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Background: Bowen’s disease (BD) of the nail unit is associated with human papillomavirus (HPV) infection. Objective: This study aimed to investigate the frequency of high-risk HPV infection, gender, age and digital distribution in this condition.
Methods: Biopsy specimens of 3 consecutive cases with periungual BD were investigated for the presence of HPV DNA by in situ hybridization and by polymerase chain reaction (PCR). Furthermore, 74 cases of ungual BD conducted with HPV genotyping as reported in the literature were reviewed.
Results: PCR of biopsy specimens revealed in 2 cases infection with HPV-16 and in 1 case with HPV-73. Additionally, in 1 HPV-16-positive case HPV-31/33 was detected by in situ hybridization. In line, review of the literature demonstrated a clear association of HPV-positive BD with high-risk HPV types. Interestingly, age at diagnosis was significantly lower in women. Whereas in both genders the second to fourth fingers on both hands were commonly diseased, only in men the thumbs were also prominently affected.
Conclusions: Infection with high-risk HPV types is common in BD of the nail unit suggesting the aetiological cause. Therefore, patients and partners should be closely followed up for digital and genital HPV-associated lesions.
Measles Virus Glycoprotein-Based Lentiviral Targeting Vectors That Avoid Neutralizing Antibodies
(2012)
Lentiviral vectors (LVs) are potent gene transfer vehicles frequently applied in research and recently also in clinical trials. Retargeting LV entry to cell types of interest is a key issue to improve gene transfer safety and efficacy. Recently, we have developed a targeting method for LVs by incorporating engineered measles virus (MV) glycoproteins, the hemagglutinin (H), responsible for receptor recognition, and the fusion protein into their envelope. The H protein displays a single-chain antibody (scFv) specific for the target receptor and is ablated for recognition of the MV receptors CD46 and SLAM by point mutations in its ectodomain. A potential hindrance to systemic administration in humans is pre-existing MV-specific immunity due to vaccination or natural infection. We compared transduction of targeting vectors and non-targeting vectors pseudotyped with MV glycoproteins unmodified in their ectodomains (MV-LV) in presence of \(\alpha\)-MV antibody-positive human plasma. At plasma dilution 1: 160 MV-LV was almost completely neutralized, whereas targeting vectors showed relative transduction efficiencies from 60% to 90%. Furthermore, at plasma dilution 1: 80 an at least 4-times higher multiplicity of infection (MOI) of MV-LV had to be applied to obtain similar transduction efficiencies as with targeting vectors. Also when the vectors were normalized to their p24 values, targeting vectors showed partial protection against \(\alpha\)-MV antibodies in human plasma. Furthermore, the monoclonal neutralizing antibody K71 with a putative epitope close to the receptor binding sites of H, did not neutralize the targeting vectors, but did neutralize MV-LV. The observed escape from neutralization may be due to the point mutations in the H ectodomain that might have destroyed antibody binding sites. Furthermore, scFv mediated cell entry via the target receptor may proceed in presence of a-MV antibodies interfering with entry via the natural MV receptors. These results are promising for in vivo applications of targeting vectors in humans.
Intrathecal, Polyspecific Antiviral Immune Response in Oligoclonal Band Negative Multiple Sclerosis
(2012)
Background: Oligoclonal bands (OCB) are detected in the cerebrospinal fluid (CSF) in more than 95% of patients with multiple sclerosis (MS) in the Western hemisphere. Here we evaluated the intrathecal, polyspecific antiviral immune response as a potential diagnostic CSF marker for OCB-negative MS patients.
Methodology/Principal Findings: We tested 46 OCB-negative German patients with paraclinically well defined, definite MS. Sixteen OCB-negative patients with a clear diagnosis of other autoimmune CNS disorders and 37 neurological patients without evidence for autoimmune CNS inflammation served as control groups. Antibodies against measles, rubella, varicella zoster and herpes simplex virus in paired serum and CSF samples were determined by ELISA, and virus-specific immunoglobulin G antibody indices were calculated. An intrathecal antibody synthesis against at least one neurotropic virus was detected in 8 of 26 (31%) patients with relapsing-remitting MS, 8 of 12 (67%) with secondary progressive MS and 5 of 8 (63%) with primary progressive MS, in 3 of 16 (19%) CNS autoimmune and 3 of 37 (8%) non-autoimmune control patients. Antibody synthesis against two or more viruses was found in 11 of 46 (24%) MS patients but in neither of the two control groups. On average, MS patients with a positive antiviral immune response were older and had a longer disease duration than those without.
Conclusion: Determination of the intrathecal, polyspecific antiviral immune response may allow to establish a CSF-supported diagnosis of MS in OCB-negative patients when two or more of the four virus antibody indices are elevated.
We earlier established a model of a persistent viral CNS infection using two week old immunologically normal (genetically unmodified) mice and recombinant measles virus (MV). Using this model infection we investigated the role of regulatory T cells (Tregs) as regulators of the immune response in the brain, and assessed whether the persistent CNS infection can be modulated by manipulation of Tregs in the periphery. CD4\(^+\) CD25\(^+\) Foxp3\(^+\) Tregs were expanded or depleted during the persistent phase of the CNS infection, and the consequences for the virus-specific immune response and the extent of persistent infection were analyzed. Virus-specific CD8\(^+\) T cells predominantly recognising the H-2D(b)-presented viral hemagglutinin epitope MV-H22-30 (RIVINREHL) were quantified in the brain by pentamer staining. Expansion of Tregs after intraperitoneal (i.p.) application of the superagonistic anti-CD28 antibody D665 inducing transient immunosuppression caused increased virus replication and spread in the CNS. In contrast, depletion of Tregs using diphtheria toxin (DT) in DEREG (depletion of regulatory T cells)-mice induced an increase of virus-specific CD8\(^+\) effector T cells in the brain and caused a reduction of the persistent infection. These data indicate that manipulation of Tregs in the periphery can be utilized to regulate virus persistence in the CNS.
1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25D3) was reported to induce premature organismal aging in fibroblast growth factor-23 (Fgf23) and klotho deficient mice, which is of main interest as 1,25D3 supplementation of its precursor cholecalciferol is used in basic osteoporosis treatment. We wanted to know if 1,25D3 is able to modulate aging processes on a cellular level in human mesenchymal stem cells (hMSC). Effects of 100 nM 1,25D3 on hMSC were analyzed by cell proliferation and apoptosis assay, beta-galactosidase staining, VDR and surface marker immunocytochemistry, RT-PCR of 1,25D3-responsive, quiescence-and replicative senescence-associated genes. 1,25D3 treatment significantly inhibited hMSC proliferation and apoptosis after 72 h and delayed the development of replicative senescence in long-term cultures according to beta-galactosidase staining and P16 expression. Cell morphology changed from a fibroblast like appearance to broad and rounded shapes. Long term treatment did not induce lineage commitment in terms of osteogenic pathways but maintained their clonogenic capacity, their surface marker characteristics (expression of CD73, CD90, CD105) and their multipotency to develop towards the chondrogenic, adipogenic and osteogenic pathways. In conclusion, 1,25D3 delays replicative senescence in primary hMSC while the pro-aging effects seen in mouse models might mainly be due to elevated systemic phosphate levels, which propagate organismal aging.
Background: Alveolar echinococcosis, caused by Echinococcus multilocularis larvae, is a chronic disease associated with considerable modulation of the host immune response. Dendritic cells (DC) are key effectors in shaping the immune response and among the first cells encountered by the parasite during an infection. Although it is assumed that E. multilocularis, by excretory/secretory (E/S)-products, specifically affects DC to deviate immune responses, little information is available on the molecular nature of respective E/S-products and their mode of action. Methodology/Principal Findings: We established cultivation systems for exposing DC to live material from early (oncosphere), chronic (metacestode) and late (protoscolex) infectious stages. When co-incubated with Echinococcus primary cells, representing the invading oncosphere, or metacestode vesicles, a significant proportion of DC underwent apoptosis and the surviving DC failed to mature. In contrast, DC exposed to protoscoleces upregulated maturation markers and did not undergo apoptosis. After pre-incubation with primary cells and metacestode vesicles, DC showed a strongly impaired ability to be activated by the TLR ligand LPS, which was not observed in DC pre-treated with protoscolex E/S-products. While none of the larvae induced the secretion of pro-inflammatory IL-12p70, the production of immunosuppressive IL-10 was elevated in response to primary cell E/S-products. Finally, upon incubation with DC and naive T-cells, E/S-products from metacestode vesicles led to a significant expansion of Foxp3+ T cells in vitro. Conclusions: This is the first report on the induction of apoptosis in DC by cestode E/S-products. Our data indicate that the early infective stage of E. multilocularis is a strong inducer of tolerance in DC, which is most probably important for generating an immunosuppressive environment at an infection phase in which the parasite is highly vulnerable to host attacks. The induction of CD4+CD25+Foxp3+ T cells through metacestode E/S-products suggests that these cells fulfill an important role for parasite persistence during chronic echinococcosis.
Background
Infections with polyomavirus BK virus (BKV) are a common cause of renal dysfunction after renal transplantation and may also be harmful in surgical patients with shock. The aim of the present study was to determine the frequency of BKV viremia in critically ill surgical patients with septic or hemorrhagic shock, and, if viremia is detectable, whether viremia may be associated with renal dysfunction.
Findings
A total of 125 plasma samples from 44 critically ill surgical patients with septic or hemorrhagic shock were tested by real-time polymerase chain reaction (PCR) for BKV DNA during their stay on the intensive care unit (ICU). BKV viremia occurred in four patients, i.e. in three of the septic and in one of the hemorrhagic shock group. There was no association between viremia and renal dysfunction. All positive samples contained a low viral load (< 500 copies/ml).
Conclusions
Since BK viremia was rarely found and with low viral load only in critically ill surgical patients with shock, it is very unlikely that BK viremia results in BK nephropathy later on.
Das Polyomavirus WU (WUPyV) wurde erstmalig im Jahr 2007 in respiratorischem Material bei Patienten mit respiratorischem Infekt beschrieben. Charakterisierung, Epidemiologie und Beurteilung des Krankheitswerts des neuen Virus sind seither Gegenstand vieler Studien weltweit. Retrospektiv wurde Probenmaterial aus dem Respirationstrakt auf WUPyV mittels PCR untersucht. Das Material war zur virologischen Routinediagnostik eingegangen und stammte von in der Universitätskinderklinik Würzburg stationär behandelten Kindern, deren klinische Diagnosen anonymisiert zur Verfügung standen. Es wurden 1277 Nasenrachensekrete (NRS) berücksichtigt aus dem Zeitraum zwischen Januar 2002 und September 2005 sowie zwischen Januar und Juli 2007. Von 1277 NRS waren 62 (4,9 %) positiv für WUPyV. Das Virus wurde in jedem Monat eines Jahres nachgewiesen, wobei Wintermonate insgesamt stärker vertreten waren. Das mediane Alter der betroffenen Patienten betrug 3,0 Jahre (4 Monate – 6,3 Jahre). Klinische Diagnosen bei WUPyV-Infektionen umfassten ein breites Spektrum an oberen und unteren Luftwegserkrankungen. Bei 33 NRS (53,2 %) waren neben WUPyV zuvor ein oder zwei weitere respiratorische Viren durch PCR oder Immunfluoreszenz-Antigentest nachgewiesen worden (Adenovirus: 10; Influenza A: 10; humanes Bocavirus: 9; RSV: 5; Parainfluenzavirus 1/2/3: 3). Die Sequenzanalyse eines 647 bp langen Abschnitts der nicht kodierenden Region bei 50 WUPyV-positiven NRS zeigte eine Übereinstimmung der Sequenzen von 98,5 %. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie unterstützen bisherige Ergebnisse zur Epidemiologie und Verbreitung des WUPyV. Demnach konnte WUPyV-DNA bei akuter respiratorischer Infektion im menschlichen Respirationstrakt, bevorzugt bei Kleinkindern, detektiert werden. WUPyV wies eine hohe Koinfektionsrate mit anderen respiratorischen Viren auf. Es zeigte sich in der phylogenetischen Analyse zweier Genomabschnitte eine geringe Variabilität des Genoms. Bei bisheriger Datenlage bleibt unklar, ob der Nachweis von WUPyV-DNA in NRS mit einer akuten respiratorischen Erkrankung assoziiert werden kann.
Als einer der ersten gegen HIV gerichteten Restriktionsfaktoren konnte die Cytidindeaminase APOBEC3G isoliert werden. Dieses zelluläre Enzym hemmt äußerst effizient die Replikation von HIV. Weiterführende Untersuchungen konnten demonstrieren, dass die Hemmung der Virusreplikation hauptsächlich auf einer Deaminase-katalysierten G zu A-Hypermutation des viralen Genoms während der Reversen Transkription beruht. Als Gegenstrategie zur antiretroviralen Wirkung von A3G kodiert HIV-1 das Protein Vif (virion infectivity factor), welches durch eine direkte Wechselwirkung den Ubiquitin-abhängigen proteasomalen Abbau von A3G bewirkt. Vor diesem Hintergrund wird der Inhibition des Vif induzierten A3G- Abbaus großes Potential als neuartiges Wirkstoffziel bei der Behandlung von HIV Infektionen vorhergesagt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand deshalb in der Etablierung von zellulären Screening-Assays für die Identifizierung von Inhibitoren des Vif induzierten A3G-Abbaus. Im Rahmen dieser Arbeit konnten insgesamt vier fluoreszenzbasierte zelluläre Assays erfolgreich entwickelt und als Screeningsysteme für die Wirkstoffsuche etabliert werden. Drei dieser Assays basieren auf stabilen Zelllinien, von denen eine Vif und ein mit EYFP markiertes A3G ko-exprimiert. Dieser sogenannte A3G-Abbauassay stellt den primären Assay für die Identifizierung von Inhibitoren des Vif induzierten A3G-Abbaus dar und wird durch zwei weitere Zelllinien-basierte Assays ergänzt. Diese sekundäre Assays erlauben die Detektion von Substanzen, die falsch-positive oder falsch-negative Signale im A3G-Abbauassays generieren. Zusammengenommen ermöglichen die drei Assays die präzise Identifizierung von Inhibitoren, die spezifisch auf den A3G-Abbau wirken und stellen damit eine wesentliche Verbesserung bereits existierender Screeningsysteme dar. Weiterhin wurde ein auf dem Prinzip der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) basierendes Testsystem entwickelt. Besagtes System misst die direkte Interaktion zwischen Vif und ElonginC in lebenden Zellen und repräsentiert damit ein weiteres Testsystem für die Identifizierung von Inhibitoren der Vif induzierten A3G-Degradation. Den zweiten Teil dieser Arbeit umfasste die Analyse von Derivaten des Vif Antagonisten RN-18 und neu entwickelten niedermolekularen Inhibitoren der Vif-ElonginC- Interaktion. Als ein wichtiges Ergebnis der Derivat-Analyse ergab sich, dass RN-18 zytotoxisch wirkt und im hier etablierten A3G-Abbauassay ein falsch-positives Signal generiert. Unter den analysierten Vif-ElonginC-Interaktionsinhibitoren fand sich eine Verbindung, die in einem initialen Screening, unter Verwendung des A3G-Abbauassays, eine deutliche Inhibition der Vif induzierten A3G-Degradation bewirkte. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieses Promotionsprojektes erfolgreich mehrere Screeningsysteme für die Identifizierung von spezifischen Inhibitoren des A3G-Abbaus etabliert werden. Diese Systeme werden zukünftig dazu beitragen, dass Auffinden von neuartigen Therapeutika für die Behandlung von HIV-Infektionen zu beschleunigen.
Respiratorische Infektionen sind bei Kindern der Hauptgrund für eine ärztliche Konsultation. In den meisten Fällen werden sie durch virale Erreger ausgelöst. Häufig nachgewiesene respiratorische Viren sind RSV, Adenovirus und Influenza-Virus. In den letzten Jahren wurden weitere Viren als Auslöser von ARI erkannt, so auch die humanen Parechoviren (hPeV), welche zur Familie der Picornaviridae gehören. Um Daten über die Prävalenz, die vorherrschenden Genotypen sowie über die Epidemiologie und Klinik von hPeV-Infektionen in Deutschland zu erhalten, wurde eine Real-Time-PCR etabliert und validiert, um hPeV-RNA in klinischem Probenmaterial nachweisen zu können. Insgesamt wurden 800 NRS aus der Universitätskinderklinik Würzburg aus dem Zeitraum zwischen Januar 2002 und September 2005 untersucht. In 16 der untersuchten Proben ließ sich hPeV-RNA nachweisen (Prävalenz 2%). Von den nachgewiesenen hPeV ließen sich insgesamt 11 Proben als hPeV 1 identifizieren sowie jeweils eine Probe als hPeV 3, hPeV 4 und hPeV 6 einordnen. Alle Kinder waren unter fünf Jahre alt, 56% der Patienten waren weiblich. Die Isolate wurden vor allem in den Monaten zwischen November und März detektiert (n = 14), jedoch auch im April und Juni. Die Koinfektionsrate mit RSV, Adenovirus Parainfluenzaviren, Influenzaviren sowie hBoV und WUPyV lag bei 56%. Die Entlassdiagnose lautete bei zwei Kindern ‚Infekt der oberen Atemwege‘ und bei 14 Kindern ‚Infekt der unteren Atemwege‘. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei hospitalisierten Kindern mit akuten Atemwegsinfekten im Großraum Würzburg hPeV hauptsächlich im Alterssegment unter 2 Jahren vorkommt, hierbei vornehmlich der Genotyp hPeV 1. Insgesamt spielt hPeV jedoch bei viralen respiratorischen Infektionen bei Kindern eine eher untergeordnete Rolle. Obwohl die hPeV-Infektion im KIndesalter häufig ist führt sie nicht unbedingt zu einer Atemwegserkrankung oder einer Hospitalisierung.
Die subakut sklerosierende Panenzephalitis ist eine demyelinisierende Erkrankung des ZNS. Ätiologisch liegt eine persistierende Infektion von Masernviren der Neuronen bzw. Gliazellen zugrunde. Bis heute gibt es keine spezifische Therapie und lediglich symptomatische Therapiemaßnahmen werden in deren Behandlung angewandt. Obwohl sich während des Krankheitsverlaufes eine ausgeprägte Immunantwort des natürlichen als auch adaptiven Immunsystems des Wirtes abspielt führt die Erkrankung unweigerlich zum Tode der Betroffenen. Eine Therapiemöglichkeit diesbezüglich könnten die Effekte der RNAi darstellen. Um geeignete Sequenzen für einen möglichen Genknockdown einzelner MV-Gene herauszufiltern, wurde ein plasmid-basierendes Testsystem entwickelt, das die mRNA des Fluoreszenzproteins DsRed2 zusammen mit mRNA-Sequenzen einzelner MV-Gene exprimiert. Gegen diese MV-Gene wiederum wurden verschiedene shRNAs ausgewählt, welche mithilfe eines lentiviralen Vektorsystems exprimiert werden. Als Expressionsindikator findet in diesem lentiviralen Vektorsystem simultan die Expression von eGFP als statt. Die Auswertung dieses Dual-Color-Systems erfolgte im Folgenden mittels FACS-Analysen. Die wirksamsten siRNA-Sequenzen, ausgewählt durch eine hohe Abnahme der Rotfluoreszenz in den untersuchten Zellen, wurden für weitere Versuche selektiert. Die auf diese Weise ausgewählten shRNA-Sequenzen wurden in einem weiteren Schritt durch die Generierung lentiviraler Partikel in persistierend infizierten NT2-Zellen (piNT2), die das Fluoreszenzprotein HcRed als Infektionsindikator exprimieren, transduziert. Weitere durchflusszytometrische Messungen zeigten eine äußerst hohe Reduktion viraler Replikation innerhalb von 7 Tagen bis unterhalb der Detektionsgrenze sofern die shRNAs gegen die Expression der MV-Proteine N, P und L gerichtet waren. Die Anzahl der virus-negativen Zellen blieb im Folgenden bis zu 3 Wochen nach stattgehabter Transduktion konstant, sofern das fusion-inhibiting-peptide den Zellkulturen hinzugegeben wurde. Die transduzierten piNT2-Zellen, welche keine Expression von HcRed zeigten wurden auf Zellrasen bestehend aus Vero-Zellen aufgetragen und führten im zeitlichen Verlauf zu keiner Fusion bzw. Synzytienbildung. Dieser Zusammenhang legt nahe, dass die transduzierten piNT2-Zellen die Fähigkeit einer Expression viraler Proteine verloren haben und eine „Heilung“ stattfinden kann, wenn die virale Proteinbiosynthese durch eine permanente Expression von siRNAs, wie beispielsweise durch lentivirale Vektorsysteme, gehemmt wird.
Toleranz gegenüber Selbstantigenen in den peripheren Geweben kann durch CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Tregs) vermittelt werden. Diese Zellen entstehen entweder in Folge der thymischen T-Zellselektion (natürlich vorkommende Tregs, nTreg) oder durch Konversion aus naiven T-Zellen in den peripheren lymphatischen Organen (induzierte Tregs, iTregs). Im Vorfeld der Arbeit war bereits bekannt, dass Dendritische Zellen (DZ) eine wichtige Rolle bei der Generierung von iTreg spielen. Allerdings bestand weitestgehend Unklarheit darüber, welche DZ in welchem Reifungszustand dazu in der Lage sind, iTregs gegen peripher-exprimierte Selbstantigene zu induzieren. Steady-state migratorische DZ (ssmDZ) gelten in dieser Hinsicht als potentielle Kandidaten, da bekannt ist, dass diese DZ bereits unter homöostatischen Bedingungen Selbstantigene aus peripheren Geweben in die drainierenden Lymphknoten transportieren und dort T-Zellen präsentieren können. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, den Phänotyp und die tolerogene Kapazität der ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten näher zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass ssmDZ einen semireifen MHC IIint CD40hi CD80/CD86int CCR7+ Phänotyp aufweisen und in vitro mit Hilfe von endogenem TGF-β iTregs induzieren können. Darüber hinaus belegt diese Arbeit zusammen mit weiteren Daten aus unserer Arbeitsgruppe, dass ssmDZ in transgenen K5mOVA-Mäusen zellassoziertes epidermales OVA aus der Haut in die drainierenden Lymphknoten transportieren und dort an CD4+ OVA-spezifische TZR-transgene OT-II T-Zellen präsentieren können. Innerhalb der ssmDZ konnten die Langerin+ dermalen DZ als die DZ-Subpopulation eingegrenzt werden, die für die Konversion von naiven OT-II T-Zellen in CD4+ CD25+ Foxp3+ iTregs verantwortlich war. Ferner zeigte sich, dass CD103 nicht als Marker für ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten herangezogen werden kann. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war, herauszufinden, welchen Einfluss der Transkriptionsfaktor RelB auf die partielle Reifung und Migration der ssmDZ hat. RelB ist ein Mitglied der NF-κB-Familie und wird mit der Reifung von DZ in Verbindung gebracht. Erste Experimente zeigten eine nukleäre Translokation von RelB in ssmDZ sowie eine verringerte Frequenz dieser DZ in den hautdrainierenden Lymphknoten von relB+/- Mäusen und Mäusen mit einer Defizienz für den RelB-Bindungspartner p52. Allerdings konnte bei Mäusen mit einer DZ-spezifischen RelB-Inaktivierung (RelBDCko Mäuse) eine erhöhte Frequenz an ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten festgestellt, die nicht auf einer Zunahme an DZ in der Haut der Tiere zurückzuführen war. Diese Ergebnisse legen einerseits die Vermutung nahe, dass es sich bei den beobachteten Effekte in den relB+/- Mäusen um DZ-extrinsische Auswirkungen auf die ssmDZ handelt. Andererseits scheint RelB unter homöostatischen Bedingungen die Erhaltung und Migration der ssmDZ eher negativ zu beeinflussen. Weitere durchflusszytometrische Analysen wiesen zudem darauf hin, dass RelB in ssmDZ die Expression von Reifungsmarkern nur partiell reguliert. So konnte auf den ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten von RelBDCko Mäusen eine erhöhte Expression von CD40 beobachtet werden, während andere Reifungsmarker wie MHC II, CD80 und CD86 nicht signifikant in ihrer Expression betroffen waren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zudem untersucht, wie sich eine RelB-Defizienz in DZ auf die Homöostase und Induktion von Tregs auswirkt. Die hierzu analysierten RelBDCko Mäuse wiesen eine erhöhte Frequenz und absolute Zellzahl an Tregs in allen untersuchten lymphatischen Organen (hautdrainierende Lymphknoten, Milz und Thymus) auf. Darüber hinaus war in diesen Organen auch eine verstärkte Proliferation der Tregs gegenüber den Kontrolltieren festzustellen. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Proliferation der Tregs in RelBDCko Mäusen in den hautdrainierenden Lymphknoten sogar stärker ausfiel als in der Milz. RelB scheint somit die tolerogene Kapazität der DZ zur Regulation der Treg-Expansion im Thymus und in der Peripherie zu beeinflussen. Unter Verwendung von neutralisierenden αIL-2-Antikörpern konnte zudem belegt werden, dass die periphere Proliferation der Tregs in den RelBDCko Mäusen von IL-2 abhängig ist. Damit einhergehend zeigten erste Vorversuche eine erhöhte IL-2-Produktion in den peripheren lymphatischen Organen von RelBDCko Mäusen. Zusammenfassend legen die Daten dieser Arbeit den Schluss nahe, dass ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten in der Lage sind, Toleranz durch Induktion von iTregs gegen epidermale Selbstantigene zu induzieren. Untersuchungen an neuartigen Mäusen mit einer konditionalen RelB-Inaktivierung spezifisch in DZ deuten darauf hin, dass die Migration und Reifung von ssmDZ partiell durch RelB reguliert wird. Da Tregs eine Schlüsselrolle bei der Erhaltung der peripheren Toleranz einnehmen, ist die Beobachtung, dass eine RelB-Defizienz in allen DZ zu einer verstärkten Treg-Proliferation und somit zu einer veränderten Treg-Homöostase führt, ein intererssanter Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen.
The Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) subtype C is currently the predominant subtype worldwide. Cell culture studies of Sub-Saharan African subtype C proviral plasmids are hampered by the low replication capacity of the resulting viruses, although viral loads in subtype C infected patients are as high as those from patients with subtype B. Here, we describe the sequencing and construction of a new HIV-1 subtype C proviral clone (pZAC), replicating more than one order of magnitude better than the previous subtype C plasmids. We identify the env-region for being the determinant for the higher viral titers and the pZAC Env to be M-tropic. This higher replication capacity does not lead to a higher cytotoxicity compared to previously described subtype C viruses. In addition, the pZAC Vpu is also shown to be able to down-regulate CD4, but fails to fully counteract CD317.
Background: HIV-associated general immune activation is a strong predictor for HIV disease progression, suggesting that chronic immune activation may drive HIV pathogenesis. Consequently, immunomodulating agents may decelerate HIV disease progression. Methods: In an observational study, we determined immune activation in HIV patients receiving low-dose (5 mg/day) prednisolone with or without highly-active antiretroviral therapy (HAART) compared to patients without prednisolone treatment. Lymphocyte activation was determined by flow cytometry detecting expression of CD38 on CD8(+) T cells. The monocyte activation markers sCD14 and LPS binding protein (LBP) as well as inflammation markers soluble urokinase plasminogen activated receptor (suPAR) and sCD40L were determined from plasma by ELISA. Results: CD38-expression on CD8+ T lymphocytes was significantly lower in prednisolone-treated patients compared to untreated patients (median 55.40% [percentile range 48.76-67.70] versus 73.34% [65.21-78.92], p = 0.0011, Mann-Whitney test). Similarly, we detected lower levels of sCD14 (3.6 μg/ml [2.78-5.12] vs. 6.11 μg/ml [4.58-7.70]; p = 0.0048), LBP (2.18 ng/ml [1.59-2.87] vs. 3.45 ng/ml [1.84-5.03]; p = 0.0386), suPAR antigen (2.17 μg/ml [1.65-2.81] vs. 2.56 μg/ml [2.24-4.26]; p = 0.0351) and a trend towards lower levels of sCD40L (2.70 pg/ml [1.90-4.00] vs. 3.60 pg/ml [2.95-5.30]; p = 0.0782). Viral load in both groups was similar (0.8 × 105 ng/ml [0.2-42.4 × 105] vs. 1.1 × 105 [0.5-12.2 × 105]; p = 0.3806). No effects attributable to prednisolone were observed when patients receiving HAART in combination with prednisolone were compared to patients who received HAART alone. Conclusions: Patients treated with low-dose prednisolone display significantly lower general immune activation than untreated patients. Further longitudinal studies are required to assess whether treatment with low-dose prednisolone translates into differences in HIV disease progression.
The ability of CD4+Foxp3+ regulatory T-cells (Treg) to produce interleukin (IL)-10 is important for the limitation of inflammation at environmental interfaces like colon or lung. Under steady state conditions, however, few Tregs produce IL-10 ex vivo. To investigate the origin and fate of IL-10 producing Tregs we used a superagonistic mouse anti-mouse CD28 mAb (CD28SA) for polyclonal in vivo stimulation of Tregs, which not only led to their numeric expansion but also to a dramatic increase in IL-10 production. IL-10 secreting Tregs strongly upregulated surface receptors associated with suppressive function as compared to non-producing Tregs. Furthermore, polyclonally expanding Tregs shifted their migration receptor pattern after activation from a CCR7+CCR52 lymph node-seeking to a CCR72CCR5+ inflammationseeking phenotype, explaining the preferential recruitment of IL-10 producers to sites of ongoing immune responses. Finally, we observed that IL-10 producing Tregs from CD28SA stimulated mice were more apoptosis-prone in vitro than their IL-10 negative counterparts. These findings support a model where prolonged activation of Tregs results in terminal differentiation towards an IL-10 producing effector phenotype associated with a limited lifespan, implicating built-in termination of immunosuppression.
Dendritic cells (DCs) are major players in the control of adaptive tolerance and immunity. Therefore, their specific generation and adoptive transfer into patients or their in vivo targeting is attractive for clinical applications. While injections of mature immunogenic DCs are tested in clinical trials, tolerogenic DCs still are awaiting this step. Besides the tolerogenic potential of immature DCs, also semi-mature DCs can show tolerogenic activity but both types also bear unfavorable features. Optimal tolerogenic DCs, their molecular tool bar, and their use for specific diseases still have to be defined. Here, the usefulness of in vitro generated and adoptively transferred semi-mature DCs for tolerance induction is outlined. The in vivo targeting of semi-mature DCs as represented by steady state migratory DCs are discussed for treatment of autoimmune diseases and allergies. First clinical trials with transcutaneous allergen application may point to their therapeutic use in the future.
Background: Recently, contradictory results on foamy virus protease activity were published. While our own results indicated that protease activity is regulated by the viral RNA, others suggested that the integrase is involved in the regulation of the protease. Results: To solve this discrepancy we performed additional experiments showing that the protease-reverse transcriptase (PR-RT) exhibits protease activity in vitro and in vivo, which is independent of the integrase domain. In contrast, Pol incorporation, and therefore PR activity in the viral context, is dependent on the integrase domain. To further analyse the regulation of the protease, we incorporated Pol in viruses by expressing a GagPol fusion protein, which supported near wild-type like infectivity. A GagPR-RT fusion, lacking the integrase domain, also resulted in wild-type like Gag processing, indicating that the integrase is dispensable for viral Gag maturation. Furthermore, we demonstrate with a trans-complementation assays that the PR in the context of the PR-RT protein supports in trans both, viral maturation and infectivity. Conclusion: We provide evidence that the FV integrase is required for Pol encapsidation and that the FV PR activity is integrase independent. We show that an active PR can be encapsidated in trans as a GagPR-RT fusion protein.
Despite intense research efforts, a safe and effective HIV-1/AIDS vaccine still remains far away. HIV-1 escapes the humoral immune response through various mechanisms and until now, only a few nAbs have been identified. A promising strategy to identify new epitopes that may elicit such nAbs is to dissect and analyze the humoral immune response of sera with broadly reactive nAbs. The identified epitopes recognized by these antibodies might then be incorporated into a vaccine to elicit similar nAbs and thus provide protection from HIV-1 infection. Using random peptide phage display libraries, the Ruprecht laboratory has identified the epitopes recognized by polyclonal antibodies of a rhesus monkey with high-titer, broadly reactive nAbs that had been induced after infection with a SHIV encoding env of a recently transmitted HIV-1 clade C. The laboratory analyzed phage peptide inserts for conformational and linear homology with computational assistance. Several of the identified peptides mimicked domains of the original HIV-1 clade Env, such as conformational V3 loop epitopes and the conserved linear region of the gp120 C-terminus. As part of this work, these mimotopes were analyzed for cross-reactivity with other sera obtained from rhesus monkeys with nAbs and antibody recognition was shown for several mimotopes, particularly those representing the V3 loop. In addition, these mimotopes were incorporated into a novel DNA prime/phage boost strategy to analyze the immunogenicity of such phage-displayed peptides. Mice were primed only once with HIV-1 clade C gp160 DNA and subsequently boosted with mixtures of recombinant phages. This strategy was designed to focus the humoral immune response on a few, selected Env epitopes (immunofocusing) and induced HIV-1 clade C gp160 binding antibodies and cross-clade nAbs. Furthermore, the C-terminus of gp120, a conserved HIV Env region, was linked to the induction of nAbs for the first time. The identification of such conserved antigens may lead to the development of a vaccine that is capable of inducing broadly reactive nAbs that might confer protection form HIV-1 infection.
Primary contact with human polyomaviruses is followed by lifelong asymptomatic persistence of viral DNA. Under severe immunosuppression JCV activation may lead to unrestricted virus growth in the CNS followed by development of progressive multifocal leukoencephalopathy (PML). Besides the kidney and the brain, target cells of persistent infection were also found in the hematopoietic system. This included the presence of JCV genomes in peripheral blood cells (PBCs). In the attempt to understand the role of PBCs for the JCV infection in humans, we asked for the type of cells affected as well as for virus interaction with PBCs. Analysis of separated subpopulations by highly sensitive and specific polymerase chain reaction and Southern blot hybridization revealed the presence of JCV DNA mostly in circulating granulocytes. These cells have important functions in innate immunity and are professional phagocytes. This suggested that PCR amplified DNA might be the result of an extranuclear association of the virus due to membrane attachment or phagocytosis rather than JCV infection with presence of viral DNA in the nucleus. In the attempt to answer this question JCV DNA was subcellularly localized in the blood of 22 healthy donors by JCV specific fluorescence in situ hybridization (FISH). Granulocytes and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were separated by Percoll gradient centrifugation. Intracellular JCV DNA was hybridized with Digoxigenin-labeled JCV specific DNA probes covering half of the viral genome. As the sensitivity of the anti-digoxigenin antibody system was lower than the PCR detection level, a chemical amplification step was included consisting of peroxidase labeled secondary antibody precipitating biotinylated tyramide followed by detection with streptavidin-Texas-Red and fluorescence microscopy. Comparison of the number of cells affected in healthy individuals with 15 HIV-1 infected patients with and without PML revealed that the rate of affected PBMCs was comparable in both groups (2.5±0.4 and 14.5±0.9 per 1000). In contrast, the rate of JCV positive granulocytes in the immunosuppressed group was 92.6±1.7% compared to 4±1.4% in healthy donors thus confirming that granulocytes are the major group of circulating cells affected by JCV and that HIV-1 associated immune impairment has an important effect on the virus-cell association. Localization revealed that JCV DNA was predominantly located within the cytoplasm, although hybridizing signals occasionally covered the nuclear compartment. The fluorescent glow of chemical amplification combined with classical fluorescence microscopy did not allow an unequivocal localization of viral DNA. However, confocal microscopy of 24 sections through single cells combined with FISH without chemical amplification confirmed cytoplasmic localization of JCV DNA in a large number of cells. Additionally, it clearly demonstrated that JCV DNA was also located in the nucleus and nuclear localization directly correlated with the number of cells affected. Calculation of the virus load in subcellular compartments revealed that up to 50% of the JCV genomes were located in the nucleus thus pointing to viral infection at least in the granulocytes of HIV-1 infected patients. This may contribute to the distribution of the virus from sites of peripheral infection to the CNS and may promote the development of active PML in the severely immune impaired patients.
Hintergrund: Das Absterben Neuromelanin (NM)-haltiger Zellen in der substantia nigra (SN), und die daraus resultierende Erniedrigung des Dopaminspiegels im striatum, ist ein pathologisches Hauptmerkmal der Parkinsonschen Krankheit. Ein neuerlicher Nachweis von Anti-Melanin-Antikörpern gibt Anlass zur Vermutung, dass NM ein Autoantigen sein könnte. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass NM tatsächlich von dendritischen Zellen (DZ), die in vivo hauptverantwortlich für die Auslösung von T- und B-Zellantworten sind, erkannt wird. Die Erkennung von NM durch DZ ist eine unabdingbare Voraussetzung für die Einleitung einer adaptiven Immunantwort. Methoden: Murine dendritische Zellen (mDZ) wurden aus Knochenmarkszellen generiert und mit NM aus humaner SN oder synthetischem Dopaminmelanin (DAM) behandelt, nachdem beide Melanine endotoxinfrei getestet wurden. Die Phagozytose von NM wurde mittels konfokaler Mikroskopie dokumentiert. Die Expression von MHC II und CD86 wurde mittels Durchflusszytometrie (FACS) analysiert. Zytokinkonzentrationen von TNF- und dem Interleukin IL-6 wurden mit ELISA-Assays bestimmt. Abschließend wurde die Funktion der durch NM aktivierten DZ mit einer allogenen mixed lymphocyte reaction (MLR) überprüft. Ergebnisse: NM wurde von den mDZ effektiv phagozytiert, woraufhin die mDZ einen reifen Phenotyp (CD86high/MHC IIhigh) zeigten. Zusätzlich sekretierten durch NM aktivierte mDZ die Zytokine IL-6 and TNF-. Schließlich ließen die mDZ T-Zellen in einer MLR proliferieren, und beweisen so ihre Funktionalität und die Fähigkeit eine primäre T-Zellantwort auszulösen. Im Gegenteil dazu konnte DAM, dem die Protein- und Lipidkomponenten von NM fehlen und nur das Melaninrückrat mit NM gemeinsam hat, nur einen kleinen Effekt bei den mDZ hervorrufen. Diskussion: NM wird von DZ in vitro erkannt und bewirkt deren Reifung. Sollte der Vorgang auch in vivo stattfinden, besteht die Möglichkeit, dass SN-Antigene dem adaptiven Immunsystem präsentiert werden, was in einzelnen Fällen zur Einleitung einer adaptiven Immunantwort führen könnte. NM könnte also der Auslöser für einen autoimmunen Pathomechanismus in der parkinsonschen Krankheit sein.
Dendritische Zellen (DCs) sind Antigen-präsentierende Zellen, die Pathogene erkennen und nach erfolgreicher Reifung spezifische adaptive Immunität induzieren. Die Infektion unreifer DCs durch Masernviren (MV) erfolgt CD150-abhängig und DC-SIGN-unterstützt. Infizierte DCs vermitteln wahrscheinlich den MV-Transport vom Respirationstrakt in sekundäre lym-phatische Gewebe, wo die MV-spezifische Immunität und die generalisierte Immunsuppressi-on initiiert werden sowie die MV-Transmission an T-Zellen stattfinden kann, die wesentlich für die Dissemination des Virus ist. Die MV-Infektion von iDCs initiierte deren Ausreifung begleitet von der moderaten Hochre-gulierung der CD150-Oberflächenexpression. Die Akkumulation viraler Proteine als auch die Freisetzung viraler Partikel waren in DCs im Vergleich zu Virus-produzierenden B-Zelllinie B95a beeinträchtigt. Diese Arbeit verglich die subzelluläre Verteilung der viralen Proteine in DCs und B95a-Zellen. In DC wiesen Matrix (M)-Proteine eine prominente Assoziation mit den Komponenten des Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexes auf. Die ausgeprägte Relokali-sierung des Tetraspanins CD81 zu Phospho (P)-Protein-Kompartimenten und die Inhibition der räumliche Interaktion der untersuchten Tetraspanine waren spezifisch für B95a-Zellen. Weder in B95a-Zellen noch für DC konnte für MV ein virus-containing compartment (VCC) detektiert werden, das für HIV-1 zuvor beschrieben wurde. Um den zellulären Transport des M-Proteins in infizierten, lebenden DCs untersuchen zu können, wurde das Protein carboxyterminal mit dem Tetracystein (TC)-Tag fusioniert. Das M-TC Fusionsprotein zeigte alle untersuchten biologischen Eigenschaften des Wildtyp-Proteins bezüglich seiner subzellulären Verteilung, der Assoziation mit DRMs sowie der Generierung und Freisetzung von virus-like particles (VPLs). Innerhalb des Viruskontextes interferierte der TC-Tag allerdings stark mit der Virusreplikation bzw. Freisetzung. Durch die Verminderung der Partikelproduktion in DCs wird eine spezielle MV-Transmissionsstruktur für die effiziente Übertragung an T-Zellen benötigt. Die MV-Transmission an autologe T-Zellen basierte vorwiegend auf Infektion von DCs (cis-Infektion) und weniger auf DC-SIGN-gebundenen Virus (trans-Infektion). Die Interaktion zwischen dem MV-Glykoprotein H mit seinem Rezeptor CD150 war wichtig für die Transmission. Die Transmission von MV erfolgte hauptsächlich durch die Bildung von Kontaktflächen, entspre-chend den beschriebenen virologischen Synapsen, wo virale Proteine akkumulierten und CD150 aktinabhängig rekrutiert wurde, und seltener über aktinreiche Filopodien. Die HIV-VS Markerproteine ICAM-1, aktiviertes LFA-1, CD81, DC-SIGN und der phosphorylierte Ezrin / Radixin / Moesin (ERM)-Proteinkomplex polarisierten zur MV-VS. Moesin und der Substanz P Rezeptor (SPR), die Prozesse des MV-Eintritts oder der Aufnahme unterstützen, akkumulierten ebenfalls in den Transmissionsstrukturen. Zusammengefasst zeigte diese Arbeit, dass die gebildete Plattform für MV-Transmission (MV-VS) wichtige Gemeinsamkeiten mit der HIV-VS teilt. In der MV-VS akkumulierten Proteine, die Aktindynamiken regulieren, die die Konjugatstabilität verstärken und die die Membranfusion unterstützen, die einen effizienten Eintritt des MV in T-Zellen ermöglichen.
Tregs dienen zur Aufrechterhaltung der Balance im Immunsystem. Die Infektion, Aktivierung oder Induktion von Tregs durch Pathogene kann diese Balance empfindlich stören, eine Immunsuppression zur Folge haben und zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen oder Persistenzen beitragen. Das MV verfügt nicht nur über vielfältige Mechanismen der Immunsuppression, während einer MV-Infektion herrschen zudem Bedingungen vor, welche die Zahl und Aktivität von Tregs beeinflussen könnten. Aufgrund der Expression von Reifungsmarkern auf Trn ist zudem eine präferenzielle Infektion dieser Zellpopulation denkbar. MV-Infektionen können sowohl die akute MV-Enzephalitis, eine Autoimmunerkrankung, nach sich ziehen, als auch die Persistenz SSPE ausbilden. Ob diese Komplikationen mit spezifischen Aberrationen in der Menge und Aktivität von Tregs im Zusammenhang stehen, war bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass auf unstimulierten Trn der Reifungsmarker und MV-Rezeptor CD150 exprimiert wird und es in Folge dessen in vitro zu einer präferentiellen nicht produktiven Infektion und Depletion von Trn kommt. Ex vivo ließ sich ein deutlicher Depletionseffekt während der frühen akuten MV-Enzephalitis nachweisen, der nach Vaczinierung eines gesunden Probanden und Challenge eines immunisierten Affen nicht auftrat. Ob dieser Depletionseffekt ursächlich für die Enzephalitis ist, oder es sich um einen Begleiteffekt handelt ließe sich an Modellorganismen durch mitogene Manipulation der Trn während einer MV-Infektion untersuchen. Auch bei SSPE kann es zu einer Depletion von Trn kommen, dies scheint jedoch nicht mit der Progression dieser Erkrankung im Zusammenhang zu stehen. Wahrscheinlich ist dagegen ein Zusammenhang mit der Induktion von Tregs. In MV-stimulierten Proben von SSPE-Patienten wurde im Mittel signifikant mehr IL-10 exprimiert als in den Kontrollen. In Proben seropositiver gesunder Spender wurde IL-10 in den ersten Stunden nach MV-Stimulation fast ausschließlich von induzierten Tregs exprimiert. Weitere Versuche sind nötig, um die Evidenz zu steigern und zu ermitteln, ob auch in Patientenproben die frühe IL-10 Expression nach MV-Stimulation von induzierten Tregs dominiert wird. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass es sowohl bei der MV-Enzephalitis als auch bei SSPE zu signifikanten Wechselwirkungen mit Tregs kommt. Ob sich eine MV-Enzephalitis auch ohne Depletion von Trn ausbilden kann und ob die Ausbildung von SSPE erhöhte IL-10 Expression voraussetzt, werden weitere Untersuchungen ergründen müssen.
Zu den gefährlichen Komplikationen der Masern gehört die selten vorkommende ZNS-Erkrankung subakute sklerosierende Panenzephalitis (SSPE), die erst mehrere Jahre nach einer akuten Masernvirusinfektion auftritt. Die SSPE verläuft immer tödlich und bis heute gibt es keine spezifische Therapie gegen diese Erkrankung. Unsere Arbeitsgruppe hat ein Modell für eine persistierende, virale ZNS-Infektion entwickelt, in dem 2-Wochen-alte, immunologisch normale C57BL/6-Mäuse mit einem rekombinanten, neurotropen Masernvirus (MV), das das Hämagglutinin eines an Nagern angepassten MV-Stammes enthält, intrazerebral (i.c.) infiziert werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Rolle regulatorischer CD4+ CD25+ Foxp3+ T-Zellen (Treg) in diesem Mausmodell analysiert und untersucht, ob die persistierende ZNS-Infektion durch Manipulation peripherer Treg beeinflusst werden kann. Außerdem wurde ein IFN-y-ELISPOT-Assay etabliert, der CD8+ zytotoxische T-Zellen (CTL) identifiziert, die spezifisch für die MV-Hämagglutinin-Epitope MV-H22-30 (RIVINREHL) bzw. MVH446-454 (SNHNNVYWL) sind. In Bezug auf das erstgenannte Epitop wurde desweiteren eine Pentamer-Färbung etabliert, um CTLs mit Hilfe der Durchflusszytometrie zu identifizieren, die H-2Db-gekoppelte MV-H22-30-Epitope erkennen. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen, dass sich trotz eines hohen Anteils Masern-spezifischer CTLs und nur sehr wenigen Treg im Gehirn eine persistierende ZNSInfektion ausbildet. Periphere Treg wurden während der persistierenden Phase der ZNS-Infektion expandiert bzw. depletiert und die Konsequenzen für die Virus-spezifische Immunantwort sowie das Ausmaß der persistierenden Infektion wurden analysiert. Die Expansion von Treg mit Hilfe des superagonistischen anti-Maus CD28 Antikörpers D665 verursachte eine transiente Immunsuppression, die die Virus-Replikation sowie -Ausbreitung im Gehirn verstärkte. Im Gegensatz dazu führte die Depletion von Treg in DEREG-Mäusen mittels Diphtherietoxin zu einem erhöhten Anteil Virus-spezifischer CTLs im Gehirn sowie zu einer Reduktion der persistierenden ZNS-Infektion. Diese Daten zeigen, dass Treg die Fähigkeit besitzen, die Persistenz von MV im Gehirn zu kontrollieren und somit möglicherweise Teil eines Therapiekonzeptes gegen ZNS-Infektionen mit dem Masernvirus sein können. Frühere Studien unserer Arbeitsgruppe haben außerdem gezeigt, dass das durch IFN-y induzierbare Enzym Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) antivirale Aktivitäten gegen MV aufweist. Dies wurde in dieser Doktorarbeit in vivo in unserem Mausmodell anhand von IDOk.o.-Tieren bestätigt, die nach i.c. Infektion nicht nur eine erhöhte Mortalitätsrate aufwiesen sondern auch in den überlebenden Tieren eine verstärkte persistierende ZNS-Infektion zeigten.