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Veränderung der Tumorimmunumgebung muriner Mamma-Karzinome durch Inhibierung der Kollagensynthese
(2023)
Das Mamma-Karzinom gehört zu den sogenannten desmoplastischen Tumorarten. Hierbei handelt es sich um Tumoren mit erhöhter Ansammlung von Bindegewebszellen und einer Akkumulation von Extrazellulärer Matrix (EZM). Diese verdichtete EZM wirkt sowohl auf mechanischer als auch auf Signalweg-vermittelter Ebene als eine Barriere, welche die therapeutische Wirksamkeit erheblich vermindert.
Einer der Hauptbestandteile der EZM ist Kollagen. Durch Anwendung von Präparaten, welche die Kollagensynthese und -reifung inhibieren, kann die rigide Struktur aufgelockert werden. Daraus ergibt sich eine verbesserte Versorgung mit Nährstoffen und eine verbesserte Infiltrationsmöglichkeit für Immunzellen. Dies ist für die Effizienz der Immuntherapie, welche sich in den letzten Jahren als vielversprechende Alternative zu den Grundsäulen der Krebstherapie entwickelt hat, unabdinglich.
In der vorliegenden Arbeit wurden murine Mamma-Karzinome der 4T1-Linie nach Behandlung mit EZM-destabilisierenden Kollageninhibitoren auf ihre Immunumgebung hin untersucht.
Verwendet wurden drei Wirkstoffe, welche an unterschiedlichen Punkten in die Kollagensynthese und -reifung eingreifen: βAPN als LOX(L)-Inhibitor, 1,4-DPCA als P4HA-Inhibitor und Minoxidil als LH-Inhibitor. Die Behandlung führte zu einem deutlichen Anstieg aller untersuchten Immunzellen und deutet somit auf eine verbesserte Infiltrationsmöglichkeit hin. Zudem wurde die Expression maligner Signalwege, wie die der Angiogenese, Hypoxie, Metastasierungsneigung, Invasivität und Immunsuppression, verringert und tumorsuppressive Immunantworten verstärkt.
Die Kollageninhibition hatte zusätzlich ein verringertes Tumorwachstum und eine Reduktion der Blutgefäßdichte zufolge.
Als Fazit gilt es festzuhalten, dass die Verwendung von Kollageninhibitoren in der Immuntherapie eine vielversprechende Option zur Verbesserung der Effizienz dieser Therapeutika darstellt. Diese Erkenntnis gilt es im Rahmen künftiger wissenschaftlicher Untersuchungen weiterzuentwickeln.
Die Progression der HIV Infektion ist vermutlich bedingt von einer unspezifischen generalisierten Immunaktivierung des Patienten (Sousa, Carneiro et al. 2002; Hazenberg, Otto et al. 2003). Somit könnte ein immunsuppressives Medikament wie das Kortisonpräparat Prednisolon die Progression der Erkrankung verlangsamen. Im Rahmen nicht-kontrollierter Studien konnte die Stabilisierung der CD4+ T-Lymphozyten in HIV-Patienten durch den Einsatz von Kortison beobachtet werden (Andrieu, Lu et al. 1995; Lu, Salerno-Goncalves et al. 1995). Dieser Effekt konnte auch mit niedrig dosiertem Prednisolon (5 mg/Tag) nachgewiesen werden (Ulmer, Muller et al. 2005). Jedoch zeigen neuere Ergebnisse, dass der CD4+ T-Lymphozytenwert bei Studien zu Immunmodulatoren kein verlässlicher Surrogatmarker für die Progression ist (Abrams, Levy et al. 2009). In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob sich zum Einen der stabilisierende Effekt von niedrig dosiertem Prednisolon (5 mg pro Tag) auf CD4+ T-Lymphozyten in einer kontrollierten Studie bestätigt, ob zum Zweiten die CD4+ T-Lymphozytenstabilisierung auf eine Senkung der Immunaktivierung zurückgeführt werden kann und ob zum Dritten die CD4+ TLymphozytenstabilisierung die klinische Krankheitsprogression verlangsamt. Im Rahmen der ProCort-Studie sollte außerdem eine Bestimmung der Prävalenz medikamentenresistenter HIV-Infektionen bei ART unbehandelten Patienten erfolgen. Hierbei wurden die WHO Kriterien überprüft, die als Einschlusskriterien für Patienten in Resistenz-Überwachungsstudien ein Höchstalter von 25 Jahren festgelegt hat. In unserer Untersuchung wurden demgegenüber Proben von Patienten mit höherem Alter und bereits therapierten Partnern analysiert.Methoden: Im Rahmen einer doppelblinden randomisierten klinischen Studie (ProCort1) im Bugando Medical Center (BMC) in Mwanza, Tansania, wurden 326 HIV-Patienten eingeschlossen, die zuvor noch nie mit ART behandelt wurden und einen CD4+ TLymphozytenwert von mindestens 300/μl aufwiesen. In 14 Visiten wurden, während einer zweijährigen Behandlungsdauer entweder mit 5mg Prednisolon täglich oder mit Placebo, die CD4+ T-Lymphozytenwerte und das Auftreten von Progression der HIV-Infektion bestimmt. Primärer Studienendpunkt war die Krankheitsprogression, definiert als ein Unterschreiten von 200 CD4-Zellen/μl oder dem Auftreten AIDS-definierender Erkrankungen. Um die immunologische Wirkungsweise von Prednisolon in HIV-infizierten Patienten zu untersuchen wurden sowohl in den tansanischen Studienpatienten als auch in einer mit 5 mg Prednisolon behandelten deutschen Kohorte die Lymphozytenaktivierungsmarker CD38/HLADR auf CD3/CD8-Zellen, der Monozytenaktivierungsmarker sCD14 und der Entzündungsmarker suPAR bestimmt. Um die Prävalenz der HIV Medikamentenresistenz (HIVDR) in der ProCort Studienpopulation zu ermitteln wurden 88 Proben der ART unbehandelten Patienten sequenziert. Ergebnisse: Die Ergebnisse der ProCort Studie zeigten eine statistisch signifikante Stabilisierung der CD4+ T-Lymphozytenwerte im Vergleich zum Ausgangswert durch Einsatz einer niedrig dosierten Prednisolonbehandlung (5 mg täglich). In der Intent to treat Analyse wurde ein Zugewinn von +20,1 Zellen/μl pro Jahr für den Prednisolonarm (p < 0.0001) im Vergleich zu -54,2 Zellen/μl pro Jahr für den Placeboarm (p < 0.0001) bestimmt. Die CD4+ T-Lymphozytenwerte zum Zeitpunkt der Startvisite waren im Prednisolonarm statistisch signifikant niedriger (Mean 512.14 Zellen/μl ± S.E.M. 13.39) als im Placeboarm (Mean 554.40 ± S.E.M 15.75; p = 0.042). Dies bedeutet eine schlechtere Ausgangslage für die mit Prednisolon behandelten Patienten. Trotzdem entwickelten nur vier Patienten mit Prednisolonbehandlung im Vergleich zu 11 Patienten mit Placebobehandlung AIDS, was eine statistisch signifikante Verringerung der Progressionsrate bedeutet (p=0.0196). In 16 Patienten versus 18 Patienten fielen die CD4+ T-Lymphozytenwerte unter die Werte von 200 Zellen/μl. Die Behandlung mit Prednisolon war nicht mit einer höheren Rate von unerwünschten Ereignissen oder höherer Viruslast assoziiert.
Cardiovascular diseases represent the leading cause of death worldwide, with myocardial infarction and strokes being the most common complications. In both cases, the appearance of an enlarged artery wall as a consequence of a growing plaque is responsible for the disturbance of the blood flow. The formation of plaques is driven by a chronic inflammatory condition known as atherosclerosis, characterized by an initial step of endothelial cell (EC) dysfunction followed by the recruitment of circulating immune cells into the tunica intima of the vessel. Accumulation of lipids and cells lead to the formation of atheromatous plaques that will define the cardiovascular outcome of an individual.
The role of the immune system in the progression of atherosclerosis has been widely recognized. By far, macrophages constitute the most abundant cell type in lesions and are known to be the major source of the lipid-laden foam cell pool during the course of the disease. However, other immune cells types, including T cells, dendritic cells (DCs) or mast cells, among others, have been described to be present in human and mouse plaques. How these populations can modulate the atherogenic process is dependent on their specialized function.
DCs constitute a unique population with the ability to bridge innate and adaptive immune responses, mainly by their strong capacity to present antigens bound to a major histocompatibility complex (MHC) molecule. Given their ability to polarize T cells and secrete cytokines, their role in atherosclerosis has gained attention for the development of new therapeutic approaches that could impact lesion growth. Hence, knowing the effect of a specific subset is an initial key step to evaluate its potential for clinical purposes. For example, the basic leucine zipper ATF-like 3 transcription factor (Batf3) controls the development of conventional dendritic cells type 1 (cDCs1), characterized by the expression of the surface markers CD8 and CD103. Initially, they were described to promote both T-helper 1 (Th1) and regulatory T cell (Treg) responses, known to accelerate and to protect against atherosclerosis, respectively. The first part of this thesis aimed to elucidate the potential role of Batf3-dependent DCs in atherosclerosis and concluded that even though systemic immune responses were mildly altered they do not modify the course of the disease and may not represent an attractive candidate for clinical studies.
DCs also have the ability to impact lesion growth through the release of a broad range of cytokines, which can either directly impact atherosclerotic plaques by modulating resident cells, or by further polarizing T cell responses. Among others, interleukin (IL) 23, a member of the IL-12 family of cytokines, has received much attention during the past year due to its connection to autoimmunity.
IL-23 is known to induce pathogenicity of Th17 cells and is responsible for the development of several autoimmune diseases including multiple sclerosis, psoriasis or rheumatoid arthritis. Interestingly, these patients often present with an accelerated course of atherosclerosis and thus, are at higher risk of developing cardiovascular events. Several epidemiological studies have pointed toward a possible connection between IL-23 and its receptor IL-23R in atherosclerosis, although their exact contribution remains to be elucidated. The second part of this thesis showed that resident antigen-presenting cells (APCs) in the aorta produced IL-23 during the steady state but this secretion was greatly enhanced after incubation with oxidized low-density lipoprotein (oxLDL). Furthermore, disruption of the IL-23R signaling led to decreased relative necrotic plaque area in lesions of Ldlr-/-Il23r-/- mice fed a high-fat diet (HFD) for 6 and 12 weeks compared to Ldlr-/- controls. A proposed mechanism involves that increased IL-23 production in the context of atherosclerosis may promote the pathogenicity of IL-23-responding T cells, especially IL-23R+ γδ T cells in the aortic root. Response to IL-23 might increase the release of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and IL-17 and alter the pro- and anti-inflammatory balance of cytokines in the aortic root. Altogether, these data showed that the IL-23 / IL-23R axis play a role in plaque stability.
The pathogenic role of endogenous antibodies in a mouse model for Charcot-Marie-Tooth 1B neuropathy
(2015)
Charcot-Marie-Tooth (CMT) type 1 neuropathies are a genetically heterogeneous group of non-treatable inherited disorders affecting the peripheral nervous system that lead to sensory and motor dysfunction. Secondary low grade inflammation, implicating the innate and adaptive immune system, could previously be identified as a substantial disease modifier in two mouse models for CMT1, CMT1B and 1X, respectively. However, the exact mechanism how the adaptive immune system contributes to disease pathogenesis is not completely understood. Based on observations that the accumulation of endogenous antibodies to myelin components is important for rapid myelin clearance after nerve injury during Wallerian degeneration, a possibly similar mechanism was considered for endogenous antibodies as disease amplifier in mice heterozygously deficient for P0 (P0het), mimicking some typical features of CMT1B.
In this study an increased antibody deposition was detected in the affected peripheral nerves of P0het myelin mutant mice. By crossbreeding P0het mutants with mice specifically lacking B-lymphocytes, and therefore antibodies (JHD-/-), a decline of endoneurial macrophages together with a substantially ameliorated demyelination could be demonstrated in 6-month-old mutant mice. Moreover, reconstitution with murine IgGs reverted the neuropathic phenotype, substantiating that endogenous antibodies are potentially pathogenic at this early stage of disease. Unexpectedly, in 12-months-old P0het mutants, JHD deficiency resulted in disease aggravation accompanied by an increased inflammatory reaction and M2-polarized macrophage response.
These observations suggest that in a mouse model for CMT1B, the lack of endogenous antibodies has a dichotomous effect: ameliorating early macrophage-mediated demyelination, as opposed to increasing inflammatory reactions leading to disease aggravation at older ages.
The bidirectional influence of parenchymal cells and cells of the immune system, especially of antigen-presenting and CD8\(^+\) T cells, in situations of putative auto- immune pathogenicity and degeneration was the main topic of this thesis. In the first part, the influence of human muscle cells on antigen-presenting cells was investigated. In inflammatory myopathies prominent infiltrates of immune cells containing T cells and antigen-presenting cells like macrophages and dendritic cells are present. The hypothesis was that human myoblasts have an inhibiting influence on these antigen-presenting cells under homeostatic conditions. A dysfunction or impairment under inflammatory circumstances might contribute to the development of myopathic conditions. The surface analysis of dendritic cells cocultured with myoblasts showed that immature dendritic cells could be driven into a reversible semi- mature state with significantly elevated levels of CD80. These dendritic cells were additionally characterized by their inhibiting function on T-cell proliferation. It was also shown that the lysates of healthy myoblasts could strongly enhance the phagocytic ability of macrophages, which could help with muscle regeneration and which might be disturbed in myositis patients. The second part of this thesis was about the clonal specificity of CD8\(^+\) T cells in a mouse model with genetically induced over-expression of PLP in oligodendrocytes. Here, we could show that the cytotoxic T lymphocytes, which had previously been shown to be pathogenic, were clonally expanded in the CNS of the transgenic mice. The amino acid sequences of the corresponding receptor chains were not identical, yet showed some similarities, which could mean that these clones recognize similar antigens (or epitopes of the same antigen). The knockout of PD-1 in this setting allowed for an analysis of the importance of tissue immune regulation. It became evident that the absence of PD-1 induced a larger number of clonal expansions in the CNS, hinting towards a reduced threshold for clonal disturbance and activation in these T cells. The expansions were, however, not pathogenic by themselves. Only in the presence of tissue damage and an antigenic stimulus (in our case the overexpression of PLP), the PD-1 limitation exacerbated the immune pathogenicity. Therefore, only in the presence of a “tissue damage signal”, the dyshomeostasis of T cells lacking PD-1 achieved high pathogenetic relevance. Finally, we investigated the pathogenetic role of CD8 T cells in Rasmussen encephalitis, a rare and chronic neurological disease mainly affecting children. The analysis of the T-cell receptor repertoire in Rasmussen encephalitis patients in the peripheral CD4\(^+\) and CD8\(^+\) T-cell compartments as well as the brain revealed the involvement of T cells in the pathogenicity of this disease. Many clonal expansions in the brain matched CD8\(^+\) T-cell expansions in the periphery on the sequence level. These putatively pathogenic clones could be visualized by immunohistochemistry in the brain and were found in close proximity to astrocytes and neurons. Additionally, the expanded clones could be found in the periphery of patients for at least one year.
Multiple Sklerose ist eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen, die zu motorischen, sensiblen und vegetativen Einschränkungen führt. Häufig beginnt die Erkrankung mit einem schubförmigen Verlauf, dem eine progrediente Verschlechterung folgt. Trotzdem leiden ca. 15% der Patienten bereits von Beginn an, an einer primär progressiven Variante der MS, die bereits mit der progredienten Phase beginnt. Bis jetzt ist die Pathophysiologie nicht vollständig verstanden. Lange Zeit dachte man, dass MS primär eine reine Autoimmun-Erkrankung darstellt, aber in den letzten Jahren ergab sich die Frage, ob es vor allem in den progressiven Formen, eine zytodegenerative Komponente gibt, auf die eine sekundäre Inflammation folgt. Eine mögliche Ursache stellen hier Mutationen des PLP 1 Gens dar, die normalerweise mit leukodystrophischen Erkrankungen assoziiert sind. Es gab zwei Fallberichte, in denen von Patienten berichtet wurde, die unterschiedliche Mutationen in diesem Gen hatten und den klinischen Phänotyp einer MS zeigten. Diese Arbeit sollte nun die Auswirkungen der Mutationen, beziehungsweise einer Nullmutation des PLP 1 Gens in 18- und zum Teil 12-Monate alten Mausmutanten untersuchen. Hier konnten Myelin-Veränderungen und axonaler Schaden in immunhistochemischen Untersuchungen sowie mittels Elektronenmikroskopie und optischer Kohärenztomographie gezeigt werden. Weiter konnte eine Neuroinflammation und damit einhergehend eine zunehmende Anzahl CD8+ T-Zellen sowie einer erhöhten Anzahl an Mikroglia/Makrophagen gefunden werden. Dies ging mit vergleichsweise reduzierten Leistungen der Mutanten bei der motorischen Rotarod-Analyse einher. Interessanterweise wurde weniger neuraler Schaden in den heterozygoten Varianten gefunden, obwohl das Ausmaß der Entzündung gleichblieb. Dies könnte für eine zielgerichtete immunvermittelte Schädigung der Oligodendrozyten sprechen, die zu neuronalem Schaden führt. So konnte gezeigt werden, dass es durch Punktmutationen in einem Myelinprotein-codierendem Gen zu einer sekundären Entzündung kommen kann, die mit dem klinischen Phänotyp einer progressiven MS einhergeht. Weiter sind diese Mausmodelle ein Beispiel für eine genetische Erkrankung des ZNS, in denen die Klinik maßgeblich durch die begleitende Inflammation und nicht allein durch den genetischen Schaden verursacht wird.
Rolle der gammadelta T-Zellen in der Immunantwort bei Patienten mit gastrointestinalen Tumoren
(2022)
Zusammenfassend konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Frage nach der Fähigkeit der selektiven Stimulierung mittels des Phosphorantigens HMBPP und den beiden BTN3 Antikörpern bestätigt werden. Es konnte zudem wie erwartet hierbei ein Unterschied zwischen den beiden Kohorten detektiert werden. Dabei zeigte die Kohorte der Normalspender erwartungsgemäß eine stärkere Aktivierungs- sowie Proliferations-fähigkeit. Normalspender ließen sich signifikant besser mit HMBPP aktivieren und bei bestimmter Konzentration signifikant besser proliferieren, bei BTN3A und sc20.1 konnten keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden, allerdings anhand der Mittelwerte eine deutlich stärkere Aktivierung und Proliferation aufgezeigt werden. Außerdem konnten interessante interindividuelle Unterschiede detektiert werden, die neue Erkenntnisse brachten. Mit Hilfe der untersuchten Oberflächenmoleküle CD45RA und CD27 und der Einteilung der gammadelta T-Zellen in unterschiedliche Subgruppen konnten so mögliche Erklärungen für die Unterschiede zwischen den Kohorten aufgezeigt werden. Normalspender zeigten signifikant höhere Anteile an naiven gammadelta T-Zellen und nicht signifikant höhere Anteile an central memory T-Zellen, demnach eine deutliche Verschiebung in Richtung nicht differenzierter Subsets, wohingegen die Tumorkohorte signifikant höhere effector memory T-Zellen aufwiesen und somit eine deutliche Verschiebung in Richtung differenzierter Subsets. Dadurch kann erklärt werden, weshalb Normalspender besser aktiviert werden und besser proliferieren können. Auch die Einteilung in unterschiedliche Profile 1-6 anhand CD28, CD27 und CD16 lieferte Gründe für den Unterschied zwischen den Kohorten, wobei Normalspender der Gruppe 1 und 2, Tumorpatienten der Gruppe 3 und 4 angehörten. Durch Ermittlung weiterer signifikanter Änderungen einiger exprimierter Oberflächenmoleküle CD39, CD161 und PD1 wurde mit Hilfe der vorliegenden Arbeit bekräftigt, dass einige Faktoren betrachtet werden müssen, die die Proliferation und Aktivierung der gammadelta T-Zellen positiv und negativ beeinflussen können. Es konnte jedoch auch erneut verdeutlicht werden, wie komplex und weitgreifend der Aktivierungsmechanismus, die damit verbundene Expansion und die Auslösung der einzelnen Effektorfunktionen ist.
Peritonitis is a common disease in man, frequently caused by fungi, such as Candida albicans; however, in seldom cases opportunistic infections with Saccharomyces cerevisiae are described. Resident peritoneal macrophages (prMΦ) are the major group of phagocytic cells in the peritoneum. They express a broad range of surface pattern recognition receptors (PRR) to recognize invaders. Yeast infections are primarily detected by the Dectin-1 receptor, which triggers activation of NFAT and NF-κB pathways.
The transcription of the Nfatc1 gene is directed by the two alternative promoters, inducible P1 and relatively constitutive P2 promoter. While the role of P1-directed NFATc1α-isoforms to promote survival and proliferation of activated lymphocytes is well-established, the relevance of constitutively generated NFATc1β-isoforms, mainly expressed in resting lymphocytes, myeloid and non-lymphoid cells, remains unclear. Moreover, former work at our department indicated different roles for NFATc1α- and NFATc1β-proteins in lymphocytes.
Our data revealed the functional role of NFATc1 in peritoneal resident macrophages. We demonstrated that the expression of NFATc1β is required for a proper immune response of prMΦ during fungal infection-induced acute peritonitis. We identified Ccl2, a major chemokine produced in response to fungal infections by prMΦ, as a novel NFATc1 target gene which is cooperatively regulated through the NFAT- and canonical NF-κB pathways. Consequently, we showed that NFATc1β deficiency in prMΦ results in a decreased infiltration of inflammatory monocytes, leading to a delayed clearance of peritoneal fungal infection.
We could further show that the expression of NFATc1β-isoforms is irrelevant for homeostasis of myeloid and adaptive immune system cells and that NFATc1α- (but not β-) isoforms are required for a normal development of peritoneal B1a cells. In contrast to the situation in myeloid cells, NFATc1β deficiency is compensated by increased expression of NFATc1α-isoforms in lymphoid cells. As a consequence, NFATc1ß is dispensable for activation of the adaptive immune system.
Taken together our results illustrate the redundancy and indispensability of NFATc1-isoforms in the adaptive and innate immune system, indicating a complex regulatory system for Nfatc1 gene expression in different compartments of the immune system and likely beyond that.
Pilzinfektionen zählen zu den häufigsten Infektionen beim Menschen. Sie verlaufen in den meisten Fällen unkompliziert und stellen keine vitale Bedrohung für den Betroffenen dar. Invasive Mykosen hingegen verlaufen oft tödlich und sind eine große Herausforderung für die moderne Medizin, da eine frühe Diagnose schwierig ist und die therapeutischen Möglichkeiten limitiert sind.
Die Invasive Aspergillose (IA) zählt mit geschätzt über 200.000 Infektionen pro Jahr weltweit zu einer der häufigsten Invasiven Mykosen. Die bekanntesten Risikofaktoren für die Entstehung einer IA sind die Neutropenie, Organtransplantationen, hämatopoetische Stammzelltransplantationen und Erkrankungen, die mit einer Kompromittierung des Immunsystems einhergehen. Erreger der Invasiven Aspergillose ist in nahezu 90 Prozent Aspergillus fumigatus (A. fumigatus), ein ubiquitär vorkommender Schimmelpilz. Seine Verbreitung erfolgt aerogen durch Sporen, sogenannte Konidien, die aufgrund ihres geringen Durchmessers problemlos über die Atemwege in die Lunge gelangen können.
Dendritische Zellen spielen als professionelle Antigen präsentierende Zellen eine wichtige Rolle in der Immunabwehr gegen A. fumigatus. Sie sind ein wichtiges Bindeglied zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem und sind mit einer Vielzahl von Rezeptoren (engl. pattern recognition receptor, PRR) zur Pathogen Erkennung ausgestattet.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion ausgewählter C Typ Lektin (CLEC) Rezeptoren auf Subtypen dendritischer Zellen (DCs) mit verschiedenen A. fumigtaus Morphologien untersucht. Es wurde mit in vitro generierten Monozyten abgeleiteten (moDCs) und in vivo vorkommenden myeloiden dendritischen Zellen (mDCs) gearbeitet und die Expression von CLEC4A, CLEC6A, CLEC7A, CLEC12A und CLEC4E und eine mögliche Regulation der Rezeptoren nach Stimulation mit Konidien, geschwollenen Konidien oder Keimschläuchen untersucht. Hierbei wurde bei beiden Subtypen eine Herabregulation von CLEC4A, CLEC7A und CLEC12A beobachtet. Dies ist vereinbar mit der Tatsache, dass C Typ Lektin Rezeptoren nicht nur eine Rolle bei der Pathogen Erkennung spielen, sondern auch als Phagozytose Rezeptoren fungieren. Auf molekularbiologischer Ebene wurde in Analysen von moDCs ebenfalls eine Reduktion der relativen mRNA Expression von CLEC4A, CLEC6A, CLEC7A und CLEC12A beobachtet.
Weiterhin wurden die Auswirkungen einer Rezeptorblockade von CLEC7A mittels blockierender Antikörper auf das Maturierungsverhalten und Zytokinprofil beider Subtypen analysiert. Hier konnte durch die Zugabe eines CLEC7A blockierenden Antikörpers vor Stimulation mit A. fumigatus Konidien oder depletiertem Zymosan die Maturierung effektiv inhibiert werden. Die Sekretion der pro inflammatorischen Zytokine Tumornekrosefaktor α, Interleukin 8 und 1β, als auch des anti inflammatorischen Zytokins Interleukin 10 war durch die Rezeptorblockade ebenfalls signifikant vermindert.
Diese Erkenntnisse stützen die bislang relativ gut untersuchte Rolle von CLEC7A auf Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen als spezifischen Rezeptor für A. fumigatus. Darüber hinaus konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass CLEC7A ebenfalls auf mDCs an der Erkennung von A. fumigatus und Initiierung einer Immunantwort beteiligt ist. Diese Tatsache ist von Bedeutung, da die beiden Subtypen nicht ohne weiteres miteinander verglichen werden können und die Relevanz von in vivo vorkommen myeloiden dendritischen Zellen an einer Immunantwort gegen A. fumigatus bislang noch viele Fragen offen lässt.
Es bedarf weiterer Untersuchungen, insbesondere funktionaler Analysen von intrazellulären Signalwegen um ein besseres Verständnis zu erlangen. Die Übertragung in ein Tiermodell und die gezielte Ausschaltung von C Typ Lektin Rezeptor Genen könnte ein Ausblick auf zukünftige Forschungsprojekte sein.
Hintergrund: Die Juvenile Idiopathische Arthritis (JIA) ist eine heterogene Erkrankung mit unbekannter Ätiologie der Arthritis bei Patientinnen und Patienten unter 16 Jahren für mehr als sechs Wochen. Das Humane Zytomegalievirus (HCMV) ist ein lymphotropes Betaherpesvirus, das im menschlichen Körper persistiert und eine anhaltende Stimulation des Effektor-T-Zell-Systems bewirkt. Sowohl für JIA als auch für HCMV zeigt sich eine vorzeitige Immunoseneszenz.
Ziel: Untersuchung des potenziellen Einflusses von HCMV auf das vorzeitig gealterte Immunsystem von JIA-Patientinnen und Patienten.
Methoden: T-Zell-Phänotyp, intrazelluläre Zytokinproduktion und die Expression von Chemokinrezeptoren wurden mittels Durchflusszytometrie (FACS) gemessen. Der HCMV-Serostatus wurde mittels Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) gemessen. Phänotyp und Zytokinproduktion von Lymphozyten von JIA-Patientinnen und Patienten und Gesundkontrollen wurden hinsichtlich ihres HCMV-Serostatus verglichen.
Ergebnisse: Sowohl JIA-Patientinnen und Patienten als auch Gesundkontrollen zeigten einen Zusammenhang zwischen HCMV-Seropositivität und Immunseneszenz, nämlich geringere Anteile naiver T-Zellen und relativ höhere Anteile an differenzierten T-Zellen. Bei den JIA-Patientinnen und Patienten war die HCMV-Seropositivität mit einer höheren intrazellulären IFNγ-Produktion verbunden. T-Zellen bei JIA-Patientinnen und Patienten zeigten eine höhere CCR5-Expression in Verbindung mit HCMV-Seropositivität. Diese Assoziation wurde bei Gesundkontrollen nicht beobachtet.
Schlussfolgerung: Der T-Zell-Phänotyp war bei JIA-Patientinnen und Patienten und Gesundkontrollen ähnlich mit HCMV assoziiert. Im Gegensatz dazu zeigten JIA-Patientinnen und Patienten Hinweise auf eine TH1-Dominanz in Verbindung mit HCMV-Seropositivität. Bei CCR5 ist dieser Effekt bei JIA-Patientinnen und Patienten signifikant stärker als bei Gesundkontrollen. Die vorliegende Studie legt nahe, dass HCMV-assoziierte Veränderungen der T-Zell-Differenzierung bei JIA-Patientinnen und Patienten bestätigt werden können.
Hintergrund: Ein bidirektionaler Zusammenhang zwischen Diabetes mellitus und Parodontitis wird durch zahlreiche wissenschaftliche Arbeiten bestätigt. Bislang weitgehend unerforscht bleibt jedoch die Frage, ob die beiden pathophysiologisch verschiedenen Krankheitsbilder des Typ-1- und des Typ-2-Diabetes bezüglich Häufigkeit und Ausmaß parodontaler Erkrankungen Divergenzen aufzeigen. Zielstellung: Ziel der vorliegenden Untersuchung war es die parodontale Gesundheit eines Patientenkollektivs alterskorrelierter Diabetiker mit inadäquat eingestelltem Blutzucker in Abhängigkeit vom vorliegenden Diabetestyp (Typ-1 bzw. Typ-2) zu evaluieren. Material und Methoden: 101 insulinpflichtige Diabetiker (Typ-1: n=47, Typ-2: n=54.), welche in der Klinik Saale im Rahmen einer stationären Reha-Maßnahme behandelt wurden, nahmen an der Studie teil. Dabei mussten sie folgende Einschlusskriterien erfüllen: Alter 35-60J., HbA1c≥7%, Insulintherapie, Nichtraucher, ≥10 natürliche Zähne, keine parodontale Therapie oder syste¬mische Antibiose in den letzten 6 Monaten. Erfasst wurden die Zahl der natürlichen Zähne sowie an den Zähnen 16,21,24,36,41,44 (Ramfjord-Zähne) die Parameter Taschentiefe, Attachmentniveau, Gingiva-Index (GI) nach Löe&Silness und Plaque-Index (PI) nach Quigley&Hein. Basierend auf Attachmentniveau und Sondie-rungstiefen wurden die Patienten zudem gemäß den Kriterien der CDC/AAP-Arbeitsgruppe zur Klassifizierung parodontaler Erkrankungen einer von drei parodontalen Erkrankungskategorien (gesund-mild/moderat/schwer) zugeordnet. Des Weiteren wurden den ärztlichen Entlassungsbriefen der Klinik Saale zahlreiche charakteristische Daten entnommen, wie Patientenalter, Krankheitsdauer, HbA1c, Ausmaß von Folge- und Begleiterkrankungen sowie insbesondere auch BMI und CRP. Ergebnisse: Trotz erheblich kürzerer Krankheitsdauer (11,7 vs. 20,3 Jahre) und bei vergleichbarer Altersstruktur (51,3 vs. 48,3 Jahre) zeigten Typ-2-Diabetiker gegenüber Typ-1-Diabetikern eine signifikant geringere Zahnzahl (24,5 vs. 26,2 Zähne; p<0,05), einen signifikant erhöhten GI-Score (4,8 vs. 2,9; p<0,001), einen signifikant erhöhten PI-Score (8,8 vs. 6,4), einen signifikant höheren Anteil schwerer Parodontalerkankungen gemäß CDC/AAP-Kriterien (40,7% vs. 23,4%; p<0,05), signifikant höhere CRP-Werte (0,66 vs.0,31 mg/dl; p<0,001) und einen signifikant höheren BMI (37,08 vs. 27,05 kg/m²; p<0,001). Die HbA1c-Werte beider Gruppen waren nicht statistisch signifikant unterschiedlich (8,88 vs. 8,39%). Schlussfolgerung: Im Vergleich von Typ-1- und insulinpflichtigen Typ-2-Diabetikern mit annähernd vergleichbarer Altersstruktur und Diabeteseinstellung zeigen Typ-2-Diabetiker, trotz deutlich kürzerer Diabetesdauer, signifikant häufiger Symptome einer schweren Parodontitis. Dies deutet darauf hin, dass neben Hyperglykämien weitere für Typ-2-Diabetes typische ätiologische Faktoren, insbesondere subklinische Inflammationen im Rahmen des Metabolischen Syndroms, für die erhöhte Prävalenz parodontaler Erkrankungen unter Diabetikern von Bedeutung sind. Für detaillierte Aussagen sind weitere gezielte klinische Studien notwendig.
Leishmanien besitzen eine Vielzahl von Mechanismen, die humorale und zelluläre Immunabwehr effektiv zu unterlaufen. Diese hängen eng mit der Expression von hauptsächlich zwei Glykokonjugaten auf der Parasitenoberfläche zusammen, dem gp63 und dem Lipophosphoglykan. Die Parasiten sind einerseits schlechte Aktivatoren des alternativen Komplementweges und umgehen damit ihre eigene extrazelluläre Lyse. Oberflächengebundene Komplementfaktoren fördern andererseits die Aufnahme der Leishmanien durch Makrophagen. Solange diese nicht durch T-Zellen aktiviert sind, dienen sie den Parasiten als "Refugium". Dies gilt insbesondere, als Leishmanien in der Lage sind, 1. den "oxidative burst" zu hemmen; 2. toxische Sauerstoffmetaboliten zu entgiften; 3. abbauende lysosomale Enzyme zu hemmen und 4. das saure Milieu in den Lysosomen für ihren eigenen Metabolismus auszunutzen. Schließlich unterlaufen Leishmanien die zelluläre Immunabwehr des Wirts, indem sie die Aktivierung von T-Lymphozyten hemmen und die Expansion von T-Zell-Sub-populationen bewirken, die für ihr eigenes Überleben nützlich sind.
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Dendritic cell-based vaccination is a well established technique for preventive and therapeutic instruction of the immune system where conservative vaccine formulations fail to cure or prevent diseases, respectively. Efficiency of this technique already was demonstrated in infectious diseases as well as for cancer in animal or human studies. Well controlled manipulation and antigen-loading of immature DC is most beneficial to this technique. But, time-consuming and cost-extensive procedures for preparation of DC precursors, expansion and stimulation of DC and inpatient administration are big disadvantages regarding vaccine development for pandemic infectious diseases that occur mainly in underdeveloped countries. Therefore vaccines are needed that are pathogen-tailored and able to induce equal immune responses as their DC-based vaccine models. For vaccination against Leishmania parasites such a DC-based vaccine is feasible and its efficacy to induce protective Th1-based immune responses was already demonstrated in several animal studies. But, one of our own studies indicated supportive activity of host cells exceeding the allocation of T cells to become activated by transferred DC. IL-12, an important cytokine for the induction of Th1-related immune responses, has to be produced by host cells. Therefore, the aim of this study was to investigate the mechanism of BMDC-based vaccination with regard to simplification of the vaccine formulation. Key questions that have been addressed are: Which cells process the information that is transferred by the injected DC and what are the key components of this information? Further more, it was looked at whether altered vaccine formulations are able to induce protective immunity and whether they share equal molecular mechanisms. The current paradigm of BMDC-based vaccination proposes direct interaction of transferred BMDC with host T cells. These BMDC have to be antigen-loaded for stimulation via antigen-peptide-MHC molecule-complexes and they have to be activated for proper co-stimulation of T cells. Here, this study demonstrates that neither activation for co-stimulation nor direct interaction with adequate MHC molecules is needed for the induction of protective immunity against infection with Leishmania-parasites. Disrupted antigen-loaded BMDC are able to induce protective immunity in BALB/c mice without pre-stimulation via CpG ODN. Beyond, if BMDC were used with a different MHC-background than recipient mice then the vaccine still would be efficient in terms of reduction of footpad swelling and parasite load in draining lymph nodes. Even more, DC-specific features are no key component that leads to protective immunity as vaccination with disrupted antigen-loaded MΦ shows equal properties than before mentioned vaccine formulations. Further more, it was found that host DC play a major role in transforming the incoming signal, received from transferred antigen-loaded DC, into Th1-related stimuli and Leishmania-antigen-specific T cell activation. Suspensions of disrupted antigen-loaded DC resemble a combination of laid off soluble molecules together with exosome-like vesicles that formed after disruption of membranes. Here it was shown that separation of the membranous and soluble fractions and subsequent transfer into BALB/c mice will lead to protection of these mice against infection with L. major promastigotes only if the membranous fraction is used as vaccine. More, this vaccine formulation takes advantage of easy storage at -80°C with no need of fresh production. This clearly demonstrates that the immunity-inducing principle of disrupted DC-based vaccination lies within the membrane enclosed fraction. On a molecular level, disrupted antigen-loaded DC induce Th1-related cytokines during vaccination and as response on pathogen encounter. In vivo assays revealed IL-12 production and antigen-specific T cell proliferation among splenocytes that were stimulated with disrupted antigen-loaded DC. Splenocytes of accordingly vaccinated mice produce tremendous amounts of IFNγ after stimulation with Leishmania parasites. In summary, disrupted antigen-loaded BMDC fulfil all characteristics of DC-based vaccination against Leishmania major. But, while purification of membranes of antigen-loaded DC and subsequent transfer to BALB/c mice leads to control of the disease in the animal model, only slight levels of Th1-related cytokines are seen in the in vivo assays. Whether this points towards a loss of vaccine activity on unseen levels or unknown sites where Th1-related immunity is induced by both, complete solution and purified membranes, still has to be determined.
Pilze sind in unserer Umwelt allgegenwärtig und besiedeln im Fall von Candida albicans (C. albicans) sogar bei über 50% der Menschen die Schleimhäute, während Sporen von Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) täglich über die Atmung in die Lunge des Menschen gelangen. Dennoch sind Erkrankungen, die durch diese zwei Pilze ausgelöst werden, bei gesunden Menschen selten. Ist jedoch das Immunsystem beeinträchtigt, können diese Pilze zu systemischen und damit lebensbedrohlichen Erkrankungen wie der invasiven Aspergillose und der systemischen Candidiasis führen. Für eine Verbesserung der Behandlung solcher Infektionen ist das genaue Verständnis der Immunabwehrmechanismen entscheidend. Da A. fumigatus über die Lunge in den Körper gelangt, wurden in dieser Arbeit die häufigsten Immunzellen der Lunge, die Makrophagen, und deren Immunantwort auf A. fumigatus untersucht. Parallel hierzu wurden dendritische Zellen (DCs) verwendet, die als Brücke zwischen dem angeborenen und adaptiven Immunsystem wirken. Ein besonderes Augenmerk wurde hierbei auf A. fumigatus induzierte Genexpressionsänderungen und deren Regulationsmechanismen gelegt. Dabei wurden kurze, regulatorische RNAs, die sogenannten miRNAs, untersucht, die eine wichtige Rolle in der post-transkriptionalen Genregulation spielen. Bislang ist nur wenig über die miRNA-abhängigen Genregulationen in DCs, die auf eine Infektion mit A. fumigatus oder C. albicans reagieren, bekannt. Um alle durch A. fumigatus und C. albicans regulierten miRNAs zu identifizieren, wurden DCs mit A. fumigatus und C. albicans ko-kultiviert und anschließend eine Komplettsequenzierung der kurzen RNAs durchgeführt. Die Pilz-spezifische Induktion der miRNA-Regulation wurde zudem mit der miRNA-Regulation durch den bakteriellen Zellwandbestandteil Lipopolysaccharid verglichen. Durch die Stimulation mit Keimschläuchen von A. fumigatus wurden die miRNAs miR-132-3p/5p, miR-155-5p, miR129-2-3p, miR-129-5p, miR-212-3p/5p und miR-9-5p in DCs induziert. Diese wurden ebenfalls durch C. albicans induziert, zudem noch die miRNAs miR-147a und miR-147b. Spezifisch für A. fumigatus war die Regulation der miR-129-2-3p. Neben dem miRNA-Profiling wurde auch das mRNA-Transkriptom über Microarrays analysiert und dadurch 18 potentielle Zielgene der Pilz-induzierten miRNAs identifiziert.
Neben den Elementen der Translationsregulation wurden auch die Transkriptionsfaktoren untersucht. Als einziger unter den 60 regulierten Transkriptionsfaktoren zeigte KLF4 eine veränderte Expressionsrichtung in DCs, die mit Pilzen oder LPS behandelt waren. Während die Stimulation mit LPS die Expression von KLF4 induzierte, wurde es durch die Pilze A. fumigatus und C. albicans reprimiert. In einer Untersuchung der unterschiedlichen A. fumigatus-Rezeptoren, wurde deren Einfluss auf die KLF4-Regulation gezeigt. Während TLR4-Liganden KLF4 induzierten, führten Liganden, die an die Rezeptoren TLR2/TLR1 und Dectin-1 binden, zu einer Reduktion von KLF4. Nach einem erfolgreich etablierten KLF4-knock-down mittels RNA-Interferenz wurden KLF4-Zielgene untersucht. Während kein bzw. nur ein geringer Effekt auf die Genexpression von CCL2, RANTES, CXCL10 und TNF beobachtet wurde, sorgte der KLF4 knock-down für eine hoch signifikante Reduktion der IL6-Genexpression in LPS-stimulierten DCs.
Um die KLF4-Regulation weiter zu untersuchen, wurde zudem eine weitere Zellpopulation des angeborenen Immunsystems, die Makrophagen, verwendet. Auch hier wurde die Immunantwort gegen A. fumigatus analysiert. Zudem wurde die Rolle der Thrombozyten als Immunmediatoren betrachtet. Zuerst wurde ein Zytokinprofil des plättchenreichen Plasmas (PRP), das mit A. fumigatus stimuliert wurde, erstellt. In diesem konnte nur RANTES in hoher Konzentration nachgewiesen werden. Daraufhin wurde der Einfluss von PRP auf die Reifung von DCs, die Phagozytosefähigkeit von Makrophagen und DCs sowie der Einfluss von DCs und Makrophagen auf die metabolische Aktivität von A. fumigatus in An- und Abwesenheit von plättchenreichem Plasma untersucht. Es konnte eine gering verstärkte Reifung der DCs durch PRP gezeigt werden. Isolierte Thrombozyten konnten die Phagozytose von DCs steigern, während Makrophagen durch PRP verstärkt Konidien phagozytierten. In einem genomweiten Transkriptomprofiling wurde die Immunantwort von DCs und Makrophagen verglichen. Zudem wurde untersucht, wie PRP die Immunantwort dieser Immunzellen beeinflusst. Es wurden 2 bzw. 24 Gene identifiziert, die signifikant in A. fumigatus-stimulierten DCs und Makrophagen reguliert waren. Hierbei wurde gezeigt, dass KLF4 durch die Zugabe von PRP herabreguliert wurde. Das zuvor beschriebene Zielgen IL6 wurde durch PRP in A. fumigatus-stimulierten DCs gegenüber stimulierten DCs ohne PRP deutlich reduziert, wodurch sich eine immunmodulatorische Fähigkeit des PRP zeigte.
Die Induktion von IL-6, weiteren Zytokinen und der Reifemarker durch A. fumigatus in DCs wurden zudem in einem Booleschen Modell simuliert. Dieses Modell soll in Zukunft Vorhersagen über experimentelle Ergebnisse und dadurch eine optimale Versuchsvorbereitung ermöglichen.
While TGF-β is able to regulate miRNA expression in numerous cell types, TGF-β-dependent changes in the miRNA profile of CD8+ T cells had not been studied before. Considering that TGF-β suppresses CD8+ T cell effector functions in numerous ways, we wondered whether induction of immune-regulatory miRNAs could add to the known transcriptional effects of TGF-β on immune effector molecules. In this study, we used miRNA arrays, deep sequencing and qRT-PCR to identify miRNAs that are modulated by TGF-β in human CD8+ T cells. Having found that the TGF-β-dependent downregulation of NKG2D surface expression in NK cells and CD8+ T cells does not go along with a corresponding reduction in mRNA levels, this pathway appeared to be a possible target of TGF-β-inducible miRNAs. However, this hypothesis could not be confirmed by miRNA reporter assays. Instead, we observed that DAP10 transcription is suppressed by TGF-β which in turn negatively affects NKG2D surface expression. In spite of promising preliminary experiments, technical difficulties associated with the transfection of primary NK cells and NK cell lines unfortunately precluded the final proof of this hypothesis.
Instead, we focused on the TGF-β-induced changes in the miRNome of CD8+ T cells and confirmed the induction of the miR-23a cluster members, namely miR-23a, miR-27a and miR-24 by three different techniques. Searching for potential targets of these miRNAs which could contribute to the immunosuppressive action of TGF-β in T cells, we identified and confirmed a previously unknown regulation of IFN-γ mRNA by miR-27a and miR-24. Newly generated miRNA reporter constructs further revealed that LAMP1 mRNA is a target of miR-23a. Upon modulation of the miR-23a cluster in CD8+ T cells by the respective miRNA antagomirs and mimics, significant changes in IFN-γ expression confirmed the functional relevance of our findings. Effects on CD107a/LAMP1 expression were, in contrast, rather minimal. Still, overexpression of the miR-23a cluster attenuated the cytotoxic activity of antigen-specific CD8+ T cells. Taken together, these functional data reveal that the miR-23a cluster not only is induced by TGF-β, but also exerts a suppressive effect on CD8+ T-cell effector functions, even in the absence of TGF-β signaling.
Ausgehend von einer potentiell anti-Tumor-aktiven B-Zellen des menschlichen Immunsystem haben sich durch die Untersuchung des peripheren Blutes auf das Vorliegen von lambda3r-positiven, CD19+B-Zellen bei Magenkarzinompatienten und Probanden unterschiedlichen Alters einige sehr interessante Ergebnisse im Bereich der B-Zellimmunität ergeben. Es scheint dabei eine Art B-Zell-Immunosurveillance in Form dieser B-Zellen, sowohl bei Karzinompatienten, als auch bei Gesunden von früher Kindheit an zu geben. Die relative Verteilung dieser Zellen ändert sich dabei im Laufe des Lebens ensprechend den Veränderungen des gesamten B-Zellkompartiments. Es findet eine Abnahme mit dem Alter statt. Im Falle des Auftretens eines Magenkarzinoms kommt es dann zu einer relativen Expansion der in dieser Arbeit beschriebenen lambda3r-positiven CD19+B-Zellen trotz einer gleichzeitig stattfindenden bisher nicht erklärlichen Involution des restlichen B-Zellsystems. Bei der relativen Zunahme dieser Zellen handelt es sich um eine Art Boosterung. Das expandierte Zellkompartiment zeigt dabei Reifungstendenzen, sichtbar im Verlust des Oberflächenmoleküls IgD sowie der Expression von CD27 und IgG. Dem Oberflächenmarker CD5 scheint im Gegensatz zur initialen Hypothese bei der Erst-beschreibung der SC-1-positiven B-Zelle keine zentrale Rolle zuzukommen.
With the progress in sequencing of the honey bee genome new data become available which allows the search and identification of genes coding for homologous proteins found in other organism. Two genes coding for c-type lysozymes were identified in the genome of A. mellifera through an online-based BLAST search. Expression of both intron-less genes seems not to be under the regulatory control of either of the two pathways involved in humoral insect immunity, i.e. Toll and Imd, since no NF-κB transcription factor binding sites are found upstream of the genes. The encoded Lys-1 and Lys-2 are 157 and 143 amino acid long, respectively, and share a sequence similarity of 90%. Further in silico analysis revealed a signal peptidase cleavage site at the N-terminus of each amino acid sequence, strongly suggesting a secretion of the enzymes into the surrounding environment of the producing cells. Sequence alignments of both amino acid sequences with other c-type lysozymes identified the highly conserved active site glutamic acid (Glu32) as well as eight highly conserved cysteine residues. However, an important aspartic acid (Asp50) in the active site that helps to stabilize a substrate intermediate during catalysis is replaced by a serine residue in the lysozymes of A. mellifera. The replacement of the active site aspartic acid in the honey bee lysozymes suggests a different catalytic mechanism and/or a different substrate-specificity in respect to other c-type lysozymes. Furthermore, 3D-models of Lys-1 and Lys-2 were generated based on the sequence similarity of A. mellifera lysozymes with other c-type lysozymes. The published 3D structure of the lysozyme from the silkmoth Bombyx mori, which shares the highest sequence similarity of all available structures with A. mellifera lysozymes, was used as template for the construction of the 3D-models. The models of Lys-1 and Lys-2 suggest that both enzymes resemble, in large part, the structure of B. mori lysozyme. In order to identify the set of AMPs in the hemolymph of A. mellifera, hemolymph of immunized bees was analyzed. Applying SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry on hemolymph from immunized bees, three out of the four peptides were identified, i.e. abaecin, defensin 1 and hymenoptaecin. Furthermore, Lys-2 was identified in the hemolymph by mass spectrometry, conclusively demonstrating the presence of a lysozyme in the hemolymph of A. mellifera for the first time. However, the protein levels of Lys-2 were not affected by bacterial injection, suggesting that the gene expression of the putative antibacterial protein is not under the regulatory control of the Imd and/or Toll pathway. Besides the abovementioned antimicrobial peptides, the 76 kDa large transferrin was also identified. Transferrin is an iron-binding protein that has been implicated in innate immunity in the honey bee. Furthermore, the effect of pathogenic dose, the timeline of peptide induction and the age-related accumulation of the aforementioned AMPs were studied. The intensity of expression of the antimicrobial peptides, abaecin, defensin 1, and hymenoptaecin as well as transferrin increased proportionally with the amount of bacteria injected into the hemocoel. No such effect was observed for the protein levels of Lys-2. Furthermore, up-regulation of the three antibacterial peptides and transferrin was observed within the first 24 h following infection with E. coli (gram-). Infection with the gram+ bacterium Micrococcus flavus resulted in high and moderate protein levels for transferrin and abaecin, respectively, whereas hardly any accumulation of hymenoptaecin was observed, indicating that the gene expression of abaecin and transferrin is somehow positively correlated, and would suggest a shared regulatory pathway that differs from that of hymenoptaecin. Although bacterial infections didn’t seem to stimulate the production of Lys-2, different concentrations in the hemolymph were observed in bees of different ages, suggesting a correlation between the expression of Lys-2 and the age-related division of labor of adult worker honey bees, also known as age polyethism. The results further allow a proposed causal connection between the age-dependent accumulation of Lys-2 and the hemolymph titer of the gonotrophic hormone juvenile hormone, which is the “behavioral pacemaker” in adult honey bees.
In den letzten Jahren ist die Zahl immunsupprimierter Patienten aufgrund des stetigen Fortschritts in der Medizin stark angestiegen. Die bei diesen Patienten wegen ihrer hohen Mortalität gefürchtete, durch A. fumigatus ausgelöste invasive Aspergillose (IA) hat trotz der Anwendung verbesserter Antimykotika zugenommen. Die beiden Medikamente Mycophenolat (MPA) und Everolimus (RAD) werden zur Immunsuppression verwendet. Sie wirken durch die Inhibition von B- und T-Zellen. Allerdings wurde auch der direkte Einfluss auf DCs beschrieben. Diese Entdeckung ist insofern von Relevanz, als DCs eine wichtige regulatorische Rolle bei der Abwehr von Erregern, so auch von Pilzen, spielen und als Bindeglied zwischen dem angeborenen und erworbenen Immunsystem fungieren. DCs sind außerdem in den vergangenen Jahren in den Fokus der Wissenschaft geraten, da sie möglicherweise als Impfstoffe gegen verschiedenste Krankheiten, darunter auch die IA, eingesetzt werden können. Da die IA vor allem Patienten mit geschwächtem Immunsystem trifft, ist es von Bedeutung, die Wirkung von Immunsuppressiva auf DCs besser zu verstehen. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von MPA und RAD auf die Entwicklung, die Reifung und die Immunantwort von aus Monozyten differenzierten DCs (moDCs) nach Kontakt mit A. fumigatus untersucht. Hierzu wurden die Medikamente zu verschiedenen Zeitpunkten der DC-Entwicklung hinzugefügt. Es konnte gezeigt werden, dass vor allem der Entwicklungsprozess der DCs beeinträchtigt wird. Neben einer verminderten Zytokinexpression von DCs nach Kontakt mit A. fumigatus wurde auch eine Veränderung der Oberflächenmarkerstruktur sowohl bei unreifen DCs (iDC) als auch bei reifen DCs (mDC) festgestellt. Des Weiteren wurde die Fähigkeit von DCs zur Phagozytose durch die Medikamente vermindert. Beide Substanzen, vor allem aber RAD, zeigten zudem eine starke Zytotoxizität gegenüber den Zellen. Es konnte in dieser Arbeit deutlich gemacht werden, dass sowohl MPA als auch RAD die Entwicklung und Reifung von moDCs beeinflussen, was zu einer Beeinträchtigung ihrer Immunantwort gegen A. fumigatus führt.