl, den prozentualen Neuronanteil und die Axonlänge der Neurone untersucht. Das Medium, die Beschichtung des Zellkulturgefäßes, die Gabe von Neurotrophinen/Zytokinen und der Einsatz eines Zytostatikums wurden separat untersucht. Es zeigte sich, dass das Medium, die Beschichtung und Neurotrophin-/Zytokingabe hauptsächlich einen Einfluss auf das axonale Längenwachstum von Neuronen haben. Den Prozentsatz der Neurone beeinflusste nur der Einsatz des Zytostatikums Cytosin-β-D-arabinofuranosid (AraC) signifikant. Die Ergebnisse wurden auch im Zusammenhang mit der reellen Neuronanzahl in Kultur gesehen.
Es ergab sich weiterhin eine Präferenz für DMEM- über NB-Medium sowie für zusätzliche Lamininbeschichtung, für den Einsatz des Zytokins LIF gegenüber den neurotrophen Faktoren BDNF und NT-3 und die Gabe des Zytostatikums AraC ab Tag 2 nach Ausplattierung in einer Konzentration von 5-10 µM. Ein kombinatorischer Einsatz dieser Präferenzen spiegelte in Summe die Ergebnisse der Versuchsreihen Neurotrophine/Zytokin und AraC wieder. Der Anteil der Neurone in der Kultur konnte im Durchschnitt auf 10-12 % gesteigert werden. Eine Verschiebung des Glia-/Neuronenanteils zugunsten letzterer ist vermutlich nur durch den Einsatz weiterer Faktoren oder anderer Methoden möglich.
Die untersuchten Mausmodelle zeigten auf Grund der Untersuchungsergebnisse nur teilweise Ähnlichkeiten mit der Erkrankung der auditorischen Neuropathie. Die Erkenntnisse zur pmn-Mauslinie über das frequenzspezifische Hörvermögen und die morphologische Degeneration im Corti´schen Organ im altersabhängigen Verlauf können aber hilfreich sein, um neben der motorischen auch die sensorische Degeneration dieser Pathologie besser zu verstehen. Zudem konnten auch umfassende Erkenntnisse für die Kultur von dissoziierten auditorischen Neuronen der Maus in Bezug auf verschiedene Variablen erhalten werden.