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Zars and co-workers were able to localize an engram of aversive olfactory memory to the mushroom bodies of Drosophila (Zars et al., 2000). In this thesis, I followed up on this finding in two ways. Inspired by Zars et al. (2000), I first focused on the whether it would also be possible to localize memory extinction.While memory extinction is well established behaviorally, little is known about the underlying circuitry and molecular mechanisms. In extension to the findings by Zars et al (2000), I show that aversive olfactory memories remain localized to a subset of mushroom body Kenyon cells for up to 3 hours. Extinction localizes to the same set of Kenyon cells. This common localization suggests a model in which unreinforced presentations of a previously learned odorant intracellularly antagonizes the signaling cascades underlying memory formation. The second part also targets memory localization, but addresses appetitive memory. I show that memories for the same olfactory cue can be established through either sugar or electric shock reinforcement. Importantly, these memories localize to the same set of neurons within the mushroom body. Thus, the question becomes apparent how the same signal can be associated with different events. It is shown that two different monoamines are specificaly necessary for formation of either of these memories, dopamine in case of electric shock and octopamine in case of sugar memory, respectively. Taking the representation of the olfactory cue within the mushroom bodies into account, the data suggest that the two memory traces are located in the same Kenyon cells, but in separate subcellular domains, one modulated by dopamine, the other by octopamine. Taken together, this study takes two further steps in the search for the engram. (1) The result that in Drosophila olfactory learning several memories are organized within the same set of Kenyon cells is in contrast to the pessimism expressed by Lashley that is might not be possible to localize an engram. (2) Beyond localization, a possibible mechanism how several engrams about the same stimulus can be localized within the same neurons might be suggested by the models of subcellular organisation, as postulated in case of appetitive and aversive memory on the one hand and acquisition and extinction of aversive memory on the other hand.
Der Blutkreislauf ist als wichtigstes Transportsystem im menschlichen Körper essentiell für die Versorgung der Gewebe und Organe mit Sauerstoff, Nährstoffen, Hormonen etc. Zwei Zelltypen, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung eines funktionell intakten Blutgefäßsystems spielen, sind Thrombozyten, die zentralen Mediatoren der Blutgerinnung, und Endothelzellen, welche die luminale Seite der Gefäßwände auskleiden. Diese beiden Zellen sind aber auch wesentlich an der Pathologie der Atherosklerose und kardiovaskulärer Erkrankungen beteiligt. Durch direkte und indirekte Interaktionen beeinflussen sich diese beiden Zelltypen gegenseitig und regulieren ihre Aktivität. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Analysenmethode entwickelt, welche den Funktionszustand der Thrombozyten quantitativ erfaßt. Sowohl die Aktivierung als auch die Hemmung humaner Thrombozyten wird durch die Phosphorylierung spezifischer Signalproteine reguliert. Basierend auf der Verwendung phosphorylierungsspezifischer Antikörper und der Durchflußzytometrie wurde eine Methode etabliert, welche die Proteinphosphorylierung auf Einzelzellebene erfaßt, schnell quantifizierbare Ergebnisse liefert und für die Analyse im Vollblut geeignet ist. Da die Sekretion von Endothelfaktoren den Phosphorylierungszustand dieser Proteine in den Thrombozyten beeinflußt, kann die Methode auch dazu verwendet werden, indirekt Rückschlüsse auf den Funktionszustand der Endothelzellen zu gewinnen. In einer ersten klinischen Anwendung wurde die Methode eingesetzt, um den Therapieverlauf der antithrombotischen Medikamente Ticlopidin und Clopidogrel, welche gezielt die ADP-induzierte Thrombozytenaktivierung hemmen, zu verfolgen und das Antwortverhalten von Patienten auf diese Medikamente zu messen. Mehrere Personen, bei denen Ticlopidin und Clopidogrel keine Wirkung zeigten, wurden gefunden, ein Hinweis darauf, daß eine Resistenz gegen Thienopyridine vorkommt. Es ist bekannt, daß Endothelfaktoren bestimmte Aspekte der Thrombozytenaktivierung hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der p38 und p42 Mitogen-aktivierten Proteinkinasen, die im Verlauf der Thrombozytenaktivierung von zahlreichen Agonisten induziert wird, ebenfalls durch die endothelialen Vasodilatatoren NO (Stickstoffmonoxid) und Prostaglandin gehemmt wurde. Außerdem hemmten diese Substanzen die Translokation der inflammatorischen Moleküle P-Selektin und CD40 Ligand (CD40L) aus intrazellulären Speicherorganellen auf die Thrombozytenoberfläche. P-Selektin und CD40L werden auf aktivierten Thrombozyten exprimiert und sind direkt an der Interaktion von Thrombozyten mit Leukozyten und Endothelzellen beteiligt. Um die Auswirkung von CD40L, P-Selektin und weiteren Faktoren aktivierter Thrombozyten auf humane Endothelzellen zu untersuchen, wurde mit Hilfe von cDNA-Arrays die differentielle Genexpression in Endothelzellen nach Koinkubation mit aktivierten Thrombozyten analysiert. Neben einer bereits bekannten Hochregulierung von Faktoren, die an inflammatorischen Prozessen beteiligt sind, wurde eine verstärkte Expression von Transkriptionsfaktoren (c-Jun, Egr1, CREB2), Wachstumsfaktoren (PDGF) sowie von Adhäsionsrezeptoren für extrazelluläre Matrixproteine (Integrin av, Integrin b1) gefunden. Diese Faktoren weisen darauf hin, daß aktivierte Thrombozyten die Migration und Proliferation der Endothelzellen anregen und damit die Wundheilung, aber auch pathophysiologische Prozesse wie die Ausbildung atherosklerotischer Plaques induzieren könnten.
Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are key regulators for a lot of diverse cellular processes. During embryonic development these proteins act as morphogens and play a crucial role particularly in organogenesis. BMPs have a direct impact on distinct cellular fates by means of concentration-gradients in the developing embryos. Using the diverse signaling input information within the embryo due to the gradient, the cells transduce the varying extracellular information into distinct gene expression profiles and cell fate decisions. Furthermore, BMP proteins bear important functions in adult organisms like tissue homeostasis or regeneration. In contrast to TGF-ß signaling, currently only little is known about how cells decode and quantify incoming BMP signals. There is poor knowledge about the quantitative relationships between signal input, transducing molecules, their states and location, and finally their ability to incorporate graded systemic inputs and produce qualitative responses. A key requirement for efficient pathway modulation is the complete comprehension of this signaling network on a quantitative level as the BMP signaling pathway, just like many other signaling pathways, is a major target for medicative interference. I therefore at first studied the subcellular distribution of Smad1, which is the main signal transducing protein of the BMP signaling pathway, in a quantitative manner and in response to various types and levels of stimuli in murine c2c12 cells. Results indicate that the subcellular localization of Smad1 is not dependent on the initial BMP input. Surprisingly, only the phospho-Smad1 level is proportionally associated to ligand concentration. Furthermore, the activated transducer proteins were entirely located in the nucleus. Besides the subcellular localization of Smad1, I have analyzed the gene expression profile induced by BMP signaling. Therefore, I examined two endogenous immediate early BMP targets as well as the expression of the stably transgenic Gaussia Luciferase. Interestingly, the results of these independent experimental setups and read-outs suggest oscillating target gene expression. The amplitudes of the oscillations showed a precise concentration-dependence for continuous and transient stimulation. Additionally, even short-time stimulation of 15’ activates oscillating gene-expression pulses that are detectable for at least 30h post-stimulation. Only treatment with a BMP type I receptor kinase inhibitor leads to the complete abolishment of the target gene expression. This indicated that target gene expression oscillations depend directly on BMP type I receptor kinase activity.
Fehlgeleitete Proliferations- und Differenzierungsprozesse von Keratinozyten spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Die intrazellulären Signalmechanismen, die die Balance zwischen Keratinozytenwachstum und -differen-zierung steuern, sind bislang weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK-) Signalwege in keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß Induktion von Keratinozytendifferenzierung durch Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration mit einer raschen und transienten Aktivierung des Raf/MEK/Erk- (MAPK-) Signalweges verbunden ist, während keine veränderte Aktivität der stressinduzierten MAPK Jnk und p38 nachweisbar war. Die calciuminduzierte Erk-Aktivierung unterschied sich in ihrer Kinetik von mitogener Erk-Aktivierung durch den Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und konnte durch Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration moduliert werden. Während die mitogene Erk-Aktivierung durch die kleine GTPase Ras vermittelt wird, erfolgte calciuminduzierte Aktivierung von Erk Ras-unabhängig, was auf einen fundamentalen Unterschied mitogener und differenzierungsinduzierender Stimuli hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen der Raf/MEK/Erk-Kaskade hindeutet. Trotz der transienten Natur der calciuminduzierten Erk-Aktivierung waren die calcium-vermittelte Expression des Zellzykusinhibitors p21/Cip1 und des Differenzierungsmarkers Involucrin sensitiv für MEK-Inhibition, was auf eine wichtige Rolle des Raf/MEK/Erk-Signalweges in frühen Stadien des Differenzierungsprozesses hinweist. Wichtige Konvergenzpunkte zwischen calcium- und MAPK-abhängigen Signalwegen scheinen die beiden calciumbindenden S100-Proteine MRP8 und MRP14 zu sein. Beide Proteine werden in vitro differenzierungsabhängig exprimiert und translozieren sowohl nach Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration als auch nach Stimulation stress-aktivierter MAPK an Zytoskelettstrukturen. Untersuchung der Expression von MRP8 und MRP14 in paraffin- und kryofixierten Serienschnitten gesunder und pathologisch veränderter Haut ergab, dass deren Expression normalerweise auf differenzierende Zellen im Haarfollikel beschränkt ist, jedoch in differenzierten Hautschichten hyperproliferativer oder tumoröser Haut massiv induziert werden kann. In der hier vorgestellten Arbeit wurden interessante neue Signalbeziehungen identifiziert, deren Entdeckung einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der regulatorischen Mechanismen leisten könnte, durch die die Epidermis ihre funktionell wichtige Homöostase erhält.
Die Stimulation primärer erythroider Vorläuferzellen (PEPs) mit Erythropoetin (Epo) führt zur Aktivierung der mitogenen Kinasen („extracellular signal-regulated kinases“ (Erks) und „mitogen-activated protein kinase/Erk-activating kinases“ (MEKs)). Der Mechanismus der Aktivierung war bisher unklar. Mehrere wissenschaftliche Gruppen haben zudem unerwartet herausgefunden, dass eine Verkürzung und Mutation des zytoplasmatischen Endes des Epo-Rezeptors (EpoR), welche zum Verlust der Bindungsmöglichkeiten für verschiedene Signalproteine führt, anscheinend nur einen geringen Effekt auf das EpoR-Signalsystem hat. Diese Ergebnisse werden durch Viabilität und normaler Erythrozytenzahl von mutierten Mäusen unterstützt. Ein neuer Signalweg, der in biochemischen Studien mit aus menschlichem Nabelschnurblut gewonnenen PEPs gefunden wurde, könnte diese überraschenden Ergebnisse erklären. Wir zeigen zum ersten mal, dass Ras und das Klasse 1b Enzym der Familie der Phosphatidylinositol-3-Kinasen (PI3K), PI3Kg, nach Stimulation mit einer physiologischen Konzentration von Epo aktiviert werden. Überraschenderweise kann in PEPs die Epo-induzierte Ras-, MEK- und Erk-Aktivierung durch drei strukturell unterschiedliche PI3K-Inhibitoren blockiert werden. Überdies ist die Erk-Aktivierung in PEPs unempfindlich gegenüber Inhibierung der Raf-Kinasen, wird aber durch Proteinkinase C (PKC)-Inhibitoren unterdrückt. Im Gegensatz dazu ist die durch Stammzellfaktor („stem cell factor“ (SCF)) induzierte Erk-Aktivierung empfindlich gegenüber Raf-Inhibierung, jedoch unempfindlich gegenüber PI3K- und PKC-Inhibitoren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aktivierung von MEKs und Erks in PEPs durch geringe Konzentrationen an Epo nicht durch die klassische Signalkaskade „Src homology 2 domain-containing transforming protein C“ (Shc), „growth factor receptor bound protein 2“ (Grb2), „son of sevenless“ (Sos), Ras, Raf, MEK und Erk erfolgt, sondern durch einen PI3K-abhängigen und Raf-unabhängigen Signalweg, welcher PKC-Aktivität benötigt, reguliert wird.
Abscisinsäure-Glucoseester (ABA-GE) kann nach der vorliegenden Untersuchung nicht mehr ausschließlich als Endmetabolit der Abscisinsäure (ABA) gelten. Der unter Stressbedingungen im Xylem verstärkt transportierte ABA-GE trägt in Kombination mit einer extrazellulären ß-D-Glucosidaseaktivität im Blattapoplast zu einer Stabilisierung und Intensivierung des ABA-Langstreckensignals bei.
Das pleiotrope Zytokin TNF (tumor necrosis factor) kann an den TNF-Rezeptor 1 (TNFR1) und den TNF-Rezeptor 2 (TNFR2) binden und mit deren Hilfe seine biologischen Funktionen über verschiedene Signalwege, wie z.B. NFB- und MAPK-Aktivierung bzw. Apop¬toseinduktion, vermitteln. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des TNFR2 zur proteasomalen Degradation des Adaterproteins TRAF2 führt und dadurch die TNFR1-induzierte Apoptose verstärkt wird. TWEAK (tumor necrosis like weak inducer of apoptosis), das ebenfalls der TNF-Ligandenfamilie angehört und die Interaktion mit dessen Rezeptor Fn14 (fibroblast growth factor-inducible 14), der wie der TNFR2 zur Untergruppe der TRAF-bindenden Rezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie gehört, zeigten in verschiedenen Arbeiten auch eine TRAF2-degradierende Wirkung. In der vorliegenden Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass dies auch im Falle des TWEAK/Fn14-Systems mit einem verstärkenden Effekt auf die TNFR1-vermittelte Apoptose einhergeht. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass TWEAK zusätzlich auch die TNFR1-induzierte Nekrose verstärkt, die den Zelltod durch andere Mechanismen als bei der Apoptose induziert. Von anderen Arbeiten unserer Gruppe war bekannt, dass lösliches TWEAK (sTWEAK) und membranständiges TWEAK (mTWEAK) bezüglich der TRAF2-Depletion wirkungs¬gleich sind. Da der apoptotische Fn14-TNFR1-„crosstalk“ auf der Depletion von TRAF2-Komplexen beruht wurden auch keine signifikanten Unterschiede zwischen sTWEAK und mTWEAK in Bezug auf die Verstärkung der TNFR1-induzierten Apoptose beobachtet. Interessanter¬weise zeigte sich in der vorliegenden Arbeit jedoch, dass sTWEAK den klassischen NFB-Signalweg gar nicht bzw. nur schwach aktiviert, wohingegen mTWEAK diesen stark induziert. Bei der Aktivierung des alternativen NFB-Signalweges hingegen ließen sich keine Unterschiede zwischen sTWEAK und mTWEAK erkennen. Die Aktivierung eines Signalweges wird also durch die Oligomerisierung des Liganden nicht moduliert, demgegenüber aber erwies sich die Aktivierung eines anderen Signalweges als stark abhängig von der Liganden-Oligomerisierung. Vor dem Hintergrund, dass das Adapterprotein TRAF1 (TNF-receptor-associated factor 1) Heterotrimere mit TRAF2 bildet, wurde weiterhin untersucht, ob dieses Molekül einen Einfluss auf die Aktivität der TWEAK-induzierten Signalwege hat. Tatsächlich zeigte sich in TRAF1-exprimie¬renden Zellen eine Verstärkung der TWEAK-induzierten Aktivierung des klassischen NFB-Signalweges Zukünftige Studien müssen nun aufklären, inwieweit die hier gefundenen Mecha-nismen das Zusammenspiel von TNF und TWEAK in vivo bestimmen.
TWEAK is a typical member oft he TNF ligand family. Therefore it is initially expressed as a type II transmembrane protein, but a soluble variant can be released by proteolytic processing. In this work it is shown that oligomerized TWEAK is more competent than soluble, trimeric TWEAK regarding the activation of classical NFκB signaling pathway. However, both TWEAK variants are able to induce depletion of TRAF2 and processing of p100, which are hallmarks for the activation of the noncanonical NFκB pathway. Like other solube TNF ligands with no or poor activity on their corresponding receptor, TWEAK gains high activity upon oligomerization resembling the activity of the transmembrane ligand. TRAF2 has a key role in TWEAK-induced NFκB signaling. Depletion or degradation of TRAF2 is crucial for activation of the noncanonial or both, the classical and the noncanonical NFκB pathway. Blocking the TWEAK receptor Fn14 inhibits the activation of NFκB signaling, irrespective of the TWEAK form used for stimulation. This indicates that the different activities of the two TWEAK variants in activation of classical and noncanonical NFκB signaling are not caused by the use of different receptors. Therefore this study on TWEAK is the first reported case where one TNF ligand in different variants induces qualitatively different activities of the corresponding TNF receptor.
Ein möglicher Ansatz neuer Therapiestrategien für Diabetes mellitus besteht zum einen in der Differenzierung von Stammzellen zu insulinproduzierenden Zellen und zum anderen in der Beschleunigung der Zellproliferation ebensolcher Zellen. In zahlreichen Studien wurden bereits mitogene Signaltransduktionswege in beta-Zellen des endokrinen Pankreas unter dem Einfluss diverser Nährstoffe untersucht. Das Protein p8, ursprünglich im Umfeld einer experimentell induzierten akuten Pankreatitis im Rattenmodell als Stressantwort beschrieben, ist an einem glukoseabhängigen Zellwachstum in der insulinproduzierenden beta-Zelle des endokrinen Pankreas beteiligt. Insofern ist es nur schlüssig, die Rolle des Proteins p8 im Rahmen der proliferationsassoziierten Signaltransduktion zu untersuchen. Zur näheren Charakterisierung von p8 wurden von unserer Arbeitsgruppe Wildtyp-INS-1-Zellen (WT-INS-1), als Modell für die beta-Zelle des endokrinen Pankreas, mit einem durch IPTG induzierbaren, p8-exprimierenden System ausgestattet (p8-INS-1). Dieses System wurde in der vorliegenden Arbeit zunächst auf seine Funktionalität hin überprüft. Unter anderem konnte p8-cDNA in den stabil transfizierten p8-INS-1-Zellen und in den mit obigem Plasmid transient transfizierten WT-INS-1-Zellen dargestellt werden, wobei letztere WT-INS-1-Zellen stärker signalisierten und somit ein höheres „output“ an p8 zu generieren scheinen. In Immunoblotanalysen ergab sich ein ähnliches Bild. Durch p8-Überexpression kommt es zu einem zunehmenden Signal des Proteins p8 innerhalb der p8-INS-1-Zellen. Jedoch erscheint dieses Signal in WT-INS-1-Zellen noch stärker. Ebenso ließen sich mehrfach Doppelbanden sowohl bei p8-INS-1-Zellen als auch bei WT-INS-1-Zellen bei 14 kDa und 22 kDa darstellen. Das differenzierte Expressionsmuster beider Zelllinien im Rahmen dieser Immunoblotanalysen legt den Schluss nahe, dass eine Erhöhung des p8-Levels, sei es nun durch Induktion per IPTG-Gabe oder durch Wachstumsfaktoren, zu einem veränderten Molekulargewicht des Proteins p8 führt. Das Protein p8 unterliegt somit ständigen Veränderungen im Rahmen der Protein-Protein-Interaktion. Im Vordergrund stehen Phosphorylierungen als Aktivierungsinitiatoren und Ubiquitinierung mit synergistischer Proliferationszunahme unter p8-Überexpression und gleichzeitiger Proteasomhemmung. Gerade in Phasen erhöhten Zellstresses (Hypo- und Hypernutrition) lassen sich durch p8-Überexpression erhöhte Wachstumsraten nachweisen, während im physiologischen Bereich nur bei gleichzeitiger Proteasomhemmung Wachstumssteigerungen durch p8-Überexpression erreicht werden können. Dies unterstreicht einmal mehr die Rolle von p8 als Stressprotein. Nichtsdestotrotz übertreffen die Proliferationsraten der p8-INS-1-Zellen die der WT-INS-1-Zellen unter den verschiedensten Stimulationsbedingungen bei weitem. So konnte gezeigt werden, dass in den p8-INS-1-Zellen eine progrediente, glukoseabhängige Proliferation vorliegt, welche sich durch Gabe von IGF-1 oder foetalem Kälberserum (FBS) zu einem signifikanten synergistischen Wachstum ausweiten lässt. Und auch hier erzeugt p8 als Stressprotein bei p8-INS-1-Zellen im glukosefreiem Medium bei alleiniger Stimulation mit Wachstumsfaktoren signifikante Wachstumsraten im Vergleich zu WT-INS-1-Zellen. Die Umsetzung der Stimulation durch Glukose und Wachstumsfaktoren auf die p8-vermittelte Proliferation vollzieht sich innerhalb der Signaltransduktion. Mit Phosphatidylinositol-3´-Kinase (PI3´K) als Schlüsselprotein innerhalb der mitogenen Signaltransduktion und Proteinkinase C (PKC alpha, beta, gamma) konnten durch Co-Immuno-präzipitationen, GST-Pull-Downs, Immunoblotanalysen aber auch Inhibitionsversuche wichtige Interaktionspartner von p8 identifiziert werden. Weitere Bindungspartner des Proteins p8 resultierten durch Inhibitionsversuche mit Proteinkinasen wie PKCzeta und PKA, aber auch p38 MAPK als Vertreter des MAPK-Signalweges. Dabei zeigt sich ein relativ gleiches Bild mit tendenziell eher mäßigen Proliferationshemmung im niedrigen bis normalen Glukosebereich, welche sich unter p8-Überexpression verstärkt. Verschiedene Regelkreise zur Feinsteuerung der p8-vermittelten Proliferation scheinen hier denkbar. Sollte p8 neben der Zellproliferation auch zu einer Aktivierung der genannten Proteine führen, könnte die Inhibition dieser Proteine ihrerseits die p8-vermittelte Proliferation hemmen. Auf Proteinebene ließ sich die Verbindung zwischen p8 und MAPK p38, PKCzeta, PKA und PKB nicht nachweisen, erscheint aber wegen der Primärstrukturen der Proteine, sowie Erkenntnissen aus der bisherigen Literatur und auch aufgrund der Versuche mit Proteininhibitoren im Rahmen dieser Arbeit wahrscheinlich. Weitergehende Untersuchungen sollten daher noch erfolgen. Die vorgestellten Ergebnisse sind ein Beitrag zum besseren Verständnis der Rolle des Proteins p8 innerhalb der mitogenen Signaltransduktion als eine Voraussetzung für einen kurativen Ansatz des Diabetes mellitus Typ I.
Bei c-Jun N-terminalen Kinasen (JNKs) (auch als Stress-aktivierte Proteinkinasen SAPKs bezeichnet), handelt es sich um Mitglieder der Mitogen-aktivierten Proteinkinase Familie (MAPK), die die Genexpression als eine Antwort auf eine Vielzahl von physiologischen und nicht-physiologischen Stimuli regulieren. Gendeletionsexperimente (knockout) und der Einsatz von dominant-negativen Mutanten wiesen auf eine Funktion von SAPK/JNKs bei Prozessen der zellulären Differenzierung, dem Überleben und/oder Apoptose sowie onkogener Transformation hin. Direkte Analysen des transformierenden Potentials von SAPK/JNKs wurden bislang durch das Fehlen von konstitutiv-aktiven Mutanten verhindert. Erst unlängst konnte durch die Fusion der MAP Kinase mit seiner direkten, in der Kaskade vorgeschalteten, Aktivatorkinase solche Mutanten bereitgestellt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde ein SAPKb-MKK7 Hybridprotein generiert, mit dessen Hilfe das transformierende Potential von aktiviertem SAPKb charakterisiert werden konnte. Die induzierte Expression von SAPKb-MKK7 führte zur morphologischen Transformation von NIH 3T3 Fibroblasten. Darüber hinaus bildeten diese Zellen kleine Foci aus transformierten Zellen, wuchsen in Soft-Agar und vergleichbar mit onkogenem Ras oder Raf, resultierte auch die Expression von aktiviertem SAPKb in der Zerstörung des F-Aktins. Des Weiteren steigerte die Expression von SAPKb-MKK7 die Proliferationsraten von NIH 3T3 Zellen. Im Gegensatz zu den akut transformierenden Onkogenen wie ras oder raf, ist SAPKb-MKK7 jedoch nicht in der Lage, das Überleben der transformierten Zellen zu bewirken. Unsere Daten schlagen daher vor, das konstitutiv-aktives SAPK/JNK zwar die Hauptaspekte zellulärer Transformation verursacht, aber nicht imstande ist, alle Veränderungen zu induzieren, die benötigt werden, um einen vollständig transformierten Phänotypen zu etablieren, weshalb insgesamt gesehen, sein transformierendes Potential deutlich schwächer ausgeprägt ist. Wir haben zusätzlich damit begonnen, dass tumorgene Potential von SAPKb-MKK7 direkt im Nacktmausmodell zu verifizieren. Die Injektion von SAPKb-MKK7 exprimierenden Fibroblasten resultierte in der Etablierung eines gut definierten Fibrosarkoms, wobei die Latenzzeit länger war als bei v-Raf transformierten Zellen. Somit ist die Expression von aktiviertem SAPK/JNK ausreichend, um die Tumorentwicklung in vivo zu initieren, auch wenn die lange Latenzzeit auf die Notwendigkeit zusätzlicher genetischer Veränderungen hinweist.
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig die vollständige cDNA-Sequenz des Proteinkinase A-Ankerproteins-2 (AKAP-2, 7,5kB) ermittelt. Zu diesem neuen humanen Gen sind bis dato außer einem unvollständigem Datenbankeintrag noch keine experimentellen Daten zur cDNA, mRNA oder zum Protein veröffentlicht. Mittels Northernblot wurde die Regulation der Expression der mRNA von AKAP-2 in humanem osteoblastären hFOB-Zellen sowie ihre Expression in unterschiedlichen Geweben untersucht: In hFOB-Zellen wird die mRNA bereits basal in geringem Maße exprimiert und kann schnell und transient induziert werden.Das Maximum der Induktion sowohl durch TNFa als auch durch TPA erfolgt nach fünf Stunde, v.a. durch veränderte Transskription. Dies entspricht der Kinetik eines sogenannten schnell induzierbaren Gens. Beide Stoffe wirken u.a. über den Transkriptionsfaktor NFkB. Andere Faktoren wie die Phosphatidylinositol-3-Kinase und cAMP dagegen scheinen keine Relevanz für die Expressionsinduktion der mRNA zu haben. TNFa spielt im Knochenstoffwechsel eine wichtige Rolle bei Osteoklastenaktivierung, Knochenresorption und bei der Entstehung von Osteoporose. AKAP-2 wird in Osteoblasten, aber auch in undifferenzierten monozytären Zellen, Vorläufern von Osteoklasten, exprimiert. AKAP-2 könnte also bei der interzellulären Kommunikation zwischen Osteoblasten und Osteoklasten von Bedeutung sein. Bisher wurden Vertreter der Familie der Proteinkinase A-Ankerproteine noch nicht in Knochengewebe nachgewiesen. Ihre Bedeutung für die Organfunktion ist vielfältig. Auf zellulärem Niveau kommt es durch Bindung der PKA in der Nähe der Adenylatzyklase und des hier entstehenden cAMP zu einer lokal erhöhten Wirkung von cAMP-vermittelten Signalen. Da die Expression der mRNA von AKAP-2 selbst unabhängig von cAMP ist, scheint es sich hier um eine Kreuzungsstelle verschiedener Signaltransduktionswege zu handeln, bei der von TNFa aktivierte zweite Botenstoffe bzw. Transkriptionsfaktoren (z.B. NFkB), die PKC und möglicherweise weitere, hier jedoch nicht weiter identifizierte Zytokine und Wachstumsfaktoren zur vermehrten Bereitstellung eines Ankerproteins der PKA führen.
Bestimmung der Substrat- und Inhibitorspezifität von Phosphodiesterasen mittels Mikrokaloriemetrie
(2009)
Neben den cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen (PKA bzw. PKG) sind als zyklonukleotid-regulierte Effektorproteine die Ionenkanäle CNG1-4, der "guanine nucleotide exhange factor“ Epac sowie die zyklonukleotid-spaltende Familie der Phosphodiesterasen (PDEs) von Bedeutung. Industriell synthetisierte cGMP- und cAMP-Analoga besitzen zwar meist eine hohe Affinität für ihr Zielprotein, über ihre Hydrolysestabilität gegenüber PDEs in der Zelle ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden die kinetischen Konstanten von elf der am häufigsten genutzten cAMP-und cGMP-Analoga an verschiedenen Vertretern der PDE-Familien mittels Mikrokaloriemetrie bestimmt. Zudem konnte in den Messungen der inhibitorisch Effekt hydrolysestabiler Derivate auf die PDEs qualitativ und quantitativ ermittelt werden kann. Die Ergebnisse zeigen, dass Phosphodiesterasen in der Lage sind, auch chemisch modifizierte Analogsubstanzen der Cyclonukleotide cAMP und cGMP zu hydrolysieren. Hydrolysestabile Derivate dagegen entwickeln häufig inhibitorische Wirkung auf die PDEs und verursachen dadurch Veränderungen der intrazellulären cAMP und cGMP Konzentrationen. So vermag z. B. die Epac-spezifische Substanz Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS in den in vitro Experimenten die PDEs mit ki-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich zu inhibieren. In mit Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS stimulierten Thrombozyten steigt als Folge dieser PDE-Hemmung die cGMP Konzentration in der Zelle an und man beobachtet eine als Folge eine PKG-vermittelte Phosphorylierung des Substratproteins VASP – eine unerwünschte Nebenreaktion. Die erhobenen Daten lassen außerdem Rückschlüsse auf den Inhibitionsmechanismus zu. Einige Analoga inhibieren die cGMP-bindenden GAF-Domänen in den PDEs 2A, 5A, 6cone und 10A sowie die PDE 4D3 nach dem linear-mixed-Typ und beeinflussen daher, neben der katalytischen Aktivität, vermutlich auch regulatorische Zentren dieser Enzyme. Zusammenfassend erleichtern die erhobenen Daten Wissenschaftlern die Auswahl des für ihre Fragestellung am besten geeigneten Derivates.
Alpha2-Rezeptoren, die weiter in alpha2A, alpha2B und alpha2C unterteilt werden, gehören zur Gruppe der adrenergen Rezeptoren innerhalb der Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Sie sind maßgeblich an der Regulation vieler physiologischer Prozesse beteiligt. Vieles, was heute über alpha2-Rezeptoren bekannt ist, wurde mithilfe von alpha2-defizienten Mäusen, sogenannten „Knock-Out“-Mäusen (KO) herausgefunden, von denen bislang drei Einzel-KOs und der Doppel-KO der Subtypen A und C existieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden durch Kreuzung der vorhandenen KO-Linien Mauslinien generiert, die defizient für alpha2A und alpha2B, für alpha2B und alpha2C oder alle drei alpha2-Rezeptoren sind. Während alpha2AB-KO-Mäuse ungefähr entsprechend der Mendelschen Verteilung geboren wurden, zeigte sich, dass alpha2BC-KO-Mäuse teilweise und alpha2ABC-KO-Mäuse sogar komplett embryonal letal waren. Die morphologischen Unter-suchungen legten den Zeitpunkt der embryonalen Letalität der alpha2ABC-KO-Mäuse auf den Tag E10,5 der Embryonalentwicklung fest und konnten zeigen, dass diese Letalität in einem Vaskularisierungsdefekt innerhalb der extraembryonalen Organe Plazenta und Dottersack begründet lag. Diese Organe stellen die Versorgung des Embryos mit Nährstoffen und Sauerstoff sicher und sorgen somit für dessen Entwicklung. Durch RT-PCR-Experimente konnte die mRNS für alle drei alpha2-Rezeptorsubtypen an Tag E10,5 sowohl im Embryo als auch in Plazenta und Dottersack nachgewiesen werden. Autoradiographische Experimente und Radioligandenbindungsstudien an Plazenten machten deutlich, dass der Großteil an alpha2-Rezeptoren im embryonalen Teil der Plazenta exprimiert wird, nämlich in den Riesenzellen und in der sich daran anschließenden Spongiotrophoblastschicht, und dass hierbei alpha2-Rezeptoren vom B-Subtyp vorherrschen. In den genannten Zellen konnte mittels Immunhistochemie eine alpha2-Rezeptor-vermittelte Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2 gezeigt werden, die auch in kultivierten WT-Dottersäcken beobachtet werden konnte. Unter basalen Bedingungen zeigte sich, dass die ERK1/2-Phosphorylierung in Gewebe von alpha2ABC-KO-Embryonen drastisch vermindert war, während andere Signalwege, die von alpha2-Rezeptoren angestoßen werden können, nicht beeinträchtigt waren. Versuche in einem Zellkulturmodell und mit kultivierten WT-Dottersäcken ergaben eine physiologisch relevante Wechselwirkung zwischen dem alpha2B-Rezeptor und dem PDGFbeta-Rezeptor, einer Rezeptortyrosinkinase, als deren Mechanismus sich in Co-Kultur-Experimenten mit alpha2B-Rezeptor-transfizierten Zellen und alpha2ABC-defizienten Dottersäcken die Transaktivierung von Rezeptortyrosinkinasen herausstellte. In dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass a2-Rezeptoren bei der Maus über eine Transaktivierung von ERK1/2 die Vaskularisierung der Plazenta und des Dottersacks bedingen und damit eine normale Embryonalentwicklung sicherstellen.
Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules (CEACAMs) are exploited by human-specific pathogens to anchor themselves to or invade host cells. Interestingly, human granulocytes express a specific isoform, CEACAM3, that can direct efficient, opsonin-independent phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria, Moraxella and Haemophilus species. As opsonin-independent phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria depends on Src-family protein tyrosine kinase (PTK) phosphorylation of the CEACAM3 cytoplasmic domain, we hypothesized that an SH2-containing protein might be involved in CEACAM3-initiated, phagocytosis-promoting signals. Accordingly, we screened glutathione-S-transferase (GST) fusion proteins containing SH2 domains derived from a panel of signaling and adapter molecules for their ability to associate with CEACAM3. In vitro pull-down assays demonstrated that the SH2 domain of the adapter molecule Nck (GST-Nck SH2), but not other SH2 domains such as the Grb2 SH2 domain, interact with CEACAM3 in a phosphotyrosine-dependent manner. Either deletion of the cytoplasmic tail of CEACAM3, or point-mutation of a critical arginine residue in the SH2 domain of Nck (GST-NckSH2R308K) that disrupts phosphotyrosine binding, both abolished CEACAM3-Nck-SH2 interaction. Upon infection of human cells with CEACAM-binding Neisseria, full-length Nck comprising an SH2 and three SH3 domains co-localized with tyrosine phosphorylated CEACAM3 and associated bacteria as analyzed by immunofluorescence staining and confocal microscopy. In addition, Nck could be detected in CEACAM3 immunoprecipitates confirming the interaction in vivo. Importantly, overexpression of a GFP-fusion protein of the isolated Nck SH2 domain (GFP-Nck-SH2), but not GFP or GFP-Nck SH2 R308K reduced CEACAM3-mediated phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria suggesting that the adaptor molecule Nck plays an important role in CEACAM3-initiated signaling leading to internalization and elimination of human-specific pathogens.
The transmission of proliferative and developmental signals from activated cell-surface receptors to initiation of cellular responses in the nucleus is synergically controlled by the coordinated action of a diverse set of intracellular signalling proteins. The Ras/Raf/MEK/MAPK signalling pathway has been shown to control the expression of genes which are crucial for the physiological regulation of cell proliferation, differentiation and apoptosis. Within this signalling cascade, the Raf protein family of serine/threonine kinases serves as a central intermediate which connects to many of other signal transduction pathways. To elucidate the signalling functions of the different Raf kinases in motoneurons during development, the expression, distribution and subcellular localization of Rafs in the spinal cord and the facial nucleus in brainstem of mice at various embryonic and postnatal stages were investigated. Moreover, we have investigated the intracellular redistribution of Raf molecules in isolated motoneurons from 13 or 14 day old mouse embryos, after addition or withdrawal of neurotrophic factors to induce Raf kinases activation in vitro. Furthermore, in order to investigate the potential anti-apoptotic function of Raf kinases on motoneurons, we isolated motoneurons from B-raf-/- and c-raf-1-/- mouse embryos and analysed the survival and differentiation effects of neurotrophic factors in motoneurons lacking B-Raf and c-Raf-1. We provide evidence here that all three Raf kinases are expressed in mouse spinal motoneurons. Their expression increases during the period of naturally occurring cell death of motoneurons. In sections of embryonic and postnatal spinal cord, motoneurons express exclusively B-Raf and c-Raf-1, but not A-Raf, and subcellularly Raf kinases are obviously colocalized with mitochondria. In isolated motoneurons, most of the B-Raf or c-Raf-1 immunoreactivity is located in the perinuclear space but also in the nucleus, especially after activation by addition of CNTF and BDNF in vitro. We found that c-Raf-1 translocation from the cytosol into the nucleus of motoneurons after its activation by neurotrophic factors is a distinct event. As a central finding of our study, we observed that the viability of isolated motoneurons from B-raf but not c-raf-1 knockout mice is lost even in the presence of CNTF and other neurotrophic factors. This indicates that B-Raf but not c-Raf-1, which is still present in B-raf deficient motoneurons, plays a crucial role in mediating the survival effect of neurotrophic factors during development. In order to prove that B-Raf is an essential player in this scenario, we have re-expressed B-Raf in mutant sensory and motor neurons by transfection. The motoneurons and the sensory neurons from B-raf knockout mouse which were transfected with exogenous B-raf gene revealed the same viability in the presence of neurotrophic factors as primary neurons from wild-type mice. Our results suggest that Raf kinases have important signalling functions in motoneurons in mouse CNS. In vitro, activation causes redistribution of Raf protein kinases, particularly for c-Raf-1, from motoneuronal cytoplasm into the nucleus. This redistribution of c-Raf-1, however, is not necessary for the survival effect of neurotrophic factors, given that B-raf-/- motor and sensory neurons can not survive despite the presence of c-Raf-1. We hypothesize that c-Raf-1 nuclear translocation may play a direct role in transcriptional regulation as a consequence of neurotrophic factor induced phosphorylation and activation of c-Raf-1 in motoneurons. Moreover, the identification of target genes for nuclear translocated c-Raf-1 and of specific cellular functions initiated by this mechanism awaits its characterization.
Das Multiple Myelom (MM) ist eine unheilbare Erkrankung, die aus einer klonalen Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark hervorgeht. Dabei liegt ein komplexes Signalnetzwerk vor, das zum Überleben und Wachstum der MM-Zellen führt. Das MM ist durch eine enorme genetische und phänotypische Heterogenität gekennzeichnet. Die konstitutive Aktivierung des PI3K/Akt-Signalwegs spielt bei ungefähr der Hälfte der Patienten mit MM eine wichtige Rolle für das Überleben der MM-Zellen und ist daher ein potentieller therapeutischer Ansatzpunkt. Isoform-spezifische Untersuchungen der katalytischen Untereinheiten der Klasse I-PI3K (p110α, p110β, p110γ, p110δ) sollten zur Erkenntnis führen, welche dieser Isoformen für das MM Zellüberleben wichtig sind, um spezifischere Behandlungen mit möglichst geringen Nebenwirkungen zu erlauben. Dafür wurden zunächst Isoform-spezifische Knockdown-Experimente mit MM Zelllinien durchgeführt und sowohl deren Überleben als auch die Aktivierung der nachgeschalteten Komponenten im PI3K Signalweg untersucht. Zur Verifizierung der Ergebnisse wurden sowohl MM Zelllinien als auch Primärzellen mit Isoform-spezifischen PI3K-Inhibitoren behandelt (BYL 719 für p110α, TGX 221 für p110β, CAY10505 für p110γ und CAL 101 für p110δ) und in gleicher Weise untersucht. In beiden Versuchsansätzen stellte sich die katalytische Untereinheit p110α als wichtigste Isoform für das Überleben von MM Zellen mit konstitutiv phosphoryliertem Akt Signal heraus. Weder der Knockdown noch die pharmakologische Inhibition der anderen drei Isoformen (p110β, p110γ, p110δ) führten in MM-Zelllinien zur Beeinträchtigung des Zellüberlebens. Auch reagierten die Primärzellen von MM Patienten größtenteils nicht mit Apoptose auf eine Behandlung mit TGX 221, CAY10505 oder CAL 101. Aufbauend auf der postulierten Bedeutung von p110α, wurde der dafür spezifische Inhibitor BYL 719 mit bereits klinisch etablierten Therapeutika in Kombination verwendet, woraus eine im Vergleich zur Einzelbehandlung verstärkte Apoptose resultierte. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass PI3K/p110α eine therapeutisch nutzbare Zielstruktur zur Behandlung des Multiplen Myeloms darstellt. Daher scheinen weitergehende prä-klinische Studien mit p110α Inhibitoren erfolgversprechend.
Auf der Suche nach physiologischen Substraten der MAPK-aktivierten Proteinkinasen (MAPKAP-Kinasen), 3pK und MAPKAP-K2 (MK2), wurden Mitglieder eines Säuger-Polycomb-Komplexes, HPH2 und das Protoonkoprotein Bmi1, als Interaktionspartner identifiziert. Proteine aus der Polycomb-Gruppe (PcG) sind dafür bekannt, multimere, Chromatin-assoziierte Proteinkomplexe zu bilden. Diese wirken als transkriptionelle Repressoren und spielen als solche eine wichtige Rolle sowohl in der Regulation von Entwicklungsprozessen als auch in der Kontrolle der zellulären Proliferation. HPH2 bindet im Hefe two-hybrid-System sowohl an 3pK als auch an MK2. Die Kinasen coimmunpräzipitieren auch mit den PcG-Proteinen. Weiterhin wurde festgestellt, daß nicht aktivierte und DNA-assoziierte 3pK, ähnlich wie Bmi1, in einem in vivo Repressionsassay als transkriptioneller Repressor wirkt. Dies unterstellt, daß 3pK, wie Bmi1, fähig sein muß, andere PcG-Proteine an das Zielgen zu rekrutieren, wo sich dann ein biologisch funktioneller Repressionskomplex rekonstituiert. Bmi1 ist ein Phosphoprotein und beide MAPKAP-Kinasen konnten in dieser Arbeit als in vitro Bmi1-Kinasen identifiziert werden. Da der Phosphorylierungsstatus von Bmi1 mit seiner Dissoziation und der anderer PcG-Proteine vom Chromatin korreliert, könnten die MAPKAP-Kinasen Regulatoren einer phosphorylierungs-abhängigen PcG-Komplex/Chromatin-Interaktion sein. 3pK und MK2 wurden hier als die ersten Kinasen identifiziert, die in Assoziation mit Proteinen von PcG-Komplexen vorliegen, was ein funktionelles Zusammenwirken von MAPK-Signaltransduktionsnetzwerk und der Regulation der PcG-Funktion nahe legt. Ein weiterer durch das two-hybrid-System und Coimmunpräzipitationsexperimente identifizierter Interaktionspartner beider hier analysierter MAPKAP-Kinasen ist der basische Helix-Loop-Helix- (bHLH) Transkriptionsfaktor E47. Dieses E2A-kodierte Protein bindet als Homo- bzw. Heterodimer mit gewebespezifischen bHLH-Proteinen an sogenannte E-Box-DNA-Motive und ist so in die Regulation gewebespezifischer Genexpression und Zelldifferenzierung involviert. In dieser Arbeit konnten 3pK und MK2 als in vitro Kinasen des in Zellen phosphoryliert vorliegenden Transkriptionsfaktors identifiziert werden. Weiterhin führte die transiente Expression jeder dieser Kinasen in einem Reportergenassay mit einem E-Box-Promotorkonstrukt zu einer Repression der transkriptionellen Aktivität von E47. Der bHLH-Transkriptionsfaktor E47 interagiert also mit beiden MAPKAP-Kinasen, 3pK und MK2, was die Kinasen als neu identifizierte Regulatoren der E47-abhängigen Genexpression präsentiert. Mit dieser Arbeit ist ein erster Aufschluß der physiologischen Aktivität der MAPKAP-Kinasen 3pK und MK2 als transkriptionelle Regulatoren gelungen.
Einleitung: Die Plasmamembran Ca2+-ATPase (PMCA) ist ein ubiquitär in eukaryonten Zellen vorkommendes Enzym, das Kalziumionen aus der Zelle transportiert. In Myokardzellen ist ihre Funktion trotz eingehender biochemischer Charakterisierung unklar. Die frühere Hypothese einer Zuständigkeit für die Feinabstimmung der [Ca2+]iz wurde in neuerer Zeit ergänzt durch die vermutete Rolle der PMCA in der Regulation von Zellparametern wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose. Unterstützt wird dies durch die Lokalisation der ATPase in Caveolae, spezifischen Membraninvaginationen, in denen wichtige Zentren der zellulären Signalverarbeitung gesehen werden. Ziel: Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Funktion der Plasmamembran Ca2+-ATPase, insbesondere eine mögliche Beteiligung des Enzyms an der Übermittlung zellulärer Signale im Rahmen von Apoptose und Wachstum, weiter aufgeklärt werden. Methoden: Die Experimente zur Apoptose in dUTP-nick-end-labeling (TUNEL)-Technik wurden zum einen an einer Myoblastenlinie, zum anderen an transgenen Ratten mit hPMCA 4CI-Überexpression durchgeführt. Die Proteinsyntheseraten neonataler Kardiomyozyten wildtypischer bzw. überexprimierender Tiere mittels 3H-Leucin-Inkorporation in Ruhe und unter Stimulation mit hypertrophieinduzierenden Substanzen wurden verglichen. Ergänzend zu diesen funktionellen Versuchen fanden Immunfluoreszenzanalysen an neonatalen Kardiomyozyten der hPMCA 4CI-überexprimierenden Rattenlinie 1142 statt. Ergebnisse: In der L6-Myoblastenlinie beeinflußte die Überexpression der Plasmamembran Ca2+-ATPase die Apoptose nicht, ebenso in ruhenden neonatalen Kardiomyozyten. Phenylephrin und Isoproterenol steigerten die Syntheseaktivität in den überexprimierenden Herzmuskelzellen signifikant gegenüber Wildtypkontrollen. NOS-Inhibition mit L-NAME induzierte in den neonatalen Kardiomyozyten Hypertrophie. Die Kombination von L-NAME und Isoproterenol ergab in beiden Zellgruppen gegenüber dem Einzelstimulus verdoppelte Proteinsyntheseraten, wobei die Myozyten der Linie 1142 signifikant stärker ansprachen. Zusammenfassung: Überexpression der Plasmamembran Ca2+-ATPase moduliert myozytäres Wachstum, wobei ein Einfluß auf den b-adrenergen und NO Signalweg vorliegt. Die mittels Immunfluoreszenz nachgewiesene Lokalisation der PMCA in Caveolae läßt eine Interaktion des Enzyms mit anderen Signaltransduktionsmolekülen in diesen Subkompartimenten vermuten.
Extracellular signals are translated and amplified via cascades of serially switched protein kinases, MAP kinases (MAPKs). One of the MAP pathways, the classical RAS/RAF/MEK/ERK pathway, transduces signals from receptor tyrosine kinases and plays a central role in regulation of cell proliferation. RAF kinases (A-, B- and C-RAF) function atop of this cascade and convert signals emanating from conformational change of RAS GTPases into their kinase activity, which in turn phosphorylates their immediate substrate, MEK. Disregulated kinase activity of RAF can result in tumor formation, as documented for many types of cancer, predominantly melanomas and thyroid carcinomas (B-RAF). A-RAF is the least characterized RAF, possibly due to its low intrinsic kinase activity and comparatively mild phenotype of A-RAF knockout mice. Nevertheless, the unique phenotype of araf -/- mice, showed predominantly neurological abnormalities such as cerebellum disorders, suggesting that A-RAF participates in a specific process not complemented by activities of B- and CRAF. Here we describe the role of A-RAF in membrane trafficking and identify its function in a specific step of endocytosis. This work led to the discovery of a C-terminally truncated version of A-RAF, AR149 that strongly interfered with cell growth and polarization in yeast and with endocytosis and actin polymerization in mammalian cells. As this work was in progress two splicing isoforms of ARAF, termed DA-RAF1 and DA-RAF2 were described that act as natural inhibitors of RAS-ERK signaling during myogenic differentiation (Yokoyama et al., 2007). DA-RAF2 contains the first 153 aa of A-RAF and thus is nearly identical with AR149. AR149 localized specifically to the recycling endosomal compartments as confirmed by colocalization and coimmunoprecipitation with ARF6. Expression of AR149 interferes with recycling of endocytosed transferrin (Tfn) and with actin polymerization. The endocytic compartment, where internalized Tfn is trapped, was identified as ARF6- and RAB11- positive endocytic vesicles. We conclude that the inhibition of Tfn trafficking in the absence of A-RAF or under overexpression of AR149 occurs between tubular- and TGNassociated recycling endosomal compartments. siRNA-mediated depletion of endogenous A-RAF or inhibition of MEK by U0126 mimic the AR149 overexpression phenotype, supporting a role of ARAF regulated ERK signalling at endosomes that is controlled by AR149 and targets ARF6. Our data additionally suggest EFA6 as a partner of A-RAF during activation of ARF6. The novel findings on the A-RAF localization and the interaction with ARF6 have led to a new model of ARAF function were A-RAF via activation of ARF6 controls the recycling of endocytic vesicles.Endocytosis and rapid recycling of synaptic vesicles is critically important for the physiological function of neurons. The finding, that A-RAF regulates endocytic recycling open a new perspective for investigation of the role of A-RAF in the nervous system.
Östrogen bewirkt in physiologischer Konzentration in Kardiomyozyten eine schnelle Induktion des Egr-1-Promotors. Dieser Effekt wird über die Östrogenrezeptoren ER alpha und ER beta vermittelt. Überraschenderweise erfolgt die östrogenabhängige Genregulation von Egr-1 aber nicht über den klassischen Signalweg mittels Bindung des Östrogenrezeptors an östrogenresponsive Elemente (ERE), sondern findet unter Bindung von Serumfaktor an serumresponsive Elemente (SRE) des Egr-1-Promotors unter Mitbeteiligung des ERK1/2-Signalweges statt. Am Beispiel der Egr-1-Induktion durch Östrogen ließ sich die Bedeutung serumresponsiver Elemente (SRE) für die Genregulation durch Östrogen aufzeigen. In der vorliegenden Arbeit konnte damit ein neuartiger Signalweg bei der östrogenabhängigen schnellen Genaktivierung in Kardiomyozyten gezeigt werden.
A successful therapy for colorectal cancer (CRC), one of the most common malignancies worldwide, requires the greatest possible research effort. Of critical importance is an understanding of the relevant intracellular networks of signaling cascades, their activation, and the resulting cellular changes that are a prerequisite for a more successful CRC therapy. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and the appropriate VEGF receptors represent molecular targets that have already been successfully implemented in the clinic (i.e. using monoclonal antibodies, tyrosine kinase inhibitors). However, for platelet derived growth factor (PDGF) and the relevant PDGF receptors, there are currently no clinically approved molecular therapeutics available. However, there are preliminary data to show that PDGF and its associated signaling pathways play an important role in CRC progression. In particular, the PI3K/Akt/mTOR pathway is emerging as an important intracellular partner of PDGF with which to control proliferation, migration, and angiogenesis in tumor cells.
Therefore it was the objective of this work to investigate the multifactorial influence of PDGF on proliferation and metabolism, depending on CRC mutation status. The intention was to identify new therapeutic targets for future cancer therapy through analyses of PDGF-induced intracellular changes.
For this purpose two human colorectal cancer cell lines were analyzed at gene and/or protein level for components of the PI3K/Akt/mTOR and MAPK signaling pathway, c-Myc, p53, and HIF1α (hypoxia-inducible-factor 1α). Changes in proliferation and metabolism, either during stimulation with PDGF and/or PI3K/Akt/mTOR inhibition, were also investigated. Experiments conducted at protein level during PDGF stimulation and/or PI3K/Akt/mTOR inhibition revealed changes in signaling pathways and crosstalk. The influence of the tumor suppressors (retinoblastoma, Rb), oncogenes (c-Myc, p53mut), and HIF1α during stimulation with PDGF, and their interactions in the tumor cell with respect to proliferation and glycolysis warrant further examination in terms of clinical treatment options. Investigations at the gene level of ex vivo samples (UICC I-IV) complete the study with regards to the clinical relevance of PDGF.
PDGF stimulation increases tumor cell proliferation in HT29 cells via the PI3K/Akt/mTOR pathway rather than the MAPK pathway. However, if the PI3K/Akt/mTOR pathway is pharmacologically blocked, PDGF stimulation is mediated by inhibitory crosstalk through the MAPK pathway. Further analyses revealed that specific Akt inhibition impedes tumor cell growth, while PI3K inhibition had little effect on proliferation. Inhibitory crosstalk was found to be responsible for these different effects. Careful intervention strategies are therefore required if future therapies intend to make use of these specific signaling pathways. One aim of future research should be to gain a better understanding of the crosstalk between these signaling pathways. In this fashion, “over-inhibition” of the signal pathways, which would result in additional clinical side effects for patients, could be prevented.
In late stage UICC, more mutation events occur, with tumorigenicity promoted by an increased mutation rate. Given that PDGF is increasingly expressed in the late UICC stages, our data would indicate that PDGF's effects are amplified with increasing malignancy. The activating effect of PDGF on the PI3K/Akt/mTOR pathway and subsequent changes in the activity of p53mut, Rb, c-Myc, and HIF1α, lead to an unfavorable prognosis for colon cancer patients. PDGF acts on colon cancer cells in an Akt-activating, glycolysis-dependent manner. PDGF increases glycolysis and the ability of CRC cells to adjust their energy metabolism. These activities should be taken as possible starting points with which to design therapeutic interventions for CRC therapy.
PDGF, as another representative of the growth factor family, seems to play a similar role to VEGF in CRC. The data from this study underline the importance of the PDGF - PI3K/Akt/mTOR pathway-axis and its potential as a possible target in colorectal cancer. Thus PDGF represents an attractive therapeutic target, besides the VEGF/EGFR-based therapies already used in CRC.
Thrombozyten (Blutplättchen) sind die Vermittler der zellulären Hämostase. Ihre Fähigkeit zu Aggregieren und sich an das umgebende Gewebe verletzter Blutgefässe anzulagern, wird durch ein komplexes intrazelluläres Signaltransduktionsnetzwerk bestimmt, das sowohl aktivierende, als auch inhibierende Subnetzwerke beinhaltet. Das Verständnis dieser Prozesse ist von hoher medizinischer Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die thrombozytäre Signaltransduktion sowohl mittels eines Boole'schen, als auch verschiedener dynamischer Modelle analysiert. Die Boole'sche Modellierung führte zu interessanten Erkenntnissen über das Zusammenwirken einzelner Subnetzwerke bei der Vermittlung irreversibler Plättchenaktivierung und zeigte Mechanismen der Interaktion mit dem hemmenden Prostaglandinsystem auf. Das Modell beinhaltet unter Anderem wichtige Systemkomponenten wie Calciumsignalgebung, Aktivierung von Schlüsselkinasen wie Src und PKC, Integrin-vermitteltes outside-in sowie inside-out Signalgebung und autokrine ADP- und Thromboxan-Produktion. Unter Verwendung dieses Boole'schen Ansatzes wurde weiterhin das System-eigene Schwellenwertverhalten analysiert. Dabei stellte sich eine umgekehrt proportionale Abhängigkeit des relativen aktivierenden Reizes, der notwendig ist um den Schwellenwert zu überschreiten, vom absoluten hemmenden Input heraus. Das System adaptiert demnach an höhere Prostaglandinkonzentrationen durch eine Erhöhung der Sensitivität für Aktivatoren wie dem van-Willebrandt-Faktor und Kollagen, und ermöglicht somit auch unter lokal hemmenden Bedingungen eine Plättchen-vermittelte Hämostase. Der nächste Schritt bestand in der Implementierung eines Differentialgleichungs-basierten Modells der thrombozytären Prostaglandin-Signaltransduktion, um einen detaillierten Überblick über die Dynamik des inhibierenden Netzwerkteils zu erhalten. Die kinetischen Parameter dieses Modells wurden teilweise der Literatur entnommen. Der andere Teil wurde anhand einer umfassenden Kombination dosis- und zeitabhängiger cAMP und phospho-VASP Messdaten geschätzt. Der Prozess beinhaltete mehrere Iterationen aus Modellvorhersagen einerseits und experimentellem Design andererseits. Das Modell liefert die quantitativen Effekte der Prostaglandinrezeptoren IP, DP1, EP3 und EP4 und des ADP-Rezeptors P2Y12 auf die zugrunde liegende Signalkaskade. EP4 zeigt den stärksten Effekt in der aktivierenden Fraktion, wohingegen EP3 einen stärkeren inhibitorischen Effekt ausübt, als der durch Clopidogrel hemmbare ADP-Rezeptor P2Y12. Weiterhin wurden die Eigenschaften des negativen feedback-loops der PKA auf den cAMP-Spiegel untersucht, und eine direkte Beeinflussung der Adenylatzyklase durch die PKA festgestellt, in Form einer Reduzierung der maximalen katalytischen Geschwindigkeit. Die Identifizierbarkeit der geschätzten Parameter wurde mittels profile-Likelihood-Schätzung untersucht. In einem dritten Schritt wurde ein sowohl die aktivierenden, als auch die hemmenden Netzwerkteile umfassendes dynamisches Modell implementiert. Die Topologie dieses Modells wurde in Anlehnung an die des Boole'schen Modells auf der Basis von a priori Wissen festgelegt. Die Modellparameter wurden anhand von Western-Blot, Calcium- und Aggregationsmessungen geschätzt. Auch hier wurde die Identifizierbarkeit der Modellparameter durch profile-likelihood-Schätzung überprüft. Die bei niedrigen Ligandenkonzentrationen auftretende Reversibilität der Plättchen-Aggregation konnte mittels dieses Modells reproduziert werden. Jedoch zeigte sich bei mittleren ADP-Konzentrationen ein Fließgleichgewicht in einem teilweise aktivierten Zustand, und damit kein bistabiles Schwellenwertverhalten. Inwiefern dieses Verhalten durch einen Umgebungs-basierteren Mechanismus des Alles-Oder-Nichts-Verhaltens begründet wird, bei dem der Übergang von reversibler zu irreversibler Aggregation mehr durch parakrine Effekte des gesammten Thrombus bestimmt wird, als durch spezifische Signaltransduktionseigenschaften der einzelnen Zelle, müssen zukünftige Experimente zeigen. Insgesamt geben die erstellten Modelle interessante Einblicke in die Funktionsweise der Thrombozyten und ermöglichen die Simulation von pharmakologischen und genetischen Einflüssen, wie Rezeptormodulationen und knock-outs. Sie geben damit Implikationen zur Entstehung und Behandlung pathophysiologischer Zustände, und wertvolle Denkanstöße für die weitere Forschung.
A disturbance in the symbiotic mutualism between the intestinal microbiome and the human host’s organism (syn. dysbiosis) accompanies the development of a variety of inflammatory and metabolic diseases that comprise the Metabolic Syndrome, chronic inflammatory gut diseases like Crohn’s disease, Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and cardiovascular diseases, among others. The changed uptake and effectiveness of short chain fatty acids (SCFAs) as well as an increase of the intestinal permeability are common, interdependent disease elements in this regard. Short chain fatty acids are end-products of intestinal bacterial fermentation and affect the mucosal barrier integrity via numerous molecular mechanisms.
There is evidence to suggest, that SCFAs have a modulating influence on Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) in intestinal epithelial cells. STAT3 is a central gene-transcription factor in signaling pathways of proliferation and inflammation. It can be activated by growth factors and other intercellular signaling molecules like the cytokine Oncostatin M (OSM). The mode of STAT3’s activation exhibits, finally, a decisive influence on the immunological balance at the intestinal mucosa. Therefore, the posttranslational modification of STAT3 under the influence of SCFAs is likely to be a very important factor within the development and -progression of dysbiosis-associated diseases.
In this study, a clear positive in vitro-effect of the short chain fatty acid butyrate on the posttranslational serine727-phosphorylation of STAT3 and its total protein amount in the human adenocarcinoma cell line CACO2 is verified. Moreover, an increased gene expression of the OSM-receptor subunit OSMRβ can be observed after butyrate incubation. Histone deacetylase inhibition is shown to have a predominant role in these effects. Furthermore, a subsequent p38 MAPK-activation by Butyrate is found to be a key molecular mechanism regarding the STAT3-phosphorylation at serine727-residues. To consider the portion of butyrate receptor signaling in this context in future assays, a CACO-2 cell 3D-culture model is introduced in which an improvement of the GPR109A-receptor expression in CACO-2 cells is accomplished.
Transforming growth factor-ß (TGF-ß) is a multifunctional cytokine that is engaged in regulating versatile cellular processes that are pivotal for development and homeostasis of most tissues in multicellular organisms. TGF-ß signal transduction is initially propagated by binding of TGF-ß to transmembrane serine/threonine kinase receptors, designated TßRI and TßRII. Upon activation, the receptors phosphorylate Smad proteins which serve as downstream mediators that enter the nucleus and finally trigger transcriptional responses of specific genes. During the past years, it became evident that signaling cascades do not proceed in a linear fashion but rather represent a complex network of numerous pathways that mutually influence each other. Along these lines, members of the TGF-ß superfamily are attributed to synergize with neurotrophins. Together, they mediate neurotrophic effects in different populations of the nervous system, suggesting that an interdependence exists between TGF-ßs on the one hand and neurotrophins on the other. In the present work, the crosstalk of NGF and TGF-ß/Smad signaling pathways is characterized in rat pheochromocytoma cells (PC12) which are frequently used as a model system for neuronal differentiation. PC12 cells were found to be unresponsive to TGF-ß due to limiting levels of TßRII. However, stimulation with NGF results in initiation of Smad-mediated transcription independent of TGF-ß. Binding of NGF to functional TrkA receptors triggers activation of Smad3. This NGF-dependent Smad activation occurs by a mechanism which is different from being induced by TGF-ß receptors in that it provokes a different phosphorylation pattern of R-Smads. Together with an inferior role of TßRI, Smad3 is proposed to serve as a substrate for cellular kinases other than TßRI. Based on the presented involvement of components of both, the MAPK/Erk and the TAK1/MKK6 cascade, signal mediators of these pathways rank as candidates to mediate direct activation of Smad3. Smad3 is subsequently translocated to the nucleus and activates transcription in a Smad4-dependent manner. Negative regulation is provided by Smad7 which was found to act as a potent inhibitor of Smad signaling not only in TGF-ß- but also in NGF-mediated cascades. The potential of NGF to activate the Smad pathway independent of TGF-ß might be of special importance in regulating expression of genes that are essential for the development and function of neuronal cells or of other NGF-sensitive cells, in particular those which are TGF-ß-resistant.
Die ersten Landpflanzen standen vor der Herausforderung sich mit der wechselnden Verfügbarkeit von Wasser an Land arrangieren zu müssen. Daraus ergab sich die Notwendigkeit den Wasserverlust zu minimieren und dennoch ausreichend CO2 für die Photosynthese aufzunehmen (Raven, 2002). Im Laufe der Evolution der Pflanzen entstanden mehrere Anpassungen an diese neuen Gegebenheiten, die schließlich auch zur Entstehung von regulierbaren Öffnungen, den Stomata, in der Blattepidermis führte. Zwei Schließzellen umschließen das Stoma und regulieren über die Aufnahme oder Abgabe von osmotisch-aktiven Teilchen ihren Turgordruck und damit die Öffnungsweite des Stomas. Das Kation Kalium und die Anionen Chlorid und Nitrat repräsentieren die Hauptosmotika, die je nach Bedarf durch Transportproteine über die Plasmamembran der Schließzellen geschleust werden. In den Samenpflanzen wie zum Beispiel der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, ist der Signalweg in Schließzellen, der bei Trockenheit zu einem schnellen Schluss des Stomas führt bereits sehr gut untersucht. Bei Wassermangel synthetisiert die Pflanze das Trockenstresshormon ABA (Abscisinsäure). Das Hormon wird durch ABA-Rezeptoren erkannt und resultiert schließlich in der Aktivität der Proteinkinase OST1. Daraufhin reguliert diese Kinase zum einen die Transkription ABA-abhängiger Gene, die der Pflanze eine langfristige Adaptation an Trockenheit und Austrocknungstoleranz verleiht. Zum anderen, phosphoryliert OST1 den Anionenkanal SLAC1 und aktiviert ihn so. Die Aktivität des Kanals initiiert schließlich den Stomaschluss durch einen Ausstrom von Anionen aus den Schließzellen, der mit einer Depolarisation der Schließzellmembran einhergeht.
Der ABA-Signalweg, der zur transkriptionellen Regulation von Genen und der damit verbunden Trockentoleranz führt ist ein sehr stark konservierter und evolutiv sehr alter Signalweg, der in allen Geweben von Pflanzen bei Trockenheit beschritten wird. Der schnelle ABA-Signalweg, der die Aktivität der SLAC1 Anionenkanäle reguliert, ist auf Schließzellen begrenzt. Da sich Schließzellen aber erst spät in der Evolution von Landpflanzen etablierten, erhob sich die Frage, wann in der Evolution geriet SLAC1 unter die Kontrolle das ABA-Signalwegs? Geht diese Regulation von SLAC1 mit der Entstehung von Schließzellen einher oder bestand dieser Regulationsmechanismus bereits in Pflanzen, die keine Schließzellen besitzen. Zur Beantwortung dieser Frage untersuchte ich die einzelnen Komponenten des Signalwegs und ihre Beziehungen zu einander im heterologen Expressionssystem der Xenopus laevis Oozyten.
Im Laufe dieser Arbeit wurden Schlüsselelemente des ABA-Signalwegs aus sechs verschiedenen Versuchspflanzen kloniert und in Oozyten charakterisiert. Für die Untersuchung der Evolution des schnellen ABA-Signalwegs wurden die sechs Versuchspflanzen aus je einem rezenten Vertreter der Grünalgen (Klebsormidium nitens), der Lebermoose (Marchantia polymorpha), der Laubmoose (Physcomitrella patens), der Lycophyten (Selaginella moellendorffii) und der Farne (Ceratopteris richardii) ausgewählt und mit der Samenpflanze Arabidopsis thaliana verglichen. Die sechs Pflanzengruppen spalteten sich an unterschiedlichen Zeitpunkten im Laufe der pflanzlichen Evolution von der Entwicklung der restlichen Pflanzen ab und erlauben so einen bestmöglichen Einblick in den jeweiligen Entwicklungsstand der Landpflanzen während der Entstehung der einzelnen Pflanzenfamilien. Obwohl sich die ersten Stomata erst in den Laubmoosen entwickelten, besitzen schon die Grünalgen OST1-Kinasen und SLAC1-Kanäle. Interessanterweise konnte wir zeigen, dass schon die frühen OST1-Kinasen aus Algen und Moosen dazu in der Lage sind, in den höher entwickelten Samenpflanzen die Rolle in der Regulation der ABA-abhängigen Expression von Genen zu übernehmen. Außerdem zeigte sich im Laufe meiner biophysikalischen Untersuchungen, dass alle dreizehn getesteten OST1-Kinasen aus den sechs unterschiedlichen Versuchspflanzenarten in Lage sind, den Anionenkanal SLAC1 aus Arabidopsis in Xenopus Oozyten zu aktivieren. Diese Austauschbarkeit von den AtSLAC1-aktivierenden Kinasen deutet auf eine sehr starke Konservierung der Struktur und Funktion von OST1 hin. Anders verhielt es sich bei der funktionellen Analyse der Anionenkanäle aus den verschiedenen Versuchspflanzen: Hier bildete nur der evolutionär gesehen jüngsten SLAC-Kanal AtSLAC1 aus Arabidopsis ein funktionelles Pärchen mit OST1. Die SLAC1 Kanäle aus der Grünalge, dem Lebermoos, den Lycophyten und dem Farn blieben ohne messbare Aktivität bei einer Co-expression mit den verschiedenen OST1 Kinasen. Nur beim Laubmoos (Physcomitrella patens) konnte noch ein funktionelles Kinase-Anionenkanal Pärchen gefunden werden. Struktur-Funktionsuntersuchungen erlaubten mir schließlich zu zeigen, dass bestimmte funktionelle Domänen sowohl im N-terminus als auch im C-terminus von SLAC1 erforderlich sind, um eine Aktivierung des Kanals durch OST1 Kinasen sicherzustellen.
Untersuchung zur NO/cGMP-Signaltransduktion in der glatten Muskulatur von NO-GC-defizienten Mäusen
(2013)
Die Stickstoffmonoxid (NO)/cGMP-Signaltransduktion besitzt eine entscheidende Rolle bei der Tonusregulation der glatten Muskulatur. Dabei ist NO neben seiner herausragenden Bedeutung für das vaskuläre System einer der wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im Gastrointestinaltrakt. Die Wirkung von NO beruht hauptsächlich auf der Aktivierung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen resultiert in einem vollständigen NO-GC-Knockout (GCKO). Im Gastrointestinaltrakt ist die Expression von NO-GC in glatten Muskelzellen (SMC), interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) und Fibroblasten-ähnlichen Zellen (FLC) nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung des NO/cGMP-Signalweges für die Regulation von Kontraktion und Relaxation innerhalb dieser drei Zelltypen anhand von zellspezifischen GCKO-Tieren untersucht. SMC- und ICC-spezifische GCKO-Tiere waren bereits vorhanden. FLC-spezifische GCKO-Tiere wurden generiert und mit den vorhandenen ICC- und SMC-GCKO-Linien gekreuzt, um Doppel- und Tripel-Knockout-Tiere zu erhalten. FLC-GCKO-Tiere zeigen eine NO-induzierte Relaxation glattmuskulären Gewebes, die der von WT-Tieren gleicht. Auch Gewebe von FLC/ICC- und FLC/SM-GCKO-Tieren kann durch NO relaxiert werden. Erst die Deletion der NO-GC in allen drei Zelltypen (Tripel-GCKO) führt zu einer Unterbrechung der NO-Relaxation, wie sie aus GCKO-Tieren bekannt ist. Überraschenderweise zeigt sich bei FLC-GCKO-Tieren eine beschleunigte Darmpassagezeit. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass die NO-GC in allen drei Zelltypen des Gastrointestinaltrakts an der nitrergen Signaltransduktion beteiligt ist, wenn auch auf unterschiedliche Weise. Es besteht demnach eine Interaktion zwischen den verschiedenen Zelltypen, die durch weiterführende Versuche mit den vorhandenen Doppel-Knockout-Tieren sowie der Tripel-GCKO-Linie nähergehend untersucht werden muss. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Rolle der NO-GC im unteren Harntrakt. Dort liegt die NO-GC in verschieden Zelltypen vor. In Urethra-Gewebe wird die NO-GC ausschließlich in SMC exprimiert, während sie in der Harnblase einzig in interstitiellen Zellen, nicht aber in SMC, befindet. Funktionell hat dies zur Folge, dass die NO-induzierte Urethra-Relaxation ausschließlich von glatten Muskelzellen vermittelt wird. Die Harnblasenmuskulatur hingegen zeigt keine Relaxation auf NO-Gabe hin. Die Identifizierung der NO-GC-exprimierenden interstitiellen Zellen sowie ihre Funktion sind bislang ungeklärt. In einem dritten Projekt wurden Untersuchungen zur Effektivität der NO-GC-Inhibitoren ODQ und NS2028 durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass bei einem Einsatz der Inhibitoren nicht von einer vollständigen Hemmung der NO-GC ausgegangen werden sollte. Drei Faktoren beeinflussen nachhaltig die Inhibitor-Effektivität: (1) die Klasse des NO-Donors, (2) die Inkubationszeit mit dem Inhibitor und dem NO-Donor sowie (3) die Stärke der Vorkontraktion bei Versuchen mit Glattmuskelgewebe. Die Wahl dieser Parameter bestimmt, in welchem Ausmaß ODQ und NS2028 die NO-stimulierte NO GC inhibieren können. Aus diesem Projektteil resultiert, dass man den Einsatz dieser Inhibitoren nicht, wie vielfach in der Literatur vorzufinden, als Beweis für cGMP unabhängige Effekte nutzen sollte.
Lokalisation, Funktion und Regulation pflanzlicher Tandem-Poren-Kaliumkanäle in Arabidopsis thaliana
(2007)
Lokalisation - Alle TPKs bis auf TPK4, der in der Plasmamembran lokalisiert ist, sind im Tonoplasten lokalisiert. - Das 14-3-3-Bindemotiv bzw. der komplette N-Terminus spielt im Gegensatz zu den tierischen TPK´s keine Rolle beim Targeting (und evtl. auch beim Assembly), da ein Austausch der N-Termini bzw. Mutationen im 14-3-3- Bindemotiv keinen Einfluss auf die subzelluläre Lokalisation hat. - Im C-Terminus ist möglicherweise ein strukturelles Motiv bzw. eine Erkennungssequenz für das Targeting in unterschiedliche Zielmembranen lokalisiert. Eventuell ist hier auch eine Assembly-Domäne für den Zusammenbau der unterschiedlichen Kanaluntereinheiten vorhanden. TPK4 - Der Kaliumkanal TPK4 wird nach Agro-Infiltration in dem pflanzlichen Expressionssystem Nicotiana benthamiana exprimiert. - TPK4 ist auch in diesem Expressionssystem in der Plasmamembran der Zelle lokalisiert. - Die Ströme, welche aus Mesophyllzellen von TPK4 infiltrierten Blättern abgeleitet wurden, gleichen denen, von TPK4 exprimierenden Oocyten von Xenopus laevis. Somit hat TPK4 in beiden Expressionssystemen die gleichen elektrophysiologischen Eigenschaften. TPK1 - TPK1 bindet über die C-terminalen EF-Hände Calcium und wird durch diese Interaktion aktiviert. - TPK1 interagiert phosphospezifisch und isotypspezifisch mit dem 14-3-3- Protein GRF6. Diese Interaktion führt zur Aktivierung des Kanals. - Die Kinasen CPK3 und CPK29, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 phosphorylieren um eine Interaktion mit 14-3-3-Proteinen zu ermöglichen, gehören zur Familie der CDPKs - Diese Kinasen sind selbst Calcium aktiviert und aller Wahrscheinlichkeit nach unter physiologischen Bedingungen inaktiv. Erst ein Anstieg der freien Calciumkonzentration führt zur Aktivierung der Kinase in der Zelle und damit zur Aktivierung des Kanals. - Das 14-3-3-Bindemotiv ist das einzige Target der CDPK´s im N-Terminus von TPK1 - Die Phosphatase, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 dephosphoryliert gehört zur Familie der PP2A-Proteinphosphatasen. - Es ist möglich, dass die Kinase und damit auch der Kanal durch Salzstress und durch Kaliumunterversorgung aktiviert werden und somit die Signalkaskade für die Aktivierung von TPK1 über Kinasen/14-3-3/Calcium in einen stressphysiologischen Kontext involviert ist. - tpk1.3- und cpk3.1-Verlustmutanten zeigen eine Reduktion in der Keimungsrate unter Salzstress und limitierten Kaliumangebot. Es kann über einen funktionalen Komplex bestehend aus TPK1 und TPC1 zur Aufrechterhaltung der Na+/K+-Homeostase und der elektroneutralen Aufnahme von Na+ in die Vakuole unter Salzstressbedingungen spekuliert werden.
The defense against invading pathogens is, amongst other things, mediated via the action of antibodies. Class-switched antibodies and antibodies of high affinity are produced by plasma cells descending from germinal center B (GCB) cells. GCB cells develop in the germinal center (GC), a specialized microstructure found in the B-cell follicle of secondary lymphoid organs. GCB-cell maturation and proliferation are supported by follicular T- helper (Tfh) cells. On the other hand, follicular regulatory T (Tfr) cells control this process in quantity and quality preventing, for instance, the formation of autoantibodies directed against endogenous structures. The development of GCB, Tfh and Tfr cells essentially depends on the migration into the GC, which is mediated via the expression of the chemokine receptor CXCR5.
One transcription factor highly expressed in follicular T cells, comprising Tfh and Tfr cells, is NFATc1. Tfr cells additionally express the transcriptional repressor Blimp-1, which is not expressed in Tfh cells. We found that NFATc1 is transactivating Cxcr5 via response elements in the promoter and enhancer in vitro. Blimp-1 binds to the same elements, transactivating Cxcr5 expression in cooperation with NFATc1, whilst mediating Cxcr5- repression on its own. In Tfr cells Blimp-1 suppresses CXCR5 expression in the absence of NFATc1. Blimp-1 itself is necessary to restrict Tfr-cell frequencies and to mediate Tfr- cell function as in mice with Blimp-1-ablated Tregs high frequencies of Tfr cells do not reduce GCB- or Tfh cell frequencies. NFATc1 and Blimp-1 double deficient Tfr cells show additional loss of function, which becomes visible in clearly expanded antibody titers.
To evaluate the function of NFATc1 in Tfr cells, we not only deleted it, but also overexpressed a constitutive active form of NFATc1/aA (caNFATc1/aA) in regulatory T cells (Tregs). The latter is leading to an upregulation of CXCR5 per cell, without changing Tfh or Tfr-cell frequencies. However, the high density of surface CXCR5 enhances the migration of Tfr cells deep into the GC, which results in a tighter control of the antigen- specific humoral immune response. Additionally, caNFATc1/aA increases the expression of genes coding for Tfr effector molecules like Il1rn, Il10, Tigit and Ctla4. Interestingly, this part of the transcriptional change is dependent on the presence of Blimp-1. Furthermore, Blimp-1 regulates the expression of multiple chemokine receptor genes on the background of caNFATc1/aA.
In contrast, when caNFATc1/aA is overexpressed in all T cells, the frequencies of Tfh- and GCB cells are dominantly reduced. This effect seems to stem from the conventional T- cell (Tcon) side, most probably originating from increased secretion of interleukin-2 (IL- 2) via the caNFATc1/aA overexpressing Tcons. IL-2 is known to hinder the germinal center reaction (GCR) and it might in its abundance not be neutralizable by Tfr cells.
Taken together, NFATc1 and Blimp-1 cooperate to control the migration of Tfr cells into the GC. Tfr cells in the GC depend on NFATc1 and Blimp-1 to perform their proper function. Overexpression of caNFATc1 in Tregs strengthens Tfr function in a Blimp-1-dependent manner, whilst overexpression of caNFATc1 in all T cells dominantly diminishes the GCR.
Notch Proteine gehören zu einer Familie hochkonservierter Transmembranrezeptoren, die bei Entwicklungsprozessen, beispielsweise im hämatopoetischen System, eine bedeutende Rolle spielen. So konnte eine Beteiligung von Notch und seinen Liganden bei der Differenzierung lymphatischer Zellen im Knochenmark, Thymus sowie in peripheren Organen gezeigt werden. Insbesondere unterdrückt Notch1 nach Ligandenbindung die Bildung von B-Zellen im Thymus und fördert stattdessen die Entwicklung von T-Zellen. Durch Aktivierung der γ-Sekretase wird die intrazelluläre Domäne von Notch1 freigesetzt und transloziert in den Kern. Dort wirkt Notch1 zusammen mit Proteinen der CSL Familie als Transkriptionsfaktor und reguliert so die Expression von Zielgenen wie beispielsweise HES1. Weiterhin kann die Signaltransduktion von Notch1 im Zytosol durch Wechselwirkung mit Proteinen wie Numb oder Deltex1 moduliert werden. Angesichts der Fähigkeit, die Proliferation unreifer Zellen aufrecht zu erhalten, kann eine aberrante Expression von Notch1 zur Entstehung von Neoplasien beitragen. Numb wird eine wichtige Rolle in der Regulation von Notch1 zugeschrieben, doch seine genaue Funktion in der T-Zellentwicklung ist unklar. Die Klonierung aller vier in der Ratte exprimierten Isoformen erlaubte erstmals deren detaillierte Charakterisierung. Die differentielle Expression und die preferentielle Interaktion von Numb i/o mit Notch1 deuten darauf hin, dass den verschiedenen Splice-Varianten nicht nur in der T-Zellentwicklung sondern auch in der Kontrolle von Notch1 unterschiedliche Funktionen zukommen. Diese Schlussfolgerung wird durch eine spezifische Expression der Numb Isoformen in humanen T-ALL Zelllinien weiter unterstützt. Transgene Ratten welche die intrazelluläre Domäne von Notch1 (N1IC) unter der Kontrolle des proximalen lck-Promoters überexprimieren (NICA), sind ein geeignetes Werkzeug, um die Rolle von Notch1 für die Genexpression und die Lymphomgenese zu untersuchen. Junge NICA-Ratten exprimieren N1IC spezifisch in Thymozyten, nicht jedoch in peripheren T-Zellen. In Folge dessen kommt es zu einer starken Expression bekannter Notch1 Zielgene, unter anderem dem präTα Rezeptor. Dies wiederum führt zur Substitution klassischer T-Zellrezeptor-Komplexe durch den präT-Zellrezeptor, was in adulten Tieren zur Entwicklung von thymischen Lymphomen beiträgt. Die Lymphomzellen in NICA-Ratten exprimieren das N1IC-Transgen sowohl im primären Tumor als auch nach Infiltration peripherer Organe. Dabei könnte die beobachtete Hochregulation von Notch3 ein möglicher Mechanismus der Tumorgenese in NICA-Ratten darstellen. Um die Ursache der Lymphomgenese besser zu verstehen, wurde eine genomweite Expressionsanalyse der Tumore mittels SAGE und Affymetrix DNA-Chips durchgeführt. Dabei wurden zahlreiche potentiell bedeutende Gene identifiziert, welche bei der Notch1-vermittelten Lymphomgenese eine Rolle spielen könnten. Die Beobachtung, dass ein Teil dieser Gene auch in humanen T-ALL-Zelllinien verändert ist, unterstreicht deren Bedeutung auch für die Pathogenese des Menschen. Eines der in NICA-Lymphomen am stärksten veränderten Gene wurde bislang weder in der Literatur noch in Sequenzdatenbanken beschrieben. Dieses von uns als Nip1 bezeichnete Protein ähnelt einem Enzym aus dem Isoprenoid-Stoffwechsel und ist vor allem im Thymus exprimiert. Ein anderes interessantes Kandidatengen ist CD30, ein Transmembran-Rezeptor welcher bei Hodgkin Lymphomen beschrieben wurde. Neben T-ALL wurde auch bei Hodgkin Lymphomen eine wichtige Rolle von Notch1 berichtet. Dabei könnte dessen hohe Expression im Zusammenhang mit der Transformation und dem Verlust der B-Zell-Identität dieser Tumore stehen. Um dies näher zu untersuchen, wurde Notch1 mittels RNAi bzw. durch Überexpression des negativen Regulators Deltex1 in Hodgkin-Zelllinien inaktiviert. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse unterstützen die These, dass nach Repression der Notch1 Aktivität die Expression B-Zellspezifischer Marker wieder gewonnen werden kann. Zusammengefasst deuten die Ergebnisse dieser Arbeit auf eine bedeutende Funktion von Notch1 bei der T-Zellentwicklung und der Entstehung von Lymphomen hin. Dabei scheint insbesondere die Interaktion mit Proteinen wie Numb und Deltex1 sowie die Regulation der Genexpression wichtig zu sein. Die gewonnenen Daten könnten in Zukunft einen neuen Ansatzpunkt zur Entwicklung verbesserter Strategien zur Therapie von Krebserkrankungen des hämatopoetischen System bilden.
In dieser Doktorarbeit wurden zwei intrazelluläre Anteile des IL-4 Rezeptors als GST-Fusionsproteine exprimiert. GST-E1, in dem das cytoplasmatische membranproximale 1/3 von IL-4Ralpha (173 AS) einschließlich des Box 1 Motivs an GST fusioniert ist, konnte nach differenzierter De- und Renaturierung und Bindung an Glutathion-Sepharose Matrix in elektrophoretisch reiner Form aufgereinigt werden. GST-gammainP5D4, in dem die intrazelluläre Domäne von gamma c an GST gebunden vorliegt, konnte nur als heterogenes Gemisch mit 4 C-terminal verkürzten Fraktionen erhalten werden. Mit diesen rekombinanten Fusionsproteinen wurden Immunpräzipitationsversuche in Lysaten IL-4R-transfizierter Ba/F3 Zellen vor und nach Stimulation mit IL-4 durchgeführt. Für GST-E1 wurde eine Wechselwirkung mit Jak1 nachgewiesen, die dem bisherigen Kenntnisstand entspricht; für GST-ginP5D4 hingegen konnte eine Wechselwirkung mit Jak3 nicht gezeigt werden. Beide Proteine sind in der Lage, STAT5 zu präzipitieren; diese Bindung erscheint unabhängig von der IL-4 Stimulation der Zellen und läßt neue Spekulationen über den Mechanismus der Signaltransduktion durch STAT5 zu. Danach könnten nach den hier gewonnenen Informationen beide IL-4-Rezeptorketten jeweils ein STAT5 Molekül zur STAT5-Dimerisirerung nach Rezeptoraktivierung beitragen. Es ist somit gelungen, ein in-vitro-Modell zur Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen am IL-4 Rezeptor zu etablieren, welches für weitere Untersuchungen eingesetzt werden kann.
Das Adapterprotein TRAF2 und seine Bedeutung für die Todesrezeptor-vermittelte Signaltransduktion
(2020)
Während die Rolle des tumor necrosis factor (TNF) receptor associated factor (TRAF)2 in der Signaltransduktion der TRAF-interagierenden Rezeptoren der TNF Receptor (TNFR)- Superfamily (TNFRSF) bereits in der Vergangenheit umfassend erforscht wurde, ist die Rolle und Funktion dieses Adapterproteins für die Signalgebung der Todesrezeptoren nicht vollständig aufgeklärt. Die unklare Funktion der Really Interesting New Gene (RING) E3 Ligase Domäne in TRAF2 und die Abhängigkeit von Caspasen für die Aktivierung des klassischen nuclear factor κB (NFκB)-Signalweges führten in dieser Arbeit zur Herstellung von CRISPR/Cas9 knockout (KO) Zellen, bei denen TRAF2 in der Kolorektalkarzinomzelllinie HCT116 als auch in den Fibrosarkomzellen HT1080 ausgeschaltet wurde. Diese Zellen wurden zuvor so modifiziert, dass die Apoptose „downstream“ der Caspase-8-Aktivierung nicht weiter induzierbar war. HCT116-Zellen exprimierten hierzu ein mutiertes Allel der Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) und HT1080-Bcl2-TNFR2 Zellen das anti-apoptotische Protein B-cell lymphoma 2 (Bcl2).
Im Fokus dieser Arbeit waren die Todesrezeptoren TNFR1, TNF-Related Apoptosis Inducing Receptor (TRAILR)1/2 und Cluster of Differentiation(CD)95. In den TRAF2-KO Zelllinien war der alternative NFκB Signalweg konstitutiv aktiv und der TNFR1-induzierte klassische NFκB-Signalweg inhibiert. Die proinflammatorische Signalgebung in Form der Interleukin (IL)8 Produktion war in den CD95-artigen Todesrezeptoren signifikant, aber nicht vollständig, reduziert und erfolgte Caspase-8-Aktivität unabhängig. Der Effekt der TRAF2-Deletion konnte durch eine Rekonstitution von TRAF2, jedoch nicht durch eine Überexpression von TRAF1 wiederhergestellt werden.
Des Weiteren führte die TRAF2-Defizienz zu einer verstärkten Procaspase-8- Prozessierung nach Aktivierung von Todesrezeptoren, die überraschenderweise mit einer Reduktion der Caspase-8-Aktivität einherging. Die Prozessierung der Procaspase-8, jedoch nicht die Aktivierung des klassischen NFκB-Signalweges wurde vermutlich durch eine verringerte Rekrutierung von cellular inhibitor of apoptosis protein (cIAP)1 an den TNFR1 erreicht. Die Expression der anti-apoptotischen Proteine FADD-like ICE (FLICE) Inhibitory Protein (FLIP)Long(L), FLIPShort(S) und cIAP1 wurde nicht von der TRAF2-Depletion beeinflusst.
Somit konnte in dieser Arbeit ein nicht-obligatorischer Effekt von TRAF2 auf die Regulation der proinflammatorischen Todesrezeptor-vermittelten Signaltransduktion nachgewiesen werden, die durch TRAF1 nicht ersetzt werden kann. Des Weiteren wurde eine bisher nicht beschriebene, stabilisierende Wirkung von TRAF2 auf die Capsase-8-Aktivität gezeigt.
Knochenwachstumsfaktoren (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs) sind ubiquitäre, sekretierte Proteine mit vielfältigen biologischen Funktionen. Die Vielfalt an zellulären Prozessen, die durch BMPs reguliert werden, von der Knochenentwicklung und Organhomöostase bis hin zur Neurogenese, erstaunt – und wirft angesichts von teils redundanten, teils spezifischen Funktionen der BMPs Fragen zu den Mechanismen ihrer Signalübermittlung auf. Die Signaltransduktion von BMPs erfolgt wie bei den strukturell verwandten TGF-βs und Activinen durch die ligandeninduzierte Oligomerisierung von transmembranen Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, von denen zwei Typen – Typ I und Typ II – existieren. Einer Vielzahl von mehr als 18 BMP-Liganden stehen nach derzeitigem Erkenntnisstand nur vier Typ I und drei Typ II Rezeptorsubtypen für die Bildung von heteromeren Rezeptorkomplexen zur Verfügung. Ein BMP-Ligand kann hochspezifisch nur einen bestimmten Rezeptorsubtyp oder in einer promisken Art und Weise mehrere Rezeptorsubtypen binden. Trotz dieser Bindungspromiskuität üben BMPs ihre biologische Funktion überwiegend hochspezifisch aus, d.h. abhängig vom Liganden werden spezifische zelluläre Prozesse reguliert. Somit stellt sich die Frage, wie die Bildung von heteromeren Ligand-Rezeptor-Komplexen und die Aktivierung definierter intrazellulärer Signalkaskaden zusammenhängen und wie letztlich ein bestimmtes BMP-Signal durch einen „Flaschenhals“, repräsentiert durch die begrenzte Anzahl an Rezeptorsubtypen, in das Zellinnere übermittelt wird. Die Interaktionen zwischen BMP-2 / GDF-5 und den Typ I Rezeptoren BMPR-IA / BMPR-IB sind ein Paradebeispiel für Bindungspromiskuität und -spezifität. Während BMP-2 beide Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB mit gleicher Bindungsaffinität bindet („promiske Interaktion“), zeigt GDF-5 eine 15-20fach höhere Bindungsaffinität zu BMPR-IB („spezifische“ Interaktion). Dieser Unterschied ist scheinbar gering, aber physiologisch überaus relevant. Um Einblick in die Mechanismen der molekularen Erkennung zwischen den Bindungspartnern zu gewinnen, wurden binäre und ternäre Komplexe aus den Liganden BMP-2 oder GDF-5, den extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA oder BMPR-IB sowie der extrazellulären Domäne des Typ II Rezeptors ActR-IIB untersucht. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die strukturelle und funktionelle Analyse dieser Ligand-Rezeptor-Komplexe. Um den Einfluss struktureller Flexibilität auf die BMP Typ I Rezeptor Erkennung näher zu analysieren, wurde zudem die Struktur von BMPRIA in freiem Zustand mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt. Aus Mutagenesedaten und der Kristallstruktur des GDF-5•BMPR-IB-Komplexes lassen sich im Vergleich zu bekannten Kristallstrukturen Merkmale ableiten, mit denen die Ligand-Rezeptor-Bindung und -Erkennung charakterisiert werden kann: (1) Die Hauptbindungsdeterminanten in Komplexen von BMPR-IA und BMPR-IB mit ihren Liganden sind unterschiedlich. Während in Komplexen mit BMPR-IB ein hydrophobes Motiv die Bindungsaffinität bestimmt, trägt in Komplexen mit BMPR-IA eine polare Interaktion signifikant zur Bindungsenergie bei. Ein Vergleich der Strukturen von freien und gebundenen Liganden und Typ I Rezeptoren zeigt, dass interessanterweise diese Hauptbindemotive erst bei der Ligand-Rezeptor-Interaktion entstehen, sodass ein „induced fit“ vorliegt und die Moleküle entsprechend „aufeinander falten“. (2) Die Bindungsspezifität wird durch periphere Schleifen in den Typ I Rezeptoren bestimmt. Wie Untersuchungen von Punktmutationen in BMPR-IA zeigen, die einer krebsartigen Darmerkrankung (Juvenile Polyposis) zugrunde liegen, führt erst die „richtige“ Kombination aus Flexibilität in den Schleifen und Rigidität des Rezeptorgrundgerüsts zu signalaktiven Typ I Rezeptoren mit einer potentiell den Liganden komplementären Oberfläche. Die mangelnde sterische Komplementarität von Ligand- und Rezeptoroberflächen führt zu der niedrigeren Bindungsaffinität von GDF-5 zu BMPR-IA im Vergleich zu BMPR-IB. Interessanterweise zeigen die hier vorgestellten, hochaufgelösten Strukturdaten, dass die Orientierungen/Positionen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB in den Bindeepitopen der Liganden BMP-2 und GDF-5 variieren. Unter der Voraussetzung, dass die extrazelluläre Domäne, das Transmembransegment und die intrazelluläre Domäne der Typ I Rezeptoren ein starres Element bilden, sollte sich die unterschiedliche Orientierung der extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren in der Anordnung der Kinasedomänen widerspiegeln und sich auf die Signaltransduktion auswirken. Möglicherweise ist eine bestimmte Anordnung der Kinasedomänen der Typ I und Typ II Rezeptoren für eine effiziente Phosphorylierung bzw. Signaltransduktion erforderlich. Der Vergleich mehrerer Ligand-Typ I Rezeptor-Komplexe zeigt, dass die unterschiedliche Orientierung dieser Rezeptoren möglicherweise vom Liganden abhängt. Angesichts der Bindungspromiskuität unter BMP-Liganden und -Rezeptoren könnten so spezifische Signale übermittelt und spezifische biologische Funktionen reguliert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Erkenntnisse tragen wesentlich zur strukturellen Charakterisierung der Ligand-Rezeptor-Erkennung in der BMP-Familie bei. Die Frage, warum trotz strukturell hoch homologer Liganden und Rezeptoren und weitgehend konservierten Bindeepitopen eine teils promiske und teils spezifische Interaktion möglich ist, kann nun für die Liganden BMP-2 und GDF-5 sowie den beiden Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB beantwortet werden.
Der Parathormonrezeptor Typ 1 (PTHR) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor der Gruppe 2 und wichtigster Regulator des Kalziumstoffwechsels. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neuartige posttranslationale Modifikation des PTHR in Form einer proteolytischen Spaltung der Ektodomäne identifiziert, charakterisiert und deren Regulation beschrieben. Nach langanhaltender Stimulation des Rezeptors mit Agonisten – aber nicht mit Antagonisten – wurde eine Massen- und Mengenzunahme des Rezeptorproteins beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor unter basalen Bedingungen einer Spaltung unterliegt. Der Massenunterschied entsteht durch die proteolytische Spaltung der Ektodomäne des PTHR, was nachfolgend die Stabilität des Rezeptors beeinträchtigt. Die Spaltung erfolgte innerhalb einer unstrukturierten Schleife der Ektodomäne, welche die Bereiche für die Ligandenbindung miteinander verbindet. Hierbei handelt es sich um eine Region, die im Vergleich zu anderen Gruppe 2-Rezeptoren spezifisch für den PTHR ist. Das durch die Spaltung entstandene N-terminale Fragment bleibt durch eine Disulfidbrücke mit dem Transmembranteil des Rezeptors verbunden. Durch Versuche mit verschiedenen Proteaseinhibitoren konnte die verantwortliche Protease der Familie der zinkabhängigen extrazellulären Proteasen zugeordnet werden. Diese Ergebnisse beschreiben einen Mechanismus wie die Homoöstase des PTHR reguliert sein könnte. In einem zweiten Abschnitt wurde die Interaktion der Adapterproteine NHERF1 und beta-Arrestin2 mit dem PTHR untersucht. Beide Proteine interagierten unabhängig mit dem Rezeptor, wobei NHERF1 über eine PDZ-Domäne konstitutiv an den C-Terminus des Rezeptors bindet. beta-Arrestin2 hingegen bindet nach Aktivierung des Rezeptors und führt zur Desensitisierung des Rezeptors. Mittels biochemischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass beide Proteine gemeinsam einen ternären Komplex mit dem PTHR bilden, welcher durch die direkte Interaktion zwischen NHERF1 und beta-Arrestin2 vermittelt wird. Dies hat zur Folge, dass beta-Arrestin im basalen Zustand durch NHERF1 an den Rezeptor gekoppelt wird. Durch Analyse der Assoziationskinetik mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen zeigte sich, dass diese Kopplung zu einer zweifach erhöhten Rekrutierungsgeschwindigkeit von beta-Arrestin2 an den PTHR führt. Somit stellt unterstützt NHERF1 die beta-Arrestin2-vermittelte Desensitisierung des PTHR.
Die Detektion von Umweltsignalen und die gezielte zelluläre Reaktion ist eine zentrale und für das Überleben aller Lebewesen essentielle Fähigkeit. Candida albicans, als dominierender humanpathogener Pilz, ist hochgradig verschiedenen biochemischen und physikalischen Umweltbedingungen ausgesetzt, welche sowohl die Zellmorphologie als auch die Virulenz dieses Erregers beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Kohlendioxid, als ubiquitär vorkommendes Gasmolekül, auf die Zellmorphologie und Virulenz untersucht. Erhöhte Konzentrationen von Kohlendioxid stellen ein äußerst robustes Umweltsignal dar, welches die morphologische Transition vom Hefewachstum zum hyphalen Wachstum, einem Hauptvirulenzfaktor, in Candida albicans stimuliert. In diesem Zusammenhang wurde die Rolle der putativen Carboanhydrase Nce103 durch die Generation von knock – out Mutanten untersucht. Die Disruption von NCE103 in C. albicans führt zu einem Kohlendioxid – abhängigen Phänotyp, welcher Wachstum unter aeroben Bedingungen (ca. 0,033% CO2) nicht zulässt, jedoch unter Bedingungen mit einem erhöhten CO2 Gehalt von ca. 5% ermöglicht. NCE103 ist also für das Wachstum von C. albicans in Wirtsnischen mit aeroben Bedingungen essentiell. Durch Untersuchungen zur Enzymkinetik mittels Stopped – flow wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass Nce103 die Funktion einer Carboanhydrase erfüllt. Die biochemische Funktion dieser Carboanhydrase besteht in der Fixation von CO2 bzw. HCO3ˉ in der Zelle zur Unterhaltung der wesentlichen metabolischen Reaktionen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Induktion hyphalen Wachstums durch CO2 in C. albicans nicht durch den Transport von CO2 mittels des Aquaporins Aqy1 beeinflusst wird. CO2 bzw. HCO3ˉ aktiviert in der Zelle direkt eine Adenylylcyclase (Cdc35), welche sich grundlegend von den bisher gut charakterisierten G-Protein gekoppelten Adenylylcylasen unterscheidet. Die Generation von cAMP beeinflusst in der Folge direkt die Transkription hyphenspezifischer Gene und nachfolgend die morphologische Transition vom Hefewachstum zum elongierten, hyphalen Wachstum. Dieser Mechanismus konnte sowohl in Candida albicans als auch in Cryptococcus neoformans nachgewiesen werden, was auf einen panfungal konservierten Signaltransduktionsmechanismus schliessen lässt. Die Inhibition dieser spezifischen Kaskade eröffnet neue Ansätze zur Entwicklung spezifischer antimykotischer Wirkstoffe.
Das Hauptthema der hier vorliegenden Arbeit befaßt sich mit dem B-Zell spezifischen Oberflächenprotein CD22, einem Mitglied der Siglec (Sialinsäure bindende Igähnliche Lektine) Proteinfamilie. Dieses Transmembranprotein besitzt sieben extrazelluläre Immunoglobulin-ähnliche Domänen und kann über die äußerste V-set Domäne seine Liganden: α2,6 verknüpfte Sialinsäuren binden. CD22 hat eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne mit sechs potentiellen Tyrosin Phosphorylierungsstellen, von denen drei eine ITIM-Sequenz (engl. immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) aufweisen. CD22 defiziente Mäuse zeigten eindeutig, daß das Siglec CD22 ein negativer Regulator des BCR-Signals ist. Durch BCR-Kreuzvernetzung wird CD22 tyrosinphosphoryliert, die inhibitorische Tyrosinphosphatase SHP-1 gebunden, aktiviert, und ist nun in der Lage das BCR Ca2+ Signal zu inhibieren. Um die Rolle der CD22Ligandenbindungsdomäne, in vivo zu untersuchen, sollte in dieser Arbeit eine CD22 knock -in Maus erzeugt werden (CD22R130E Maus), in der die Ligandenbindungsdomäne von CD22 durch eine Punktmutation funktionell ausgeschaltet ist. In der hieraus resultierenden Mauslinie sollte dann die BZellentwicklung, Signaltransduktion und der Immunstatus analysiert werden. Der Vergleich des Phänotyps der CD22R130E Maus und der CD22 defizienten Maus sollte dann zeigen, wie die Adhäsions- und Signalleitungseigenschaften von CD22 zusammenhängen. Der „Targeting“ Vektor für die „Gene Targeting“ Experimente wurde von der Arbeitsgruppe Dr. Anton van der Merwe (von Christina Piperi) angefertigt. Ursprünglich wurde ein „Targeting“ Vektor aus genomischer C57BL/6-DNA verwendet, um den genetischen Hintergrund der CD22-defizienten Maus beizubehalten. Dieser Vektor wurde von mir für ES-Zell Transfektionen in der C57Bl/6 ES-Zellline verwendet. Aus den Gene Targeting Experimenten mit der C57Bl/6-III ES-Zelllinie konnten zwei ES-Zellklone isoliert werden, die eine korrekte homologe Integration des Targetvektors trugen. Aus einem Blastozysteninjektions- Experiment mit einem Cre-deletierten C57BL/6-III Subklon wurden sechs hochchimäre Mäuse erhalten, mit denen allerdings keine Keimbahntransmission erzielt werden konnte. Nach Problemen mit Keimbahntransmission von Klonen aus der C57BL/6-III ESZelllinie, wurden noch die BALB/c und die E14Tg2a ES-Zelllinie für neue Gene Targeting Experimente verwendet. Die Experimente mit der BALB/c ES-Zelllinie ergaben keine ES-Zellklone mit korrekter homologer Integration, dies beruhte wahrscheinlich auf dem nicht isogenen Hintergrund. Alle folgenden Experimente mit der E14Tg2a ES-Zelllinie (genetischer Hintergrund: 129/ola) wurden mit dem verlängerten R130E-Targetvektor (Targetvektor 2), der mit 129/ola DNA um 2,3 Kb in 5’-Richtung verlängert wurde, um den isogenetischen Anteil des Targetvektors zu erhöhen, durchgeführt. Aus diesen Experimenten resultierten wiederum zwei ESZellklone, deren korrekte homologen Rekombination durch Southern Blot bestätigt werden konnten. Bei den darauffolgenden Blastozysten-Injektionsexperimenten mit diesen zwei E14Tg2a Klonen konnten fünf chimäre Tiere gewonnen werden. Ein 80 %ig chimäres Männchen erzeugte eine hohe Anzahl von Nachkommen mit Keimbahntransmission. Bei der Analyse dieser Tiere trat das Resultat zutage, daß alle diese Tiere mit Keimbahntransmission einen wildtypischen Genotyp besaßen. Ein weiteres Mitglied der Siglecproteinfamilie, das murine SiglecG (ein Ortholog zu humanem Siglec10), wurde in dieser Arbeit untersucht. In Zusammenarbeit mit dem Labor von Dr. Paul Crocker sollte eine SiglecG knock out Maus hergestellt werden. Die Strategie für die Gene Targeting Experimente für einen SiglecG knock out basierten auf der Verwendung der BalbI ES-Zelllinie (aus BALB/c Mäusen), da hiermit sehr gute Erfahrungen vorlagen, was die Stabilität ihrer Pluripotenz und des Keimbahntransmissionspotenzials angeht. Daher wurde im Labor von Paul Crocker (von Sheena Kerr) ein Kontroll- und ein Targetvektor kloniert, mit dem große Teile der ersten und zweiten Ig-Domäne von SiglecG ausgeschaltet werden sollte. Mit diesem Vektor führte ich mehrere ES-Zell Transfektionsexperimente durch. Innerhalb der Zeitspanne meiner Doktorarbeit konnten keine ES-Zellklone mit einem korrekten homologen Integrationsereignis gewonnen werden. Mittels der ursprünglichen Strategie konnte die mir nachfolgende Doktorandin jedoch ES-Zell Klone isolieren, nach Blastozysteninjektion Keimbahntransmission erzielen und somit eine SiglecGdefiziente Maus generieren. Eine andere Zusammenarbeit kam mit Dr. Burkhard Kneitz (Physiologisches Chemie I, Biozentrum, Universität Würzburg) zustande. Seine Intention war es, die Rolle des TGF-β Signalmediators SMAD2 auf B-Zellebene näher zu untersuchen. Von Erwin Böttinger bekamen wir eine Mauslinie, in der das Smad2-Gen gefloxt ist, die mit der CD19-Cre Maus gekreuzt wurde. So wurde eine B-Zell spezifische SMAD2 knock out Maus (bSmad2-/-) erzeugt. Meine Aufgabe bestand darin, die B-Zellkompartmente und die Immunantworten der B-Zell spezifischen Smad2-defizienten Maus zu analysieren. Faßt man alle gewonnenen Daten aus den hier generierten B-Zell spezifischen Smad2 knock out Tieren zusammen, so kann man zu dem klaren Ergebnis kommen, daß der TGF-β Signalmediator Smad2 eine entscheidende Rolle bei der Weiterleitung von TGF-β Signalen in das Zellinnere von B-Zellen spielt. Hierbei zeigten sich klare Veränderungen, im Vergleich zu Kontrolltieren, eine Erhöhung der Zellzahl in den Peyerschen Plaques (PP), und der B1-Zellen im Peritoneum. Die IgA-Immunantwort war in bSmad-/- Tieren stark erniedrigt. Der für TGF-β beschriebene Effekt der Proliferationshemmung von aktivierten B-Zellen war bei aktivierten B-Zellen der bSmad2-/- Mäuse hingegen nicht beeinträchtigt.
Die vorliegende Arbeit behandelt TRAIL-induzierte Apoptose und Nekroptose in verschiedenen Zelllinien. Im Speziellen wurden die verschiedenen Funktionen des TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) untersucht. Hierzu wurde ein transienter Knockdown etabliert und dessen Wirkung auf die Suszeptibilität der Zellen gegenüber dem Zytokin TRAIL untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein Knockdown von TRAF2 nicht nur zur Sensitivierung für Apoptose führt, sondern auch in Nekroptose-kompetenten Zellen zu einer Verstärkung der durch Caspaseinhibition mittels zVAD-fmk nach TRAIL-Stimulation induzierten Nekroptose führt. Mittels des Zytokins Fc-TWEAK wurde Fn14-vermittelt TRAF2 aus dem Zytosol in ein Triton X100-unlösliches Kompartiment rekrutiert und dadurch physiologisch depletiert. Dies führte zwar kaum zu gesteigerter TRAIL-abhängiger Apoptose, sensitivierte jedoch analog zum TRAF2-Knockdown RIP3-exprimierende Zellen für Nekroptose. Durch Vergleich RIP3-negativer (HeLa-Leervektor) mit RIP3-exprimierenden Zellen (HeLa RIP3, HT29, HaCaT) konnte die Essentialität von RIP3 für die Nekroptose herausgestellt werden und Einsatz des RIP1-Kinase-Inhibitors Necrostatin-1 sowie des MLKL-Inhibitors Necrosulfonamide belegte die Beteiligung der Nekroptosomkomponenten RIP1 und MLKL. Antagonismus putativen autokrinen TNFs bewies, dass es sich bei dem durch Fc-TWEAK verstärkten Zelltod um einen direkten TRAIL-Effekt handelte und Inhibition kanonischen NFkBs durch IKK2-Inhibitor TPCA-1, dass die TRAF2-Knockdown-vermittelte Sensitivierung gegenüber TRAIL nicht auf verändertes NFkB-Signalling zurückzuführen ist. Einsatz des SMAC-Mimetikums BV6 rekapitulierte zudem stark das im TRAF2-Knockdown Gesehene und unterstrich die Bedeutung der cIAPs. Immunpräzipitation von Caspase 8 unter nekroptotischen Bedingungen zeigte bei TRAF2-Knockdown eine Depletion von TRAF2 und cIAP1/2 sowie RIP1 und RIP3 aus dem Komplex mit Caspase 8. Insgesamt wird deutlich, dass TRAF2 einerseits antiapoptotisch wirkt als K48-Ubiquitinligase, die die Halbwertszeit aktiver Caspase 8-Komplexe determiniert und andererseits eine antinekroptotische Funktion hat, da es durch Rekrutierung von cIAP1/2 an RIP1 die TRAIL-induzierte Nekroptose verhindert, wenn die Caspasen inhibiert sind.
Das zentrale Paradigma der Systembiologie zielt auf ein möglichst umfassendes Ver-ständnis der komplexen Zusammenhänge biologischer Systeme. Die in dieser Arbeit angewandten Methoden folgen diesem Grundsatz.
Am Beispiel von drei auf Basis von Datenbanken und aktueller Literatur rekonstruier-ten Netzwerkmodellen konnte in der hier vorliegenden Arbeit die Gültigkeit analyti-scher und prädiktiver Algorithmen nachgewiesen werden, die in Form der Analy-sesoftware Jimena angewandt wurden. Die daraus resultierenden Ergebnisse sowohl für die Berechnung von stabilen Systemzuständen, der dynamischen Simulation, als auch der Identifikation zentraler Kontrollknoten konnten experimentell validiert wer-den. Die Ergebnisse wurden in einem iterativen Prozess verwendet werden um das entsprechende Netzwerkmodell zu optimieren.
Beim Vergleich des Verhaltens des semiquantitativ ausgewerteten regulatorischen Netzwerks zur Kontrolle der Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in Chondrozyten (Knorpelbildung), Osteoblasten (Knochenbildung) und Adipozyten (Fett-zellbildung) konnten 12 wichtige Faktoren (darunter: RUNX2, OSX/SP7, SOX9, TP53) mit Hilfe der Berechnung der Bedeutung (Kontrollzentralität der Netzwerkknoten identifi-ziert werden). Der Abgleich des simulierten Verhaltens dieses Netzwerkes ergab eine Übereinstimmung mit experimentellen Daten von 47,2%, bei einem widersprüchlichen Verhalten von ca. 25%, dass unter anderem durch die temporäre Natur experimentel-ler Messungen im Vergleich zu den terminalen Bedingungen des Berechnung der stabilen Systemzustände erklärt werden kann.
Bei der Analyse des Netzwerkmodells der menschlichen Immunantwort auf eine Infek-tion durch A. fumigatus konnten vier Hauptregulatoren identifiziert werden (A. fumi-gatus, Blutplättchen, hier Platelets genannt, und TNF), die im Zusammenspiel mit wei-teren Faktoren mit hohen Zentralitätswerten (CCL5, IL1, IL6, Dectin-1, TLR2 und TLR4) fähig sind das gesamte Netzwerkverhalten zu beeinflussen. Es konnte gezeigt werden, dass sich das Aktivitätsverhalten von IL6 in Reaktion auf A. fumigatus und die regulato-rische Wirkung von Blutplättchen mit den entsprechenden experimentellen Resultaten deckt.
Die Simulation, sowie die Berechnung der stabilen Systemzustände der Immunantwort von A. thaliana auf eine Infektion durch Pseudomonas syringae konnte zeigen, dass die in silico Ergebnisse mit den experimentellen Ergebnissen übereinstimmen. Zusätzlich konnten mit Hilfe der Analyse der Zentralitätswerte des Netzwerkmodells fünf Master-regulatoren identifiziert werden: TGA Transkriptionsfaktor, Jasmonsäure, Ent-Kaurenoate-Oxidase, Ent-kaurene-Synthase und Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase.
Während die ersteren beiden bereits lange als wichtige Regulatoren für die Gib-berellin-Synthese bekannt sind, ist die immunregulatorische Funktion von Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase bisher weitgehend unbekannt.
In physiological conditions platelets have a major role in maintaining haemostasis. Platelets prevent bleeding from wounds by distinguishing normal endothelial cells in vasculature from areas with lesions to which they adhere. Interaction of platelet agonists and their receptors is controlled by intracellular signaling molecules that regulate the activation state of platelets. Very important intracellular signaling molecules are cyclic nucleotides (cGMP and cAMP), both involved in inhibition of platelet activation. Formation of cGMP and cAMP in platelets is stimulated by endothelial-derived NO and prostacyclin (PGI2), which then mediate inhibition of platelets by activating protein kinase G (PKG) and protein kinase A (PKA). Recently, it has been suggested that reactive oxygen species (ROS) represent new modulators of cell signaling within different cell types. The work summarized here describes the involvement of platelet ROS production in platelet activation, the relation of NO/cGMP/PKG I pathway to ROS and to mitogen-activated protein kinases (MAP kinase) signaling, and the involvement of cyclic nucleotides in megakaryocyte and platelet development. Platelets activated with different agonists produce intracellular but not extracellular ROS by activation of NAD(P)H oxidase. In addition, ROS produced in platelets significantly affects αIIbβ3 integrin activation but not alpha/dense granule secretion and platelet shape change. Thrombin induced integrin αIIbβ3 activation is significantly decreased after pretreatment of platelets with NAD(P)H oxidase inhibitors and superoxide scavengers. These inhibitors also reduce platelet aggregation and thrombus formation on collagen under high shear and achieve their effects independently of the NO/cGMP pathway. ADP secreted from platelet dense granules with subsequent activation of P2Y12 receptors as well as thromboxane A2 release are found to be important upstream mediators of p38 MAP kinase activation by thrombin. However, p38 MAP kinase activation does not significantly contribute to calcium mobilization, P-selectin expression, αIIbβ3 integrin activation and aggregation of human platelets in response to thrombin. Finally, PKG activation does not stimulate, but rather inhibit, p38 and ERK MAP kinases in human platelets. Further study revealed that cyclic nucleotides not only inhibit platelet activation, but are also involved, albeit differentially, in megakaryocyte and platelet development. cAMP is engaged in haematopoietic stem cell differentiation to megakaryocytes, and cGMP has no impact on this process. While PKA is already present in stem cells, expression of proteins involved in cGMP signaling (soluble guanylyl cyclase, sGC; PKG) increases with maturation of megakaryocytes. In the final step of megakaryocyte maturation that includes release of platelets, cGMP and cAMP have mild but opposing effects: cGMP increases platelet production while cAMP decreases it indicating a finely regulated process that could depend on stimulus coming from adjacent endothelial cells of sinusoids in bone marrow. The results of this thesis contribute to a better understanding of platelet regulation and of the possible molecular mechanisms involved in megakaryocyte maturation in bone marrow vascular microenvironment.
The Immune system exerts its response against invading pathogens via a cumulative, sequential cooperation of immune cells coordinated by their secreted products. Immune cells, such as macrophages and dendritic cells (DCs), express toll-like receptors (TLRs) to sense the presence of pathogens through pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). The interaction of PAMPs with TLRs elicits a cytosolic signaling cascade that enhances the expression of genes to stimulate inflammation. Interleukin 1 receptor-associated kinase 2 (IRAK2) is a component of the TLR signaling pathway. IRAK2 transduces the TLR signal via a direct interaction with TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6) and subsequent enhancement of its ubiquitination.
During my PhD thesis, I determined that a 55-amino acid long stretch at the C-terminal end of IRAK2 is important for TLR signaling. Overexpression of C-terminal truncated IRAK2 (IRAK2Δ55) in the murine macrophage cell line RAW 264.7 led to impaired CD40 expression after TLR4 stimulation by Lipopolysaccharide (LPS). I observed attenuated competency of IRAK2Δ55 in restoring a full TLR signaling response i.e. IL-6 secretion, NO production and CD40 expression in IRAK2-deficient RAW cells generated via CRISPR-Cas9 approach. Additionally, diminished TLR4 induced activation of nuclear factor κB (NF-κB) and extracellular signal related kinase (ERK) was observed with IRAK2Δ55 reconstituted RAW cells as compared to cell reconstituted with wildtype IRAK2.
IRAK2Δ55 reconstituted RAW cells also exhibited reduced TLR4-induced cell death and phosphorylation of receptor interacting protein kinase 3 (RIP3). Co-immunoprecipitation experiments in HEK 293T cells showed that IRAK2Δ55 was still able to bind to TRAF6 alike IRAK2 but failed to induce ubiquitination of TRAF6. In conclusion, the results suggest that the IRAK2 TRAF6 interaction is not sufficient to sustain full TLR signaling. An C-terminus-dependent unknown molecular mechanism is also involved.
Through my PhD work, I also analyzed a B cell lineage-specific HECTD1 knock-out mice. HECTD1 is an E3 ubiquitin ligase for various substrate proteins, such as heat shock protein 90 (HSP90), adenomatous polyposis coli and phosphatidylinositol phosphate kinase type 1 γ. Hsp90 regulates a variety of signaling molecules in NF-κB activation pathways which are essential for an optimal B cell response.
HECTD1-deficient pro-B cells developed normally into mature B cells. However, TLR4 stimulated HECTD1-deficient B cells displayed reduced immunoglobulin (Ig) production in in vitro cultures. In addition, mice with HECTD1-deficient B cells showed a diminished Ig response after nitrophenylacetyl-keyhole limpet hemocyanin immunization. Thus, HECTD1 is necessary for efficient Ig secretion.
Chronische Drucküberlastung des adulten Herzens führt zu Umbauvorgängen in der Extrazellulärmatrix und zur Hypertrophie der Herzmuskelzellen. Dabei kommt es zur Aktivierung von Integrinrezeptoren und der dadurch induzierten Entstehung des sogenannten fokalen Adhäsionskomplexes im Zytoskelett der Herzmuskelzelle. Dies konnte kürzlich im Modell der rechtsventrikulären Drucküberlastung an der Katze gezeigt werden. (Laser M et al., J. Biol. Chem, 2000). Um zu testen, ob die Integrinaktivierunng und der Umbau des Zytoskeletts im Hypertrophieprozess des linken Ventrikels eine Rolle spielen, wurden ausgewachsene Mäuse (30g Körpergewicht) nach Konstriktion der transversalen Aorta analysiert und mit scheinoperierten Mäusen verglichen. Morphologisch zeigte sich bei den drucküberlasteten Tieren eine signifikante Herzhypertrophie bezogen auf Körpergewicht und Tibialänge innerhalb eines Monats. Keine Unterschiede fanden sich bei der hämodynamischen Charakterisierung für die in vivo gemessene Herzfrequenz, während der systolische Druck und der enddiastolische Druck signifikant erhöht waren. Zur Western Blot-Analyse wurden jeweils eine Detergens-lösliche sowie eine unlösliche Fraktion (Zytoskelett) der Herzen präpariert. Dabei zeigten sich im Zytoskelett verschiedene tyrosinphosphorylierte Proteine bei 160, 125, 75 und 60 kD, beginnend drei Tage nach Drucküberlastung. Zwei dieser Banden konnten wir als Zytoskelett-assoziierte Tyrosinkinasen, „focal adhesion kinase“(Fak) und c-Src, identifizieren, welche beide zum sogenannten Integrin-abhängigen fokalen Adhäsionskomplex gehören. Weitere Analysen zeigten Phosphorylierungen von Fak bei Tyr-397 und Tyr-925, c-Src bei Tyr-418. Dies lässt darauf schließen, dass beide Kinasen aktiviert sind. Aus diesen Daten wird deutlich, dass eine Aktivierung von Integrinrezeptoren und die Formation des fokalen Adhäsionskomplexes auch im Hypertrophieprozess des linken Ventrikels eine Rolle spielen. Um den Einfluss der Integrin-vermittelten Signalwege auf die Entwicklung der Hypertrophie und deren Signaltransduktion weiter zu testen, wurde eine konditionale „knock-out“-Mauslinie (Cre/loxP-System mit MLC-2v-Promotor) etabliert. Bei diesen Mäusen ist das beta.1-Integrin-Gen selektiv im Myokard ausgeschaltet. Die Ergebnisse aus Phänotypisierung und Charakterisierung dieser Mauslinie im Hypertrophieprozess stehen noch aus.
Flagellar motility and chemotaxis are essential virulence traits required for the ability of Helicobacter pylori to colonize the gastric mucosa. The flagellar regulatory network and the complex chemotaxis system of H. pylori are fundamentally different from other bacteria, despite many similarities. In H. pylori expression of the flagella is controlled by a complex regulatory cascade involving the two-component system FlgR-HP244, the sigma factors 54 and 28 and the anti-sigma 28 factor FlgM. Thus far, the input signal for histidine kinase HP244, which activates the transcriptional regulator FlgR, which triggers sigma factor 54-dependent transcription of the flagellar class 2 genes, is not known. Based on a yeast two-hybrid screen a highly significant protein-protein interaction between the H. pylori protein HP137 and both the histidine kinase HP244 and the flagellar hook protein HP908 (FlgE´) has been reported recently (Rain et al., 2001). So far, no function could be assigned to HP137. Interestingly, the interaction between HP137 and histidine kinase HP244 was observed in the characteristic block N sequence motif of the C-terminal ATP-binding kinase domain. In this work a potential role of HP137 in a feedback regulatory mechanism controlling the activity of histidine kinase HP244 in the flagellar regulation of H. pylori was investigated. Although the substitution of the gene encoding HP137 by a kanamycin cassette resulted in non-motile bacteria, the failure to restore motility by the reintroduction of hp137 in cis into the mutant strain, and the observation that HP137 has no significant effect on the activity of histidine kinase HP244 in vitro indicated that HP137 is not directly involved in flagellar regulation. Therefore, it was demonstrated that HP137 does not participate in the regulation of flagellar gene expression, neither in H. pylori nor in the closely related bacterium C. jejuni. Chemotactic signal transduction in H. pylori differs from the enterobacterial paradigm in several respects. In addition to a CheY response regulator protein (CheY1) H. pylori contains a CheY-like receiver domain (CheY2) which is C-terminally fused to the histidine kinase CheA. Furthermore, the genome of H. pylori encodes three CheV proteins consisting of an N-terminal CheW-like domain and a C-terminal receiver domain, while there are no orthologues of the chemotaxis genes cheB, cheR, and cheZ. To obtain insight into the mechanism controlling the chemotactic response of H. pylori the phosphotransfer reactions between the purified two-component signalling modules were investigated in vitro. Using in vitro phosphorylation assays it was shown that both H. pylori histidine kinases CheAY2 and CheA´ lacking the CheY-like domain (CheY2) act as ATP-dependent autokinases. Similar to other CheA proteins CheA´ shows a kinetic of phosphorylation represented by an exponential time course, while the kinetics of phosphorylation of CheAY2 is characterized by a short exponential time course followed by the hydrolysis of CheAY2~P. Therefore, it was demonstrated that the presence of the CheY2-like receiver domain influences the stability of the phosphorylated P1 domain of the CheA part of the bifunctional protein. Furthermore, it was proven that both CheY1 and CheY2 are phosphorylated by CheAY2 and CheA´~P and that the three CheV proteins mediate the dephosphorylation of CheA´~P, although with a clearly reduced efficiency as compared to CheY1 and CheY2. Moreover, CheA´ is capable of donating its phospho group to the CheY1 protein from C. jejuni and to CheY protein from E. coli. Retrophosphorylation experiments indicated that CheY1~P is able to transfer the phosphate group back to the HK CheAY2 and the receiver domain present in the bifunctional CheAY2 protein acts as a phosphate sink fine tuning the activity of the freely diffusible CheY1 protein, which is thought to interact with the flagellar motor. Hence, in this work evidence of a complex phosphorelay in the chemotaxis system was obtained which has similarities to other systems with multiple CheY proteins. The role of the CheV proteins remain unclear at the moment, but they might be engaged in a further fine regulation of the phosphate flow in this complex chemotaxis system and the independent function of the two domains CheA´ and CheY2 is not sufficient for normal chemotactic signalling in vivo.
Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, neuroendokrine Zellen in den Atemwegen bei Mäusen zu untersuchen, welche Kontakt zu sensorischen Nervenfasern ausbilden. In vorangegangenen Versuchen konnte bereits die Menge des ausgeschütteten CGRPs nach Stimulation mit Bitterstoffen bestimmt werden. Die Methode zur Messung der Freisetzung von CGRP aus verschiedenen Organen wurde von Prof. Reeh und seiner Arbeitsgruppe etabliert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, woher das ausgeschüttete CGRP kommt und ob die Stimulation von Bürstenzellen mit Bitterstoffen zur Ausschüttung von CGRP aus den neuroendokrinen Zellen führt. Anhand der elektronenmikroskopischen Auswertung und der dreidimensionalen Rekonstruktion konnte gezeigt werden, dass es Kontakt zwischen den neuroendokrinen Zellen im Epithel der Trachea und sensorischen Nervenfasern gibt. Die immunhistochemischen Versuche zeigten, dass es nach Stimulation mit Denatonium höchstwahrscheinlich zur Ausschüttung von CGRP durch die intraepithelialen Fasern gekommen ist. Diese Annahme spiegelt sich in der veränderten Morphologie sowie der geringeren Quantität der intraepithelialen Fasern nach Stimulation mit Denatonium deutlich wider. Dass es weder bei der Anzahl der neuroendokrinen Zellen, noch bei der Erscheinung und Anzahl der extraepithelialen Fasern nach Denatoniumstimulation zu einer Veränderung gekommen ist, unterstützt diese Annahme ebenfalls. Im Hinblick auf die durchgeführten Versuche mit den TRPM5-gendefizienten Mäusen zeigte sich, dass die Stimulation mit Denatonium keine Auswirkungen auf die Anzahl der neuroendokrinen Zellen hatte. Dieses Ergebnis unterstützt die Erkenntnisse der vorangegangenen Untersuchungen, welche gezeigt haben, dass das CGRP nicht von den neuroendokrinen Zellen ausgeschüttet wurde. Des Weiteren lässt das Ergebnis darauf schließen, dass die Ausschüttung von CGRP nicht abhängig von der Anwesenheit von Bürstenzellen ist. Insgesamt zeigen die Untersuchungen, dass es nach Stimulation mit Bittersubstanzen zu einer CGRP-Ausschüttung durch die intraepithelialen Fasern gekommen ist. Interessant wäre es weiterhin zu klären, welche Effekte diese Ausschüttung bewirkt und welche Bedeutung der Freisetzung von Substanz P in diesem Zusammenhang zukommt.
Activation of mitogen-activated protein (MAP) kinases is a common reaction of plant cells in defense-related signal transduction pathways. Since the downstream events after the activation of MAP kinases are largely unknown in plants, the role of MAP kinases in the co-ordinate regulation of defense reactions and primary carbon metabolism by stress related stimuli has been analyzed in tomato. Thus, the relationship between mitogen activated protein kinases (LpMPK2 and LpMPK3) and extracellular invertases Lin6, as the key enzyme of an apoplasmic phloem unloading pathway, has been analyzed. The results showed that the mRNAs of LpMPK3 and Lin6 are sequentially induced by the same set of stress related stimuli (E-Fol, PGA,wounding, and KCl). The induction of the Lin6 promotor, as revealed by an increase in β-glucuronidase activity after 2 hours, was dependent both on the expression and activation of LpMPK3. These data suggest that the induction of extracellular invertase Lin6 by stress related stimuli requires LpMPK3. Glucose, metabolic molecule, was shown to result in the simultaneous induction of AtMPK4 and AtMPK6 activities that could be separated by anion-exchange chromatography, and characterized by differential cross-reaction with MAP kinase antibodies. Taken together, these data suggest that the activation of MAP inases play central roles in the regulation of sugar signaling. Stomatal movement is controlled by environmental signals including light intensity,humidity and atmospheric CO2 level. In Arabidopsis, a complete MAP kinase signaling cascade regulates stomatal development and patterning. However, the movement of stomata mediated by CO2 induced signaling pathways is not fully studied in higher plants. Here, we show that elevated levels of CO2 induce rapid and transient activation of SIPK and NtMPK4. The activation of both MAP kinases may regulate the anion channel activation for stomatal movement by the elevated level CO2. Up to now, the non-antioxidant function of tocopherol is not clear in higher plant,whereas the ability of tocopherol to modulate the stress tolerance mediated by function of antioxidant has been described in numerous studies. Thus, the function of α-tocopherol in stimuli-induced signal transduction pathways mediated by MAP kinase has been analyzed in tobacco. It has been shown that the activation of MAP kinase was induced by treatment of fungal elicitor and α-tocopherol phosphate but not α-tocopherol. Interestingly, α-tocopherol showed the transient inhibitory effect on the activation of stimuli-induced MAP Kinases in BY2 cells and tobacco plants, whereas ascorbate did not inhibit the activation of MAP kinases. The inhibitory activity test indicated that current application may indirectly affect the activity of MAP kinases. These results suggest that α-tocopherol can negatively regulate stimuliinduced signal transduction pathways via inactivation of MAP kinases. The purine-analogues have been tested and reported to be specific inhibitors of protein kinases mediated by structural-based selectivity in mammalian. Here, we tested C2, N6, N9-trisubstituted purines to determine basic relationship between their chemical structure and inhibitory activity using a particular plant MAP kinase. The modification of substitution in position C2 and N9 caused the increased inhibitory activity of 6-(benzylamino) purine analogue. In addition, 6-(isopentenylamino) purine analogues suggested that addition of a methyl group to position N9 caused at least 2-fold increased inhibitory activity compared with the addition of isopropyl group.Taken together, our study suggests that the selectivity and potency of inhibitors can be improved by structure modification. In addition, we have characterized the physiological function of Arabidopsis thaliana PLAT domain protein 1 (AtPDP1) in modulating the interaction of defense pathways mediated by biotic and abiotic factors. Interestingly, overexpression of AtPDP1 resulted in increasing susceptibility of virulent pathogens and necrotrophic fungus, and developing necrosis induced by unknown biotic factors. However, these overexperssion lines showed the significantly delayed senescence and higher level of phosystem II quantum yield compared with control plants against high salt stress. Our results strongly indicate that AtPDP1 positively regulate with salt tolerance, and enhances the sensitivity to biotic stresses. We propose that the AtPDP1 might be regulated with the complex pathways of interplay among various signaling during stress adaptation.
Plants have evolved an elaborate system to cope with a variety of biotic and abiotic stresses. Typically, under stress conditions an appropriate defense response is invoked which is accompanied by changes in the metabolic status of the plant. Photosynthesis is downregulated and sucrose is imported into the tissue, which provides a faster and more constant flux of energy and carbon skeletons to perform the defense response. Interestingly, these processes are co-ordinately regulated and the signal transduction chains underlying these cellular programs appear to share at least some common elements. Both the induction of sink metabolism and defense response is dependent on signal transduction pathways involving protein phosphorylation. Furthermore, regulation of extracellular invertase (INV) and phenylalanine ammonia lyase (PAL) which are markers for sink metabolism and defense response is preceded by the transient activation of MAP kinases. In depth analysis of MAP kinase activation by partial purification led to the discovery that, depending on the stimulus, different subsets of MAP kinases are activated. This differential MAPK activation is likely to possess a signal encoding function. In addition, the partial purification of MAP kinases was found to be suitable to address specific cellular functions to individual MAP kinase isoenzymes. By this way, LpWIPK was identified as the major MAP kinase activity induced after stimulation of tomato cells with different elicitors. LpWIPK is thus considered as a key regulator of defense response together with sink induction in tomato. A study using nonmetabolisable sucrose analogs revealed that the regulation of photosynthesis is not directly coupled to this signal transduction pathway since it is independent of MAP kinase activation. Nonetheless, downregulation is induced by the same stimuli that induce the defense response and sink metabolism and it will therefore be interesting to uncover the branch points of this signalling network in the future. MAP kinases are not only central components regulating the response to biotic stresses. In addition to e.g. pathogens, MAP kinases are as well involved in signal transduction events invoked by abiotic stresses like cold and drought. In a recent study, we could show that a MAP kinase is activated by heat stress, under conditions a plant will encounter in nature. This previously unknown MAP kinase is able to specifically recognise the heat stress transcription factor HsfA3 as a substrate, which supports a role of this MAP kinase in the regulation of the heat stress response. Moreover, the observation that HsfA3 is phosphorylated by the heat activated MAP kinase in vitro provides a promising basis to identify HsfA3 as the first physiological substrate of a plant MAP kinase. Intracellular protons have been implicated in the signal transduction of defense related signals. In a study using Chenopodium rubrum cells, we could show that cytosolic changes in pH values do not precede the regulation of the marker genes INV and PAL. Depending on the stimulus applied, cytosolic acidification or alkalinisation can be observed, which excludes a role for protons as signals in this pathway. Together with the concomitant changes of the pH value of the extracellular space, these variations can thus be considered as terminal part of the defense response itself rather than as a second messenger. WRKY transcription factors have only recently been identified as indirect targets of a central plant MAP kinase cascade. In addition, the identification of cognate binding sites in the promoters of INV and PAL supports a role for these proteins in the co-ordinate regulation of defense response and sink induction. A novel elicitor responsive WRKY transcription factor, LpWRKY1, was cloned from tomato and characterised with respect to its posttranslational modification. This immediate early transcription factor is transiently induced upon pathogen attack and the induction is dependent on phosphorylation. Furthermore, it was shown for the first time with respect to WRKY transcription factors, that LpWRKY1 is phosphorylated in vivo. Analysis of the role of this phosphorylation by in gel assays using recombinant WRKY protein as the substrate revealed two protein kinases that are transiently activated during the defense response to phosphorylate LpWRKY1. This data demonstrates that WRKY proteins require phosphorylation to modulate their DNA binding or transactivating activity.
Zur Durchführung peripherer Nervenblockaden werden im klinischen Alltag nichtselektive Lokalanästhetika verwendet, die neben sensorischen auch motorische Nervenfasern blockieren. Diese Arbeit untersucht und beschreibt Grundlagen für die Verwendung selektiv wirksamer Co-Analgetika. Ziel dieser Arbeit war in diesem Kontext die Analyse der intrazellulären Signalwege, welche nach Applikation von rtPA am peripheren Nerven zur Öffnung der perineuralen Barriere und so zu einer opiat- vermittelten Analgesie führen. Gemäß unserer Hypothese bindet rtPA an den LRP-1- Rezeptor und löst eine intrazelluläre Signalkaskade aus: Erk wird phosphoryliert und inhibiert über bislang unklare Mechanismen die Claudin-1-Transkription. Claudin-1 wird weniger in die Zellmembran eingebaut und/oder verlässt durch Endozytose/ Internalisierung die Zellmembran, was zur Öffnung der perineuralen Barriere führt und den Durchtritt selektiv wirksamer Analgetika erlaubt. In der späteren Phase steht die Analyse der Wiederherstellung der Barrierefunktion der Zellmembran im Vordergrund. Die ist von zentraler Bedeutung um eine Schädigung des Nervens durch das Umgebungsmilieu zu verhindern. Vermutlich wird die Wiederherstellung der Barrierefunktion über den Wnt-Signalweg gesteuert. Die Akkumulation von b-Catenin und Cdx2 führt zu einem erneuten Anstieg der Claudin-1-Transkription. Der Claudin-1- Gehalt steigt in Western Blot-Untersuchungen jedoch bereits zu einem früheren Zeitpunkt in der Zellmembran wieder an. Dies legt nahe, dass weitere von der Transkription unabhängige Mechanismen zur Wiederherstellung der Barrierefunktion beitragen. Eine mögliche Alternative zu rtPA stellt katalytisch inaktives rtPAi dar, welches in Untersuchungen ähnliche Ergebnisse wie rtPA zeigte. Dabei könnte die Verwendung von rtPAi anstatt rtPA pathophysiologisch denkbare Komplikationen wie beispielsweise Blutungen verhindern.
In Versuchen anderer Mitglieder der Arbeitsgruppe wurde die Öffnung der perineuralen Barriere mittels immunhistochemischer und funktioneller Untersuchungen bestätigt. Auch konnten keine akute Neurotoxizität oder Blutungsgefahr beobachtet werden. Somit stellt rtPA in Kombination mit Opioiden eine mögliche Alternative zur Verbesserung der postoperativen Analgesie dar, die jedoch weiterer Untersuchungen hinsichtlich von Nutzen, Risiken und Nebenwirkungen bedarf.
Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden zusammen mit den Activinen, Growth and Differentiation Factors (GDFs) und Transforming Growth Factor β (TGF-β) die Transforming Growth Factor β-Superfamilie von sekretierten Signalproteinen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Erhaltung und Regeneration von Geweben und Organen. Die Signalvermittlung dieser Proteine erfolgt durch die Bindung von zwei verschiedenen Typen von Serin-/Threonin-Kinaserezeptoren, die als Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren bezeichnet werden. Im ersten Schritt erfolgt die Bindung an den hochaffinen Rezeptor (im Fall von BMP-2 der Typ-I-Rezeptor), im nächsten Schritt wird der niederaffine Rezeptor in den Komplex rekrutiert. Bis heute sind lediglich sieben Typ-I- und fünf Typ-II-Rezeptoren bekannt, was auf eine Promiskuität in der Liganden-Rezeptor-Interaktion schließen lässt. Die Architektur beider Rezeptorsubtypen ist dabei relativ ähnlich. Beide bestehen aus einer ligandenbindenden extrazellulären Domäne, einer Transmembrandomäne sowie einer intrazellulären Kinasedomäne. Eine nacheinander ablaufende Transphosphorylierung der intrazellulären Domänen führt zu einer Phosphorylierung von SMAD-Proteinen, die dann als nachgeschaltete Vermittler fungieren und die Transkription regulierter Gene auslösen. Im Hauptteil dieser Arbeit wurden die initialen Schritte der Rezeptorkomplexformierung sowie die Mobilität der Rezeptoren mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass für die Bildung eines Signalkomplexes eine bestimmte Schwellenkonzentration des Liganden nötig ist und dass der Mechanismus nach einem Alles-oder-Nichts-Prinzip wie ein Schalter funktioniert. Außerdem konnten Unterschiede in der Nutzung der gleichen Rezeptoren durch verschiedene Liganden festgestellt werden. Die anderen Teile der Arbeit befassen sich mit der Funktionalität der verschiedenen Rezeptordomänen in der Signalübermittlung, der Analyse von hoch- und niederaffinen Ligandenbindestellen auf ganzen Zellen sowie dem Einfluss des SMAD- und des MAPK-Signalwegs auf die Induktion der Alkalischen Phosphatase. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Art der SMAD-Phosphorylierung allein vom Typ der Kinasedomäne abhängig ist, dass auf einer Zelle verschiedene Rezeptorpopulationen existieren, welche von unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen angesprochen werden, und dass die Induktion der Alkalischen Phosphatase stark vom zeitlichen Verlauf der SMAD- und MAPK-Aktivierung abhängig ist.
In der vorliegenden Dissertation gelang es, die strukturellen und molekularen Determinanten der PTH-Rezeptoren für die Ankopplung an intrazelluläre Signalwege näher zu charakterisieren. Die Regulation des Kalzium-, Phosphat- und Knochenstoffwechsels wird zum erheblichen Teil über den PTH1-Rezeptor (P1R) vermittelt. Parathormon (PTH) aktiviert am P1R mindestens zwei Signalwege: den durch zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) vermittelten Weg und den Phospholipase C-Signalweg (PLC). Der nahe verwandte PTH2-Rezeptor (P2R) kann außer durch PTH auch über das tuberoinfundibiläre Peptid (TIP39) aktiviert werden. Jedoch besitzt dieser Rezeptor keine Ankopplung an den PLC-Signalweg. Zur Aufklärung der strukturellen und molekularen Determinaten der intrazellulären Signalwegankopplung wurden verschiedene Versuchsansätze ausgewählt, die eine Untergliederung dieser Arbeit in drei Teilprojekte ermöglicht: 1) Die PTH-Rezeptoren sind wichtige Vertreter der Klasse II der G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der siebten Transmembrandomäne dieser Klasse zeigt ein hoch konserviertes, cytosolnahes „YCFXN“-Motiv in diesem Bereich. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte durch Punktmutationen der einzelnen Aminosäuren dieses Motivs gezeigt werden, dass dieser Abschnitt eine entscheidende Determinierungsregion dieser Rezeptorfamilie sowohl für die Ankopplung an den cAMP-Weg, als auch an den PLC-Signalweg darstellt. Die Untersuchungen legen die Vermutung nahe, dass dieser Bereich für die Stabilisierung der Konformation dieser Rezeptoren von großer Bedeutung ist. 2) In einem zweiten Abschnitt dieser Arbeit wurde durch stufenweise Angleichung des P2R an den P1R eine Reihe von funktionell exprimierten P2R/P1R Hybridrezeptoren hergestellt, die eine Übereinstimmung des intrazellulären Bereichs des P1R von bis zu 95 % erreichen. Der Nachweis des PLC-Signalwegs durch die Bestimmung der akkumulierten Gesamtinositolphosphate und des intrazellulären Kalziums zeigte eindrucksvoll, dass trotz einer weitgehenden intrazellulären Übereinstimmung der Aminosäuresequenz des P2R mit dem P1R die Eigenschaft des P1R an den PLC-Signalweg zu koppeln nicht auf den P2R übertragen werden kann. Dies legt nahe, dass auch extrazelluläre Bereiche und Transmembranabschnitte die Ankopplung an intrazelluläre Signalwege steuern. Im Weiteren konnte für den cAMP-Signalweg durch diese Hybridrezeptoren gezeigt werden, dass im Kontext des P2R eingefügte Teilabschnitte des P1R (C-Terminus, zweite und dritte intrazelluläre Schleife ) zusammenwirken und eine effizientere Ankopplung an den cAMP-Weg ermöglichen. Weiterführende Untersuchungen der Membrantranslokation von beta Arrestin2 mit einer anschließenden Internalisierung des Rezeptors zeigten, dass sowohl der P2R als auch die hiervon abgeleiteten Hybridrezeptoren selektiv durch Stimulation mit TIP39, nicht jedoch nach einer Stimulation mit PTH, eine Translokation bewirken. Dieses Ereignis ist von den untersuchten Signalwegen (cAMP-, PLC- und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-Signalweg) unabhängig. Erstmals wurde hier gezeigt, dass der P2R eine Phosphorilierung von MAPK bewirkt, wobei hierfür einer beta-Arrestin2 Translokation nicht notwendig ist. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass der PTH-Rezeptor in unterschiedlichen Rezeptorkonformationen existiert, so dass einzelne Rezeptorabschnitte unabhängig voneinander verschiedene Signale aktivieren können. 3) Der letzte Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Identifikation von intrazellulären Interaktionspartnern des humanen P1R. Neue Protein–Interaktionen mit dem humanen P1R wurden mit einem „Yeast-two-Hybrid“ System identifiziert. Mit Hilfe dieser Methode konnte, als ein potentiell bedeutender intrazellulärer Interaktionspartner des humanen P1R, das PDZ-Protein PDZK1 identifiziert werden. Es gelang mit Hilfe von Koimmunpräzipitations-Experimenten und von GST-pull-down-Assays die Interaktion von PDZK1 mit dem P1R zu verifizieren. PDZK1 bindet an eine Liganden-Bindungsdomäne innerhalb des C-terminalen Abschnitts des P1R, vermutlich an die letzten vier Aminosäuren. Durch einen Hefe-Interaktionstest konnte von den vier in diesem Protein vorkommenden PDZ-Domänen die PDZ1-Domäne als einzige selektiv mit dem P1R interagierende Domäne identifiziert werden. In der Niere interagiert PDZK1 über die PDZ3-Domäne mit dem Na/Pi-Transporter IIa. Eine attraktive Hypothese ist daher die Funktion von PDZK1 als einem Bindeglied zwischem dem Rezeptor und dem Transporter und die damit einhergehende PTH- vermittelte Regulation des Phosphattransports in der Niere. Diese Hypothese bedarf aber nochweiterer funktioneller Analysen (z.B. durch Untersuchungen an PDZK1 Knock-Out Mäusen).
Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury is critical to prevent excessive blood loss, but may also lead to life-threatening ischemic diseases, such as myocardial infarction and stroke. Extracellular agonists induce platelet activation by stimulation of platelet membrane receptors. Signal transduction results in reorganization of the cytoskeleton, shape change, platelet adhesion and aggregation, cumulating in thrombus formation. Several Rho GTPases, including Rac1, Cdc42 and RhoA, are essential mediators of subsequent intracellular transduction of ITAM- and GPCR-signaling. Therefore, inhibition or knockout can result in severely defective platelet signaling.
Mice with platelet specific Rac1-deficiency are protected from arterial thrombosis. This benefit highlights further investigation of Rac1-specific functions and its potential as a new pharmacological target for prevention of cardiovascular diseases. Two newly developed synthetic compounds, NSC23766 and EHT1864, were proposed to provide highly specific inhibition of Rac1 activity, but both drugs have never been tested in Rac1-deficient cell systems to rule out potential Rac1-independent effects.
This study revealed significant off-target effects of NSC23766 and EHT1864 that occurred in a dose-dependent fashion in both wild-type and Rac1-deficient platelets. Both inhibitors individually affected resting platelets after treatment, either by altering membrane protein expression (NSC23766) or by a marked decrease of platelet viability (EHT1864). Platelet apoptosis could be confirmed by enhanced levels of phosphatidylserine exposure and decreased mitochondrial membrane potential. Phosphorylation studies of the major effector proteins of Rac1 revealed that NSC23766 and EHT1864 abolish PAK1/PAK2 activation independently of Rac1 in wild-type and knockout platelets, which may contribute to the observed off-target effects.
Additionally, this study demonstrated the involvement of Rac1 in G protein-coupled receptor-mediated platelet activation and GPIb-induced signaling. Furthermore, the data revealed that Rac1 is dispensable in the process of integrin IIb 3-mediated clot retraction.
This study unveiled that new pharmacological approaches in antithrombotic therapy with Rac1 as molecular target have to be designed carefully in order to obtain high specificity and minimize potential off-target effects.
BMPs influence a variety of cellular processes. They have been shown to regulate proliferation, differentiation, migration and apoptosis and thus play central roles during developmental processes and tissue homeostasis. Ligand mediated signal transduction is transmitted via BMP type I and BMP type II receptors, both members of the serine/threonine kinase superfamily. The BMP receptor mediated signal transduction is not explored in detail. Therefore our aim was to address different aspects of BMP mediated signal transduction with main focus on BRII and its regulation. Due to the existence of two alternative splice variants, a long and a short form, the function of the two variants and the impact of the C-terminal extension are of general interest. Moreover, mutations in the BMPR2 gene were identified to be responsible for PPH, a autosomal dominant lung disease. In this thesis, BRII phosphorylation and signalling mediated by different receptor oligomers were investigated and multiple BRII associated proteins were identified. We could show that the oligomerization pattern of BMP receptors exhibits a higher degree of flexibility compared to other receptors of that superfamily. In the present work the BMP2 mediated signal transduction should be examined, depending on the receptor oligomerization pattern. Using kinase-deficient mutants, it could be demonstrated, that signalling via preformed BMP receptor complexes is mediated by the well characterized Smad1/5/8 pathway, whereas signalling initiated by BMP2 induced recruitment of the receptors activates the p38 pathway and leads to Alkaline Phosphatase production. To further study signalling events triggered directly from the BRII a proteomics-based screen for BRII associated proteins was performed. 53 associated proteins were found, the majority being signal transducing molecules, but in addition metabolic proteins, transcriptional regulators and others were identified. These proteins enable to gain a deeper insight in BMP mediated signalling. One of the interactors, the receptor tyrosine kinase c-kit, was characterized in more detail. It could be demonstrated, that BRII and c-kit form a complex in vitro and in vivo, and the interaction is enhanced upon BMP2 stimulation. 2D phosphopeptid mapping showed that BRII is phosphorylated at S757 upon activation of c-kit by SCF. Moreover, c-kit and its ligand SCF are modulating BMP2 pathways, by enhancing Smad1/5 phosphorylation, Smad-transcriptional activity, Alkaline Phosphatase production and expression of Cbfa1. All these pathways hint towards modulation of the osteoblast development via c-kit. Thus, we were able to develop a novel paradigm for the BMP2 meditated signalling. One of the initial triggers for BRII is the auto-phosphorylation of BRII. Here we analyze ligand-independent as well as ligand-dependent phosphorylation of BRII. Some phosphorylation sites in BRII were identified. The general phosphorylation occurs mostly on serines. S815, S818 and Y825 are identified targets of phosphorylation whose function is still unclear. However phosphorylation of S336 is demonstrated to be essential for BRII activation. The elucidation of BMP receptor phosphorylation and oligomerization as well as the impact of a number of BRII associated proteins (such as c-kit), demonstrated in this thesis that BMP signalling has to be regulated precisely on multiple levels. This can be useful for the development of selective signalling inhibitors for basic research and therapeutic approaches of PPH and other diseases.