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In dieser Arbeit ist die Synthese von funktionalisiertem Nanodiamant mit bioaktiven Substanzen, welche vor allem als Wirkstofftransporter eingesetzt werden sollen, beschrieben. Dazu werden zum einen bereits bekannte Anbindungsmöglichkeiten an Nanodiamant, wie zum Beispiel die Klick-Reaktion, sowie die Ausbildung von Amidbrücken verwendet. Zum anderen werden neuartige Funktionalisierungsmöglichkeiten wie Protein Ligation und Thioharnstoffbrücken verwendet und somit das Repertoire an bekannten Anbindungsreaktion erweitert.
Des weiteren wurde ein multifunktionales Nanodiamantsystem synthetisiert. Dieses ist in der Lage, zwei verschiedene Moleküle auf einem Partikel zu immobilisieren. Die verwendeten Methoden ermöglichen die Anbindung verschiedener Substanzen aus unterschiedlichen Molekülgruppen an Nanodiamanten und sind somit universell einsetzbar.
The initial goal was the conversion of Bifidobacterium adolescentis Sucrose Phosphorylase (BaSP) into a polyphenol glucosidase by structure based enzyme engineering. BaSP was chosen because of its ability to utilize sucrose, an economically viable and sustainable donor substrate, and transfer the glucosyl moiety to various acceptor substrates. The introduction of aromatic residues into the active site was considered a viable way to render it more suitable for aromatic acceptor compounds by reducing its polarity and potentially introducing π-π-interactions with the polyphenols. An investigation of the active site revealed Gln345 as a suitable mutagenesis target. As a proof of concept BaSP Q345F was employed in the glycosylation of (+)-catechin, (-)-epicatechin and resveratrol. The variant was selective for the aromatic acceptor substrates and the glucose disaccharide side reaction was only observed after almost quantitative conversion of the aromatic substrates. A crystal structure of BaSP Q345F in complex with glucose was obtained and it displayed an unexpected shift of an entire domain by 3.3 Å. A crystal structure of BaSP D192N-Q345F, an inactive variant in complex with resveratrol-3-α-D-glucosid, the glucosylation product of resveratrol, synthesized by BaSP Q345F was solved. It proved that the domain shift is in fact responsible for the ability of the variant to glycosylate aromatic compounds. Simultaneously a ligand free crystal structure of BaSP Q345F disproved an induced fit effect as the cause of the domain shift. The missing link, a crystal structure of BaSP Q345F in the F-conformation is obtained. This does not feature the domain shift, but is in outstanding agreement with the wildtype structure. The domain shift is therefore not static but rather a step in a dynamic process. It is further conceivable that the domain shifted conformation of BaSP Q345F resembles the open conformation of the wild type and that an adjustment of a conformational equilibrium as a result of the Q345F point mutation is observed. An investigation into the background reaction, the formation of glucose-glucose disaccharides of BaSP Q345F and three further variants that addressed the same region (L341C, D316C-L341C and D316C-N340C) revealed the formation of nigerose by BaSP Q345F.
The aim of the thesis was to develop water soluble poly(2-oxazoline) (POx) copolymers with new side group functionalities, which can be used for the formation of hydrogels in biomedical applications and for the development of peptide-polymer conjugates.
First, random copolymers of the monomer MeOx or EtOx with ButEnOx and EtOx with DecEnOx were synthesized and characterized. The vinyl functionality brought into the copolymer by the monomers ButEnOx and DecEnOx would later serve for post-polymerization functionalization. The synthesized copolymers were further functionalized with thiols via post-polymerization functionalization using a newly developed synthesis protocol or with a protected catechol molecule for hydrogel formation. For the formation of peptide-polymer conjugates, a cyclic thioester, namely thiolactone acrylamide and an azlactone precursor, whose synthesis was newly developed, were attached to the side chain of P(EtOx-co-ButEnOx) copolymers.
The application of the functionalized thiol copolymers as hydrogels using thiol-ene chemistry for cross-linking was demonstrated. The swelling behavior and mechanical properties were characterized. The hydrophilicity of the network as well as the cross-linking density strongly influenced the swelling behavior and the mechanical strength of the hydrogels. All hydrogels showed good cell viability results.
The hydrogel networks based on MeOx and EtOx were loaded with two dyes, fluorescein and methylene blue. It was observed that the uptake of the more hydrophilic dye fluorescein depended more on the ability of the hydrogel to swell. In contrast, the uptake of the more hydrophobic dye methylene blue was less dependent on the swelling degree, but much more on the hydrophilicity of the network.
For the potential application as cartilage glue, (biohybrid) hydrogels were synthesized based on the catechol-functionalized copolymers, with and without additional fibrinogen, using sodium periodate as the oxidizing agent. The system allowed for degradation due to the incorporated ester linkages at the cross-linking points. The swelling behavior as well as the mechanical properties were characterized. As expected, hydrogels with higher degrees of cross-linking showed less swelling and higher elastic modulus. The addition of fibrinogen however increased the elasticity of the network, which can be favorable for the intended application as a cartilage glue. Biological evaluation clearly demonstrated the advantage of degradable ester links in the hydrogel network, where chondrocytes were able to bridge the artificial gap in contrast to hydrogels without any ester motifs.
Lastly, different ways to form peptide-polymer conjugates were presented. Peptides were attached with the thiol of the terminal cysteine group to the vinyl side chain of P(EtOx-co-ButEnOx) copolymers by radical thiol-ene chemistry. Another approach was to use a cyclic thioester, thiolactone, or an azlactone functionality to bind a model peptide via native chemical ligation. The two latter named strategies to bind peptides to POx side chains are especially interesting as one and in the case of thiolactone two free thiols are still present at the binding site after the reaction, which can, for example, be used for further thiol-ene cross-linking to form POx hydrogels.
In summary, side functional poly(oxazoline) copolymers show great potential for numerous biomedical applications. The various side chain functionalities can be introduced by an appropriate monomer or by post-polymerization functionalization, as demonstrated. By their multi-functionality, hydrogel characteristics, such as cross-linking degree and mechanical strength, can be fine-tuned and adjusted depending on the application in the human body. In addition, the presented chemoselective and orthogonal reaction strategies can be used in the future to synthesize polymer conjugates, which can, for example, be used in drug delivery or in tissue regeneration.
Die vorliegende Dissertation befasst sich mit den Struktur-Eigenschafts-Beziehungen von sternförmigen Mesogenen mit kontrollierbaren Konformationen in den LC-Phasen. Zunächst sollte mithilfe verschiedener Moleküldesigns geklärt werden, wie eine Faltung der Arme verhindert werden kann, und somit, ob sternförmige Konformationen in den kolumnaren Packungen realisiert werden können. Hierzu wurde erfolgreich eine Bibliothek von dreiarmigen Amidsternen, semiflexiblen Oligoestersternen mit hexasubstituiertem Benzolkern und formtreuen hexasubstituierten Benzolen synthetisiert. Die besondere Herausforderung bei der Darstellung letzterer lag in der C3-Symmetrie der Verbindungen und konnte durch Optimierung der Synthesestrategie mittels aufeinander folgender Wittig-Horner- und Suzuki-Reaktionen in einem divergenten Ansatz gemeistert werden. Ein herausragendes Ergebnis ist die Flüssigkristallinität dieser formtreuen hexasubstituierten Strukturen, wenn sie mindestens neun bzw. zwölf periphere Ketten besitzen. Die detaillierte Auswertung der Kolumnendurchmesser mithilfe von äquatorialen Reflexen sowie der Dichte und der meridionalen Beugungsmuster zeigen, dass lediglich für die formtreuen hexasubstituierten Benzolderivate eine Faltung verhindert werden kann. Intrinsische Freiräume (Kävitäten) zwischen den Oligo(phenylenvinylen)-Armen werden durch außergewöhnliche Dimerenbildung und helikale Packung der Moleküle kompensiert.
In die Kavitäten der Trispyridylverbindungen können Carbonsäure-funktionalisierte Gäste unter Ausbildung von Wasserstoffbrücken eingelagert werden. Mit zunehmender Gastkonzentration wird die helikale Dimerphase des Wirts kontinuierlich in eine neue kolumnare Phase von monomeren Supermesogenen ohne helikale Struktur umgewandelt. Da die Gäste in den Supermesogenen vollständig von den Oligo(phenylenvinylen)-Armen und den aliphatischen Ketten umschlossen sind, handelt es sich bei der Wirtverbindung erstmals um einen flüssigkristallinen Endorezeptor mit drei Bindungsstellen. Das Sternmesogen mit größeren intrinsischen Freiräumen ermöglicht die Einlagerung von funktionalen Bausteinen wie z.B. Anthracenchromophoren. Aus Untersuchungen mittels Festkörper-NMR- und Fluoreszenzspektroskopie geht hervor, dass sich die Mesophase mit drei Anthracengästen langsam in eine doppelt nanosegregierte Struktur umwandelt, in der intrakolumnar Oligo(phenylenvinylen)-Arme und Anthracene Seite an Seite segregiert stapeln und so segmentierte Kolumnen bilden. Diese Art von doppelter Nanosegregation offenbart das Potential des verwendeten Moleküldesigns im Bezug auf die Entwicklung mesomorpher Multikabelstrukturen.
Im Vergleich zu den Supermesogenen weisen die analogen Sternverbindungen mit kovalent gebundenen Pseudogästen um über 100 °C höhere Klärpunkte auf, was unter Berücksichtigung der strukturellen Ähnlichkeit der kolumnaren Phasen und der ähnlichen Mischungsenthalpien in unterschiedlichen Werten der Mischungsentropie begründet liegen muss. Der Vergleich mit einer 1:3-Mischung ohne spezifische Wirt-Gast-Wechselwirkung bestätigt in diesem Zusammenhang den Einfluss der Bindungsart der Gäste auf die Mesophasenstabilität. Die Klärtemperaturen der Sternmesogene lassen sich folglich über die Art der Bindung der Gastmoleküle kontrollieren. Dies ist vor allem für die Orientierung kolumnarer Phasen in dünnen Filmen großer funktionaler Mesogene, die häufig erst bei sehr hohen Temperaturen unter Zersetzung in die isotrope Phase übergehen, interessant.
In this work the catalytic activity of nanodiamond particles with different dopants and surface terminations and of diamond nanomaterials funtionalized with ruthenium-based photocatalysts was investigated, illustrating materials application in photoredox chemistry and the photo(electro)catalytic reduction of CO2. Regarding the application of diamond nanomaterials in photocatalysis, methods to fabricate and characterize several (un)doped nanoparticles with different surface termination were successfully developed. Various photocatalysts, attached to nanodiamond particles via linker systems, were tested in photoredox catalysis and the photo(electro)catalytic reduction of CO2.
Fluorogenic Aptamers and Fluorescent Nucleoside Analogs as Probes for RNA Structure and Function
(2020)
RNA plays a key role in numerous cellular processes beyond the central dogma of molecular biology. Observing and understanding this wealth of functions, discovering new ones and engineering them into purpose-built tools requires a sensitive means of observation. Over the past decade, fluorogenic aptamers have emerged to fill this niche. These short oligonucleotides are generated by in vitro selection to specifically interact with small organic fluorophores and can be utilized as genetically encoded tags for RNAs of interest.
The most versatile class of fluorogenic aptamers is based on derivatives of hydroxybenzylidene imidazolone (HBI), a conditional fluorophore mimicking the chromophore structure found in green and red fluorescent proteins. The respective aptamers are well-known by the “vegetable” nomenclature, including Spinach, Broccoli and Corn, and have found numerous applications for studying RNA function in vitro and in cells.
Their success, however, is somewhat overshadowed by individual shortcomings such as a propensity for misfolding, dependence on unphysiologically high concentrations of magnesium ions or, in the case of Corn, dimerization that might affect the function of the tagged RNA. Moreover, most fluorogenic aptamers exhibit limited ligand promiscuity by design, thereby restricting their potential for spectral tuning to a narrow window of wavelengths.
This thesis details the characterization of a new fluorogenic aptamer system nicknamed Chili. Chili is derived from an aptamer that was originally selected to bind 4-hydroxy-3,5-dimethoxy¬hydroxy-benzylidene imidazolone (DMHBI), resulting in a green fluorescent complex. Unlike other aptamers of its kind, Chili engages in a proton transfer cycle with the bound ligand, resulting in a remarkably large Stokes shift of more than 130 nm.
By means of an empirical ligand optimization approach, several new DMHBI derivatives were found that bind to Chili with high affinity, furnishing complexes up to 7.5 times brighter compared to the parent ligand. In addition, Chili binds to π-extended DMHBI derivatives that confer fluorescence in the yellow–red region of the visible spectrum. The highest affinity and degree of fluorescence turn-on for both green and red fluorogenic ligands were achieved by the incorporation of a unique, positively charged substituent into the HBI scaffold.
Supplemented by NMR spectroscopy, kinetic and thermodynamic studies showed that the binding site of Chili is loosely preorganized in the absence of ligand and likely forms a G-quadruplex upon ligand binding.
To showcase future applications, Chili was incorporated into a FRET sensor for monitoring the cleavage of an RNA substrate by a 10-23 DNAzyme.
Besides aptamers as macromolecular fluorescent complexes, fluorescent nucleobase analogs are powerful small isomorphic components of RNA suitable for studying structure and folding. Here, the highly emissive nucleobase analog 4-cyanoindole (4CI) was developed into a ribonucleoside (r4CI) for this purpose. A new phosphoramidite building block was synthesized to enable site-specific incorporation of 4CI into RNA.
Thermal denaturation experiments confirmed that 4CI behaves as a universal nucleobase, i.e. without bias towards any particular hybridization partner. Photophysical characterization established r4CI as a generally useful fluorescent ribonucleoside analog. In this work, it was employed to gain further insight into the structure of the Chili aptamer. Using several 4CI-modified Chili–HBI complexes, a novel base–ligand FRET assay was established to obtain a set of combined distance and orientation restraints for the tertiary structure of the aptamer.
In addition to their utility for interrogating structure and binding, supramolecular FRET pairs comprising a fluorescent nucleobase analog donor and an innately fluorogenic acceptor hold great promise for the construction of color-switchable RNA aptamer sensor devices.
Enzym-Modifikationen finden in der Natur in Form von posttranslationalen Protein-Modifikationen statt und sind ein faszinierender Mechanismus, um die biologische Vielfalt und Funktion von Proteinen um ein Vielfaches zu erhöhen. Daher ist es für ein ganzheitliches Verständnis bestimmter biologischer Prozesse oder enzymatischer Struktur-Funktions-Beziehungen unerlässlich, chemische Methoden zu entwickeln, die in der Lage sind, diese natürliche Diversität nachzuahmen.[61] Die wohl größte Herausforderung der chemischen Protein-Konjugation ist die chemo- und regioselektive Modifikation einer gezielten Aminosäure bei gleichzeitig milden und physiologischen Reaktionsbedingungen. Trotz zahlreich beschriebener Ansätze zur selektiven Protein-Modifikation, bedarf es weiterhin neuer Methoden, da viele bestehende Herangehens¬weisen auf ein spezielles System zugeschnitten sind.[9, 63]
Aus diesem Grund sollte im Rahmen dieser Arbeit eine breit anwendbare Methode zur selektiven chemischen Tyrosin-Modifikation am Modell der Levansucrase aus Bacillus megaterium entwickelt werden. Durch eine zweistufige Protein-Modifikation, bestehend aus einer En-Reaktion im ersten Schritt und einer Click-Reaktion im zweiten Konjugationsschritt, gelang es die Produktspezifität der Bm Levansucrase rational zu beeinflussen. Zunächst wurde die Tyrosin-spezifische En-Reaktion mit der Luminol-Verbindung 1 an natürlich vorkommenden Tyrosin-Seitenketten der Levansucrase erprobt und analysiert. Hierbei zeigte sich durch massenspektrometrische Untersuchungen, dass hauptsächlich zwei der 25 vorhandenen Tyrosin-Reste mit dem Luminol-Tag 1 modifiziert wurden, zu denen die Seitenketten Y247 und Y196 gehörten. Um die Auswirkungen der Tyrosin-Modifikation leichter interpretieren zu können und eine gegenseitige Beeinflussung auszuschließen, wurde vorerst mit der Einzelmutante Y247F gearbeitet. Da nach der ersten Modifikation der Variante Y247F geringe Veränderungen im Produkt¬spektrum beobachtet wurden, insbesondere im hoch-molekularen Bereich, wurde die Click-Reaktion im zweiten Schritt mit der Intention durchgeführt, diesen Effekt zu verstärken. Schließlich bewirkte die Click-Reaktion mit Azidoglucose (AzGlc) bei Variante Y247F-1-AzGlc eine erhebliche Verschiebung der Produktverteilung von kleinen Fructooligosacchariden (ca. 1100 Da) hin zu hoch-molekularem Levan (ca. 2,1∙106 Da).
Drei weitere Positionen, die in der dritten Zone des Enzyms liegen, wurden für die gentechnische Substitution gegen nicht-native Tyrosin-Reste ausgewählt. Dadurch wurden die Varianten E314Y, D248Y sowie F445Y erhalten und anschließend wie zuvor in zwei Schritten chemisch modifiziert. Die Modifikation dieser Varianten führte hinsichtlich der Veränderung des Produktprofils zu ähnlichen Ergebnissen, wie sie mit dem Enzym Y247F erhalten wurden (Übersicht 1, A). Um den Einfluss verschiedener Seitenketten zu analysieren, wurden neben der Azidoglucose vier weitere Azido-Verbindungen in der Click-Reaktion getestet.
Die Resultate aus den genannten Untersuchungen und die Einbeziehung molekular¬-dynamischer Simulationen ließen erste Rückschlüsse auf die mechanistischen Prozesse der Bm Levansucrase und deren gezielte Manipulation zu: Die Größe der eingeführten Seitenkette sowie die Fähigkeit des Tags polare Wechselwirkungen auszubilden, spielen eine entscheidende Rolle zur rationalen Modulation der Produkt¬spezifität. Insbesondere die räumliche Orientierung und Bewegung der Seitenkette 1 AzGlc und die damit einhergehende sterische Hinderung trugen dazu bei, eine vorzeitige Dissoziation der wachsenden Fructane zu verhindern und ermöglichten dadurch die prozessive Polymersynthese.
Weitere Erkenntnisse über den Levan-Elongationsmechanismus wurden durch die Modifikation der Varianten N126Y und S125Y erhalten. Diese lagen im Gegensatz zu den zuvor untersuchten Tyrosin-Resten nicht im Wachstumsverlauf des Substrats und besaßen zudem eine kürzere Distanz zum aktiven Zentrum. In beiden Fällen führte bereits die erste Modifikation mit Luminol-Derivat 1 zu völlig unter¬schiedlichen Produktprofilen im Vergleich zu den zuvor untersuchten Enzym-Varianten. Während mit der Variante N126Y-1 eine signifikante Akkumulation (bis zu 800 % Zunahme) verschiedener Oligosaccharide erzielt wurde, synthetisierte die Variante S125Y-1 schon nach dem ersten Modifikationsschritt Levan-Polymer (Übersicht 1, B/C). Die zugrunde-liegenden Interaktionen und Trajektorien der eingeführten Seitenkette wurden ebenfalls mit Hilfe von MD Simulationen analysiert und bestätigten die zuvor getroffenen Annahmen. Durch die räumliche Nähe zur Substrat-Bindungstasche reichte bei Variante S125Y 1 bereits die Luminol-Verbindung aus, um die Substrat-Dissoziation zu verhindern und damit die Polymer¬synthese zu induzieren. Hingegen dazu ergaben die Simulationen eine sehr dynamische und fluktuierende Seitenkette für N126Y-1, was vermutlich zur Destabilisierung initialer Wechselwirkungen zwischen Substrat und der Protein¬oberfläche führte und dadurch die Freisetzung und Akkumulation kurzer Oligo-saccharide begünstigte.
Durch die bioorthogonale chemische Einführung einer artifiziellen Seitenkette war es schließlich möglich, das Produktspektrum der Bm Levansucrase sowohl in Richtung Polymersynthese als auch in Richtung kurzer Oligosaccharide zu lenken. Unter Verwendung der Tyrosin-spezifischen En-Reaktion wurden dafür gezielt native und nicht-native Tyrosin-Reste selektiv modifiziert und in einer Folge¬reaktion mittels Click-Chemie zusätzlich derivatisiert. Die Auswirkungen der Modifikations-Reaktionen auf den Elongationsmechanismus des Substrats konnten durch MD-Simulationen aufgeklärt werden. Das Ziel, die Produktspezifität der Levansucrase rational zu beeinflussen und in eine gezielte Richtung zu steuern, wurde damit erfolgreich umgesetzt.
Ein weiterer Fokus dieser Arbeit lag darin, eine effiziente und einfache Methode zur Reinigung eines Fructan-Gemisches zu entwickeln, um damit den Zugang zu Oligo-sacchariden definierter Größen zu vereinfachen. Die Verfügbarkeit bestimmter Oligosaccharide in ausreichender Menge und Reinheit würde die Untersuchung von Fructanen auf ihre präbiotischen Eigenschaften erleichtern und zum Verständnis der Korrelation zwischen dem Darmmikrobiom und verschiedenen Krankheits¬bildern beitragen.[125] Mit Hilfe der Levansucrase-Variante K373L wurde ein Fructan-Gemisch synthetisiert, das im Vergleich zum Produkt¬profil des Wildtyps einen höheren Anteil kurzkettiger Oligosaccharide aufwies. In einem dreistufigen Reinigungsprozess wurde das Produktgemisch im ersten Schritt von den Monosacchariden Glucose und Fructose sowohl fermentativ durch den Hefe¬stamm H. polymorpha als auch chromatographisch per Silicagel separiert. Anschließend erfolgte eine grobe Trennung der Oligosaccharide nach dem Größen¬ausschlussprinzip mit einer Bio-Gel®P2-Säule. Im letzten Schritt wurde die Oligosaccharidfraktion, die hauptsächlich Tri- und Tetrasaccharide enthielt, schließlich mittels Umkehrphasen-Säulenchromatographie (RP18-HPLC) in die gewünschten Produkte aufgetrennt. Auf diese Weise gelang es, die Oligosaccharide 1 Kestose (28 %), 6 Kestose (56 %) und 6 Nystose (20 %) in hoher Reinheit (> 95 %) und moderaten Ausbeuten zu isolieren (Übersicht 2).
Der letzte Teil dieser Arbeit sollte die verschiedenen Disziplinen der Biokatalyse, chemischen Protein-Modifikation und Click-Reaktion mit einer neuen Kompontente, der Photokatalyse, verbinden und in einem innovativen Konzept die Grundlage für die Kombination dieser Forschungsbereiche schaffen. In diesem Kontext wurde einerseits eine lineare photo-biokatalysierte Kaskaden-Reaktion entworfen und vorbereitet, während andererseits die Synthese eines clickbaren Photokatalysators durchgeführt wurde (Übersicht 3). Für den enzymatischen Teil der Kaskaden-Reaktion wurden die Halogenasen RebH und RadH mit den zugehörigen Regenerationssystemen Fre und GDH erfolgreich in E. coli exprimiert, gereinigt und deren Aktivität nachgewiesen. Darüber hinaus wurde ein aktiver Alkin-funktionalisierter Photokatalysator synthetisiert, dessen Aktivität auch nach der Click-Reaktion mit einer Aminosäure und einem Peptid erhalten blieb. Damit wurden die Grundlagen geschaffen, um z. B. photoaktive Bausteine in ein Enzym einzubringen und somit neue lichtabhängige Reaktionszentren oder sogenannte Designer-Enzyme zu erzeugen.