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Sonstige beteiligte Institutionen
- DNA Analytics Core Facility, Biocenter, University of Würzburg, Würzburg, Germany (1)
- Department of Animal Ecology and Tropical Biology, University of Würzburg, Würzburg, Germany (1)
- Forschungsstation Fabrikschleichach (1)
- Institut für Tierökologie und Tropenbiologie (1)
- Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (ZIKF), Würzburg (1)
- Klinische Mikrobiologie am Universitätsklinikum Erlangen (1)
- Technische Hochschule Wildau (1)
In contrast to c-Myc, a deregulated expression of the MYCN gene is restricted to human neuroendocrine tumours. In most cases, the excessive activity of N-Myc results from a MYCN amplification. In neuroblastoma, amplification of MYCN is a predictor of poor prognosis and resistance to therapy. The inability to target the N-Myc protein directly necessitates the search for alternative targets. This project aimed at identifying genes specifically required for growth and survival of cells that express high levels of N-Myc using high-throughput shRNA screening combined with next generation sequencing. The identification and analysis of these genes will shed light on functional interaction partners of N-Myc.
We screened a shRNA library containing 18,327 shRNAs and identified 148 shRNAs, which were selectively depleted in the presence of active N-Myc. In addition, shRNAs targeting genes that are involved in p53 and ARF turnover and apoptosis were depleted in the cell population during the screen. These processes are known to affect N-Myc-mediated apoptosis. Consequently, these results biologically validated the screen. The 148 shRNAs that showed a significant synthetic lethal interaction with high levels of N-Myc expression were further analysed using the bioinformatics program DAVID. We found an enrichment of shRNAs that target genes involved in specific biological processes. For example, we validated synthetic lethal interactions for genes such as, THOC1, NUP153 and LARP7, which play an important role in the process of RNA polymerase II-mediated transcription elongation. We also validated genes that are involved in the neddylation pathway.
In the screen we identified Cullin 3, which is a component of the BTB-CUL3-Rbx1 ubiquitin ligase that is involved in the turnover of Cyclin E. Depletion of cullin 3 and activation of N-Myc was found to synergistically increase Cyclin E expression to supraphysiological levels, inducing S-phase arrest and a strong DNA damage response.
Together with results from a proteomics analysis of N-Myc associated proteins, our results lead us to the following hypothesis: In a neuroblastoma cell, the high levels of N-Myc result in a conflict between RNA polymerase II and the replication machinery during S-phase. The newly identified interaction partners of N- Myc are required to solve this conflict. Consequently, loss of the interaction leads to a massive DNA damage and the induction of apoptosis. In addition, inhibition or depletion of the essential components of the neddylation pathway also results in an unresolvable problem during S-phase.
Background: Teleost fish present a high diversity of sex determination systems, with possible frequent evolutionary turnover of sex chromosomes and sex-determining genes. In order to identify genes involved in male sex determination and differentiation in the platyfish Xiphophorus maculatus, bacterial artificial chromosome contigs from the sex-determining region differentiating the Y from the X chromosome have been assembled and analyzed.
Results: A novel three-copy gene called teximY (for testis-expressed in Xiphophorus maculatus on the Y) was identified on the Y but not on the X chromosome. A highly related sequence called texim1, probably at the origin of the Y-linked genes, as well as three more divergent texim genes were detected in (pseudo) autosomal regions of the platyfish genome. Texim genes, for which no functional data are available so far in any organism, encode predicted esterases/lipases with a SGNH hydrolase domain. Texim proteins are related to proteins from very different origins, including proteins encoded by animal CR1 retrotransposons, animal platelet-activating factor acetylhydrolases (PAFah) and bacterial hydrolases. Texim gene distribution is patchy in animals. Texim sequences were detected in several fish species including killifish, medaka, pufferfish, sea bass, cod and gar, but not in zebrafish. Texim-like genes are also present in Oikopleura (urochordate), Amphioxus (cephalochordate) and sea urchin (echinoderm) but absent from mammals and other tetrapods. Interestingly, texim genes are associated with a Helitron transposon in different fish species but not in urochordates, cephalochordates and echinoderms, suggesting capture and mobilization of an ancestral texim gene in the bony fish lineage. RT-qPCR analyses showed that Y-linked teximY genes are preferentially expressed in testis, with expression at late stages of spermatogenesis (late spermatids and spermatozeugmata).
Conclusions: These observations suggest either that TeximY proteins play a role in Helitron transposition in the male germ line in fish, or that texim genes are spermatogenesis genes mobilized and spread by transposable elements in fish genomes.
Nasal colonization is a major risk factor for S. aureus infections. The mechanisms responsible for colonization are still not well understood and involve several factors on the host and the bacterial side. One key factor is the cell wall teichoic acid (WTA) of S. aureus, which governs direct interactions with nasal epithelial surfaces. We report here the first receptor for the cell wall glycopolymer WTA on nasal epithelial cells. In several assay systems this type F-scavenger receptor, termed SREC-I, bound WTA in a charge dependent manner and mediated adhesion to nasal epithelial cells in vitro. The impact of WTA and SREC-I interaction on epithelial adhesion was especially pronounced under shear stress, which resembles the conditions found in the nasal cavity. Most importantly, we demonstrate here a key role of the WTA-receptor interaction in a cotton rat model of nasal colonization. When we inhibited WTA mediated adhesion with a SREC-I antibody, nasal colonization in the animal model was strongly reduced at the early onset of colonization. More importantly, colonization stayed low over an extended period of 6 days. Therefore we propose targeting of this glycopolymer-receptor interaction as a novel strategy to prevent or control S. aureus nasal colonization.
Mitochondrial structure and function is emerging as a major contributor to neuromuscular disease, highlighting the need for the complete elucidation of the underlying molecular and pathophysiological mechanisms. Following a forward genetics approach with N-ethyl-N-nitrosourea (ENU)-mediated random mutagenesis, we identified a novel mouse model of autosomal recessive neuromuscular disease caused by a splice-site hypomorphic mutation in a novel gene of unknown function, DnaJC11. Recent findings have demonstrated that DNAJC11 protein co-immunoprecipitates with proteins of the mitochondrial contact site (MICOS) complex involved in the formation of mitochondrial cristae and cristae junctions. Homozygous mutant mice developed locomotion defects, muscle weakness, spasticity, limb tremor, leucopenia, thymic and splenic hypoplasia, general wasting and early lethality. Neuropathological analysis showed severe vacuolation of the motor neurons in the spinal cord, originating from dilatations of the endoplasmic reticulum and notably from mitochondria that had lost their proper inner membrane organization. The causal role of the identified mutation in DnaJC11 was verified in rescue experiments by overexpressing the human ortholog. The full length 63 kDa isoform of human DNAJC11 was shown to localize in the periphery of the mitochondrial outer membrane whereas putative additional isoforms displayed differential submitochondrial localization. Moreover, we showed that DNAJC11 is assembled in a high molecular weight complex, similarly to mitofilin and that downregulation of mitofilin or SAM50 affected the levels of DNAJC11 in HeLa cells. Our findings provide the first mouse mutant for a putative MICOS protein and establish a link between DNAJC11 and neuromuscular diseases.
Agricultural Policies Exacerbate Honeybee Pollination Service Supply-Demand Mismatches Across Europe
(2014)
Declines in insect pollinators across Europe have raised concerns about the supply of pollination services to agriculture. Simultaneously, EU agricultural and biofuel policies have encouraged substantial growth in the cultivated area of insect pollinated crops across the continent. Using data from 41 European countries, this study demonstrates that the recommended number of honeybees required to provide crop pollination across Europe has risen 4.9 times as fast as honeybee stocks between 2005 and 2010. Consequently, honeybee stocks were insufficient to supply >90% of demands in 22 countries studied. These findings raise concerns about the capacity of many countries to cope with major losses of wild pollinators and highlight numerous critical gaps in current understanding of pollination service supplies and demands, pointing to a pressing need for further research into this issue.
Autoimmune myositis encompasses various myositis-overlap syndromes, each being identified by the presence of serum marker autoantibodies. We describe a novel myositis-overlap syndrome in 4 patients characterized by the presence of a unique immunologic marker, autoantibodies to nuclear pore complexes. The clinical phenotype was characterized by prominent myositis in association with erosive, anti-CCP, and rheumatoid factor-positive arthritis, trigeminal neuralgia, mild interstitial lung disease, Raynaud phenomenon, and weight loss. The myositis was typically chronic, relapsing, and refractory to corticosteroids alone, but remitted with the addition of a second immuno-modulating drug. There was no clinical or laboratory evidence for liver disease. The prognosis was good with 100% long-term survival (mean follow-up 19.5 yr). By indirect immunofluorescence on HEp-2 cells, sera from all 4 patients displayed a high titer of antinuclear autoantibodies (ANA) with a distinct punctate peripheral (rim) fluorescent pattern of the nuclear envelope characteristic of nuclear pore complexes. Reactivity with nuclear pore complexes was confirmed by immunoelectron microscopy. In a cohort of 100 French Canadian patients with autoimmune myositis, the nuclear pore complex fluorescent ANA pattern was restricted to these 4 patients (4%). It was not observed in sera from 393 adult patients with systemic sclerosis (n = 112), mixed connective tissue disease (n = 35), systemic lupus (n = 94), rheumatoid arthritis (n = 45), or other rheumatic diseases (n = 107), nor was it observed in 62 normal adults. Autoantibodies to nuclear pore complexes were predominantly of IgG isotype. No other IgG autoantibody markers for defined connective tissue diseases or overlap syndromes were present, indicating a selective and highly focused immune response. In 3 patients, anti-nuclear pore complex autoantibody titers varied in parallel with myositis activity, suggesting a pathogenic link to pathophysiology. The nuclear pore complex proteins, that is, nucleoporins (nup), recognized by these sera were heterogeneous and included Nup358/RanBP2 (n = 2 patients), Nup90 (n = 1), Nup62 (n = 1), and gp210 (n = 1). Taken together the data suggest that nup autoantigens themselves drive the anti-nup autoimmune response. Immunogenetically, the 4 patients shared the DQA1*0501 allele associated with an increased risk for autoimmune myositis. In conclusion, we report an apparent novel subset of autoimmune myositis in our population of French Canadian patients with connective tissue diseases. This syndrome is recognized by the presence of a unique immunologic marker, autoantibodies to nuclear pore complexes that react with nups, consistent with an "anti-nupsyndrome.''
LINC complexes are evolutionarily conserved nuclear envelope bridges, composed of SUN (Sad-1/UNC-84) and KASH (Klarsicht/ANC-1/Syne/homology) domain proteins. They are crucial for nuclear positioning and nuclear shape determination, and also mediate nuclear envelope (NE) attachment of meiotic telomeres, essential for driving homolog synapsis and recombination. In mice, SUN1 and SUN2 are the only SUN domain proteins expressed during meiosis, sharing their localization with meiosis-specific KASH5. Recent studies have shown that loss of SUN1 severely interferes with meiotic processes. Absence of SUN1 provokes defective telomere attachment and causes infertility. Here, we report that meiotic telomere attachment is not entirely lost in mice deficient for SUN1, but numerous telomeres are still attached to the NE through SUN2/KASH5-LINC complexes. In Sun12/2 meiocytes attached telomeres retained the capacity to form bouquetlike clusters. Furthermore, we could detect significant numbers of late meiotic recombination events in Sun12/2 mice. Together, this indicates that even in the absence of SUN1 telomere attachment and their movement within the nuclear envelope per se can be functional.
Author summary:
Correct genome haploidization during meiosis requires tightly regulated chromosome movements that follow a highly conserved choreography during prophase I. Errors in these movements cause subsequent meiotic defects, which typically lead to infertility. At the beginning of meiotic prophase, chromosome ends are tethered to the nuclear envelope (NE). This attachment of telomeres appears to be mediated by well-conserved membrane spanning protein complexes within the NE (LINC complexes). In mouse meiosis, the two main LINC components SUN1 and SUN2 were independently described to localize at the sites of telomere attachment. While SUN1 has been demonstrated to be critical for meiotic telomere attachment, the precise role of SUN2 in this context, however, has been discussed controversially in the field. Our current study was targeted to determine the factual capacity of SUN2 in telomere attachment and chromosome movements in SUN1 deficient mice. Remarkably, although telomere attachment is impaired in the absence of SUN1, we could find a yet undescribed SUN1-independent telomere attachment, which presumably is mediated by SUN2 and KASH5. This SUN2 mediated telomere attachment is stable throughout prophase I and functional in moving telomeres within the NE. Thus, our results clearly indicate that SUN1 and SUN2, at least partially, fulfill redundant meiotic functions.
Arboreal spiders in deciduous and coniferous trees were investigated on their distribution and diversity. Insecticidal knock-down was used to comprehensively sample spiders from 175 trees from 2001 to 2003 in the Białowieża forest and three remote forests in Poland. We identified 140 species from 9273 adult spiders. Spider communities were distinguished between deciduous and coniferous trees. The richest fauna was collected from Quercus where beta diversity was also highest. A tree-species-specific pattern was clearly observed for Alnus, Carpinus, Picea and Pinus trees and also for those tree species that were fogged in only four or three replicates, namely Betula and Populus. This hitherto unrecognised association was mainly due to the community composition of common species identified in a Dufrene-Legendre indicator species analysis. It was not caused by spatial or temporal autocorrelation. Explaining tree-species specificity for generalist predators like spiders is difficult and has to involve physical and ecological tree parameters like linkage with the abundance of prey species. However, neither did we find a consistent correlation of prey group abundances with spiders nor could differences in spider guild composition explain the observed pattern. Our results hint towards the importance of deterministic mechanisms structuring communities of generalist canopy spiders although the casual relationship is not yet understood.
Zentrales Ziel dieser Arbeit war es, Methoden der Mikroskopie, Bildverarbeitung und Bilderkennung für die Charakterisierungen verschiedener Phyotplankter zu nutzen, um deren Analyse zu verbessern und zu vereinfachen.
Der erste Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Analyse von Phytoplanktongemeinschaften, die im Rahmen der Überprüfung der Süßwasserqualität als Marker dienen. Die konventionelle Analyse ist dabei sehr aufwendig, da diese noch immer vollständig von Hand durchgeführt wird und hierfür speziell ausgebildetes Personal eingesetzt werden muss. Ziel war es, ein System zur automatischen Erkennung aufzubauen, um die Analyse vereinfachen zu können. Mit Hilfe von automatischer Mikroskopie war es möglich Plankter unterschiedlicher Ausdehnung durch die Integration mehrerer Schärfeebenen besser in einem Bild aufzunehmen. Weiterhin wurden verschiedene Fluoreszenzeigenschaften in die Analyse integriert. Mit einem für ImageJ erstellten Plugin können Organismen vom Hintergrund der Aufnahmen abgetrennt und eine Vielzahl von Merkmalen berechnet werden. Über das Training von neuralen Netzen wird die Unterscheidung von verschieden Gruppen von Planktontaxa möglich. Zudem können weitere Taxa einfach in die Analyse integriert und die Erkennung erweitert werden. Die erste Analyse von Mischproben, bestehend aus 10 verschiedenen Taxa, zeigte dabei eine durchschnittliche Erkennungsrate von 94.7% und eine durchschnittliche Falsch-Positiv Rate von 5.5%. Im Vergleich mit bestehenden Systemen konnte die Erkennungsrate verbessert und die Falsch Positiv Rate deutlich gesenkt werde. Bei einer Erweiterung des Datensatzes auf 22 Taxa wurde darauf geachtet, Arten zu verwenden, die verschiedene Stadien in ihrem Wachstum durchlaufen oder höhere Ähnlichkeiten zu den bereits vorhandenen Arten aufweisen, um evtl. Schwachstellen des Systemes erkennen zu können. Hier ergab sich eine gute Erkennungsrate (86.8%), bei der der Ausschluss von nicht-planktonischen Partikeln (11.9%) weiterhin verbessert war. Der Vergleich mit weiteren Klassifikationsverfahren zeigte, dass neuronale Netze anderen Verfahren bei dieser Problemstellung überlegen sind. Ähnlich gute Klassifikationsraten konnten durch Support Vektor Maschinen erzielt werden. Allerdings waren diese bei der Unterscheidung von unbekannten Partikeln dem neuralen Netz deutlich unterlegen.
Der zweite Abschnitt stellt die Entwicklung einer einfachen Methode zur Viabilitätsanalyse von Cyanobakterien, bei der keine weitere Behandlung der Proben notwendig ist, dar. Dabei wird die rote Chlorophyll - Autofluoreszenz als Marker für lebende Zellen und eine grüne unspezifische Fluoreszenz als Marker für tote Zellen genutzt. Der Assay wurde mit dem Modellorganismus Synechocystis sp. PCC 6803 etabliert und validiert. Die Auswahl eines geeigeneten Filtersets ermöglicht es beide Signale gleichzeitig anzuregen und zu beobachten und somit direkt zwischen lebendenden und toten Zellen zu unterscheiden. Die Ergebnisse zur Etablierung des Assays konnten durch Ausplattieren, Chlorophyllbestimmung und Bestimmung des Absorbtionsspektrums bestätigt werden. Durch den Einsatz von automatisierter Mikroskopie und einem neu erstellten ImageJ Plugin wurde eine sehr genaue und schnelle Analyse der Proben möglich. Der Einsatz beim Monitoring einer mutagenisierten Kultur zur Erhöhung der Temperaturtoleranz ermöglichte genaue und zeitnahe Einblicke in den Zustand der Kultur. Weitere Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Kombination mit Absorptionsspektren es ermöglichen können bessere Einblicke in die Vitalität der Kultur zu erhalten.
Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl Cyclase bei der Angiogenese und der Arteriogenese in der Maus
(2014)
Stickstoffmonoxid (NO) spielt eine wichtige Rolle bei Gefäßremodelling-Prozessen wie Angiogenese und Arteriogenese. Die NO-Synthese im Gefäßsystem wird hauptsächlich durch die endotheliale NO-Synthase (eNOS) gewährleistet. Sie kann durch verschiedene Faktoren wie Scherkräfte und Zytokine wie der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) reguliert werden. VEGF ist ein wichtiger Stimulator der Angiogenese und wird während dieses Prozesses hochreguliert. Die meisten physiologischen Effekte von NO werden durch die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) vermittelt. Als Hauptrezeptor für NO produziert die NO-GC den sekundären Botenstoff cyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) und führt dadurch zur Stimulation der verschiedenen Effektoren wie z.B. der PKG. Ob die Wirkung von NO in Angiogenese und Arteriogenese ebenfalls durch NO-GC vermittelt wird, war bis zum Beginn dieser Arbeit noch unklar.
Die NO-GC besteht aus zwei Untereinheiten (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen resultiert in einer vollständigen Knockout Maus (GCKO). Mithilfe des Cre-LoxP-Systems wurden zusätzlich zellspezifische Knockout-Mäuse für glatte Muskelzellen (SMC-GCKO) und Endothelzellen (EC-GCKO) generiert. Um die Rolle der NO-GC in der Angiogenese und Arteriogenese zu untersuchen, wurden drei gut etablierte Methoden benutzt.
Im ersten Teil des Projekts sollte die Expression der NO-GC in Endothelzellen untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde die reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) benutzt. Die Ergebnisse zeigen, dass die NO-GC in Endothelzellen der Lunge nur äußerst gering wenig exprimiert ist. Durch den Aortenring-Assay wurde eine Rolle der NO-GC bei der VEGF-vermittelten Angiogenese festgestellt. Dabei zeigte sich eine stärkere Angiogeneserate bei globaler Abwesenheit der NO-GC. Bei Fehlen der NO-GC ausschließlich in Endothelzellen zeigte sich kein Unterschied in den aussprossenden Aorten im Vergleich zu den Kontroll-Tieren. Dies zeigt, dass die NO-GC in Endothelzellen sehr wahrscheinlich keine Rolle bei der VEGF-vermittelten Angiogenese spielt.
Im zweiten Teil wurde die Rolle der NO-GC bei der Angiogenese in einem in vivo-Modell untersucht. In dem Modell der Sauerstoff-induzierten-Retinopathie zeigten die GCKO-Mäuse eine verringerte Vaso-Obliteration, eine verlangsamte Angiogenese und eine erhöhte Tuft-Bildung. Ähnliche Ergebnisse wurden bei den SMC-GCKO-Tieren beobachtet. EC-GCKO-Mäuse zeigten eine gegenüber den Kontroll-Tieren unveränderte Vaso-Obliteration, Angiogeneserate und Tuft-Bildung. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die NO-GC in Endothelzellen keine Rolle spielt. Immunfluoreszenz-Aufnahmen zeigten die Expression von NO-GC in Perizyten der Gefäßkapillaren der Mausretina. Daher könnte die NO-GC in diesem Zelltyp letztendlich für die Effekte bei den GCKO- und SMC-GCKO-Tieren verantwortlich sein.
Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Versuchsreihe unter Anwendung des Hinterlauf-Ischämie-Modells durchgeführt. Hierbei entwickelten die Pfoten aller GCKO- und teilweise der SMC-GCKO-Tiere nach der Ligation der Femoralarterie eine Nekrose. Die Regeneration der Hinterläufe der EC-GCKO-Tiere nach der Operation verlief normal. Diese Ergebnisse schließen eine bedeutende Rolle der NO-GC in Endothelzellen aus, zeigen allerdings, dass die NO-GC in den glatten Muskelzellen essentiell für den Arteriogenese-Prozess ist.
Zusammengefasst führt die Deletion der NO-GC in glatten Muskelzellen und wahrscheinlich auch in Perizyten zur einer verlangsamten Angiogenese und Inhibierung der Arteriogenese.
Pollination improves the yield of most crop species and contributes to one-third of global crop production, but comprehensive benefits including crop quality are still unknown. Hence, pollination is underestimated by international policies, which is particularly alarming in times of agricultural intensification and diminishing pollination services. In this study, exclusion experiments with strawberries showed bee pollination to improve fruit quality, quantity and market value compared with wind and self-pollination. Bee-pollinated fruits were heavier, had less malformations and reached higher commercial grades. They had increased redness and reduced sugar–acid–ratios and were firmer, thus improving the commercially important shelf life. Longer shelf life reduced fruit loss by at least 11%. This is accounting for 0.32 billion US$ of the 1.44 billion US$ provided by bee pollination to the total value of 2.90 billion US$ made with strawberry selling in the European Union 2009. The fruit quality and yield effects are driven by the pollination-mediated production of hormonal growth regulators, which occur in several pollination-dependent crops. Thus, our comprehensive findings should be transferable to a wide range of crops and demonstrate bee pollination to be a hitherto underestimated but vital and economically important determinant of fruit quality.
In recent years, zebrafish, and to a lesser extent medaka, have become widely used small animal models for human diseases. These organisms have convincingly demonstrated the usefulness of fish for improving our understanding of the molecular and cellular mechanisms leading to pathological conditions, and for the development of new diagnostic and therapeutic tools. Despite the usefulness of zebrafish and medaka in the investigation of a wide spectrum of traits, there is evidence to suggest that other fish species could be better suited for more targeted questions. With the emergence of new, improved sequencing technologies that enable genomic resources to be generated with increasing efficiency and speed, the potential of non-mainstream fish species as disease models can now be explored. A key feature of these fish species is that the pathological condition that they model is often related to specific evolutionary adaptations. By exploring these adaptations, new disease-causing and disease-modifier genes might be identified; thus, diverse fish species could be exploited to better understand the complexity of disease processes. In addition, non-mainstream fish models could allow us to study the impact of environmental factors, as well as genetic variation, on complex disease phenotypes. This Review will discuss the opportunities that such fish models offer for current and future biomedical research.
MYC is one of the most frequently overexpressed oncogenes in human cancer, and even modestly deregulated MYC can initiate ectopic proliferation in many postmitotic cell types in vivo. Sensitization of cells to apoptosis limits MYC's oncogenic potential. However, the mechanism through which MYC induces apoptosis is controversial. Some studies implicate p19ARF-mediated stabilization of p53, followed by induction of proapoptotic BH3 proteins NOXA and PUMA, whereas others argue for direct regulation of BH3 proteins, especially BIM. Here, we use a single experimental system to systematically evaluate the roles of p19ARF and BIM during MYC-induced apoptosis, in vitro, in vivo, and in combination with a widely used chemotherapeutic, doxorubicin. We find a common specific requirement for BIM during MYC-induced apoptosis in multiple settings, which does not extend to the p53-responsive BH3 family member PUMA, and find no evidence of a role for p19ARF during MYC-induced apoptosis in the tissues examined.
GAS2L3 was identified recently as a target gene of the DREAM complex (Reichert et al., 2010; Wolter et al., 2012). It was shown that GAS2L3 is expressed in a cell cycle specific manner and that depletion of the protein leads to defects in cytokinesis and genomic instability (Wolter et al., 2012).
Major aim of this thesis was, to further characterize the biochemical properties and physiological function of GAS2L3.
By in vitro co-sedimentation and bundling assays, GAS2L3 was identified as a cytoskeleton associated protein which bundles, binds and crosslinks F-actin and MTs. GST pulldown assays and co-immunoprecipitation experiments revealed that GAS2L3 interacts in vitro and in vivo with the chromosomal passenger complex (CPC), a very important regulator of mitosis and cytokinesis, and that the interaction is mediated by the GAR domain of GAS2L3 and the C-terminal part of Borealin and the N-terminal part of Survivin. Kinase assays showed that GAS2L3 is not a substrate of the CPC but is strongly phosphorylated by CDK1 in vitro. Depletion of GAS2L3 by shRNA influenced protein stability and activity of the CPC. However pharmacological studies showed that the decreased CPC activity is not responsible for the observed cytokinesis defects upon GAS2L3 depletion. Immunofluorescence experiments revealed that GAS2L3 is localized to the constriction zone by the CPC in a GAR dependent manner and that the GAR domain is important for proper protein function.
New interacting proteins of GAS2L3 were identified by stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC) in combination with tandem affinity purification and subsequent mass spectrometrical analysis. Co-immunoprecipitation experiments further confirmed the obtained mass spectrometrical data.
To address the physiological function of GAS2L3 in vivo, a conditional and a non-conditional knockout mouse strain was established. The non-conditional mouse strain showed a highly increased mortality rate before weaning age probably due to heart failure. The physiological function of GAS2L3 in vivo as well as the exact reason for the observed heart phenotype is not known at the moment.
Die Lokalisationsmikroskopie ist eine neue, vielversprechende Methode der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie. Sie ermöglicht detaillierte Einblicke in die Organisation und den strukturellen Aufbau von Zellen. Da die Vorbereitung der Proben und das Aufnehmen der Bilder im Vergleich zu herkömmlichen Methoden höhere Anforderungen stellt, mussten ihr Potential und ihre Zuverlässigkeit erst noch überzeugend gezeigt werden. Bis vor kurzem wurde das Auflösungsvermögen vor allem an Mikrotubuli gezeigt, deren filamentöse Struktur allerdings schon in konfokalen Bildern zu erkennen ist. Deswegen wurde in dieser Dissertation der Kernporenkomplex (NPC), dessen Struktur in der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie nicht auflösbar ist, als Modellstruktur für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie eingeführt.
Dazu wurden Kernporenkomplexe aus Kernhüllen von Xenopus laevis Oocyten mit dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy), einer Methode der Lokalisationsmikroskopie, hochaufgelöst. Damit konnte nun erstmals die Achtfachsymmetrie dieses Proteinkomplexes lichtmikroskopisch dargestellt werden. Desweiteren konnte der Zentralkanal mit einem Durchmesser von ca. 40 nm aufgelöst werden. Die Daten eigneten sich außerdem für eine automatisierte Bildanalyse nach dem sogenannten "particle averaging" - einer aus der Elektronenmikroskopie bekannten Methode, um eine Durchschnittsstruktur zu ermitteln.
Darüber hinaus wurden Zweifach-Färbungen von NPCs benutzt, um verschiedene Ansätze für Zweifarben-Aufnahmen mit dSTORM zu testen. Neben dem mittlerweile standardmäßig benutzten, sequentiellen Ansatz mit zwei spektral getrennten Farbstoffen, wurde auch ein simultaner Ansatz mit zwei spektral überlappenden Farbstoffen erfolgreich angewandt. Auch für 3D-Messungen mit den Ansätzen Biplane und Astigmatismus eignete sich die Markierung der Kernhülle. Hier wurden jedoch A6-Zellen benutzt und die Krümmung des Zellkerns über die gefärbten Kernporen dargestellt.
dSTORM-Messungen können nicht nur an fixierten, sondern auch in lebenden Zellen durchgeführt werden. Hierzu eignen sich vor allem sehr immobile Proteine, wie H2B oder Lamin C. Anhand von SNAP-Tag- und Halo-Tag-Konstrukten konnte gezeigt werden, dass sich kommerziell erhältliche, organische Farbstoffe auch in endogener zellulärer Umgebung schalten lassen, wodurch Lebendzell-Aufnahmen mit dSTORM möglich sind.
Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasst sich mit korrelativen Aufnahmen aus dSTORM und Rasterelektronenmikroskopie (SEM). Hierzu wurden Xenopus laevis Kernhüllen zuerst mit dSTORM hochaufgelöst und danach für die EM präpariert. Anschließend wurden zugehörige Bereiche am Rasterelektronenmikroskop aufgenommen. Mit den erhaltenen korrelativen Bildern konnte gezeigt werden, dass sich dSTORM und SEM bei geeigneten Proben durchaus kombinieren lassen. Proteine können somit spezifisch markiert und im Rahmen ihrer strukturellen Umgebung mit nahezu molekularer Auflösung dargestellt werden.
Da hochwertige Aufnahmen eine ausgereifte Probenpräparation voraussetzen, darf deren Etablierung nicht zu kurz kommen. Unter dieser Prämisse wurde ein optimiertes Markierungsprotokoll mit dem Namen ClickOx entwickelt. Mit ClickOx bleibt bei der kupferkatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition die Feinstruktur von Aktinfilamenten, sowie die Fluoreszenz fluoreszierender Proteine, deutlich sichtbar erhalten. Während bei den klassischen Click-Protokollen auf Grund der Entstehung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) feine zelluläre Strukturen, wie Aktinfilamente, angegriffen oder zerstört werden, schützt das neue Protokoll mit enzymatischem Sauerstoffentzug Proteine und somit Strukturen vor Reaktionen mit ROS. Das unterstreicht, wie wichtig es ist auch sogenannte "etablierte" Protokolle weiterzuentwickeln, denn bestimmte Nebeneffekte in Präparationen werden unter Umständen erstmals in der Hochauflösung sichtbar.
Ein weiterer Aspekt war die Untersuchung des Einflusses von D1 auf die Chromatinorganisation. Mit verschiedenen mikroskopischen Methoden konnten Hinweise auf eine mögliche DNA-Cross-Linking-Fähigkeit dieses Proteins gesammelt werden. Hier wurde die Einzelmolekülinformation der dSTORM-Filme genutzt, um unterschiedliche Grade von DNA- bzw. Chromatin-Akkumulation zu vergleichen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass wildtypisches D1 DNA vernetzen kann. Dies erfolgt über die sogenannten AT-Haken-Motive. Sobald diese alle durch Mutation funktionsunfähig gemacht werden - wie bei der verwendeten R10xG-Mutante - lässt sich keine Akkumulation der DNA mehr beobachten. Neben der Chromatinaggregation durch D1-Expression konnte in FRAP-Experimenten gezeigt werden, dass nur die "echten" AT-Haken eine hohe Affinität zum Chromatin aufweisen, die sogenannten "potentiellen" hingegen nicht.
Zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten spielen in vielen inflammatorischen, aber auch primär neurodegenerativen Erkrankungen eine wichtige Rolle. Daher besitzt die Fragestellung inwiefern CD8+ ZTL Neurone direkt schädigen und ggf. welche mechanistischen Aspekte dieser Schädigung zugrunde liegen, eine hohe Relevanz. Um diese Fragestellung eingehender zu beleuchten, wurde mit dem OT-I-System gearbeitet. Dieses gut vorcharakterisierte CD8+ T-Zell-Modell besitzt den Vorteil, dass diese transgenen Zellen nur eine Peptidsequenz des Ovalbumin (OVA) Protein als spezifisches Antigen erkennen.
Zunächst wurden in der vorliegenden Arbeit Co-Kultivierungs-Experimente durchgeführt. Hierzu wurden akut isolierte murine Hippokampus-Neurone unter verschiedenen Bedingungen mit OT-I Lymphozyten co-kultiviert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass unter Antigenpräsentation der Neurone signifikant mehr Neurone in die Apoptose/Nekrose geführt werden, als unter Kontroll-Bedingungen, in denen entweder kein Antigen oder ein Antigen, das nicht von OT-I Lymphozyten erkannt wird, präsentiert wird.
Nachdem die Antigen-abhängigen zytotoxischen Effekte auf Neurone gezeigt werden konnten, wurde mithilfe elektrophysiologischer Techniken die mechanistischen und funktionellen Konsequenzen des direkten neuronalen/OT-I-vermittelten Zellkontakts untersucht. Bei diesem experimentellen Ansatz wurde durch elektrisches Auslenken eines Neurons nach Kontakt mit einem OT-I Lymphozyt die passiven elektrischen Parameter der Neuronenmembran gemessen. In diesen Messungen konnte gezeigt werden, dass nach unmittelbarem Kontakt eines Neurons mit einem OT-I Lymphozyt der neuronale Membranwiderstand reduziert wird bzw. die Leitfähigkeit der Zellmembran erhöht wird. Diese Änderung der neuronalen Membran-Leitfähigkeit findet in einem Zeitraum von 10 min nach dem Zell-Zell-Kontakt statt. Auch hier konnte gezeigt werden, dass dieser Einfluss von OT-I Lymphozyten auf Neurone strikt Antigen-abhängig ist. Zur Untersuchung des Mechanismus der OT-I T-Lymphozyten auf Neurone wurde das Augenmerk auf verschiedene T-Zell-induzierte Apoptosewegegelegt. Es konnte gezeigt werden, dass durch Blockieren der Fas/FasL-Interaktion mittels eines Antikörpers kein Unterschied, weder in der neuronalen Apoptoserate nach Co-Kultivierung, noch eine Änderung der passiven neuronalen Membran-Leitfähigkeit auftritt. Weiterhin wurde die Rolle der von T-Zellen sezernierten Granula Perforin und Granzym B untersucht. Um den Einfluss dieser Granula aufzuklären, wurden OT-I Lymphozyten verwendet, die entweder defizient für Perforin oder Granzym B waren. In diesem experimentellen Ansatz wurde gezeigt, dass ausschließlich Perforin für die Erniedrigung des passiven neuronalen Membran-Widerstandes verantwortlich ist.
Diese Erhöhung der neuronalen Membranleitfähigkeit führte aber nicht direkt zum neuronalen Zelltod. Vielmehr wurde durch die einhergehende Depolarisation des Neurons die elektrische Aktivität der Zelle vermindert, sodass es zu einem sogenannten „electrical silencing“ kommt. Dieser Umstand konnte auch in der Betrachtung der spontanen Netzwerkaktivität von Neuronenkulturen gezeigt werden. Hierfür wurden hoch dichte Neuronenkulturen auf MEA-Chips kultiviert. Mit Hilfe dieser MEA konnten die Summenfeldpotentiale der Neuronenkulturen detektiert werden. Hierbei wurde beobachtet, dass nach Beladung der Neuronen mit dem spezifischen OT-I-Antigen und OT-I Zellen eine Verringerung der spontanen Netzwerkaktivität einhergeht. Auch in diesem Effekt konnte eine Antigen-Spezifität nachgewiesen werden.
Da der Prozess der zellulären Apoptose mit einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration einhergeht, und Perforin als Ca2+-durchlässiger unselektiver Porenbildner fungiert, wurden zur Überprüfung der Hypothese calcium imaging-Experimente durchgeführt. Analog zu den elektrophysiologischen Messungen wurde gezeigt, dass nach direktem Zell-Zell-Kontakt zwischen Neuron und OT-I Lymphozyt eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration zu messen ist. Dass diese Änderung des neuronalen Ca2+-Einstroms durch Perforin-abhängige Membranporen hervorgerufen wird, konnte durch die Verwendung von Perforin-defizienten OT-I Lymphozyten bewiesen werden. Unter Verwendung von Perforin-defizienten OT-I Lymphozyten wurde keine Änderung der neuronalen Ca2+-Konzentration ermittelt. Weiterhin wurde in diesem experimentellen Ansatz gezeigt, dass auch der OT-I-vermittelte neuronale Ca2+-Anstieg strikt Antigen-abhängig ist.Zusammengefasst konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass MHC-I/Antigen-vermittelte CD8+ Lymphozyten-Interaktion mit einem Neuron zu „electrical silencing“ des Neurons führt. Dieser Prozess ist klar Perforin-abhängig, führt jedoch nicht zum unmittelbaren Zelltod des Neurons.
Cell Surface Area and Membrane Folding in Glioblastoma Cell Lines Differing in PTEN and p53 Status
(2014)
Glioblastoma multiforme (GBM) is characterized by rapid growth, invasion and resistance to chemo−/radiotherapy. The complex cell surface morphology with abundant membrane folds, microvilli, filopodia and other membrane extensions is believed to contribute to the highly invasive behavior and therapy resistance of GBM cells. The present study addresses the mechanisms leading to the excessive cell membrane area in five GBM lines differing in mutational status for PTEN and p53. In addition to scanning electron microscopy (SEM), the membrane area and folding were quantified by dielectric measurements of membrane capacitance using the single-cell electrorotation (ROT) technique. The osmotic stability and volume regulation of GBM cells were analyzed by video microscopy. The expression of PTEN, p53, mTOR and several other marker proteins involved in cell growth and membrane synthesis were examined by Western blotting. The combined SEM, ROT and osmotic data provided independent lines of evidence for a large variability in membrane area and folding among tested GBM lines. Thus, DK-MG cells (wild type p53 and wild type PTEN) exhibited the lowest degree of membrane folding, probed by the area-specific capacitance Cm = 1.9 µF/cm2. In contrast, cell lines carrying mutations in both p53 and PTEN (U373-MG and SNB19) showed the highest Cm values of 3.7–4.0 µF/cm2, which corroborate well with their heavily villated cell surface revealed by SEM. Since PTEN and p53 are well-known inhibitors of mTOR, the increased membrane area/folding in mutant GBM lines may be related to the enhanced protein and lipid synthesis due to a deregulation of the mTOR-dependent downstream signaling pathway. Given that membrane folds and extensions are implicated in tumor cell motility and metastasis, the dielectric approach presented here provides a rapid and simple tool for screening the biophysical cell properties in studies on targeting chemo- or radiotherapeutically the migration and invasion of GBM and other tumor types.
The anti-silencing function protein 1 (Asf1) is a chaperone that forms a complex with histones H3 and H4 facilitating dimer deposition and removal from chromatin. Most eukaryotes possess two different Asf1 chaperones but their specific functions are still unknown. Trypanosomes, a group of early-diverged eukaryotes, also have two, but more divergent Asf1 paralogs than Asf1 of higher eukaryotes. To unravel possible different functions, we characterized the two Asf1 proteins in Trypanosoma brucei. Asf1A is mainly localized in the cytosol but translocates to the nucleus in S phase. In contrast, Asf1B is predominantly localized in the nucleus, as described for other organisms. Cytosolic Asf1 knockdown results in accumulation of cells in early S phase of the cell cycle, whereas nuclear Asf1 knockdown arrests cells in S/G2 phase. Overexpression of cytosolic Asf1 increases the levels of histone H3 and H4 acetylation. In contrast to cytosolic Asf1, overexpression of nuclear Asf1 causes less pronounced growth defects in parasites exposed to genotoxic agents, prompting a function in chromatin remodeling in response to DNA damage. Only the cytosolic Asf1 interacts with recombinant H3/H4 dimers in vitro. These findings denote the early appearance in evolution of distinguishable functions for the two Asf1 chaperons in trypanosomes.
Das atriale natriuretische Peptid (ANP) wird infolge einer Zunahme des atrialen Drucks aus den Myozyten des Atriums sezerniert. Es spielt lokal eine bedeutende, protektive Rolle und wirkt der Entstehung von Herzhypertrophie und Fibrose entgegen. Darüber hinaus kommt ANP vor allem eine wichtige Rolle als endokrines Hormon zu, das den arteriellen Blutdruck und das Blutvolumen regelt. Diese physiologischen Effekte vermittelt das Herzhormon durch seinen Rezeptor, das Transmembranprotein Guanylatzyklase A (GC-A). Durch Bindung von ANP an die extrazelluläre Domäne der GC-A wird intrazellulär, durch die katalytische Domäne des Rezeptors, der sekundäre Botenstoff cGMP gebildet. Patienten mit einer, durch Bluthochdruck verursachten Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz weisen erhöhte ANP-Konzentrationen im Plasma auf. Die durch ANP vermittelten, protektiven Effekte sind allerdings vermindert. Zahlreiche Studien haben in vitro gezeigt, dass die chronische Inkubation der GC-A mit ihrem Liganden, sowie die Behandlung von GC-A exprimierenden Zellen mit Hormonen wie Angiotensin II, zur Desensitisierung des Rezeptors führen. Der Verlust der Funktionsfähigkeit geht einher mit der Dephosphorylierung des Rezeptors an spezifischen, intrazellulär lokalisierten Aminosäuren. Durch die Erforschung dieses Mechanismus und Identifizierung möglicher Interaktionspartner in vivo könnte der Grundstein für neue oder verbesserte Therapieformen gelegt werden.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine kürzlich identifizierte Isoform des GC-A-Rezeptors identifiziert, die durch alternatives Spleißen des Exons 4 entsteht und in einer Vielzahl untersuchter Gewebe der Maus vorkommt. Die Deletion umfasst 51 Basenpaare und resultiert in einem um 17 Aminosäuren verkürzten GC-A-Rezeptor (GC-AΔLys314-Gln330). Molekulare Modellierungen der extrazellulären Domänen des wildtypischen GC-A-Rezeptors und der Isoform zeigten, dass sich die Deletion im membrannahen Bereich der extrazellulären Domäne und damit deutlich entfernt von der ANP-Bindungsdomäne befindet. Oberflächenbiotinylierungs- und Zellfraktionierungsversuche zeigten, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors an der Oberfläche von Zellmembranen transient transfizierter HEK 293-Zellen präsentiert wird. Jedoch zeigten die ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-Radioimmunassay (cGMP-RIA) und Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)-Messungen, dass die Isoform nicht zur ANP-vermittelten intrazellulären cGMP-Bildung stimuliert werden kann. Im Rahmen von ANP-Bindungsstudien mit 125I-ANP wurde gezeigt, dass GC-AΔLys314-Gln330 die Fähigkeit zur Bindung des Liganden ANP verloren hat. Jedoch zeigten die Koimmunpräzipitationsversuche, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors Heterodimere mit dem wildtypischen GC-A-Rezeptor bilden und dadurch die ligandeninduzierte Bildung von cGMP reduzieren kann. In vivo konnte gezeigt werden, dass unter Angiotensin II-induzierter Hypertonie die mRNA-Expression für GC-AΔLys314-Gln330 in der Lunge gesteigert, und gleichzeitig die ANP-vermittelte cGMP-Bildung deutlich reduziert ist. Daher kann davon ausgegangen werden, dass das alternative Spleißen ein regulierender Mechanismus ist, der auf den ANP/GC-A-Signalweg Einfluss nimmt. Angiotensin II-induziertes alternatives Spleißen des GC-A-Gens kann daher einen neuen Mechanismus für die Verringerung der Sensitivität des GC-A-Rezeptors gegenüber ANP darstellen.
Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden transgene Tiere mit kardiomyozytenspezifischer Überexpression eines Epitop-getaggten GC-A-Rezeptors generiert. Durch dieses Modell sollte es ermöglicht werden, den Rezeptor aus murinem Gewebe anreichern und aufreinigen zu können um danach Analysen zu posttranslationalen Veränderungen und möglichen Interaktionspartnern durchzuführen. Zunächst wurde in eine FLAG-Epitop-getaggte GC-A zusätzlich ein HA-tag, sowie eine Erkennungssequenz für die Protease des tobacco etch virus (TEV) eingefügt. Die Expression und Funktionsfähigkeit des modifizierten Rezeptors wurde durch ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-RIA und FRET-Messungen verifiziert. Die Funktionsfähigkeit der TEV-Erkennungssequenz wurde durch die Elution mittels TEV-Protease nach Immunpräzipitation (IP) nachgewiesen. In vivo wurde an Mäusen die Expression und Lokalisation der GC-A auf Proteinebene, unter Anwendung von Zellfraktionierungsexperimenten und Immunpräzipitationen, überprüft. Die entstandenen transgenen Tiere zeigten eine deutliche, in den Zellmembranen von Kardiomyozyten lokalisierte, Überexpression des Rezeptors. Dieser konnte über das HA-tag angereichert und aufgereinigt werden. Um die Funktionsfähigkeit des modifizierten Rezeptors in vivo nachzuweisen, wurde in zwei Versuchsreihen kardiale Hypertrophie durch chronische Applikation von Angiotensin II induziert. Es wurde postuliert, dass die Überexpression funktionsfähiger GC-A im Herzen die Tiere vor Herzhypertrophie schützt. Die Ergebnisse der Studien zeigen allerdings, dass die generierten transgene Tiere trotz kardiomyozytenspezifischer Überexpression des Rezeptors nicht den erwarteten Schutz vor Herzhypertrophie aufwiesen, sondern ähnlich wie ihre wildtypischen Geschwistertiere reagieren. Jedoch gelang es mit Hilfe des Überexpressionsmodells zusammen mit anderen Mitarbeitern der AG Kuhn eine zuvor in vitro beschriebene Interaktion des GC-A-Rezeptors mit den Kationenkanälen TRPC3 und TRPC6 in vivo nachzuweisen. Somit besteht die Möglichkeit die Epitope und das murine Überexpressionsmodell auch zukünftig zu nutzen, um Interaktionspartner der GC-A zu identifizieren.
Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that replicates inside a vacuole, the so-called inclusion. During replication by a biphasic life-cycle Chlamydia secrete via their type 3 secretion system various effector proteins into the inclusion lumen, the inclusion membrane or the host cell cytosol to form their favored replication niche. Chlamydia-infected cells are highly resistant against apoptosis since the replicative form of Chlamydia is non-infectious and premature cell death would cause complete loss of one Chlamydia generation. The bacteria block apoptosis by preventing mitochondrial outer membrane permeabilization. Various proteins with anti-apoptotic function are enriched in Chlamydia-infected cells such as Mcl-1, cIAP2, Survivin or HIF1α. The accumulation of these proteins is a result of increased gene expression and direct protein stabilization. However, the molecular mechanisms and involved bacterial effector proteins are mostly unknown.
With this work the molecular mechanisms of Mcl-1 stabilization and the participation of chlamydial factors were investigated. Mcl-1 is a member of the Bcl-2 protein family and has an extremely short half-life causing its permanent ubiquitination and subsequent degradation by the 26S proteasome under normal homeostasis whilst Mcl-1 accumulation results in apoptosis inhibition. It was shown that during C. trachomatis infection Mcl-1 ubiquitination is reduced causing its stabilization albeit no cellular ubiquitin-proteasome-system components are involved in this process. However, C. trachomatis express the two deubiquitinases ChlaDUB1 and ChlaDUB2 which are mostly uncharacterized. With this work the expression profile, subcellular localization, substrates and function of the deubiquitinases were investigated. It was shown that ChlaDUB1 is secreted to the surface of the inclusion where it interacts with Mcl-1 which is accumulated in the proximity of this compartment. By utilization of infection experiments, heterologous expression systems and in vitro experiments a direct interaction of ChlaDUB1 and Mcl-1 was demonstrated. Furthermore, it was shown that Mcl-1 is deubiquitinated by ChlaDUB1 causing its stabilization. During replicative phase of infection, ChlaDUB2 seems to be accumulated in the chlamydial particles. However, ChlaDUB2 substrates could not be identified which would give an indication for the physiological role of ChlaDUB2.
Since 2011, a protocol to transform C. trachomatis with artificial plasmid DNA is available. As part of this work the transformation of C. trachomatis with plasmid DNA suitable for the permanent or inducible protein overexpression on a routinely basis was established. In addition, the first targeted homologous recombination into the chlamydial genome to replace the ChlaDUB1 gene by a modified one was performed and validated. The targeted homologous recombination was also used to create a ChlaDUB1 knock-out mutant; however deletion of ChlaDUB1 seems to be lethal for C. trachomatis. Due to the fact that ChlaDUB1-lacking Chlamydia could not be obtained an inhibitor screen was performed and identified CYN312 as a potential ChlaDUB1 inhibitor. Application of CYN312 during infection interfered with chlamydial growth and reduced Mcl-1 quantity in infected cells. Furthermore, CYN312 treated Ctr-infected cells were significantly sensitized for apoptosis.
Taken together, C. trachomatis secretes the deubiquitinase ChlaDUB1 to the surface of the inclusion where it deubiquitinates Mcl-1 causing its accumulation in infected cells resulting in apoptosis resistance. Application of the ChlaDUB1 inhibitor CYN312 interferes with Mcl-1 stabilization sensitizing infected cells for apoptosis.
Biodiversity, a multidimensional property of natural systems, is difficult to quantify partly because of the multitude of indices proposed for this purpose. Indices aim to describe general properties of communities that allow us to compare different regions, taxa, and trophic levels. Therefore, they are of fundamental importance for environmental monitoring and conservation, although there is no consensus about which indices are more appropriate and informative. We tested several common diversity indices in a range of simple to complex statistical analyses in order to determine whether some were better suited for certain analyses than others. We used data collected around the focal plant Plantago lanceolata on 60 temperate grassland plots embedded in an agricultural landscape to explore relationships between the common diversity indices of species richness (S), Shannon's diversity (H'), Simpson's diversity (D-1), Simpson's dominance (D-2), Simpson's evenness (E), and Berger-Parker dominance (BP). We calculated each of these indices for herbaceous plants, arbuscular mycorrhizal fungi, aboveground arthropods, belowground insect larvae, and P.lanceolata molecular and chemical diversity. Including these trait-based measures of diversity allowed us to test whether or not they behaved similarly to the better studied species diversity. We used path analysis to determine whether compound indices detected more relationships between diversities of different organisms and traits than more basic indices. In the path models, more paths were significant when using H', even though all models except that with E were equally reliable. This demonstrates that while common diversity indices may appear interchangeable in simple analyses, when considering complex interactions, the choice of index can profoundly alter the interpretation of results. Data mining in order to identify the index producing the most significant results should be avoided, but simultaneously considering analyses using multiple indices can provide greater insight into the interactions in a system.
Background
Renal cell carcinoma (RCC) is marked by high mortality rate. To date, no robust risk stratification by clinical or molecular prognosticators of cancer-specific survival (CSS) has been established for early stages. Transcriptional profiling of small non-coding RNA gene products (miRNAs) seems promising for prognostic stratification. The expression of miR-21 and miR-126 was analysed in a large cohort of RCC patients; a combined risk score (CRS)-model was constructed based on expression levels of both miRNAs.
Methods
Expression of miR-21 and miR-126 was evaluated by qRT-PCR in tumour and adjacent non-neoplastic tissue in n = 139 clear cell RCC patients. Relation of miR-21 and miR-126 expression with various clinical parameters was assessed. Parameters were analysed by uni- and multivariate COX regression. A factor derived from the z-score resulting from the COX model was determined for both miRs separately and a combined risk score (CRS) was calculated multiplying the relative expression of miR-21 and miR-126 by this factor. The best fitting COX model was selected by relative goodness-of-fit with the Akaike information criterion (AIC).
Results
RCC with and without miR-21 up- and miR-126 downregulation differed significantly in synchronous metastatic status and CSS. Upregulation of miR-21 and downregulation of miR-126 were independently prognostic. A combined risk score (CRS) based on the expression of both miRs showed high sensitivity and specificity in predicting CSS and prediction was independent from any other clinico-pathological parameter. Association of CRS with CSS was successfully validated in a testing cohort containing patients with high and low risk for progressive disease.
Conclusions
A combined expression level of miR-21 and miR-126 accurately predicted CSS in two independent RCC cohorts and seems feasible for clinical application in assessing prognosis.
Climatic extreme events can cause the shift or disruption of plant-insect interactions due to altered plant quality, e.g. leaf carbon to nitrogen ratios, and phenology. However, the response of plant-herbivore interactions to extreme events and climatic gradients has been rarely studied, although climatic extremes will increase in frequency and intensity in the future and insect herbivores represent a highly diverse and functionally important group. We set up a replicated climate change experiment along elevational gradients in the German Alps to study the responses of three plant guilds and their herbivory by insects to extreme events (extreme drought, advanced and delayed snowmelt) versus control plots under different climatic conditions on 15 grassland sites. Our results indicate that elevational shifts in CN (carbon to nitrogen) ratios and herbivory depend on plant guild and season. CN ratios increased with altitude for grasses, but decreased for legumes and other forbs. In contrast to our hypotheses, extreme climatic events did not significantly affect CN ratios and herbivory. Thus, our study indicates that nutritional quality of plants and antagonistic interactions with insect herbivores are robust against seasonal climatic extremes. Across the three functional plant guilds, herbivory increased with nitrogen concentrations. Further, increased CN ratios indicate a reduction in nutritional plant quality with advancing season. Although our results revealed no direct effects of extreme climatic events, the opposing responses of plant guilds along elevation imply that competitive interactions within plant communities might change under future climates, with unknown consequences for plant-herbivore interactions and plant community composition.
Background
VKORC1 has been identified some years ago as the gene encoding vitamin K epoxide reductase (VKOR) – the target protein for coumarin derivates like warfarin or phenprocoumon. Resistance against warfarin and other coumarin-type anticoagulants has been frequently reported over the last 50 years in rodents due to problems in pest control as well as in thrombophilic patients showing variable response to anticoagulant treatment. Many different mutations have already been detected in the VKORC1 gene leading to warfarin resistance in rats, mice and in humans. Since the conventional in vitro dithiothreitol (DTT)-driven VKOR enzymatic assay often did not reflect the in vivo status concerning warfarin resistance, we recently developed a cell culture-based method for coexpression of VKORC1 with coagulation factor IX and subsequent measurement of secreted FIX in order to test warfarin inhibition in wild-type and mutated VKORC1.
Results
In the present study, we coexpressed wild-type factor IX with 12 different VKORC1 variants which were previously detected in warfarin resistant rats and mice. The results show that amino acid substitutions in VKORC1 maintain VKOR activity and are associated with warfarin resistance. When we projected in silico the amino acid substitutions onto the published three-dimensional model of the bacterial VKOR enzyme, the predicted effects matched well the catalytic mechanism proposed for the bacterial enzyme.
Conclusions
The established cell-based system for coexpression of VKORC1 and factor IX uses FIX activity as an indicator of carboxylation efficiency. This system reflects the warfarin resistance status of VKORC1 mutations from anticoagulant resistant rodents more closely than the traditional DTT-driven enzyme assay. All mutations studied were also predicted to be involved in the reaction mechanism.
Background. Up to 75% of crop species benefit at least to some degree from animal pollination for fruit or seed set and yield. However, basic information on the level of pollinator dependence and pollinator contribution to yield is lacking for many crops. Even less is known about how insect pollination affects crop quality. Given that habitat loss and agricultural intensification are known to decrease pollinator richness and abundance, there is a need to assess the consequences for different components of crop production. Methods. We used pollination exclusion on flowers or inflorescences on a whole plant basis to assess the contribution of insect pollination to crop yield and quality in four flowering crops (spring oilseed rape, field bean, strawberry, and buckwheat) located in four regions of Europe. For each crop, we recorded abundance and species richness of flower visiting insects in ten fields located along a gradient from simple to heterogeneous landscapes. Results. Insect pollination enhanced average crop yield between 18 and 71% depending on the crop. Yield quality was also enhanced in most crops. For instance, oilseed rape had higher oil and lower chlorophyll contents when adequately pollinated, the proportion of empty seeds decreased in buckwheat, and strawberries' commercial grade improved; however, we did not find higher nitrogen content in open pollinated field beans. Complex landscapes had a higher overall species richness of wild pollinators across crops, but visitation rates were only higher in complex landscapes for some crops. On the contrary, the overall yield was consistently enhanced by higher visitation rates, but not by higher pollinator richness. Discussion. For the four crops in this study, there is clear benefit delivered by pollinators on yield quantity and/or quality, but it is not maximized under current agricultural intensification. Honeybees, the most abundant pollinator, might partially compensate the loss of wild pollinators in some areas, but our results suggest the need of landscape-scale actions to enhance wild pollinator populations.
In recent years three-dimensional (3D) super-resolution fluorescence imaging by single-molecule localization (localization microscopy) has gained considerable interest because of its simple implementation and high optical resolution. Astigmatic and biplane imaging are experimentally simple methods to engineer a 3D-specific point spread function (PSF), but existing evaluation methods have proven problematic in practical application. Here we introduce the use of cubic B-splines to model the relationship of axial position and PSF width in the above mentioned approaches and compare the performance with existing methods. We show that cubic B-splines are the first method that can combine precision, accuracy and simplicity.
Embryonale Stammzellen (ESCs) sind durch zwei charakteristische Eigenschaften definiert. Neben einer kontinuierlichen Selbsterneuerungskapazität weisen ESCs die Fähigkeit auf, in alle Zelltypen der drei Keimblätter differenzieren zu können. Diese Eigenschaften werden unter anderem durch ein Netzwerk wichtiger Pluripotenzfaktoren als auch durch epigenetische Mechanismen reguliert, welche die Transkription von Pluripotenz- und Differenzierungsgenen kontrollieren.
In murinen ESCs sind an der Repression von Differenzierungsgenen auch Polycomb group (PcG) Proteine beteiligt. Diese Proteine bauen zwei Chromatin-modifizierende Komplexe auf, die als Polycomb repressive complex 1 bzw. 2 (PRC1 bzw. PRC2) bezeichnet werden. Nach dem klassischen Modell der Polycombfunktion, katalysieren PRC1 und PRC2 gemeinsam zwei charakteristische Histonmodifikationen, die zur Repression PRC-spezifischer Zielgene beitragen. Zahlreiche Studien in den letzten Jahren belegen, dass der Proteinaufbau der PRC1 Komplexe stark variieren kann, wobei die Familie der Polycomb group RING finger (Pcgf) Proteine eine wichtige Rolle spielt. In diesem Zusammenhang definieren einzelne Pcgf Paraloge (Pcgf1 – 6) verschiedene PRC1 Varianten (PRC1.1 – 1.6), die Komplex-spezifische Bindestellen im Genom aufweisen. Diese Erkenntnisse lassen auf unterschiedliche Mechanismen der PRC1 Varianten und Pcgf Paralog-spezifische Funktionen schließen, die zum jetzigen Zeitpunkt nur wenig erforscht sind.
Für manche Pcgf Paraloge sind wichtige Rollen in verschiedenen Stammzelltypen und während der iPS Reprogrammierung bekannt. Pcgf1 (Nspc1), Pcgf2 (Mel18) und Pcgf4 (Bmi1) zeigen eine Funktion in verschiedenen adulten Stammzellen. Pcgf4 spielt darüber hinaus eine wichtige Rolle in der murinen iPS Reprogrammierung. Für Pcgf6 (Mblr) wird eine Pluripotenz-assoziierte Funktion angenommen, denn Pcgf6 ist das einzige Pcgf Paralog, das eine erhöhte Expression in murinen ESCs aufweist, die jedoch im Verlauf der ESC-Differenzierung absinkt. Außerdem zeigen murine Pcgf6 KD ESCs eine verminderte Expression der Pluripotenzgene Oct4, Sox2 und Nanog, eine De-Repression mesodermaler und Testes-spezifischer Gene als auch eine erhöhte Tendenz zur hämatopoetischen Differenzierung. Wie genau Pcgf6 an der Regulation dieser Prozesse in murinen ESCs beteiligt ist, ist nicht bekannt.
In der hier vorliegenden Dissertation wurde die Funktion von Pcgf6 in der murinen iPS Reprogrammierung untersucht. Da bereits für Pcgf4 eine Rolle in der Reprogrammierung somatischer Zellen gezeigt wurde und Pcgf6 eine erhöhte Expression in ESCs aufweist, wurde auch für Pcgf6 eine Funktion in der iPS Reprogrammierung angenommen. Zunächst konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Pcgf6 während der iPS Reprogrammierung verstärkt exprimiert wird und in iPS Zellen eine ESC-ähnliche Expression aufweist. Darüber hinaus konnte Pcgf6 in Kombination mit Oct4, Klf4 und c-Myc spezifisch den Transkriptionsfaktor Sox2 in der iPS Reprogrammierung ersetzen. Zudem wurden für OPKM-induzierte iPS Zellen charakteristische Eigenschaften pluripotenter Zellen nachgewiesen. Außerdem konnte eine Rolle von Pcgf6 als Enhancer-Faktor für die iPS Reprogrammierung ausgeschlossen werden, da die Überexpression von Pcgf6 zusammen mit den OSKM Faktoren keine additiven Effekte auf die Reprogrammierungseffizienz erzielte. Im Gegensatz dazu führte der Knockdown (KD) von Pcgf6 in embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) zu verminderten Effizienzen nach OSKM Reprogrammierung. Darüber hinaus handelte es sich bei der Mehrheit der AP+ Kolonien, die unter Pcgf6 KD Konditionen entstanden, um partiell-reprogrammierte iPS Zellen.
Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit, dass Pcgf6 ein neuer und essentieller Faktor der iPS Reprogrammierung ist, der in Kombination mit Oct4, Klf4 und c-Myc spezifisch den Transkriptionsfaktor Sox2 ersetzen kann.
The intracellular pathogen Chlamydia is the causative agent of millions of new infections per year transmitting diseases like trachoma, pelvic inflammatory disease or lymphogranuloma venereum. Undetected or recurrent infections caused by chlamydial persistence are especially likely to provoke severe pathologies. To ensure host cell survival and to facilitate long term infections Chlamydia induces anti-apoptotic pathways, mainly at the level of mitochondria, and restrains activity of pro-apoptotic proteins. Additionally, the pathogen seizes host energy, carbohydrates, amino acids, lipids and nucleotides to facilitate propagation of bacterial progeny and growth of the chlamydial inclusion.
At the beginning of this study, Chlamydia-mediated apoptosis resistance to DNA damage induced by the topoisomerase inhibitor etoposide was investigated. In the course of this, a central cellular protein crucial for etoposide-mediated apoptosis, the tumour suppressor p53, was found to be downregulated during Chlamydia infections. Subsequently, different chlamydial strains and serovars were examined and p53 downregulation was ascertained to be a general feature during Chlamydia infections of human cells. Reduction of p53 protein level was established to be mediated by the PI3K-Akt signalling pathway, activation of the E3-ubiquitin ligase HDM2 and final degradation by the proteasome. Additionally, an intriguing discrepancy between infections of human and mouse cells was detected. Both activation of the PI3K-Akt pathway as well as degradation of p53 could not be observed in Chlamydia-infected mouse cells. Recently, production of reactive oxygen species (ROS) and damage to host cell DNA was reported to occur during Chlamydia infection. Thus, degradation of p53 strongly contributes to the anti-apoptotic environment crucial for chlamydial infection.
To verify the importance of p53 degradation for chlamydial growth and development, p53 was stabilised and activated by the HDM2-inhibiting drug nutlin-3 and the DNA damage-inducing compound etoposide. Unexpectedly, chlamydial development was severely impaired and inclusion formation was defective. Completion of the chlamydial developmental cycle was prevented resulting in loss of infectivity. Intriguingly, removal of the p53 activating stimulus allowed formation of the bacterial inclusion and recovery of infectivity. A similar observation of growth recovery was made in infected cell lines deficient for p53.
As bacterial growth and inclusion formation was strongly delayed in the presence of activated p53, p53-mediated inhibitory regulation of cellular metabolism was suspected to contribute to chlamydial growth defects. To verify this, glycolytic and pentose phosphate pathways were analysed revealing the importance of a functioning PPP for chlamydial growth. In addition, increased expression of glucose-6-phosphate dehydrogenase rescued chlamydial growth inhibition induced by activated p53. The rescuing effect was even more pronounced in p53-deficient cells treated with etoposide or nutlin-3 revealing additional p53-independent aspects of Chlamydia inhibition. Removal of ROS by anti-oxidant compounds was not sufficient to rescue chlamydial infectivity. Apparently, not only the anti-oxidant capacities of the PPP but also provision of precursors for nucleotide synthesis as well as contribution to DNA repair are important for successful chlamydial growth.
Modulation of host cell signalling was previously reported for a number of pathogens. As formation of ROS and DNA damage are likely to occur during infections of intracellular bacteria, several strategies to manipulate the host and to inhibit induction of apoptosis were invented. Downregulation of the tumour suppressor p53 is a crucial point during development of Chlamydia, ensuring both host cell survival and metabolic support conducive to chlamydial growth.
This thesis reviews the fundamentals of three-dimensional super-resolution localization imaging. In order to infer the axial coordinate of the emission of single fluorophores, the point spread function is engineered following a technique usually referred to as astigmatic imaging by the introduction of a cylindrical lens to the detection path of a microscope.
After giving a short introduction to optics and localization microscopy, I outline sources of aberrations as frequently encountered in 3D-localization microscopy and will discuss their respective impact on the precision and accuracy of the localization process. With the knowledge from these considerations, experiments were designed and conducted to verify the validity of the conclusions and to demonstrate the abilities of the proposed microscope to resolve biological structures in the three spatial dimensions. Additionally, it is demonstrated that measurements of huge volumes with virtually no aberrations is in principle feasible.
During the course of this thesis, a new method was introduced for inferring axial coordinates. This interpolation method based on cubic B-splines shows superior performance in the calibration of a microscope and the evaluation of subsequent measurement and will therefore be used and explained in this work.
Finally, this work is also meant to give future students some guidance for entering the field of 3D localization microscopy and therefore, detailed protocols are provided covering the specific aspects of two color 3D localization imaging.
Malaria is a challenging infection with increasing and wide-spread treatment failure risk due to resistance. With a estimated death toll of 1-3 Million per year, most cases of Malaria affect children under the age of five years in Sub-Saharan Africa. In this thesis, I analyse the current status of malaria control (focussing on diagnosis and therapy) in Burkina Faso to show how this disease burdens public health in endemic countries and to identify possible approaches to improvement. MB is discussed as a therapeutic option under these circumstances.
Burkina Faso is used as a representative example for a country in Sub-Saharan Africa with high endemicity for malaria and is here portrayed, its health system characterised and discussed under socioeconomic aspects.
More than half of this country’s population live in absolute poverty. The burden that malaria, especially treatment cost, poses on these people cannot be under-estimated.
A retrospective study of case files from the university pediatric hospital in Burkina Faso’s capital, Ouagadougou, shows that the case load is huge, and especially the specific diagnosis of severe malaria is difficult to apply in the hospital’s daily routine. Treatment policy as proposed by WHO is not satisfactorily implemented neither in home treatment nor in health services, as data for pretreatment clearly show.
In the face of growing resistance in malaria parasites, pharmacological combination therapies are important. Artemisinins currently are the last resort of malaria therapy. As I show with homology models, even this golden bullet is not beyond resistance development. Inconsidered mass use has rendered other drugs virtually useless before. Artemisinins should thus be protected similar to reserve antibiotics against multi-resistant bacteria.
There is accumulating evidence that MB is an effective drug against malaria. Here the biological effects of both MB alone and in combination therapy is explored via modeling and experimental data. Several different lines of MB attack on Plasmodium redox defense were identified by analysis of the network effects. Next, CQ resistance based on Pfmdr1 and PfCRT transporters as well as SP resistance were modeled in silico. Further modeling shows that MB has a favorable synergism on antimalarial network effects with these commonly used antimalarial drugs, given their correct application.
Also from the economic point of view MB shows great potential: in terms of production price, it can be compared to CQ, which could help to diminuish the costs of malaria treatment to affordable ranges for those most affected and struk by poverty.
Malaria control is feasible, but suboptimal diagnosis and treatment are often hindering the achievment of this goal. In order to achieve malaria control, more effort has to be made to implement better adjusted and available primary treatment strategies for uncomplicated malaria that are highly standardised. Unfortunately, campaigns against malaria are chronically underfinanced. In order to maximize the effect of available funds, a cheap treatment option is most important, especially as pharmaceuticals represent the biggest single matter of expense in the fight against malaria.
Pocket-Proteine und E2F-Transkriptionsfaktoren regulieren die Expression von Zellzyklus-assoziierten Genen und spielen eine zentrale Rolle bei der Koordination der Zellteilung, Differenzierung und Apoptose. Störungen dieser Signalwege tragen zur Entstehung zahlreicher Tumorentitäten beim Menschen bei. Trotz der intensiven Untersuchung der Zellzyklusregulation sind viele Details noch unverstanden.
Der LIN-Komplex (LINC / DREAM) ist ein kürzlich entdeckter humaner Multiprotein-komplex, welcher dynamisch mit Pocket-Proteinen und E2F-Transkriptionsfaktoren interagiert. Eine essentielle Komponente des LIN-Komplexes ist das LIN9-Protein. Um die Funktion dieses Proteins bei der Zellzyklusregulation und Tumorentstehung genauer untersuchen zu können, wurde in unserer Arbeitsgruppe ein konditionelles Lin9-Knockout-Mausmodell etabliert.
Primäres Ziel der Arbeit war es, den Phänotyp embryonaler Fibroblasten (MEFs) aus diesen Mäusen zu charakterisieren. Bereits kurz nach Inaktivierung von Lin9 konnte ein stark verlangsamtes Zellwachstums beobachtet werden. In Lin9-depletierten MEFs wurden multiple mitotische Defekte detektiert, die u. a. strukturelle Auffälligkeiten des Spindelapparates, aberrante Zellkerne, Störungen der Chromosomensegregation sowie zytokinetische Defekte umfassen und in einer dramatischen Zunahme polyploider und aneuploider Zellen resultieren. Im Langzeitverlauf führen diese erheblichen Aberrationen zu einer vorzeitigen zellulären Seneszenz. Wird diese durch das Large T-Protoonkogen durchbrochen, können sich MEFs an den Verlust von Lin9 adaptieren, zeigen dann jedoch eine hochgradige genomische Instabilität und Substrat-unabhängiges Wachstum im Weichagar als Zeichen onkogener Transformation.
Im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression in Lin9-defizienten MEFs mittels quantitativer Real Time-PCR untersucht um zu klären, ob die beschriebenen Defekte auf Veränderungen der transkriptionellen Aktivität zurück-zuführen sind. Dabei wurde eine erhebliche Reduktion der Expressionslevel mitotischer Gene nach Verlust von Lin9 beobachtet. Des Weiteren wurden zur Klärung der zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen Chromatin-Immunpräzipitations-Experimente (ChIP) durchgeführt. Im Vergleich zu Kontrollzellen wurden dabei in Lin9-defizienten Zellen signifikante epigenetische Veränderungen bezüglich aktivierender Histon-Modifikationen an den Promotoren mitotischer Lin9-Zielgene festgestellt.
Im letzten Abschnitt der Arbeit sollten die Auswirkungen des heterozygoten Verlustes von Lin9 analysiert werden. Dabei zeigte sich, dass Lin9-haploinsuffiziente Zellen normal proliferieren, obwohl die Expression verschiedener G2/M-Gene leicht vermindert war. Es wurde jedoch eine Schwächung des mitotischen Spindelkontrollpunktes und in der Folge über mehrere Zellgenerationen eine Zunahme polyploider Zellen beobachtet. Mit Weichagar-Assays konnte gezeigt werden, dass bereits der heterozygote Verlust des Lin9-Gens zur onkogenen Transformation beiträgt.
Zusammengenommen dokumentieren diese Studien, dass LIN9 eine entscheidende Bedeutung bei der Regulation von Zellzyklus-assoziierten Genen spielt und sowohl einen essentiellen Faktor für die Zellproliferation darstellt als auch durch die Gewährleistung genomischer Stabilität tumorsuppressive Eigenschaften aufweist.
Degenerative Bandscheibenerkrankungen wie Protrusionen oder vorgefallenes Nukle-usgewebe führen häufig zu chronischen Schmerzen und schränken die Bewegungsmo-bilität sehr ein. Operative Behandlungsmöglichkeiten wie die Nukleotomie oder die Fusion von Wirbelkörpern stellen traumatische Eingriffe in das komplexe System der Wirbelsäule dar. Biologische Verfahren, durch die eine Regeneration des geschädigten Gewebes erzielt werden kann, sind klinisch bisher nicht etabliert.
Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung, Herstellung und Testung regenerativer azellulä-rer Implantatmatrices auf der Basis von Kollagen Typ I, die den degenerierten Nukleus pulposus ersetzen sollen. Insbesondere eine Höhenminderung der Bandscheibe kann zu Anschlussdegenerationen benachbarter Segmente führen. Dies soll durch die Implan-tatmatrix ausgeglichen werden. Nach der Konstruktion und dem Bau eines Reaktors aus dem Hochleistungskunststoff Polytetrafluorethylen (PTFE), der allen Anforderungen eines CE-Konformitätsbewertungsverfahrens entspricht, wird eine hoch verdichtete Kollagen Typ I Matrix mit einer Stärke von 1 mm hergestellt. Diese kann über den Pro-zess der Lyophilisation auf 0,6 mm weiter reduziert werden. Es gelingt, die Matrix in einer Edelstahlhülse zu platzieren, über die mit Hilfe eines passgenauen Führungssta-bes die endoskopische Implantation in die Nukleuskavität erfolgen soll. Im Rahmen der Interkorporellen Fusionstage des Diakonie Klinikums Stuttgart wird das operative Handling an einem humanem Präparat simuliert. Die Implantation erfolgt offen über einen transforaminalen Zugang in zwei nukleotomierte Segmente der lumbalen Wir-belsäule. Die anwesenden Wirbelsäulenchirurgen beurteilen die Möglichkeit der endo-skopischen Applikation als positiv und machbar.
Durch den Zusatz des Polysaccharids Hyaluronsäure gelingt es, die Quelleigenschaften der hoch verdichteten Matrix zu steigern, so dass diese wie natives Nukleusgewebe in der Lage ist, Flüssigkeit in Ruhe wieder aufzunehmen. Das Quellpotential und die da-mit einhergehende Volumenzunahme nach Kompression sind für ein Nukleusersatzma-terial essentiell. Die hier verwendete Hyaluronsäure geht jedoch im offenen System der in vitro Inkubation innerhalb von 11 Tagen verloren. Dennoch zeigen sich weitere Vorteile gegenüber der Matrix ohne Hyaluronsäure-Zusatz innerhalb der Testungen heraus. Diese sind neben dem erhöhten Quellpotential z. B. eine gesteigerte Rate der Zellproliferation der verwendeten bovinen und humanen Bandscheibenzellen (bBSZ und hBSZ) sowie humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC), die über die Be-stimmung der Zellzahl und Viabilität ermittelt wird. Zudem zeigt sich eine gesteigerte mechanische Stabilität, die über die Spannungs-Kompressions-Messungen evaluiert wird. Über Lebend-/ Totfärbungen und Zytotoxizitätstests an Monolayerkulturen kann zudem nachgewiesen werden, dass die notwendige Endsterilisation durch γ-Bestrahlung zu keinen zytotoxischen Veränderungen der Matrix führt. Da die verdich-tete Implantatmatrix azellulär als Medizinprodukt der Klasse III eingesetzt werden soll, wird als ergänzende Matrix zur Füllung kleinster Hohlräume die zunächst flüssige ChondroFillerliquid Matrix (ein Knorpelersatzmaterial der Firma Amedrix GmbH, Esslin-gen) durch den Zusatz von Hyaluronsäure modifiziert und in der Zellkultur getestet. Da es sich hierbei um ein Zweikammerspritzensystem handelt, ist die Verwendung von Additiva wie z. B. Stammzellen technisch möglich. Die Ermittlung der maximalen Inku-bationszeit von Zellen in verschieden konzentrierten hyperosmotischen Neutralisations-lösungen ergibt eine Dauer von 5 min, bis irreversible Zellschäden auftreten. In Migra-tionsversuchen kann gezeigt werden, dass die ChondroFillerliquid Matrix als Konektiv zwischen nativem Nukleusgewebe und verdichteter Implantatmatrix fungiert. Des Wei-teren synthetisieren bBSZ, hBSZ und hMSC sulfatierte Glykosaminoglykane und behal-ten dabei ihr charakteristisches Genexpressionsprofil. Die chondrogene Differenzie-rung durch die Verwendung eines chondrogenen Differenzierungsmediums gelingt bei den hMSC bereits nach einer Kultivierungsdauer von 14 d. Die Zellverteilung in den Implantatmatrices und deren Morphologie entspricht dem nativen Nukleusgewebe. Die biomechanische Testung an einem international anerkannten Modellsystem für humane Wirbelsäulen – der Kalbswirbelsäule – ergibt, dass die Nukleotomie zu einer Erhöhung des Range of Motion (RoM) in alle Richtungen nach Flexion/Extension, Seit-neigung rechts/links und axiale Rotation rechts/links sowie zu einer Höhenreduktion des Segments im Vergleich zum Intaktzustand führt. Nach der Implantation der ver-dichteten Implantatmatrix wird der RoM deutlich reduziert. Das Segment weist dadurch eine hohe Steifigkeit ähnlich dem Intaktzustand auf. Die Höhenreduktion kann durch die Implantation beinahe vollständig wieder ausgeglichen werden. Im Rahmen der zyklischen Dauerbelastungen treten jedoch Implantatextrusionen auf. Zudem nimmt die Steifigkeit deutlich ab, der RoM hingegen wieder zu. Da das bovine Modell jedoch nicht der in vivo Situation entspricht und beispielsweise eine zunehmende In-tegration des Implantats durch Einwachsen nicht ermöglicht, ist die hohe Extrusionsra-te als nicht realistisch zu werten. Klinische Studien am Tier und Mensch müssen zeigen, inwieweit derartige Extrusionen ohne die Verwendung eines Anulusverschlußsystems auftreten.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, einen geeigneten Reaktor zu ent-wickeln und mit diesem eine biokompatible, stabile und quellfähige Matrix herzustel-len, die den Höhenverlust nach einer Nukleotomie auszugleichen vermag. Die modifi-zierte ChondroFillerliquid Matrix stellt eine ideale Ergänzung dar, da über diese Zellen oder andere Additiva verabreicht werden können und deren konektive Wirkung die Zellbesiedlung der azellulären Matrix begünstigt.
Die Identifikation der Bindungsspezifitäten von Proteininteraktionsdomänen und damit letztlich auch die Fähigkeit potentielle Bindungspartner dieser in vivo vorherzusagen bildet ein grundlegendes Element für das Verständnis der biologischen Funktionen dieser Domänen. In dieser Arbeit wurde untersucht, inwieweit solche Vorhersagen bezüglich der SH3-Domäne – als Beispiel für eine Proteininteraktionsdomäne – mithilfe von Support-Vector-Machines (SVMs) möglich sind, wenn diesen als Informationsquelle ausschließlich die innerhalb der Aminosäuresequenz der Domäne konservierten Informationen zur Verfügung stehen. Um den SVM-basierten Klassifikator zu trainieren und zu validieren, wurde ein Satz aus 51 SH3-Domänen verwendet, die zuvor entsprechend ihrer Ligandenpräferenz in ein System aus acht verschiedenen Klassen eingeteilt worden waren. Da die innerhalb der Aminosäuresequenzen konservierten Informationen in abstrakte Zahlenwerte konvertiert werden mussten (Voraussetzung für mathematisch basierte Klassifikatoren wie SVMs), wurde jede Aminosäuresequenz durch ihren jeweiligen Fisher-Score-Vektor ausgedrückt. Die Ergebnisse erbrachten einen Klassifikationserror, welcher weit unterhalb des Zufallsniveaus lag, was darauf hindeutet, dass sich die Bindungsspezifität (Klasse) einer SH3-Domäne in der Tat von seiner Aminosäuresequenz ableiten lassen dürfte. Mithilfe klassenspezifisch emittierter, artifizieller Sequenzen, implementiert in den Trainingsprozess des Klassifikators, um etwaigen nachteiligen Auswirkungen von Overfitting zu entgegenzuwirken, sowie durch Berücksichtigung taxonomischer Informationen des Klassensystems während Training und Validierung, ließ sich der Klassifikationserror sogar noch weiter senken und lag schließlich bei lediglich 35,29% (vergleiche Zufall: 7/8 = 87.50%). Auch die Nutzung von Feature Selections zur Abmilderung Overfitting-bedingter, negativer Effekte lieferte recht vielversprechende Ergebnisse, wenngleich ihr volles Potential aufgrund von Software-Beschränkungen nicht ausgenutzt werden konnte.
Die Analyse der Positionen im Sequence-Alignment, welche für den SVM- basierten Klassifikator am relevantesten waren, zeigte, dass diese häufig mit Positionen korrelierten, von denen angenommen wird auch in vivo eine Schlüsselrolle bei der Determination der Bindungsspezifität (Klasse) zu spielen. Dies unterstreicht nicht nur die Reliabilität des präsentierten Klassifikators, es gibt auch Grund zur Annahme, dass das Verfahren möglicherweise auch als Supplement anderer Ansätze genutzt werden könnte, welche zum Ziel haben die Positionen zu identifizieren, die die Ligandenpräferenz in vivo determinieren. Informationen, die nicht nur für ein besseres Verständnis der SH3-Domäne (und möglicherweise auch anderer Proteininteraktionsdomänen) von grundlegender Bedeutung sind, sondern auch aus pharmakologischer Sicht von großem Interesse sein dürften.
Chapter I
The gradual turnover of dead organic material into mineral nutrients is a key ecological function, linking decomposition and primary production, the essential parts of the nutrient-energy cycle. However, disturbances in terms of species or resource losses might impair the equilibrium between production and decomposition. Humanity has converted large proportions of natural landscapes and intensified land-use activity for food production. Globally, only very few areas are totally unaffected by human activity today.
To ensure the maintenance of both essential ecosystem services, knowledge about the interplay of biodiversity and ecosystem functioning as well as effects of intensified management on both is crucial. The vast majority of terrestrial biomass production as well as decomposition take place in forest ecosystems. Though forestry has a long sustainable history in Europe, its intensification during the last century has caused severe impacts on forest features and, consequently, on the associated biota, especially deadwood dependent organisms. Among these, saproxylic beetles are the most diverse group in terms of species numbers and functional diversity, but also most endangered due to habitat loss. These features classify them as ideal research organisms to study effects of intensified forestry on ecosystem services. The BELONGDEAD project located in Germany aimed to investigate deadwood decay and functional consequences of diversity changes in the associated fauna on the decomposition process from the initialisation of deadwood decay to complete degradation.
As part of the BeLongDead project, this dissertation focussed on saproxylic beetle species, thereby evaluating (1) regionally effects of tree species identity of fresh deadwood and (2) forest management of varying intensities on the diversity, abundance and community composition of saproxylic beetles (chapter II); (3) the specialisation degree of different trophic guilds of saproxylic beetles, and thus the stability and robustness of their interaction networks against disturbances (chapter III); (4) the impact of environmental features of local to regional spatial scales on species richness of saproxylic beetles differing in their habitat niche in terms of deadwood decay stages (chapter IV).
Chapter II
The vast majority of European forest ecosystems have been anthropogenically affected, leaving less than 1% of the about 1 milliard hectare as natural forests. A long history of forestry and especially the technological progress during the last century have caused massive habitat fragmentation as well as substantial loss of essential resources in European forest ecosystems. Due to this, the substrate-dependent group of saproxylic beetles has experienced severe species losses. Thus, investigations concerning saproxylic diversity and deadwood volume were badly needed. However, the importance of different deadwood in terms of tree species identity for the colonization by saproxylic beetles under different local and regional management regimes is poorly understood. Therefore, we studied possible regional differences in colonization patterns of saproxylic beetle species in a total of 688 fresh deadwood logs of 13 tree species in 9 sites of managed conifer and beech forests, and unmanaged beech forests, respectively. We found that tree species identity was an important driver in determining saproxylic species composition and abundance within fresh deadwood. However, saproxylic species showed different colonization patterns of deadwood items of the same tree species among the study regions. Regionally consistent, conifer forests were most diverse. We attribute the latter result to the historically adaption of saproxylic beetle species to semi-open forests, which conditions are actually best reflected by conifer forests. To preserve a diverse local species pool of early successional saproxylic beetles, we suggest an equal high degree of deadwood diversity in a tree species context in due consideration of regional differences.
Chapter III
The extinction risk of a particular species corresponds with its species-specific requirements on resources and habitat conditions, in other words with the width of the species` ecological niche. Species with a narrow ecological niche are defined as specialists. Members of this group experience higher extinction risk by resource limitation than generalists, which are able to utilize a variety of resources. For the classification of species as specialists or generalists, thus evaluating possible extinction risks, ecologists use the concept of interaction networks. This method has often been applied for mutualistic or antagonistic plant-animal interactions, but information for networks of detritivores is scarce. Therefore, saproxylic beetle species sampled as described in chapter II were categorised according to their larval diet; additionally their interaction networks (N=108) with 13 dead host tree species were analysed. Specialisation degree was highest for wood-digesting beetles and decreased with increasing trophic level. Also the network indices evaluating robustness and generality indicated a higher susceptibility to species extinctions for xylophagous than for mycetophagous and predatory beetles. The specialisation of xylophagous species on specific tree species might be an adaption to tree species specific ingredients stored for defence against pathogens and pests. However, we conclude that the high specialisation degree of xylophages and thus their higher extinction risk by resource loss harbours certain dangers for ecosystem function and stability as species diversity is positively linked to both.
Chapter IV
Populations depend on individual emigration and immigration events to ensure genetic exchange. For successful migration it is of utmost importance that spatially separated populations are obtainable by specimen. Migratory success depends on the one hand on the species dispersal abilities and on the other on the availability of suitable habitats in the surrounding landscape in which the distinct host populations exist. However, consequences of intensive forest management correspond not only to severe reduction of local deadwood amount, but, among others, also a change in tree species composition and high levels of fragmentation in the surrounding forest area. Saproxylic beetle species differ in their dispersal behaviour according to the temporal availability of their preferred habitat. Generally, early successional saproxylic beetles are able to disperse over large distances, whereas beetles inhabiting advanced decayed wood often remain close to their larval habitat. Due to this, environmental factors might affect saproxylic beetle guilds differently. We classified the saproxylic beetles sampled as described in chapter II according to their calculated habitat niche as early, intermediate or late successional saproxylic beetles. For the different guilds the effects of 14 environmental factors on different spatial scales (stand factors at 0.1 km radius, landscape composition at 2 km radius, and regionally differing abiotic factors in 400 km to 700 km distance) were investigated. Consistently for all guilds, species richness decreased with fragmentation at local and landscape scale, and increased in warmer climate. However, we found contradictory results between the guilds to some extent. We relate this to guild specific habitat requirements of the saproxylic beetles. Therefore, for the development of appropriate conservation practices guild-specific requirements saproxylic beetles have to be considered not only locally but on larger spatial scales.
Chapter V
In conclusion, this dissertation identified main drivers of early successional saproxylic beetle species richness on various spatial scales. Our results emphasize the importance to develop management schemes meeting species-specific and guild-specific habitat requirements of the saproxylic beetle fauna at relevant spatial and temporal scales. Therefore, short-term actions suggested for sustainable forest management should be the focus on a diverse tree species composition consisting of indigenous tree species with respect to regional differences. Moreover, senescent trees, fallen and standing deadwood should remain in the forests, and some tree individuals should be allowed to grow old. Long-term actions should involve the reduction of forest fragmentation and the connection of spatial widely separated forest fragments. Furthermore, to fully understand the effects of forest management long-term research should be conducted to compare habitat requirements of intermediate and late successional beetles with the results presented in this dissertation.
Since more than two centuries naturalists are fascinated by the profound changes in biodiversity observed along climatic gradients. Although the theories explaining changes in the diversity and the shape of organisms along climatic gradients belong to the foundations of modern ecology, our picture on the spatial patterns and drivers of biodiversity is far from being complete. Ambiguities in theory and data are common and past work has been strongly concentrated on plants and vertebrates. In the last two decades, interest in the fundamental processes structuring diversity along climatic gradients gained new impetus as they are expected to improve our understanding about how ecosystems will respond to global environmental changes. Global temperatures are rising faster than ever before; natural habitats are transformed into agricultural land and existing land use systems get more and more intensified to meet the demands of growing human populations. The fundamental shifts in the abiotic and biotic environment are proclaimed to affect ecosystems all over the world; however, precise predictions about how ecosystems respond to global changes are still lacking. We investigated diversity, traits and ecosystem services of wild bees along climate and land use gradients on Mount Kilimanjaro (Tanzania, East Africa). Wild bees play a major role in ecosystems, as they contribute to the reproduction and performance of wild and crop plants. Their responsiveness to environmental changes is therefore of high ecological and economic importance.
Temperature and energy resources have often been suggested to be the main determinants of global and local species richness, but the mechanisms behind remain poorly understood. In the study described in chapter II we analyzed species richness patterns of wild bees along climate and land use gradients on Mount Kilimanjaro and disentangled the factors explaining most of the changes in bee richness. We found that floral resources had a weak but significant effect on pollinator abundance, which in turn was positively related to species richness. However, temperature was the strongest predictor of species richness, affecting species richness both directly and indirectly by positively influencing bee abundances. We observed higher levels of bee-flower-interactions at higher temperatures, independently of flower and bee abundances. This suggests that temperature restricts species richness by constraining the exploitation of resources by ectotherms. Current land use did not negatively affect species richness. We conclude that the richness of bees is explained by both temperature and resource availability, whereas temperature plays the dominant role as it limits the access of ectotherms to floral resources and may accelerate ecological and evolutionary processes that drive the maintenance and origination of diversity.
Not only species numbers, but also morphological traits like body size are expected to be shaped by both physiological and energetic constraints along elevational gradients. Paradoxically, Bergmann´s rule predicts increases of body sizes in cooler climates resulting from physiological constraints, while species-energy theory suggests declines in the mean body size of species caused by increased extinction probabilities for large-bodied species in low-energy habitats. In chapter III we confronted this ambiguity with field data by studying community-wide body size variation of wild bees on Mt. Kilimanjaro. We found that along a 3680 m elevational gradient bee individuals became on average larger within species, while large species were increasingly absent from high-elevational communities. This demonstrates, on the one hand, how well-established, but apparently contrasting ecological theories can be merged through the parallel consideration of different levels of biological organization. On the other hand it signals that the extinction risk in the course of environmental change is not equally distributed among species within a community.
Land use intensification is known to threaten biodiversity, but the consequences for ecosystem services are still a matter of debate. In chapter IV, we experimentally tested the single and combined contributions of pest predators and pollinators to coffee production along a land use intensification gradient on Mount Kilimanjaro. We found that pest predation increased fruit set by on average 9%, while pollination increased fruit weight of coffee by on average 7.4%. Land use had no significant effect on both ecosystem services. However, we found that in coffee plantations with most intensified land use, pollination services were virtually exclusively provided by the honey bee (Apis mellifera). The reliance on a single pollinator species is risky, as possible declines of that species may directly lower pollination services, resulting in yield losses. In contrast, pollination services in structurally complex homegardens were found to be provided by a diverse pollinator community, increasing the stability of pollination services in a long term.
We showed that on Mount Kilimanjaro pollinator communities changed along elevational gradients in terms of species richness (chapter II) and trait composition (chapter III). Temperature and the temperature-mediated accessibility of resources were identified as important predictors of these patterns, which contributes to our fundamental understanding about the factors that shape ectothermic insect communities along climatic gradients. The strong temperature-dependence of pollinators suggests that temperature shifts in the course of global change are likely to affect pollinator communities. Pollinators might either profit from rising temperatures, or shift to higher elevations, which could result in related biotic attrition in the lowland with consequences for the provision of ecosystem services in cropping systems. Up to now, land use intensification had no significant impact on the diversity of pollinator communities and their ecosystem services. Pollinators might profit from the strong landscape heterogeneity in the region and from the amount of flower resources in the understory of cropping systems. However,progressing homogenization of the landscape and the pronounced application of pesticides could result in reduced diversity and dominance of single species, as we already found in sun coffee plantations. Such shifts in community compositions could threaten the stability of ecosystem services within cropping and natural systems in a long term.
Fbw7, the substrate recognition subunit of SCF(Fbw7) ubiquitin ligase, mediates the turnover of multiple proto-oncoproteins and promotes its own degradation. Fbw7-dependent substrate ubiquitination is antagonized by the Usp28 deubiquitinase. Here, we show that Usp28 preferentially antagonizes autocatalytic ubiquitination and stabilizes Fbw7, resulting in dose-dependent effects in Usp28 knockout mice. Monoallelic deletion of Usp28 maintains stable Fbw7 but drives Fbw7 substrate degradation. In contrast, complete knockout triggers Fbw7 degradation and leads to the accumulation of Fbw7 substrates in several tissues and embryonic fibroblasts. On the other hand, overexpression of Usp28 stabilizes both Fbw7 and its substrates. Consequently, both complete loss and ectopic expression of Usp28 promote Ras-driven oncogenic transformation. We propose that dual regulation of Fbw7 activity by Usp28 is a safeguard mechanism for maintaining physiological levels of proto-oncogenic Fbw7 substrates, which is equivalently disrupted by loss or overexpression of Usp28.
Clinical prognosis of metastasized colorectal carcinoma (CRC) is still not at desired levels and novel drugs are needed. Here, we focused on the multi-tyrosine kinase inhibitor E7080 (Lenvatinib) and assessed its therapeutic efficacy against human CRC cell lines in vitro and human CRC xenografts in vivo. The effect of E7080 on cell viability was examined on 10 humanCRCcell lines and humanendothelial cells (HUVEC). The inhibitory effect of E7080 on VEGF-induced angiogenesis was studied in an ex vivo mouse aortic ring angiogenesis assay. In addition, the efficacy of E7080 against xenografts derived fromCRC cell lines and CRC patient resection specimenswithmutated KRASwas investigated in vivo. Arelatively low cytotoxic effect of E7080 on CRC cell viabilitywas observed in vitro. Endothelial cells (HUVEC)weremore susceptible to the incubation with E7080. This is in line with the observation that E7080 demonstrated an anti-angiogenic effect in a three-dimensional ex vivo mouse aortic ring angiogenesis assay. E7080 effectively disrupted CRC cell-mediated VEGF-stimulated growth of HUVEC in vitro. Daily in vivo treatment with E7080 (5 mg/kg) significantly delayed the growth of KRAS mutated CRC xenografts with decreased density of tumor-associated vessel formations and without tumor regression. This observation is in line with results that E7080 did not significantly reduce the number of Ki67-positive cells in CRC xenografts. The results suggest antiangiogenic activity of E7080 at a dosage thatwas well tolerated by nudemice. E7080 may provide therapeutic benefits in the treatment of CRC with mutated KRAS.
WISP3 is a member of the CCN family which comprises six members found in the 1990’s: Cysteine-rich,angiogenic inducer 61 (CYR61, CCN1), Connective tissue growth factor (CTGF, CCN2), Nephroblastoma overexpressed (NOV, CNN3) and the Wnt1 inducible signalling pathway protein 1-3 (WISP1-3, CCN4-6).They are involved in the adhesion, migration, mitogenesis, chemotaxis, proliferation, cell survival, angiogenesis, tumorigenesis, and wound healing by the interaction with different integrins and heparan sulfate proteoglycans. Until now the only member correlated to the musculoskeletal autosomal disease Progressive Pseudorheumatoid Dysplasia (PPD) is WISP3. PPD is characterised by normal embryonic development followed by cartilage degradation over time starting around the age of three to eight years. Animal studies in mice exhibited no differences between knock out or overexpression compared to wild type litter mates, thus were not able to reproduce the symptoms observed in PPD patients. Studies in vitro and in vivo revealed a role for WISP3 in antagonising BMP, IGF and Wnt signalling pathways. Since most of the knowledge of WISP3 was gained in epithelial cells, cancer cells or chondrocyte cell lines, we investigated the roll of WISP3 in primary human mesenchymal stem cells (hMSCs) as well as primary chondrocytes.
WISP3 knock down was efficiently established with three short hairpin RNAs in both cell types, displaying a change of morphology followed by a reduction in cell number. Simultaneous treatment with recombinant WISP3 was not enough to rescue the observed phenotype nor increase the endogenous expression of WISP3. We concluded that WISP3 acts as an essential survival factor, where the loss resulted in the passing of cell cycle control points followed by apoptosis. Nevertheless, Annexin V-Cy3 staining and detection of active caspases by Western blot and immunofluorescence staining detected no clear evidence for apoptosis. Furthermore, the gene expression of the death receptors TRAILR1 and TRAILR2,important for the extrinsic activation of apoptosis, remained unchanged during WISP3 mRNA reduction. Autophagy as cause of cell death was also excluded, given that the autophagy marker LC3 A/B demonstrated to be uncleaved in WISP3-deficient hMSCs. To reveal correlated signalling pathways to WISP3 a whole genome expression analyses of WISP3-deficient hMSCs compared to a control (scramble) was performed. Microarray analyses exhibited differentially regulated genes involved in cell cycle control, adhesion, cytoskeleton and cell death. Cell death observed by WISP3 knock down in hMSCs and chondrocytes might be explained by the induction of necroptosis through the BMP/TAK1/RIPK1 signalling axis. Loss of WISP3 allows BMP to bind its receptor activating the Smad 2/3/4 complex which in turn can activate TAK1 as previously demonstrated in epithelial cells. TAK1 is able to block
caspase-dependent apoptosis thereby triggering the assembly of the necrosome resulting in cell death by necroptosis.
Together with its role in cell cycle control and extracellular matrix adhesion, as demonstrated in human mammary epithelial cells, the data supports the role of WISP3 as tumor suppressor and survival factor in cells of the musculoskeletal system as well as epithelial cells.
Assistierte Reproduktionstechniken (ARTs) zur Behandlung von Infertilität werden mit einer erhöhten Häufigkeit von epigenetischen Aberrationen während der Gametogenese und der frühen Embryonalentwicklung in Verbindung gebracht, speziell durch eine Beeinträchtigung von geprägten Genen. Die in vitro-Maturation (IVM) von Eizellen ist eine ART, die bereits routinemäßig zur Reproduktion von ökonomisch wertvollen Zuchttieren wie dem Hausrind (Bos taurus) eingesetzt wird. IVM-Oozyten weisen jedoch eine verringerte Entwicklungs-kompetenz zum Blastozystenstadium dar, welche möglicherweise auf eine beeinträchtigte epigenetische Regulation zurückzuführen ist.
Von allen bekannten epigenetischen Mechanismen ist die DNA-Methylierung die meist untersuchte DNA-Modifikation. In dieser Arbeit wurden zur Klärung der Frage nach den Auswirkungen der IVM auf die DNA-Methylierung geprägter als auch nicht geprägter Gene Oozyten des Hausrinds analysiert. Diese Tierart weist eine ähnliche Präimplantations-entwicklung und Tragezeit wie der Mensch auf und wird daher zunehmend als Modell zum Studium der humanen Keimzell- und Embryonalentwicklung herangezogen. Im Gegensatz zu Mensch und Maus gibt es bislang nur wenig Information über bovine geprägte Gene. Das erste Ziel der hier dargestellten Forschungsarbeiten war daher die Identifizierung und Charakterisierung der bovinen differenziell methylierten Regionen (DMRs) der drei geprägten Genorte von IGF2/H19, SNRPN und PEG3, welche mit Imprintingdefekten des Menschen und/oder im Mausmodell assoziiert werden. Die hier erstmalig erfolgte Beschreibung von mehreren intergenischen DMRs mittels Bisulfitsequenzierung und Pyrosequenzierung belegt die Existenz und evolutionäre Konservierung der IGF2/H19-Imprintingkontrollregion (ICR) beim Rind. Der geprägte Zustand der IGF2/H19-ICR sowie der bovinen Gene SNRPN und PEG3 wurde durch den Nachweis differenzieller Methylierung in plazentalen und somatischen Geweben sowie in Spermien und parthenogenetischen Embryonen bestätigt. Die beobachteten Methylierungsprofile waren typisch für genomische Prägung.
Die direkte Bisulfitsequenzierung nach vorangegangener Limiting Dilution (LD) erlaubt die Analyse von Methylierungsmustern einzelner Allele (DNA-Moleküle) von einigen wenigen oder auch nur einer einzigen Zelle (El Hajj et al., 2011). In einem ersten LD-Versuch an bovinen Oozyten wurden die drei vorab charakterisierten und geprägten Gene hinsichtlich möglicher epigenetischer Veränderungen untersucht, welche durch verschiedene IVM-Bedingungen und -Medien (TCM und mSOF) hervorgerufen werden könnten. Die Gesamtrate von Methylierungsfehlern einzelner CpG-Stellen sowie die von ganzen Allelen (Imprintingfehlern) unterschied sich nicht wesentlich zwischen den beiden IVM-Gruppen und der in vivo-Gruppe. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die gängigen IVM-Protokolle keinen oder nur einen geringfügigen Einfluss auf diese entscheidenden epigenetischen Markierungen haben.
IVM-Oozyten präpuberaler Kälber weisen eine herabgesetzte Entwicklungskompetenz im Vergleich zu IVM-Oozyten aus adulten Tieren auf. Aus diesem Grund wurde in einem zweiten LD-Versuchsansatz die Promotormethylierung von drei entwicklungsrelevanten, nicht geprägten Genen (SLC2A1, PRDX1, ZAR1) nach ovarieller Stimulation mit FSH und/oder IGF1 untersucht. Sowohl ungereifte als auch in vitro-gereifte Oozyten präpuberaler und adulter Kühe zeigten eine deutliche, unbeeinträchtige Hypomethylierung der drei Genpromotoren ohne jegliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Alterstypen der Spendertiere oder deren Behandlung. Weder das Alter, die hormonelle Stimulation noch die IVM scheinen somit einen Einfluss auf den Methylierungsstatus dieser drei Gene zu haben.
Zusammenfassend spiegelte sich die reduzierte Entwicklungsfähigkeit von IVM-Eizellen aus adulten und präpuberalen Kühen nicht in abnormalen Methylierungsmustern der untersuchten geprägten und ungeprägten Gene wider. Dies lässt auf eine generelle Stabilität der etablierten DNA-Methylierungsprofile in Oozyten schließen. Aus diesem Grund müssen andere epigenetische Mechanismen als die DNA-Methylierung wie beispielsweise ncRNAs oder Histonmodifikationen zur Reduktion der Entwicklungskompetenz von präpuberalen und IVM-Oozyten beitragen. Diese Veränderungen behindern mutmaßlich die zytoplasmatische Reifung der Eizelle, welche wiederum zu einer späteren Beeinträchtigung der Entwicklung der Zygote und des Embryos führt.
Retroviral vectors are potent tools for gene delivery and various biomedical applications. To accomplish a gene transfer task successfully, retroviral vectors must effectively transduce diverse cell cultures at different phases of a cell cycle. However, very promising retroviral vectors based on the foamy viral (FV) backbone lack the capacity to efficiently transduce quiescent cells. It is hypothesized that this phenomenon might be explained as the inability of foamy viruses to form a pre-integration complex (PIC) with nuclear import activity in growth-arrested cells, which is the characteristic for lentiviruses (HIV-1). In this process, the HIV-1 central polypurine tract (cPPT) serves as a primer for plus-strand synthesis to produce a “flap” element and is believed to be crucial for the subsequent double-stranded cDNA formation of all retroviral RNA genomes. In this study, the effects of the lentiviral cPPT element on the FV transduction potential in dividing and growth-arrested (G1/S phase) adenocarcinomic human alveolar basal epithelial (A549) cells are investigated by experimental and theoretical methods. The results indicated that the HIV-1 cPPT element in a foamy viral vector background will lead to a significant reduction of the FV transduction and viral titre in growth-arrested cells due to the absence of PICs with nuclear import activity.
Virotherapy on the basis of oncolytic vaccinia virus (VACV) infection is a promising approach for cancer therapy. In this study we describe the establishment of a new preclinical model of feline mammary carcinoma (FMC) using a recently established cancer cell line, DT09/06. In addition, we evaluated a recombinant vaccinia virus strain, GLV-5b451, expressing the anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) single-chain antibody (scAb) GLAF-2 as an oncolytic agent against FMC. Cell culture data demonstrate that GLV-5b451 virus efficiently infected, replicated in and destroyed DT09/06 cancer cells. In the selected xenografts of FMC, a single systemic administration of GLV-5b451 led to significant inhibition of tumor growth in comparison to untreated tumor-bearing mice. Furthermore, tumor-specific virus infection led to overproduction of functional scAb GLAF-2, which caused drastic reduction of intratumoral VEGF levels and inhibition of angiogenesis.
In summary, here we have shown, for the first time, that the vaccinia virus strains and especially GLV-5b451 have great potential for effective treatment of FMC in animal model.
We have discovered a new mechanism of monoallelic gene expression that links antigenic variation, cell cycle, and development in the model parasite Trypanosoma brucei. African trypanosomes possess hundreds of variant surface glycoprotein (VSG) genes, but only one is expressed from a telomeric expression site (ES) at any given time. We found that the expression of a second VSG alone is sufficient to silence the active VSG gene and directionally attenuate the ES by disruptor of telomeric silencing-1B (DOT1B)-mediated histone methylation. Three conserved expression-site-associated genes (ESAGs) appear to serve as signal for ES attenuation. Their depletion causes G1-phase dormancy and reversible initiation of the slender-to-stumpy differentiation pathway. ES-attenuated slender bloodstream trypanosomes gain full developmental competence for transformation to the tsetse fly stage. This surprising connection between antigenic variation and developmental progression provides an unexpected point of attack against the deadly sleeping sickness.
Eye structure, activity rhythms, and visually-driven behavior are tuned to visual niche in ants
(2014)
Insects have evolved physiological adaptations and behavioral strategies that allow them to cope with a broad spectrum of environmental challenges and contribute to their evolutionary success. Visual performance plays a key role in this success. Correlates between life style and eye organization have been reported in various insect species. Yet, if and how visual ecology translates effectively into different visual discrimination and learning capabilities has been less explored. Here we report results from optical and behavioral analyses performed in two sympatric ant species, Formica cunicularia and Camponotus aethiops. We show that the former are diurnal while the latter are cathemeral. Accordingly, F. cunicularia workers present compound eyes with higher resolution, while C. aethiops workers exhibit eyes with lower resolution but higher sensitivity. The discrimination and learning of visual stimuli differs significantly between these species in controlled dual-choice experiments: discrimination learning of small-field visual stimuli is achieved by F. cunicularia but not by C. aethiops, while both species master the discrimination of large-field visual stimuli. Our work thus provides a paradigmatic example about how timing of foraging activities and visual environment match the organization of compound eyes and visually-driven behavior. This correspondence underlines the relevance of an ecological/evolutionary framework for analyses in behavioral neuroscience.
An in vivo model of antiangiogenic therapy allowed us to identify genes upregulated by bevacizumab treatment, including Fatty Acid Binding Protein 3 (FABP3) and FABP7, both of which are involved in fatty acid uptake. In vitro, both were induced by hypoxia in a hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1 alpha)-dependent manner. There was a significant lipid droplet (LD) accumulation in hypoxia that was time and O-2 concentration dependent. Knockdown of endogenous expression of FABP3, FABP7, or Adipophilin (an essential LD structural component) significantly impaired LD formation under hypoxia. We showed that LD accumulation is due to FABP3/7-dependent fatty acid uptake while de novo fatty acid synthesis is repressed in hypoxia. We also showed that ATP production occurs via beta-oxidation or glycogen degradation in a cell-type-dependent manner in hypoxia-reoxygenation. Finally, inhibition of lipid storage reduced protection against reactive oxygen species toxicity, decreased the survival of cells subjected to hypoxia-reoxygenation in vitro, and strongly impaired tumorigenesis in vivo.
Insects of the order Orthoptera are well-known for their acoustic communication. The structures used for this purpose show a high diversity which obviously relates to differences in song parameters and to the physics of sound production. Here we describe song and morphology of the sound producing organs of a tropical bush-cricket, Ectomoptera nepicauda, from East Africa. It has a very unusual calling song consisting of frequency-modulated, pure-tone sounds in the high ultrasonic range of 80 to 120 kHz and produced by extremely fast wing movements. Concerning morphology, it represents the most extreme state in the degree of left-right fore-wing differentiation found among Orthoptera: the acoustic parts of the left fore-wing consist exclusively of the stridulatory file, comparable in function to the bow of a violin, while the right wing carries only the plectrum (= string) and mirror (= soundbox).
Cell growth and cell division are two interconnected yet distinct processes. Initiation of proliferation of central brain progenitor cells (neuroblasts) after the late embryonic quiescence stage requires cell growth, and maintenance of proper cell size is an important prerequisite for continuous larval neuroblast proliferation. Beside extrinsic nutrition signals, cell growth requires constant supply with functional ribosomes to maintain protein synthesis.
Mutations in the mushroom body miniature (mbm) gene were previously identified in a screen for structural brain mutants. This study focused on the function of the Mbm protein as a new nucleolar protein, which is the site of ribosome biogenesis. The comparison of the relative expression levels of Mbm and other nucleolar proteins in different cell types showed a pronounced expression of Mbm in neuroblasts, particularly in the fibrillar component of the nucleolus, suggesting that in addition to nucleolar components generally required for ribosome biogenesis, more neuroblast specific nucleolar factors exist. Mutations in mbm cause neuroblast proliferation defects but do not interfere with cell polarity, spindle orientation or asymmetry of cell division of neuroblasts. Instead a reduction in cell size was observed, which correlates with an impairment of ribosome biogenesis. In particular, loss of Mbm leads to the retention of the small ribosomal subunit in the nucleolus resulting in decreased protein synthesis. Interestingly, the defect in ribosome biogenesis was only observed in neuroblasts. Moreover, Mbm is apparently not required for cell size and proliferation control in wing imaginal disc and S2 cells supporting the idea of a neuroblast-specific function of Mbm.
Furthermore, the transcriptional regulation of the mbm gene and the functional relevance of posttranslational modifications were analyzed. Mbm is a transcriptional target of dMyc. A common feature of dMyc target genes is the presence of a conserved E-box sequence in their promoter regions. Two E-box motifs are found in the vicinity of the transcriptional start site of mbm. Gene reporter assays verified that only one of them mediates dMyc-dependent transcription. Complementary studies in flies showed that removal of dMyc function in neuroblasts resulted in reduced Mbm expression levels.
At the posttranslational level, Mbm becomes phosphorylated by protein kinase CK2. Six serine and threonine residues located in two acidic amino acid rich clusters in the C-terminal half of the Mbm protein were identified as CK2 phosphorylation sites.
Mutational analysis of these sites verified their importance for Mbm function in vivo and indicated that Mbm localization is controlled by CK2-mediated phosphorylation.
Although the molecular function of Mbm in ribosome biogenesis remains to be determined, the results of this study emphasize the specific role of Mbm in neuroblast ribosome biogenesis to control cell growth and proliferation.
Murine embryonale Stammzellen (ES-Zellen) stellen mit ihrem Selbsterneuerungs- und Differenzierungspotenzial einen einzigartigen Zelltyp für die Grundlagenforschung und angewandte Wissenschaften dar. Auf Grund ihrer Fähigkeit, in vitro die embryonale Entwicklung eines Organismus nachzuahmen, sind sie für die Untersuchung der Zell-Differenzierung, wie z.B. der embryonalen Hämatopoese geeignet. Während der ES-Zell-Selbsterneuerung und -Differenzierung spielen epigenetischen Modifikationen, unter anderem Histon-Methylierungen, eine wichtige Rolle. Transkriptionell aktivierende (H3K4me2/3, di- bzw. trimethyliertes Lysin 4 an Histon 3) und reprimierende (H3K27me2/3; di- bzw. trimethyliertes Lysin 27 an Histon 3) Histon-Methylierungs-Muster und die epigenetische Gen-Regulierung werden unter anderem durch die entgegenwirkenden PcG- und MLL-Protein-Komplexe koordiniert. Die H3K27me2/3-spezifische Demethylase UTX/KDM6A ist eine Komponente des MLL-Komplexes und somit an aktivierenden Gen-Regulationsmechanismen beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit war es mein Ziel zu untersuchen, inwieweit UTX für die Aufrechterhaltung der ES-Zell-Pluripotenz und für die ES-Zell-Differenzierung, insbesondere die hämatopoetische Differenzierung, von Bedeutung ist. Meine Daten zeigten, dass UTX in undifferenzierten ES-Zellen, während der ES-Zell-Differenzierung und in adulten Geweben ubiquitär exprimiert ist. Um Aufschluss über die UTX-Funktion zu bekommen, wurde UTX in ES-Zellen mittels RNA-Interferenz und Gene-Targeting gezielt ablatiert. Genexpressions-Analysen zeigten, dass die Expression von Pluripotenzgenen, genauso wie die Zellproliferation und die Verteilung der Zellzyklus-Phasen in ES-Zellen durch den Verlust von UTX unbeeinflusst blieben, während globale H3K4me3- sowie H3K27me3-Level reduziert waren. Während der ES-Zell-Differenzierung konnte ich eine verminderte Induktion der mesodermalen und hämatopoetischen Marker Flk1, Brachyury, Runx1 und Gata1 beobachten. Zudem war die Expression von UTY, dem auf dem Y-Chromosom kodierten UTX-Homolog, in ES-Zellen und während der Differenzierung runterreguliert, was auf eine Regulierung durch UTX schließen lässt. Des Weiteren zeigten UTX-Knockdown und –Knockout-Zellen in funktionellen hämatopoetischen in vitro Assays eine verminderte Fähigkeit, Blast-Kolonien und hämatopoetische Vorläuferzellen zu generieren. Interessanterweise zeigten ChIP-Analysen in differenzierenden wt und UTX-Knockout-EBs unveränderte H3K27me3-Level an Promotoren der hämatopoetischen Gene, was auf eine Demethylase-unabhängige Funktion von UTX während der frühen Hämatopoese hindeutet. Um die Funktion von UTX während der Entwicklung in vivo, insbesondere während der embryonalen Hämatopoese, untersuchen zu können, habe ich eine konditionelle UTX-Knockout-Maus hergestellt, die für eine gezielte UTX-Deletion im hämatopoetischen System verwendet wird. Zusammenfassend zeigen meine Daten, dass UTX für die ES-Zell-Proliferation und –Pluripotenz unbedeutend ist und die Reduzierung der H3K27-Trimethylierung auch bei fehlendem UTX weiterhin herbeigeführt werden kann. Im Gegensatz dazu übernimmt UTX eine entscheidende Rolle während der mesodermalen und hämatopoetischen ES-Zell-Differenzierung, vermutlich über eine Histon-Demethylase-unabhängige Funktion.
The embryonic vertebrate heart tube develops an atrioventricular canal that divides the atrial and ventricular chambers, forms atrioventricular conduction tissue and organizes valve development. Here we assess the transcriptional mechanism underlying this localized differentiation process. We show that atrioventricular canal-specific enhancers are GATA-binding site-dependent and act as switches that repress gene activity in the chambers. We find that atrioventricular canal-specific gene loci are enriched in H3K27ac, a marker of active enhancers, in atrioventricular canal tissue and depleted in H3K27ac in chamber tissue. In the atrioventricular canal, Gata4 activates the enhancers in synergy with Bmp2/Smad signalling, leading to H3K27 acetylation. In contrast, in chambers, Gata4 cooperates with pan-cardiac Hdac1 and Hdac2 and chamber-specific Hey1 and Hey2, leading to H3K27 deacetylation and repression. We conclude that atrioventricular canal-specific enhancers are platforms integrating cardiac transcription factors, broadly active histone modification enzymes and localized co-factors to drive atrioventricular canal-specific gene activity.
The initial stages of the interaction between the host and Aspergillus fumigatus at the alveolar surface of the human lung are critical in the establishment of aspergillosis. Using an in vitro bilayer model of the alveolus, including both the epithelium (human lung adenocarcinoma epithelial cell line, A549) and endothelium (human pulmonary artery epithelial cells, HPAEC) on transwell membranes, it was possible to closely replicate the in vivo conditions. Two distinct sub-groups of dendritic cells (DC), monocyte-derived DC (moDC) and myeloid DC (mDC), were included in the model to examine immune responses to fungal infection at the alveolar surface. RNA in high quantity and quality was extracted from the cell layers on the transwell membrane to allow gene expression analysis using tailored custom-made microarrays, containing probes for 117 immune-relevant genes. This microarray data indicated minimal induction of immune gene expression in A549 alveolar epithelial cells in response to germ tubes of A. fumigatus. In contrast, the addition of DC to the system greatly increased the number of differentially expressed immune genes. moDC exhibited increased expression of genes including CLEC7A, CD209 and CCL18 in the absence of A. fumigatus compared to mDC. In the presence of A. fumigatus, both DC subgroups exhibited up-regulation of genes identified in previous studies as being associated with the exposure of DC to A. fumigatus and exhibiting chemotactic properties for neutrophils, including CXCL2, CXCL5, CCL20, and IL1B. This model closely approximated the human alveolus allowing for an analysis of the host pathogen interface that complements existing animal models of IA.
Similarity between odours is notoriously difficult to measure. Widely used behavioural approaches in insect olfaction research are cross-adaptation, masking, as well as associative tasks based on olfactory learning and the subsequent testing for how specific the established memory is. A concern with such memory-based approaches is that the learning process required to establish an odour memory may alter the way the odour is processed, such that measures of perception taken at the test are distorted. The present study was therefore designed to see whether behavioural judgements of perceptual distance are different for two different memory-based tasks, namely generalization and discrimination. We used odour-reward learning in larval Drosophila as a study case. In order to challenge the larvae's olfactory system, we chose to work with binary mixtures and their elements (1-octanol, n-amyl acetate, 3-octanol, benzaldehyde and hexyl acetate). We determined the perceptual distance between each mixture and its elements, first in a generalization task, and then in a discrimination task. It turns out that scores of perceptual distance are correlated between both tasks. A re-analysis of published studies looking at element-to-element perceptual distances in larval reward learning and in adult punishment learning confirms this result. We therefore suggest that across a given set of olfactory stimuli, associative training does not grossly alter the pattern of perceptual distances.