Institut für Klinische Biochemie und Pathobiochemie
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Die Rolle des Proteins VASP für die Proliferation und Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen
(2005)
Im Rahmen der Arbeit wurden in mehreren Teilprojekten die Eigenschaften und Funktionen des Vasodilatator stimulierenden Phosphoproteins (VASP) untersucht. Es wurde ein neuer Antikörper (5C6) charakterisiert, der für an Serin157 phosphoryliertes VASP spezifisch sein sollte. Es konnte gezeigt werden, dass der 5C6 Antikörper spezifisch VASP erkennt, welches an der Stelle Serin157 phosphoryliert ist. Auch konnten mit dem neuen Antikörper Ergebnisse bestätigt werden, die vorher mit anderen Methoden erhoben wurden, nämlich, dass Serin157 sowohl cAMP- als auch cGMP-vermittelt phosphoryliert wird. Der Antikörper 5C6 stellte sich als ein guter Marker für die Phosphorylierung von VASP an Serin157 durch die PKA dar und ermöglichte, die Zeitkinetik der VASP-Phosphorylierung zu beschreiben. In einem weiteren Projekt wurde die Rolle des Proteins VASP bei der Proliferation und Differenzierung von Knochenmark-Stammzellen zu Megakaryozyten und Thrombozyten untersucht. Die Stammzellen wurden zusätzlich zu Wachstumsfaktoren mit unterschiedlichen Dosen eines cGMP-Analogons stimuliert. Es zeigte sich hierbei, dass 8-pCPT-cGMP einen dualen, konzentrationsabhängigen Effekt auf die Proliferation und die Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen von Wildtypmäusen hat. Niedrige Dosen hemmten die Proliferation und förderten die Differenzierung, dagegen hatten höhere Konzentrationen einen proliferationsfördernden und differenzierungshemmenden Effekt auf die Stammzellen. Im Vergleich hierzu ergab eine Stimulation mit 8-pCPT-cGMP bei VASP knock out Mäusen immer einen proliferationsfördernden Effekt, hingegen einen hemmenden Effekt auf die Differenzierung der hämatopoetischen Stammzellen. Bei den knock out Zellen führten höhere Konzentrationen lediglich zu einer stärkeren Reaktion als niedrige.
Die Analyse des Phosphoproteoms in ruhenden und in aktivierten humanen Plättchen führte zur Identifikation des PITPnm2-Proteins. Dieses Protein wird bei einer Stimulation von Thrombozyten mit dem Prostazyklinanalogon Iloprost phosphoryliert. Diese Ergebnisse gaben Anlass zu weiteren Untersuchungen zum Vorkommen und zur Funktion dieses Proteins in Thrombozyten. In der Arbeit wurde gezeigt, dass das PITPnm2-Protein das einzige Protein der PITP-Familie ist, welches in humanen Thrombozyten exprimiert wird. Die membranassoziierten Phosphatidylinositol-Transfer-Proteine PITPnm1 und PITPnm3 sind auf cDNA-Ebene nicht in Thrombozyten nachweisbar. Von den drei zur Zeit der Untersuchung bekannten Splicevarianten des PITPnm2-Proteins konnten zwei Varianten in Thrombozyten mittels RT-PCR identifiziert werden. Diese zwei Varianten unterscheiden sich durch ein unterschiedlich exprimiertes Exon, welches im zentralen Teil des Proteins liegt. Ein weiteres Spliceprodukt, dem die Aminosäuren 50 bis 328 im vorderen Teil des Proteins fehlen, wird nicht in Thrombozyten exprimiert. PITPNM2 (Splicevariante 1) wurde als Fusionsprotein mit einem sogenannten „Flag-Tag“ kloniert und in Eukaryonten exprimiert (pCMV-SC-CF, Stratagene). Mit dem rekombinanten Fusionsprotein wurden gegen PITPnm2 gerichtete Antikörper getestet. Der Vergleich mit Flag-Tag-spezifischen Antikörpern zeigte, dass der PITPnm2-spezifische Antikörper zahlreiche Banden detektiert und für weitere Untersuchungen nicht geeignet ist. Dieser PITPnm2-Klon wird auch in weiterführenden Arbeiten eingesetzt werden, die sich mit der Identifizierung der Interaktionspartner dieses Proteins, der subzellulären Lokalisierung und der Teilnahme des Proteins an spezifischen Zell-Signalwegen beschäftigen werden.
Background
While hypercholesterolemia plays a causative role for the development of ischemic stroke in large vessels, its significance for cerebral small vessel disease (CSVD) remains unclear. We thus aimed to understand the detailed relationship between hypercholesterolemia and CSVD using the well described Ldlr\(^{−/-}\) mouse model.
Methods
We used Ldlr\(^{−/-}\) mice (n = 16) and wild-type (WT) mice (n = 15) at the age of 6 and 12 months. Ldlr\(^{−/-}\) mice develop high plasma cholesterol levels following a high fat diet. We analyzed cerebral capillaries and arterioles for intravascular erythrocyte accumulations, thrombotic vessel occlusions, blood-brain barrier (BBB) dysfunction and microbleeds.
Results
We found a significant increase in the number of erythrocyte stases in 6 months old Ldlr\(^{−/-}\) mice compared to all other groups (P < 0.05). Ldlr\(^{−/-}\) animals aged 12 months showed the highest number of thrombotic occlusions while in WT animals hardly any occlusions could be observed (P < 0.001). Compared to WT mice, Ldlr\(^{−/-}\) mice did not display significant gray matter BBB breakdown. Microhemorrhages were observed in one Ldlr\(^{−/-}\) mouse that was 6 months old. Results did not differ when considering subcortical and cortical regions.
Conclusions
In Ldlr\(^{−/-}\) mice, hypercholesterolemia is related to a thrombotic CSVD phenotype, which is different from hypertension-related CSVD that associates with a hemorrhagic CSVD phenotype. Our data demonstrate a relationship between hypercholesterolemia and the development of CSVD. Ldlr\(^{−/-}\) mice appear to be an adequate animal model for research into CSVD.
Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen im Alter führende Todesursachen in der westlichen Welt dar. Der Proteinkinase B, auch AKT genannt, kommt am Herzen eine zentrale Rolle bezüglich der Organogenese zu. Ihre Funktion wird in Verbindung mit der Insulinwirkung, dem Einfluss auf den Kohlenhydrat-stoffwechsel sowie die Steuerung von Entwicklung und Differenzierung von Geweben durch Modulation des Zellüberlebens, des Zellwachstum und der Zellteilung diskutiert. Auch das postnatale Herzwachstum in physiologischer sowie pathologischer Ausprägung wird durch den PKB/AKT-Signalweg reguliert. Diez et al.zeigten bei seneszenten Kardiofibroblasten der Ratte in vitro eine reduzierte Expression der PKB/AKT-1. Auch bei Myokard-Biopsaten von jungen und alten Patienten (ohne Myokardpathologie) konnte gezeigt werden, dass die Expressionstärke der AKT-1/PKB mit dem Alter abnahm. Die vorliegende Arbeit sollte die Frage klären ob AKT/PKB zu einer veränderten Expression von extrazellulären Matrix-Proteinen, die sie abbauenden Matrixmetalloproteinasen bzw. deren Inhibitoren führt und damit zu einer Umstrukturierung der Extrazellulären Matrix im Sinne einer Fibrose des Myokards beitragen könnte. Nach adenoviraler Transfektion von Kardiofibroblasten mit einer konstitutiv aktiven bzw. inaktiven PKB/AKT-Mutanten, erfolgte die Analyse der differentiellen Genexpression fibroserelevanter Gene mittels RT-PCR und Agarosegelelektrophorese in drei verschiedenen Zellzuständen. Die Auswertung der gewonnen Daten zeigte, dass von den untersuchten Genen lediglich die Matrix-Metalloproteinasen (MMPs).-2/-9/-13 einer deutlichen Regulation unterworfen sind. Die Darstellung auf Proteinebene gelang für die MMP-9 und MMP-2 letztendlich mittels Zymographie. Bezugnehmend auf die Fragestellung zeigte sich bei der durchgeführten Genexpressionsanalyse fibroserelevanter Gene eine Regulation der MMP-2/-9 und -13 durch die PKB/AKT auf m-RNS-Ebene, mit deutlichem Anstieg der für die MMP-9 und MMP-13 kodierenden m-RNS bei Inaktivierung der PKB/AKT. Auf Proteinebene besteht lediglich bei der MMP-9 eine entsprechende Änderung der Proteinmenge. Die MMP-2-Enzymmenge zeigte sich auf basalem Expressionsniveau als nicht reguliert. Die MMP-13 konnte zymographisch nicht nachgewiesen werden. Bezugnehmend auf die durch Diez et al. gefundene Herabregulation der PKB-Akt in seneszenten Kardiofibroblasten der Ratte könnte die in der Arbeit gezeigte Steigerung der Genexpression der MMP-2/-9 und 13 die Voraussetzung eines zur Fibrose führenden Remodelings der kardialen extrazellulären Matrix im Sinne einer Degradation der EZM darstellen. Nach Schram und Sweeney et al. kann sich ein Remodeling der extrazellulären Matrix des Herzens schwerpunktmäßig sowohl als Veränderungen in der Synthese von matrixbildenden Proteinen als auch in Veränderungen der Expression und Aktivität von MMPs und TIMPs darstellen. Neben der wichtigen Wirkung eines antiapoptotischen Zellschutzes könnte die Serin-Threonin-Kinase PKB/AKT mit an der Entstehung einer myokardialen Fibrose beteiligt sein. Weitere Untersuchungen sind aber nötig, diese Frage eindeutig zu klären.
In physiological conditions platelets have a major role in maintaining haemostasis. Platelets prevent bleeding from wounds by distinguishing normal endothelial cells in vasculature from areas with lesions to which they adhere. Interaction of platelet agonists and their receptors is controlled by intracellular signaling molecules that regulate the activation state of platelets. Very important intracellular signaling molecules are cyclic nucleotides (cGMP and cAMP), both involved in inhibition of platelet activation. Formation of cGMP and cAMP in platelets is stimulated by endothelial-derived NO and prostacyclin (PGI2), which then mediate inhibition of platelets by activating protein kinase G (PKG) and protein kinase A (PKA). Recently, it has been suggested that reactive oxygen species (ROS) represent new modulators of cell signaling within different cell types. The work summarized here describes the involvement of platelet ROS production in platelet activation, the relation of NO/cGMP/PKG I pathway to ROS and to mitogen-activated protein kinases (MAP kinase) signaling, and the involvement of cyclic nucleotides in megakaryocyte and platelet development. Platelets activated with different agonists produce intracellular but not extracellular ROS by activation of NAD(P)H oxidase. In addition, ROS produced in platelets significantly affects αIIbβ3 integrin activation but not alpha/dense granule secretion and platelet shape change. Thrombin induced integrin αIIbβ3 activation is significantly decreased after pretreatment of platelets with NAD(P)H oxidase inhibitors and superoxide scavengers. These inhibitors also reduce platelet aggregation and thrombus formation on collagen under high shear and achieve their effects independently of the NO/cGMP pathway. ADP secreted from platelet dense granules with subsequent activation of P2Y12 receptors as well as thromboxane A2 release are found to be important upstream mediators of p38 MAP kinase activation by thrombin. However, p38 MAP kinase activation does not significantly contribute to calcium mobilization, P-selectin expression, αIIbβ3 integrin activation and aggregation of human platelets in response to thrombin. Finally, PKG activation does not stimulate, but rather inhibit, p38 and ERK MAP kinases in human platelets. Further study revealed that cyclic nucleotides not only inhibit platelet activation, but are also involved, albeit differentially, in megakaryocyte and platelet development. cAMP is engaged in haematopoietic stem cell differentiation to megakaryocytes, and cGMP has no impact on this process. While PKA is already present in stem cells, expression of proteins involved in cGMP signaling (soluble guanylyl cyclase, sGC; PKG) increases with maturation of megakaryocytes. In the final step of megakaryocyte maturation that includes release of platelets, cGMP and cAMP have mild but opposing effects: cGMP increases platelet production while cAMP decreases it indicating a finely regulated process that could depend on stimulus coming from adjacent endothelial cells of sinusoids in bone marrow. The results of this thesis contribute to a better understanding of platelet regulation and of the possible molecular mechanisms involved in megakaryocyte maturation in bone marrow vascular microenvironment.
Protamin antagonisiert die antikoagulierende Wirkung von Heparin. Nach intravenöser Protaminapplikation treten als häufige unerwünschte Wirkungen ein systemischer Blutdruckabfall, Herzfrequenzabfall sowie eine Erhöhung des pulmonalarteriellen Widerstandes auf. Die Protamin-assoziierten Nebenwirkungen sind zum Teil lebensbedrohlich. Der ihnen zugrunde liegende Mechanismus wurde in der vorliegenden Arbeit auf Zellkultur- und Gesamttierebene analysiert sowie mögliche Therapieoptionen aufgezeigt. Heparin-Protamin-Komplexe aktivieren auf Endothelzellen den Blutgerinnungsfaktor XII. Aktiver Faktor XII startet über sein Substrat Plasmakallikrein die Freisetzung des Peptidhormons Bradykinin aus hochmolekularem Kininogen. Funktions-inhibierende Antikörper oder pharmakologische Inhibitoren von Plasmakallikrein oder Faktor XII blockierten die Heparin-Protamin induzierte Bradykininbildung auf Zellen. Stickstoffmonoxid-spezifische Fluorophore zeigten, dass Bradykinin-Bindung an Kinin B2 Rezeptoren die endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase aktiviert. B2 Rezeptorantagonisten blockierten die Heparin-Protamin induzierte Stickstoff-monoxidbildung. Die intravenöse Infusion von Protamin in heparinisierte Wildtypmäuse senkte den systemischen Blutdruck und die Herzfrequenz. Im Gegensatz dazu waren Faktor XII und B2 Rezeptor Gen-defiziente Mäuse oder Tiere, die Faktor XII Inhibitoren oder B2 Rezeptorantagonisten infundiert bekamen, vor Heparin-Protamin-Effekten geschützt. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Heparin-Protamin-Komplikationen durch eine Faktor XII-getriebene Bradykininbildung verursacht werden. Eine Blockade der Bradykininbildung oder -wirkung eröffnet eventuell eine Möglichkeit, die Heparin-Protamin-Nebenwirkungen auch beim Patienten zu therapieren.
Prostanoide wirken über Prostanoid-Rezeptoren auf die Aktivierung oder Hemmung der Thrombozyten. In dieser Arbeit wurde die Existenz und Funktionsweise der Prostanoid-Rezeptoren anhand synthetischer Agonisten und Antagonisten in humanen Thrombozyten nachgewiesen. Weiter wurde untersucht, über welche Prostanoid-Rezeptoren die Signaltransduktion der natürlichen Agonisten wie PGE2, PGE1 und PGA1 vermittelt wird, sowie das Zusammenspiel der Prostanoid-Rezeptoren auf die Aktivierung oder Hemmung der Thrombozyten gezeigt. Das Vorhandensein der Prostaglandin E2 Synthase 3 wurde nachgewiesen sowie erste Anhaltspunkte für die Existenz eines Komplexes aus Prostaglandin E2 Synthase 3, Hitzeschockprotein-90 sowie Casein Kinase 2 gezeigt.
We have established the novel interaction between mCHL2, Tsg and BMP-2 for the first time. Tsg binds to VWC1 and VWC3 of mCHL2 in a cooperative waz and plazs a role in strengthening the binding affinity. Furthermore, Tsg/mCHL2/BMP-2 termary complex and Tsg/mCHL2 binary complex have been isolated by gel-filtration chromatography. Therefore mCHL2 can form a ternary complex with Tsg and BMP-2 and this complex makes mCHL2 a better BMP-2 antagnonist.
Background: In infarcted heart, improper clearance of dying cells by activated neighboring phagocytes may precipitate the transition to heart failure. We analyzed the coordinated role of 2 major mediators of efferocytosis, the myeloid-epithelial-reproductive protein tyrosine kinase (Mertk) and the milk fat globule epidermal growth factor (Mfge8), in directing cardiac remodeling by skewing the inflammatory response after myocardial infarction.
Methods and Results: We generated double-deficient mice for Mertk and Mfge8 (Mertk\(^{-/-}\)/Mfge8\(^{-/-}\)) and challenged them with acute coronary ligature. Compared with wild-type, Mertk-deficient (Mertk\(^{-/-}\)), or Mfge8-deficient (Mfge8\(^{-/-}\)) animals, Mertk\(^{-/-}\)/Mfge8\(^{-/-}\) mice displayed greater alteration in cardiac function and remodeling. Mertk and Mfge8 were expressed mainly by cardiac Ly6C\(^{High and Low}\) monocytes and macrophages. In parallel, Mertk\(^{-/-}\)/Mfge8\(^{-/-}\) bone marrow chimeras manifested increased accumulation of apoptotic cells, enhanced fibrotic area, and larger infarct size, as well as reduced angiogenesis. We found that the abrogation of efferocytosis affected neither the ability of circulating monocytes to infiltrate cardiac tissue nor the number of resident Ly6C\(^{High}\) and Ly6C\(^{Low}\) monocytes/macrophages populating the infarcted milieu. In contrast, combined Mertk and Mfge8 deficiency in Ly6C\(^{High}\)/Ly6C\(^{Low}\) monocytes/macrophages either obtained from in vitro differentiation of bone marrow cells or isolated from infarcted hearts altered their capacity of efferocytosis and subsequently blunted vascular endothelial growth factor A (VEGFA) release. Using LysMCre\(^+\)/VEGFA\(^{fl/fl}\) mice, we further identified an important role for myeloid-derived VEGFA in improving cardiac function and angiogenesis.
Conclusions: After myocardial infarction, Mertk- and Mfge8-expressing monocyte/macrophages synergistically engage the clearance of injured cardiomyocytes, favoring the secretion of VEGFA to locally repair the dysfunctional heart.
The transcription factor SPT5 physically interacts with MYC oncoproteins and is essential for efficient transcriptional activation of MYC targets in cultured cells. Here, we use Drosophila to address the relevance of this interaction in a living organism. Spt5 displays moderate synergy with Myc in fast proliferating young imaginal disc cells. During later development, Spt5-knockdown has no detectable consequences on its own, but strongly enhances eye defects caused by Myc overexpression. Similarly, Spt5-knockdown in larval type 2 neuroblasts has only mild effects on brain development and survival of control flies, but dramatically shrinks the volumes of experimentally induced neuroblast tumors and significantly extends the lifespan of tumor-bearing animals. This beneficial effect is still observed when Spt5 is knocked down systemically and after tumor initiation, highlighting SPT5 as a potential drug target in human oncology.
Die vorliegende Arbeit untersuchte die Veränderungen der wichtigsten hämostatischen Komponenten der plasmatischen Gerinnung in Thrombozyten- und Plasmakonzentraten während der achttägigen Lagerung bei Raumtemperatur. Es wurden keine signifikanten und klinisch relevanten Veränderungen der plasmatischen hämostatischen Kapazität des Plasmas für Fibrinogen, Gerinnungsfaktor XI, XII und XIII, Protein S und C (quantitative Messung), D-Dimere, von Willebrand-Faktor, Kollagenbindungs-aktivität und Ristocetin-Cofaktor nachgewiesen. Es kam jedoch zu einer zeitabhängigen Veränderung während der Lagerung bei PTT, Quick, Thrombinzeit, Gerinnungsfaktoren II, V, VII, VIII, IX, und X, Antithrombin III, Protein S und C (funktionelle Messung), Prothrombinfragmente F1+F2 und APC-Resistenz. Diese Veränderungen fanden sich zudem insbesondere in den gelagerten Thrombozytenkonzentraten. Die wenigen, in der Literatur verfügbaren Untersuchungen zeigen Ergebnisse, die den unseren vergleichbar sind. Erstmal wurden mit dieser Dissertationsarbeit jedoch umfassend alle diese Parameter in einem Ansatz verglichen. Vorausgesetzt, dass hämostaseologische Faktoren auch unter ungünstigen Lagerungsbedingungen weitgehend ihre hämostatische Kapazität behalten, kann bei Infusionen von Früh- oder Neugeborenen praktische Bedeutung erlangen, da die plasmatische hämostatische Kapazität in Thrombozytenkonzentraten nun in den Gesamtbedarf einbezogen werden kann. Ebenso können vereinfachte Lagerbedingungen (Raumtemperatur versus Tiefkühlung) in Krisensituationen enorme logistische Vorteile mit sich bringen. Weitere, insbesondere klinische Transfusionsstudien müssen nun zeigen, ob die ex vivo gewonnenen Erkenntnisse zur Haltbarkeit hämostatischer Gerinnungsfaktoren sich in den klinisch-praktischen Einsatz übertragen lassen. Mit unseren Versuchen wollten wir auch dazu beitragen, zukünftig möglichst schnelle und praktikable Therapievorschläge für Notfälle bereitzustellen. Eine bedeutende Rolle kann das bei Raumtemperatur gelagerten Plasma in der Transfusionsmedizin, Notfallmedizin, bei Operationen und in Kriseneinsätzen spielen. Es bleiben noch viele Fragen zu diesem Thema offen. Diese Arbeit wird zu weiterer Forschung anregen.
Several studies have linked overexpression of the LIM and SH3 domain protein 1 (LASP1) to progression of breast, colon, liver, and bladder cancer. However, its expression pattern and role in human prostate cancer (PCa) remained largely undefined.
Analysis of published microarray data revealed a significant overexpression of LASP1 in PCa metastases compared to parental primary tumors and normal prostate epithelial cells. Subsequent gene-set enrichment analysis comparing LASP1-high and -low PCa identified an association of LASP1 with genes involved in locomotory behavior and chemokine signaling. These bioinformatic predictions were confirmed in vitro as the inducible short hairpin RNA-mediated LASP1 knockdown impaired migration and proliferation in LNCaP prostate cancer cells.
By immunohistochemical staining and semi-quantitative image analysis of whole tissue sections we found an enhanced expression of LASP1 in primary PCa and lymph node metastases over benign prostatic hyperplasia. Strong cytosolic and nuclear LASP1 immunoreactivity correlated with PSA progression. Conversely, qRT-PCR analyses for mir-203, which is a known translational suppressor of LASP1 in matched RNA samples revealed an inverse correlation of LASP1 protein and mir-203 expression. Collectively, our results suggest that loss of mir-203 expression and thus uncontrolled LASP1 overexpression might drive progression of PCa.
Brustkrebs ist, verbunden mit einem Lebenszeitrisiko von 12.5 % daran zu erkranken, die häufigste maligne Erkrankung der Frau in der westlichen Welt. Das LIM- und SH3-Domänen Protein LASP-1 wurde erstmalig 1995 als spezifisch in fokalen Kontakten akkumulierendes Protein in humanen Brustkrebszellen beschrieben. Eine eigene Patientenstudie (n = 83) ergab, dass LASP-1 in 55.4 % der untersuchten invasiven Mammakarzinome eindeutig überexprimiert wird und die LASP-1-Expressionshöhe signifikant positiv mit der Tumorgröße (p < 0.05) und der Wahrscheinlichkeit für Nodalpositivität (p < 0.01) korreliert. Als Actin-bindendes Protein mit ubiquitärer Expression interagiert LASP-1 mittels seiner SH3-Domäne auch mit Zyxin. Zyxin ist ein Signalprotein, das zwischen fokalen Kontakten und dem Zellkern pendelt und an der Regulation von Transcription, Zellzyklus und Zellbewegung beteiligt ist. In dieser Doktorarbeit untersuchte ich die Funktion von LASP-1 in verschiedenen humanen Brustkrebszelllinien und einer humanen Ovarkarzinomzelllinie unter Verwendung der RNA-Interferenz zum sequenzspezifischen knock-down von LASP-1. Die Transfektion der Zellen mit LASP-1-spezifischer small-interfering-RNA (siRNA) senkte die Proteinexpression um ca. 50 - 58 %, was zu einer Arretierung des Zellzyklus in der G2-Phase führte und die Proliferation der Brust- und Eierstockkrebszellen um 30 - 50 % reduzierte. Apoptotische und nekrotische Prozesse wurden dabei durch Caspase-3 Western-blots und Trypan-Blau-Färbungen ausgeschlossen. Außerdem verringerte der knock-down von LASP-1 die Migration der Krebszellen, wohingegen die Überexpression von LASP-1 in PTK2- (Potorous tridactylis kidney) Zellen, welche kein endogenes LASP-1 exprimieren, in einer signifikanten Steigerung der Migration resultierte. Immunfluoreszenzfärbungen zeigten, dass der knock-down von LASP-1 von einer verringerten Konzentration seines Interaktionspartners Zyxin an fokalen Kontakten begleitet wird, ohne dabei das Actin-Zytoskelett oder die Morphologie der fokalen Kontakte zu verändern. Die Transfektion der Brust- und Eierstockkrebszellen mit einer Kontroll-siRNA (scrambled Neuropilin1) beeinflusste hingegen keinen der genannten Parameter. Diese Daten unterstreichen die wichtige Rolle von LASP-1 für die Tumorzellproliferation und -migration. LASP-1 könnte daher in Interaktion mit Zyxin an der molekularen Karzinogenese von Brust- und Eierstockkrebs beteiligt sein und in der Zukunft als viel versprechender Prognosemarker dienen.
LASP-1, das LIM und SH3 Protein 1, ist ein Aktin-bindendes Gerüstprotein, das in verschiedenen Tumorentitäten überexprimiert ist. Dabei scheint LASP-1 eine wichtig Rolle sowohl bei der Proliferation und Migration von Zellen als auch bei der Tumorgenese und Metastasierung zu spielen.
Ziel dieser Arbeit war es, die Expression von LASP-1 im Urothelkarzinom der Harnblase zu untersuchen und eine daraus abzuleitende klinische Relevanz für die Diagnostik zu evaluieren. Dazu wurden histologische Blasenschnitte immunhistochemisch nach LASP-1 gefärbt und Western Blot-Analysen von Urinproben durchgeführt.
Die Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Blasenschnitte ergab, dass Urothelkarzinome signifikant mehr LASP-1 auf Proteinebene exprimieren als gesundes Blasengewebe. Allerdings konnte keine Korrelation zwischen der Stärke der LASP-1-Expression und verschiedener klinisch-pathologischer Parameter nachgewiesen werden.
Mittels Western Blot-Analysen gelang es, LASP-1 eindeutig im Urin und statistisch signifikant häufiger bei Blasenkarzinompatienten zu detektieren. Ohne Berücksichtigung einer Kontamination mit LASP-1-positiven Blut- und Entzündungszellen ist der LASP-1-Nachweis im Western Blot mit einer Gesamtsensitivität von 84,2% derzeit sensitiver als die meisten erhältlichen Tumormarker. Darüber hinaus ergab der Vergleich von Spontanurin und von Harnblasenspülflüssigkeit, dass Spontanurinproben sogar geeigneter zur Diagnostik zu sein scheinen.
Abschließend kann zusammengefasst werden, dass LASP-1 aufgrund der einfachen, nicht invasiven und kostengünstigen Probengewinnung zusammen mit den hohen Werten für Sensitivität und Spezifität als Urin-basierter Tumormarker für das Urothelkarzinom der Harnblase vielversprechend zu sein scheint.
A central question to biology is how pathogenic bacteria initiate acute or chronic infections. Here we describe a genetic program for cell-fate decision in the opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus, which generates the phenotypic bifurcation of the cells into two genetically identical but different cell types during the course of an infection. Whereas one cell type promotes the formation of biofilms that contribute to chronic infections, the second type is planktonic and produces the toxins that contribute to acute bacteremia. We identified a bimodal switch in the agr quorum sensing system that antagonistically regulates the differentiation of these two physiologically distinct cell types. We found that extracellular signals affect the behavior of the agr bimodal switch and modify the size of the specialized subpopulations in specific colonization niches. For instance, magnesium-enriched colonization niches causes magnesium binding to S. aureusteichoic acids and increases bacterial cell wall rigidity. This signal triggers a genetic program that ultimately downregulates the agr bimodal switch. Colonization niches with different magnesium concentrations influence the bimodal system activity, which defines a distinct ratio between these subpopulations; this in turn leads to distinct infection outcomes in vitro and in an in vivo murine infection model. Cell differentiation generates physiological heterogeneity in clonal bacterial infections and helps to determine the distinct infection types.
The mammalian Vasodilator Stimulated Phosphoprotein (VASP) is a founding member of the Ena/VASP family of proteins that includes Drosophila Enabled (ena), the mammalian Ena homologue (Mena) and the Ena-VASP-like protein (Evl). VASP was initially discovered and characterized as a substrate for cGMP- and cAMP-dependent protein kinases (cGKs and cAKs). Ena/VASP proteins are involved in Actin-filament formation, plasma membrane protrusion, acceleration of Actin-based motility of Listeria and the establishment of cell-cell adhesion. Moreover, Ena/VASP proteins have been implicated as inhibitory factors in repulsive axon guidance and inhibition of plasma membrane activity and random motility in fibroblast. In order to study the physiological function of VASP, VASP-deficient mice had been generated in the laboratory by homologous recombination. VASP-/- mice showed hyperplasia of megakaryocytes in the bone marrow and spleen and a two-fold increase in thrombin- and collagen-induced platelet activation. To further investigate the cellular function of VASP, I established cardiac fibroblast cell lines derived from both wild type and VASP-/- mice. Both cell lines presented similar growth rates and normal contact dependent-growth inhibition but showed differences in morphology, migration and adhesion. Adherent VASP-/- cells, despite normal Mena and Evl expression levels, were highly spread. VASP-/- cells covered about twice the substrate surface area as wild type cells, while the cell volumes were unchanged. This shape difference suggests that VASP is involved in the regulation of spreading. Since the small GTPases Rac and Cdc 42 and their effector p21-activated kinase (Pak) are key regulators of lamellipodia formation and cell spreading, I analyzed this signalling pathway in VASP-/- cells stimulated with Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) or fetal calf serum. In wild type cells Rac and Pak were rapidly and transiently activated by PDGF or serum; however, in the absence of VASP both Rac and Pak activation was dramatically prolonged. The Rac/Pak pathway is known to play an essential role in cell motility. VASP deficient cells showed compromised migration and reorientation in a wound healing assay, probably due to enhanced Rac activity. The spreading phenotype, compromised migration and the effect observed on the Rac and Pak activities were reverted in VASP-/- cells stably transfected with full lenght human VASP, indicating a VASP dependent modulation of the Rac/Pak pathway and Rac/Pak regulated processes. Moreover, adhesion and detachment of VASP-deficient cells were significantly slower when compared to wild type cells. Preincubation of VASP+/+ cells with a cGMP analog accelerated adhesion. This acceleration did not take place in the VASP-/- cells, suggesting a VASP dependent effect. The second part of this work focused on VASP function in platelets. On the one hand I investigated the possibility of VASP-dependent Rac regulation in mouse platelets. Murine platelets are a good model for studying Rac regulation since they express high levels of VASP but not Mena/Evl and since VASP-deficient platelets show an increased platelet activation. Rac was activated by platelet agonists which was inhibited by preincubation with cGMP and cAMP analogs. Initial results which need to be extended showed that the cGMPcaused inhibition of Rac activation was VASP-dependent. Finally, in vivo platelet adhesion (platelet-vessel wall interactions) was studied using VASP-deficient mice. These studies demonstrated in-vivo that VASP down regulates platelet adhesion to the vascular wall under both physiological and pathophysiological conditions.
Background
Direct interaction between Red blood cells (RBCs) and platelets is known for a long time. The bleeding time is prolonged in anemic patients independent of their platelet count and could be corrected by transfusion of RBCs, which indicates that RBCs play an important role in hemostasis and platelet activation. However, in the last few years, opposing mechanisms of platelet inhibition by RBCs derived nitric oxide (NO) were proposed. The aim of our study was to identify whether RBCs could produce NO and activate soluble guanylate cyclase (sGC) in platelets.
Methods
To test whether RBCs could activate sGC under different conditions (whole blood, under hypoxia, or even loaded with NO), we used our well-established and highly sensitive models of NO-dependent sGC activation in platelets and activation of purified sGC. The activation of sGC was monitored by detecting the phosphorylation of Vasodilator Stimulated Phosphoprotein (VASPS239) by flow cytometry and Western blot. ANOVA followed by Bonferroni’s test and Student’s t-test were used as appropriate.
Results
We show that in the whole blood, RBCs prevent NO-mediated inhibition of ADP and TRAP6-induced platelet activation. Likewise, coincubation of RBCs with platelets results in strong inhibition of NO-induced sGC activation. Under hypoxic conditions, incubation of RBCs with NO donor leads to Hb-NO formation which inhibits sGC activation in platelets. Similarly, RBCs inhibit activation of purified sGC, even under conditions optimal for RBC-mediated generation of NO from nitrite.
Conclusions
All our experiments demonstrate that RBCs act as strong NO scavengers and prevent NO-mediated inhibition of activated platelets. In all tested conditions, RBCs were not able to activate platelet or purified sGC.
Das Vasodilatator stimulierte Phosphoprotein (VASP) ist ein Zytoskelett-assoziiertes Protein der Ena (Enabled)/VASP-Proteinfamilie. Seine Funktionen bezüglich Aktin- Polymerisation, Thrombozyten-Aggregation, Wachstumskegel-Führungsprozessen und Motilität sowohl von Zellen als auch von Listerien sind bisher nur unvollständig charakterisiert. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, wie die VASP-F-Aktin Interaktion in vitro durch die Phosphorylierung zweier Aminosäuren von VASP reguliert wird. Transfektions-Experimente mit VASP und RhoA deuten eine mögliche Beteiligung von VASP im Signalweg von RhoA an. Zudem führen Überexpression und Deletion von VASP in Zellen zu demselben Stressfaser-Phänotyp, der unabhängig vom stimulierenden Einfluss von Serum ist. In VASPdefizienten Fibroblasten ist außerdem die Membranrigidität und die Phosphorylierung der leichten Kette des Myosins erhöht, was auf ein stabileres und stärker kontrahiertes Aktin- Zytoskelett in diesen Zellen schließen lässt. Die Regulation und Organisation des Aktin- Zytoskeletts beeinflusst auch die zelluläre Adhäsion, die in VASP-defizienten Zellen verändert ist. VASP-defiziente Zellen adhärieren signifikant stärker an Fibronektinbeschichtete Perlen als Wildtyp-Zellen. Der Widerstand dieser Perlen gegenüber mechanischen Kräften ist in VASP (-/-) Zellen signifikant erhöht. Dieser Unterschied beruht in erster Linie auf dem verstärkten Aktin-Zytoskelett in diesen Zellen und ist unabhängig von Mikrotubuli. Messungen mit rekonstituierten Zelllinien zeigen zudem eine VASPAbhängigkeit dieses Effekts. Der GTPase Rap1 kommt eine wichtige Bedeutung bei der Integrin-abhängigen Adhäsion von Zellen zu. Aktivierung von Epac, einem Guanin-Nukleotid- Austauschfaktor von Rap1, führt in Wildtyp-Zellen zur Verstärkung des Widerstandes gegenüber mechanischen Kräften, die auf Fibronektin-beschichtete Perlen wirken, ohne dabei die Membranrigidität zu verändern. Diese Kraft-Verstärkung wird weder vom Aktin- noch vom Mikrotubuli-Zytoskelett beeinflusst. Es exisitiert daher ein Mechanismus, bei dem die Länge von elastischen Membranfortsätzen unabhängig von der Membranfestigkeit und dem Aktin-Zytoskelett reguliert wird. Diese Experimente zeigen, dass VASP eine wichtige Rolle bei der Stabilität und Kontraktilität des Aktin-Zytoskeletts, der Membranrigidität sowie bei der zellulären Adhäsion spielt. Die vorliegenden Ergebnisse weisen darauf hin, dass hierbei weniger die direkte Interaktion von VASP mit dem Aktin-Zytoskelett von Bedeutung ist, sondern viel mehr seine mögliche Funktion als Gerüstprotein (Scaffold), das eine geregelte Signaltransduktion organisiert.
In der vorliegenden Arbeit ging es darum, die inhibierende Wirkung von extrazellulär zugefügten GMP-Derivaten auf die Thrombozytenaktivierung nachzuweisen. Anhand verschiedener thrombozytärer Aktivierungsmarker wie ERK, der Expression von P-Selektin und intrazellulärem Kalziumeinstrom zeigte sich eine signifikante Inhibition der Thrombozytenaktivierung durch zyklische GMP-Analoga. Neu ist, dass auch nicht-zyklische GMP-Derivate eindeutig einen hemmenden Effekt aufweisen. Guanosin-Derivate alleine führen dagegen weder zu einer Hemmung noch zu einer vermehrten Stimulation der Plättchenaktivierung. Die Wirkung der GMP-Analoga scheint von der negativen Phosphatgruppe abhängig zu sein. Der frühe Zeitpunkt der Inhibition und die Tatsache, dass auch Hemmer der PKG einen inhibierenden Effekt auf die Thrombozytenaktierung aufweisen, führen zu der Hypothese, dass es sich um PGK-unabhängige Effekte handelt. Der Thrombinrezeptor als Wirkort der GMP-Analoga konnte in Biacore-Messungen ausgeschlossen werden. Es gilt nun, speziell den Thromboxanrezeptor auf mögliche Interaktionen mit GMP-Derivaten hin zu untersuchen.
Chronic myeloid leukemia (CML) is characterized by a genomic translocation generating a permanently active BCR-ABL oncogene with a complex pattern of atypically tyrosine-phosphorylated proteins that drive the malignant phenotype of CML. Recently, the LIM and SH3 domain protein 1 (LASP1) was identified as a component of a six gene signature that is strongly predictive for disease progression and relapse in CML patients. However, the underlying mechanisms why LASP1 expression correlates with dismal outcome remained unresolved.
Here, we identified LASP1 as a novel and overexpressed direct substrate of BCR-ABL in CML. We demonstrate that LASP1 is specifically phosphorylated by BCR-ABL at tyrosine-171 in CML patients, which is abolished by tyrosine kinase inhibitor therapy. Further studies revealed that LASP1 phosphorylation results in an association with CRKL - another specific BCR-ABL substrate and bona fide biomarker for BCR-ABL activity. pLASP1-Y171 binds to non-phosphorylated CRKL at its SH2 domain. Accordingly, the BCR-ABL-mediated pathophysiological hyper-phosphorylation of LASP1 in CML disrupts normal regulation of CRKL and LASP1, which likely has implications on downstream BCR-ABL signaling. Collectively, our results suggest that LASP1 phosphorylation might serve as an additional candidate biomarker for assessment of BCR-ABL activity and provide a first step toward a molecular understanding of LASP1 function in CML.
Brustkrebs ist gegenwärtig die häufigste bösartige Erkrankung der Frau weltweit und verantwortlich für 15 % der Krebs¬todes-ursachen in der westlichen Welt. Maligne Erkrankungen in metastasierten Stadien gelten generell als unheilbar mit einem medianen Überleben von wenigen Jahren. Das LIM und SH3 Domänen Protein (LASP-1) ist ein spezielles fokales Ad¬hä¬sions-protein, das an den Vorgängen der Zellproliferation und -migration beteiligt ist. Der Knockdown von LASP-1 in metastatischen Brust- und Eier¬stock¬krebs-zelllinien führt zu einer starken Hemmung der Zellmigration und -proliferation. Um¬ge-kehrt kommt es nach Überexpression des Proteins in nicht neoplastischen Zellen zu einer erhöhten Migration. Bei den von uns untersuchten Patientinnen mit Brust- oder Eierstockkrebs korreliert die Überexpression des Proteins mit fortgeschrittener Tumor-größe und Lymphknoten-Metastasierung. Die genetische Analyse von 63 mikrodissektierten histologischen Brust-krebs-Schnittpräparaten mit anschließender qRT PCR auf LASP-1 ergab (mit nur einer positiven Probe; 1,6 %) allerdings keine Amplifikation des Gens. Es scheint, dass die LASP 1 Proteinüberexpression als aktiver Prozess in der Tumorgenese aufgefasst werden kann und in der Mehrheit der Brustkrebsfälle bevorzugt durch trans¬krip-tionelle Regulation als durch Gen¬amplifi¬ka-tion hervorgerufen wird. LASP-1 ist nicht ausschließlich ein zytosolisch lokalisiertes Protein, sondern in malignen Zellen außerdem im Zellkern nachweisbar. In einer Langzeitstudie (Januar 1985 – Dezember 2007) wurde anhand anti-LASP-1 gefärbter histologischer Schnittpräparate die LASP Expression bestimmt und mit dem Patienten-Überleben korreliert. Patientinnen mit nukleärer LASP-1-Lokalisation zeigen, im Vergleich zu nukleär-LASP-1 negativen Schnitten, ein signifikant (p = 0,0250) reduziertes Langzeitüberleben. Mit diesen Ergebnissen lassen sich zukünftig vielleicht prognostische Aussagen über die Auswirkungen der LASP-1-Expression für den einzelnen Patienten treffen.
Neutrophile Granulozyten sind wichtige Effektorzellen des menschlichen Immunsystems. Eine Suppression der Neutrophilen kann zur Immundeffizienz mit Gefahr für bakterielle Erkrankungen und maligne Tumoren führen, eine Überstimulation dieser Zellen ist jedoch an der Entstehung der Autoimmunerkrankungen beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden aktivierende und hemmende Wege untersucht, die für zukünftige Strategien in Prävention und Therapie dieser Erkrankungen eine wichtige Rolle spielen. Neutrophile Granulozyten enthalten VASP in hoher Konzentration. VASP ist ein bereits gut charakterisiertes Substrat der cAMP-PK und der cGMP-PK. Phosphorylierungsversuche mit cAMP-erhöhenden Substanzen ergaben eine rasche, reversible Phosphorylierung dieses Proteins an Ser-157 und Ser-239 in intakten humanen Neutrophilen Granulozyten. Versuche mit cGMP-erhöhenden Substanzen zeigten jedenfalls eine Phosphorylierung am Ser-157, jedoch keine Phosphorylierung am Ser-239. Diese Ergebnisse unterstreichen deutlich das Vorhandensein und die physiologische Funktion der cAMP-PK bezüglich der Phosphorylierung von VASP, stellen jedoch die Funktion der cGMP-PK in humanen Neutrophilen Granulozyten in Frage. Basierend auf der Methode der Immunfluoreszenz wurde gezeigt, dass VASP bei der Adhärenz der Neutrophilen eine entscheidende Rolle spielt. So ist mit Hilfe der spezifischen monoklonalen Antikörper eine Phosphorylierung am Ser-157 und am Ser-239 nach der Adhäsion der Neutrophilen an die Objektträger nachgewiesen worden. Nach zusätzlicher Stimulation mit PG-E1 zeigte sich kein wesentlicher Phosphorylierungsanstieg in adhärierten Neutrophilen. Zahlreiche chemotaktische Faktoren wie fMLP führen zur Phosphorylierung der p42/p44-, p38-MAPK sowie auch der PKB. Diese intrazellulären Signalmoleküle spielen eine zentrale Rolle bei der Neutrophilenaktivierung. Da es bereits von hemmenden Einflussen der Vasodilatatoren auf die Aktivierung der Neutrophilen Granulozyten berichtet worden ist, wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von cAMP- und cGMP-erhöhenden Substanzen auf die fMLP-induzierte Phosphorylierung der p42/p44-, p38-MAPK sowie der PKB untersucht. Flolan, ein cAMP-erhöhender Vasodilatator führte zur signifikanten Hemmung der fMLP-induzierten p42/p44-, p38- sowie PKB-Phosphorylierung. cGMP-erhöhender Vasodilatator SNP zeigte jedoch keinen Einfluss auf die fMLP-induzierte Aktivierung dieser Signalmoleküle. Physiologisch vorkommende cAMP-erhöhende Substanzen besitzen im menschlichen Körper eine wichtige regulatorische Funktion, die Neutrophile Granulozyten vor der „Überstimulation“ bewahrt.
In Brassicaceae, tissue damage triggers the mustard oil bomb i.e., activates the degradation of glucosinolates by myrosinases leading to a rapid accumulation of isothiocyanates at the site of damage. Isothiocyanates are reactive electrophilic species (RES) known to covalently bind to thiols in proteins and glutathione, a process that is not only toxic to herbivores and microbes but can also cause cell death of healthy plant tissues. Previously, it has been shown that subtoxic isothiocyanate concentrations can induce transcriptional reprogramming in intact plant cells. Glutathione depletion by RES leading to breakdown of the redox potential has been proposed as a central and common RES signal transduction mechanism. Using transcriptome analyses, we show that after exposure of Arabidopsis seedlings (grown in liquid culture) to subtoxic concentrations of sulforaphane hundreds of genes were regulated without depletion of the cellular glutathione pool. Heat shock genes were among the most highly up-regulated genes and this response was found to be dependent on the canonical heat shock factors A1 (HSFA1). HSFA1-deficient plants were more sensitive to isothiocyanates than wild type plants. Moreover, pretreatment of Arabidopsis seedlings with subtoxic concentrations of isothiocyanates increased resistance against exposure to toxic levels of isothiocyanates and, hence, may reduce the autotoxicity of the mustard oil bomb by inducing cell protection mechanisms.
The subject of this thesis was the cloning and the initial biochemical and functional characterisation of novel human proteins with an N-terminal Ena-VASP homology (EVH)-1 domain and a C-terminal Sprouty homologous region (SPR), which are related to the Drosophila AE33 protein. During the course of this work, three mouse homologues of the AE33 fly protein have been reported and termed Sprouty-related protein with an EVH-1 domain 1, 2 and 3 (Spred-1, -2, -3)(Wakioka et al, 2001; Kato et al, 2003). Spred-1, -2 and -3 are membrane associated substrates of receptor tyrosine kinases and they act as negative regulators of the Ras pathway during growth factor stimulation. As the Spred-family members seem to exert similar functions, the specific function of each member remains enigmatic. Therefore, we investigated the mRNA and protein expression patterns of the two murine protein family members Spred-1 and Spred-2 on the whole organ level. Furthermore, we focussed on the cellular localisation and the role of human and murine Spred-2 in the organism. The expression patterns of Spred-1 and Spred-2 differed markedly among various tissues and cell types. In mouse, Spred-1 is abundantly expressed in adult brain, cerebellum, and fetal tissues, whereas Spred-2 was ubiquitously expressed. In humans, Spred-2 was found to be strongly expressed in glandular epithelia and in invasive cytotrophoblasts, and at the subcellular level its immunoreactivity was associated with secretory vesicles and was found to colocalise with Rab11 GTPase. The new human Spred gene family was investigated in detail. Cloning of the fulllength form of human Spred-2 resulted in an 1254 bp coding sequence, corresponding to a 418 amino-acids protein. Immunoblotting with a set of affinitypurified antibodies confirmed the expression of a 47 kDa protein and suggested the presence of additional differently sized variants. Cloning of various shortened Spred- 2 mRNAs and identification of 2 additional human Spred genes (localised on different chromosomes) with their respective EST (expressed sequence tag) revealed that the new human Spred gene family displays extensive splicing, leading to the generation of short and long Spred proteins. All protein isoforms and splicing variants contain an EVH1-domain located at the N-terminus of the protein. The full-length forms (“a” forms) comprised the SPR, another functional domain localised at the C-terminus whereas the short variants (Spred-1b, 2 c-e, 3 c) lack the entire C-terminal SPR domain or part of it. The existence of short and long splicing variants of Spred-1, -2 and -3 revealed a common principle of organisation and splicing pattern in the Spred family. Functional analyses of the 5 cloned Spred-2 splicing variants revealed differential subcellular localisation and differential regulation of serum- and EGF- mediated ERK activation in HEK-293 cells. Taken together, these results indicate a highly specific expression pattern of Spred-1 and Spred-2 in various tissues suggesting a specific physiological role for the individual Spred isoform in these tissues. For example, Spred-2 appears to be involved in regulating secretory pathways. Furthermore, the human Spred family contains three genes, which are subject to extensive alternative splicing resulting in at least 8 different proteins with differential subcellular localisation and differential regulatory potential of the MAPK pathways during growth factor stimulation.
LASP1 reguliert die Genexpression und Sekretion von Matrix-Metalloproteasen in Brustkrebszellen
(2016)
Migration und Tumorzellinvasion erfordern die vorhergehende Degradation der umliegenden Extrazellulärmartrix (EZM). Dieser Umbauprozess erfolgt primär durch proteolytische Endopeptidasen, sog. Matrix-Metalloproteasen (MMPs). Damit diese ihre funktionelle Aktivität ausüben können, müssen sie zunächst rekrutiert und mit Hilfe podosomaler bzw. invadopodialer Strukturen in die EZM sezerniert werden.
Das LIM und SH3 Domänen Protein 1 (LASP1), ein neu in Podosomen von Makrophagen identifiziertes regulatorisches Gerüstprotein, beeinflusst, neben Größe, Anzahl und Beständigkeit von Podosomen, in hohem Maße die Matrixdegradationskapazität der Zelle.
Auch in invasiven Brustkrebszellen wurde eine Lokalisation von LASP1 an Invadopodien, den Podosomen-äquivalenten Strukturen, detektiert.
Das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die funktionelle Charakterisierung von LASP1 in Invadopodien. Unter Etablierung eines Matrix-Degradations-Assays konnte gezeigt werden, dass eine Herunterregulation von LASP1 auch in der humanen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231, die zuvor schon für Makrophagen gezeigte Matrixdegradation nachhaltig beeinträchtig.
Durch Analyse und Verifikation von zugänglichen Mikroarraydaten mittels qRT-PCR und Western Blot konnte ferner belegt werden, dass LASP1 in den Brustkrebszellen die Genexpression und Proteintranslation von MMP1, -3 und -9 positiv moduliert und somit das gesamt-invasive Potential der Zelle steigert. Darüber hinaus deuten Zymogramme und die Analyse des konditionierten Mediums darauf hin, dass LASP1 als Strukturprotein die vesikuläre Sekretion der inaktiven Zymogene (proMMPs) in die EZM fördert. Demzufolge modifiziert LASP1 während der Krebsprogression die zelluläre Mikroumgebung zugunsten einer erhöhten Metastasierungsrate.
Die neu identifizierte regulatorische Funktion von LASP1 auf die Transkription sowie Sekretion von Matrix-Metalloproteasen erklärt die in früheren Arbeiten beobachtete Korrelation zwischen einer erhöhten LASP1 Konzentration im Gewebe und dem vermehrten Auftreten von Metastasen, und damit einhergehend, schlechteren Überleben der Patientinnen.
Infektionen mit Streptokokken der Gruppe B (GBS) sind immer noch die häufigste Ursache für early-onset Erkrankungen des Neugeborenen in den Industrieländern, die zu erhöhter neonataler Mortalität und Morbidität führen. Bereits bekannt ist, dass neben verschiedenen anderen Bakterien GBS durch die direkte Interaktion mit Thrombozyten eine Aggregation verursachen können. In dieser Arbeit wurde das Verhalten von septischen und kolonisierenden GBS-Stämmen verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass alle GBS-Stämme eine thrombozytäre Formänderung veranlassen; jedoch führen nur von septischen Patienten isolierte Stämme zur Thrombozytenaggregation sowie zur P-Selektinexpression. Septische GBS-Stämme binden Fibrinogen auf ihrer Oberfläche und induzieren die thrombozytäre Thromboxansynthese und Granulasekretion, während kolonisierende GBS-Stämme dies nicht können. p38-mitogen-aktivierte Proteinkinase (p38-MAPK) wurde bevorzugt durch aus septischen Patienten isolierte GBS-Stämme aktiviert, ebenfalls scheint Proteinkinase C (PKC) durch diese aktiviert zu werden. Alle GBS-Stämme aktivierten Phospholipase CgammaII (PLCgammaII), Calzium-Calmodulin-abhängige Kinase II (CaMKII) und bewirken Myosinleichtketten (MLC)-Phosphorylierung über Fcgamma-Rezeptor IIA abhängige Signalwege. Es gibt weder einen Unterschied noch einen additiven Effekt zwischen der Aggregation induziert durch GBS und der Aggregation durch GBS und einer geringen Menge Adenosindiphosphat (ADP). Diese Kenntnisse der molekularen Mechanismen von GBS-induzierten Signalwegen in menschlichen Thrombozyten werden zu einem besseren Verständnis von Bakterieneffekten auf die Thrombozytenaktivierung beitragen und können deshalb neue molekulare Ziele für die pharmakologische Behandlung von GBS sein.
Die arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie ARVC ist eine seltene Erkrankung des Herzmuskels. Die ARVC tritt oft familiär gehäuft auf und geht meist mit einer autosomal dominanten Vererbung einher. Durch molekulargenetische Untersuchungen konnten bisher neun Genmutationen identifiziert werden, davon ein Großteil in Bestandteilen der kardialen Desmosomen, am häufigsten im Plakophilin-2-Gen. Das Protein Plakophilin 2 ist Bestandteil kardialer Desmosomen und gehört zur Familie der Armadillo-Proteine. Es wird vermutet, dass Veränderungen im Protein Plakophilin 2 zu Schädigungen der Zell-Zell-Verbindungen führen. Der Verlust der Myocytenadhäsion führt zum Zelltod und regionalen Fibrosierung. Da Mutationen im PKP-2-Gen am häufigsten in den westlichen Ländern für die familiär auftretende ARVC verantwortlich sind, entschieden wir uns für das PKP-2-Gen als Kandidatengen für Familie A, die für ein signifikantes Ergebnis einer Kopplungsanalyse zu klein war. Bei der direkten Sequenzierung der 14 Exons des PKP2-Gens, konnte auf Exon 11 von Patient II-2 ein Einzelnucleotidpolymorphismus SNP identifiziert werden, der sich allerdings auch in gesunder Kontroll-DNA bestätigte und somit als nicht krankheitsrelevant gewertet werden konnte. Die restriktive Kardiomyopathie RCM ist ebenfalls eine sehr seltene Herzmuskelerkrankung. Sie ist durch eine Verminderung der diastolischen Dehnbarkeit der Ventrikel charakterisiert. Die RCM kann im Rahmen systemischer Erkrankungen auftreten oder genetisch bedingt sein. Bisher wurden 6 Mutationen im kardialen Troponin-I-Gen als Ursache identifiziert. Troponin I gehört zusammen mit Troponin C und T zum kardialen Troponinkomplex und ist für die Regulation der Ca2+-abhängigen Kontraktion der kardialen Myocyten verantwortlich. Kommt es zu Veränderungen im Troponin I, wird die physiologische Relaxation des myokardialen Gewebes gestört. Da Mutationen im TNNI3-Gen häufig an der Pathogenese der familiären RCM beteiligt sind, untersuchten wir bei Familie B das TNNI3-Gen durch Direktsequenzierung. Dabei wurden bei der Sequenzierung des Exon 2 des erkrankten Kindes III-1 vier zusätzliche, intronisch gelegene Basen auf einem Strang entdeckt, die zu einer Verschiebung des Leserasters führten. Die Kontrolle der Auffälligkeit durch die Sequenzierung des DNA-Abschnitts bei der ebenfalls erkrankten Mutter II-1, der Tante II-3 und des gesunden Vaters II-2 zeigten, dass die vier zusätzlichen Basen vom gesunden Vater II-2 auf das Kind III-1 vererbt wurden und somit nicht mit der monogen vererbten Krankheit korrelieren. Die Charakterisierung der genetischen Ursachen von familiär bedingten Kardiomyopathien bringt weitere Erkenntnisse der pathophysiologischen Mechanismen der Erkrankungen. Dies ist die Voraussetzung zur Entwicklung und Verbesserung von präventiven, diagnostischen und therapeutischen Maßnahmen. Sollte sich bei Patienten, die an einer idiopathischen Kardiomyopathie erkrankt sind, eine genetische Ursache finden, so ist es für Verwandte empfehlenswert sich ebenfalls einer klinischen und genetischen Untersuchung zu unterziehen, um im Falle eines positiven Ergebnisses rechtzeitig Komplikationen der Erkrankung vermeiden und eine präventive Therapie einleiten zu können.
T cell activation represents a double-edged sword in atherogenesis, as it promotes both pro-inflammatory T cell activation and atheroprotective Foxp3(+) regulatory T cell (Treg) responses. Here, we investigated the role of the co-inhibitory receptor programmed cell death-1 (PD-1) in T cell activation and CD4(+) T cell polarization towards pro-atherogenic or atheroprotective responses in mice. Mice deficient for both low density lipoprotein receptor and PD-1 (Ldlr(-/-)Pd1(-/-)) displayed striking increases in systemic CD4(+) and CD8(+) T cell activation after 9 weeks of high fat diet feeding, associated with an expansion of both pro-atherogenic IFNγ-secreting T helper 1 cells and atheroprotective Foxp3+ Tregs. Importantly, PD-1 deficiency did not affect Treg suppressive function in vitro. Notably, PD-1 deficiency exacerbated atherosclerotic lesion growth and entailed a massive infiltration of T cells in atherosclerotic lesions. In addition, aggravated hypercholesterolemia was observed in Ldlr(-/-)Pd1(-/-) mice. In conclusion, we here demonstrate that although disruption of PD-1 signaling enhances both pro- and anti-atherogenic T cell responses in Ldlr(-/-) mice, pro-inflammatory T cell activation prevails and enhances dyslipidemia, vascular inflammation and atherosclerosis.
Dendritic cells (DCs) can be sub-divided into various subsets that play specialized roles in priming of adaptive immune responses. Atherosclerosis is regarded as a chronic inflammatory disease of the vessel wall and DCs can be found in non-inflamed and diseased arteries. We here performed a systematic analyses of DCs subsets during atherogenesis. Our data indicate that distinct DC subsets can be localized in the vessel wall. In C57BL/6 and low density lipoprotein receptor-deficient (Ldlr−/−) mice, CD11c+ MHCII+ DCs could be discriminated into CD103− CD11b+F4/80+, CD11b+F4/80− and CD11b−F4/80− DCs and CD103+ CD11b−F4/80− DCs. Except for CD103− CD11b− F4/80− DCs, these subsets expanded in high fat diet-fed Ldlr−/− mice. Signal-regulatory protein (Sirp)-α was detected on aortic macrophages, CD11b+ DCs, and partially on CD103− CD11b− F4/80− but not on CD103+ DCs. Notably, in FMS-like tyrosine kinase 3-ligand-deficient (Flt3l−/−) mice, a specific loss of CD103+ DCs but also CD103− CD11b+ F4/80− DCs was evidenced. Aortic CD103+ and CD11b+ F4/80− CD103− DCs may thus belong to conventional rather than monocyte-derived DCs, given their dependence on Flt3L-signalling. CD64, postulated to distinguish macrophages from DCs, could not be detected on DC subsets under physiological conditions, but appeared in a fraction of CD103− CD11b+ F4/80− and CD11b+ F4/80+ cells in atherosclerotic Ldlr−/− mice. The emergence of CD64 expression in atherosclerosis may indicate that CD11b+ F4/80− DCs similar to CD11b+ F4/80+ DCs are at least in part derived from immigrated monocytes during atherosclerotic lesion formation. Our data advance our knowledge about the presence of distinct DC subsets and their accumulation characteristics in atherosclerosis, and may help to assist in future studies aiming at specific DC-based therapeutic strategies for the treatment of chronic vascular inflammation.
Background
The vascular type represents a very rare, yet the clinically most fatal entity of Ehlers-Danlos syndrome (EDS). Patients are often admitted due to arterial bleedings and the friable tissue and the altered coagulation contribute to the challenge in treatment strategies. Until now there is little information about clotting characteristics that might influence hemostasis decisively and eventually worsen emergency situations.
Results
22 vascular type EDS patients were studied for hemoglobin, platelet volume and count, Quick and activated partial thromboplastin time, fibrinogen, factor XIII, von Willebrand disease, vitamin D and platelet aggregation by modern standard laboratory methods. Results show a high prevalence of over 50 % for platelet aggregation disorders in vascular type EDS patients, especially for collagen and epinephrine induced tests, whereas the plasmatic cascade did not show any alterations. Additionally, more than half of the tested subjects showed low vitamin D serum levels, which might additionally affect vascular wall integrity.
Conclusion
The presented data underline the importance of detailed laboratory screening methods in vascular type EDS patients in order to allow for targeted application of platelet-interacting substances that might be of decisive benefit in the emergency setting.
Spreds are a new Sprouty-related family of membrane-associated proteins inhibiting the MAPK signaling pathway by interacting with Ras and Raf-1. Different studies have already demonstrated the inhibitory function of Spreds in cell culture systems, but the in vivo function of Spreds in the whole organism was still unclear. Therefore, Spred-2 knockout mice were generated using a gene trap approach. The Spred-2 deficiency was verified on RNA and protein levels and the lack of functional Spred-2 protein in mice caused a dwarf phenotype similar to achondroplasia, the most common form of human dwarfism. Spred-2-/- mice showed reduced growth and body weight, they had a shorter tibia length and showed narrower growth plates as compared to wildtype mice. Spred-2 promoter activity and protein expression were detected in chondrocytes, suggesting an important function of Spred-2 in chondrocytes and bone development. Furthermore, stimulation of chondrocytes with different FGF concentrations showed earlier and augmented ERK phosphorylation in Spred-2-/- chondrocytes as compared to Spred-2+/+ chondrocytes. These observations suggest a model, in which loss of Spred-2 inhibits bone growth by inhibiting chondrocyte differentiation through upregulation of the MAPK signaling pathway. An additional observation of Spred-2-/- mice was an increased bleeding phenotype after injuries, whereas the bleeding volume was extremely enlarged and the bleeding time was significantly prolonged. So far, hypertension as cause could be excluded, but to discover the physiological reasons for this phenotype, the different steps of the clotting cascade have to be investigated further. As the Spred-2 promoter activity studies demonstrated a high and specific Spred-2 expression in vascular smooth muscle cells and previous studies showed an interaction of Spreds with RhoA, a key regulator of vascular smooth muscle contraction, the regulation of smooth muscle contractility seems to be a good candidate of this phenomenon. Moreover, Spred-1 and Spred-2 specific antibodies were generated as important tools to study the protein expression patterns in mice. Furthermore, nothing was known about the Spred-2 promoter region and its regulation. Here, a detailed in situ analysis of the physiological promoter activity profile in the gene trapped Spred-2-deficient mouse strain was shown. In these mice, the beta-galactosidase and neomycin fusion gene (β-geo) of the gene trap vector was brought under control of the endogenous Spred-2 promoter, giving the opportunity to monitor Spred-2 promoter activity in practically every organ and their corresponding sub-compartments. X-Gal staining of sections of newborn and adult mice revealed 1) a very high Spred-2 promoter activity in neural tissues and different glands; 2) a high activity in intestinal and uterine smooth muscle cells, and kidney; 3) a low activity in heart, testis, lung, and liver; 4) an almost lacking activity in skeletal muscle and spleen, and 5) very interestingly, a very distinct and strong activity in vascular smooth muscle cells. Moreover, comparison of newborn and adult mouse organs revealed a nearly congruent Spred-2 promoter activity. These detailed data provide valuable information for further studies of the physiological functions of Spred-2 in organs showing strong Spred-2 promoter activity, which are in most of these organs still unclear. Finally, gene targeting vectors for Spred-1 and Spred-2 were cloned, to generate ES cells with a floxed exon 2 of the Spred-1 and Spred-2 gene, respectively. Now, these ES cells are valuable tools to establish conditional knockout mice. This is of major interest to investigate the physiological tissue specific functions of Spred-1 and Spred-2, especially if the double knockout mice are not viable.
In dieser Arbeit wurde in humanen CD34-positiven Stammzellen die PK-G, PK-A sowie ihr Substratprotein VASP nachgewiesen. Dabei liegt VASP in unstimulierten Zellen in nicht-phosphorylierter Form vor. Die VASP-Phosphorylierung kann durch die aus anderen Zellsystemen bekannten cAMP- und cGMP- abhängigen Signalkaskaden auch im Zellkultursystem von humanen CD34-positiven Stammzellen reguliert werden. Ein weiterer Teilaspekt war der Einfluss des cGMP-erhöhenden Stickstoffmonoxyd-Donors DEA/NO auf das Proliferations,- und Differenzierungsverhalten humaner CD34-positiver Stammzellen. Hierbei fand sich ein dualer konzentrationsabhängiger Effekt von cGMP: niedrige Konzentrationen zeigten einen hemmenden Einfluss auf die Proliferation undgleichzeitig einen aktivierenden Effekt auf die Differenzierung der hämatopeotischen Zellen zu CD41-positiven Megakaryozyten. Die höhere Konzentration von DEA/NO beinflusst zwar das Zellwachstum positiv, die Differenzierung der CD34-positiven Zellen hingegen wird gehemmt. Eine Zelldifferenzierung von humanen CD34-positiven Stammzellen zu CD15-positiven Granulozyten /Monozyten unter DEA/NO war nicht zu beobachten. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Signalwege, die über zyklische Nukleotide reguliert werden, eine wichtige Rolle in Proliferations- und Differenzierungsvorgängen humaner hämatopoetischer Progenitorzellen spielen. Damit stehen diese Signalwege prinzipiell als Grundlage für neue pharmakologische Therapieoptionen zu Verfügung.
Die Thienopyridine Ticlopidin und Clopidogrel sind seit mehreren Jahren im klinischen Einsatz als Thrombozytenaggregationshemmer zur Sekundärprophylaxe bei arteriosklerotischen Erkrankungen der Herzgefäße, zerebralen Gefäße sowie der peripheren Arterien. Trotz ihrer nachgewiesenen klinischen Wirksamkeit war der Wirkmechanismus lange Zeit auf die Beschreibung als ADP-Rezeptorantagonist beschränkt. Im Zuge neuerer Erkenntnisse zum Mechanismus der Auslösung einer Aggregation, insbesondere der ADP-vermittelten Aggregation, sollte im Rahmen dieser Dissertation der Wirkmechanismus der Thienopyridine genauer untersucht werden sowie mögliche Auswirkungen auf intrazelluläre Kaskaden, die den aggregationshemmenden Effekt vermitteln. Zu diesem Zweck wurden die Effekte einer Thienopyridin-Einnahme auf die Thrombozytenfunktion gesunder Probanden untersucht. In unseren Versuchen bestätigte sich die gute Wirksamkeit der Substanzen hinsichtlich der deutlichen Reduktion der ADP-vermittelten Aggregation. Vor dem Hintergrund eines damals neu propagierten Drei-Rezeptoren-Modells für die ADP-vermittelte Aggregation konnten wir erstmals den Wirkmechanismus an humanen Thrombozyten auf eine Inhibierung des P2Yac-Rezeptors eingrenzen. Weiterhin konnten wir unter Thienopyridin-Einnahme eine Aufhebung der ADP-vermittelten Hemmung der PG-E1-vermittelten VASP-(VAsodilator-Stimulated Phosphoprotein) Phosphorylierung feststellen und somit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Wirkung der Substanzen beitragen. Zum besseren Verständnis der zum damaligen Zeitpunkt bereits auf molekularer Ebene bekannten humanen thrombozytären ADP-Rezeptoren P2Y1 und P2X1 wurden diese aus humanen Thrombozyten kloniert und mit verschiedenen Tags versehen in einer Astrozytoma-Zelllinine transient und stabil exprimiert. Es wurden verschiedene zellbiologische Methoden wie Immunpräzipitation, Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz etabliert, die als Grundlage für weitere Untersuchungen der intrazellulären Signalkaskaden der Rezeptoren dienen können. Die stabil exprimierenden Zelllinien dienten zur Verifizierung des pharmakologischen Profils der Rezeptoren, weiterhin konnten bereits erste Versuche zu einer möglichen Regulation der Rezeptoren durch zyklische Nukleotide durchgeführt werden. Durch die Etablierung dieser Zelllininen wurde insgesamt eine gute Grundlage für eine weitere Charakterisierung dieser ADP-Rezeptoren unter besser standardisierbaren Bedingungen geschaffen.
Members of the enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein (Ena/VASP) family are important regulators of the actin cytoskeleton dynamics. VASP functions as well as its interactions with other proteins are regulated by phosphorylation at three sites - serine157 (S157), serine239 (S239), and threonine278 (T278) in humans. cAMP- and cGMP- dependent protein kinases phosphorylate S157 and S239, respectively. In contrast, the kinase responsible for T278 was as yet unknown and identified in the first part of this thesis. In a screen for T278 phosphorylating kinases using a phospho-specific antibody against phosphorylated T278 AMP-activated protein kinase (AMPK) was identified in endothelial cells. Mutants of AMPK with altered kinase-activity modulate T278-phosphorylation levels in cells. AMPK-driven T278-phosphorylation impaired stress fiber formation and changed cell morphology in living cells. AMPK is a fundamental sensor of cellular and whole body energy homeostasis. Zucker Diabetic Fatty (ZDF) rats, which are an animal model for type II diabetes mellitus, were used to analyze the impact of phosphorylated T278 in vivo. AMPK-activity and T278-phosphorylation were substantially reduced in arterial vessel walls of ZDF rats in comparison to control animals. These findings demonstrate that VASP is a new AMPK substrate, that VASP phosphorylation mediates the effects of metabolic regulation on actin cytoskeleton rearrangements, and that this signaling system becomes down-regulated in diabetic vessel disorders in rats. In the second part of this thesis, a functional analysis of differential VASP phosphorylations was performed. To systematically address VASP phosphorylation patterns, a set of VASP phosphomimetic mutants was cloned. These mutants enable the mimicking of defined phosphorylation patterns and the specific analysis of single kinase-mediated phosphorylations. VASP localization to the cell periphery was increased by S157- phosphorylation and modulated by phosphorylation at S239 and T278. Latter phosphorylations synergistically reduced actin polymerization. In contrast, S157- phosphorylation had no effect on actin-dynamics. Taken together, the results of the second part show that phosphorylation of VASP serves as a fine regulator of localization and actin polymerization activity. In summary, this study revealed the functions of VASP phosphorylations and established novel links between signaling pathways and actin cytoskeleton rearrangement.
Early onset sepsis due to group B streptococcus leads to neonatal morbidity, increased mortality, and long-term neurological deficencies. Interaction between septicemic GBS and confluent monolayers of human coronary artery endothelial cells (HCAECs) was analyzed by genome wide expression profiling. In total, 124 genes were differentially expressed (89 upregulated, 35 downregulated) based on a more than 3-fold difference to control HCAEC. Regulated genes are involved in apoptosis, hemostasis, oxidative stress response, infection, and inflammation. Regulation of selected genes and proteins identified in the gene array analysis was confirmed by Real-time RT-PCR assay (granulocy te chemotactic protein 2), ELISA (urokinase, cyclooxygenase 2, granulocyte chemotactic protein 1), and western blotting (Heme oxygenase1, BCL2 interacting protein) at various time points between 4 and 24 hours. These results indicate that GBS infection might influence signalling pathways leading to impaired function of the innate immune system and hemorrhagic and inflammatory complications during GBS sepsis.
Directed cortical actin assembly is the driving force for intercellular adhesion. Vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) participates in actin-fiber formation and VASP activity is regulated by phosphorylations. We screened for endothelial cell proteins, which bind to VASP dependent on its phosphorylation status. Differential proteomics identified αII-spectrin as novel VASP-interacting protein. αII-spectrin binds to the triple GP5-motif in VASP via its SH3 domain. cAMP-dependent protein kinase-mediated VASP phosphorylation at Ser157 inhibits αII-spectrin/VASP complex formation. VASP becomes dephosphorylated upon formation of cell-cell contacts and in confluent but not in sparse endothelial cells αII-spectrin colocalizes with non-phosphorylated VASP at cell-cell junctions. Ectopic expression of the αII-spectrin SH3 domain fused to claudin-5 translocates VASP to cell-cell contacts and is sufficient to initiate the formation of cortical actin cytoskeletons. αII-spectrin SH3 domain overexpression stabilizes cell-cell contacts and decreases endothelial permeability. Conversely, permeability of VASP-deficient endothelial cells is elevated. In a skin edema model, microvascular leakage is increased in VASP-deficient over wild-type mice. We propose that αII-spectrin/VASP complexes regulate cortical actin cytoskeleton assembly with implications for formation of endothelial cell-cell contacts and regulation of vascular permeability.
Atherosklerose ist eine chronisch-entzündliche Gefäßerkrankung. Dabei sind alle entscheidenden Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems involviert. Besonders dendritische Zellen (DCs) expandieren subendothelial während der Progression einer Atherosklerose. Diese können Antigene aufnehmen und daraufhin Zytokine produzieren oder andere Immunzellen aktivieren. MicroRNAs (miRNAs) sind kleine nicht-kodierende Stränge aus Ribonukleinsäure, welche als weitere Ebene der Genregulation wichtige Zellvorgänge beeinflussen können. Diese Arbeit zeigt mögliche Zielproteine des miRNA 17-92 Clusters in dendritischen Zellen auf und schlägt mögliche Modelle vor, wie dadurch Zellvorgänge von DCs in der Atherosklerose reguliert werden könnten.
Die Bedeutung der cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinase für die Hemmung der Plättchenaktivierung und -aggregation ist gut beschrieben. Zahlreiche fundamentale Plättchenantworten wie die Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration, die Exposition von Adhäsionsrezeptoren und die Aktinpolymerisation können durch die Cyclonukleotid vermittelte Kinasenaktivierung fast vollständig gehemmt werden. Die Vielfalt der cGMP bindenden Proteine und deren synergistische Interaktion mit cAMP vermittelten Signalwegen deuten auf eine Reihe von cGMP Zielproteinen hin. Vor kurzem wurde die zentrale Bedeutung einer Gi-Protein Stimulation für die Plättchenaktivierung und –aggregation gezeigt. In dieser Dissertation wurde daher der Frage nachgegangen, ob Signalmoleküle, die an Gi-Protein vermittelten Effekten beteiligt sind, einen Angriffspunkt für cAMP/cGMP-abhängige Proteinkinasen darstellen. Zu diesem Zweck wurden die Effekte erhöhter cGMP Spiegel und die selektive Aktivierung der cGMP-abhängigen Proteinkinase auf die adrenerge und purinerge Rezeptor vermittelte Erniedrigung stimulierter cAMP Konzentrationen untersucht. In unseren Versuchen konnte erstmalig gezeigt werden, dass eine Erhöhung der intrazellulären cGMP Konzentration Gi-Protein vermittelte Signale hemmt. Dieses erfolgt nicht auf Grund einer cGMP stimulierten Aktivierung von cyclonukleotidabbauenden Phosphodiesterasen, sondern auf Grund einer Aktivierung der cGMP-abhängigen Proteinkinase. In Anbetracht der essentiellen Bedeutung der Gi-Protein Stimulation für die Plättchenaktivierung stellt dies einen wichtigen Mechanismus dar, wie das aus dem Endothel freigesetzte NO über cGMP die Thrombozytenfunktion hemmt. Klinisch bedeutsame Substanzen wie Clopidogrel oder Ticlopidin imitieren diesen in vivo Effekt des NO, indem sie extrazellulär über eine Rezeptorhemmung Gi-Protein Stimulation verhindern. (Aktas et al., Biochem Pharmacol 2002; 64: 433-439) Dipyridamol und im Besonderen die Kombination von Dipyridamol und niedrig dosierter Acetylsalicylsäure sind in der Sekundärprävention des Schlaganfalles sehr gut wirksam. Jedoch sind die hierfür zu Grunde liegenden biochemischen Mechanismen noch nicht vollständig aufgeklärt. Da für das Dipyridamol eine in vitro Hemmung der cGMP-spezifischen Phosphodiesterase 5 (PDE 5) nachgewiesen ist, wurde in dieser Arbeit untersucht, ob Dipyridamol in therapeutisch relevanten Konzentrationen die NO/cGMP vermittelte Effekte auf die Plättchenfunktion unter ex vivo Bedingungen verstärkt. Die Phosphorylierung von VASP (VAsodilator-Stimulated Phosphoprotein) diente dabei als Meßparameter NO/cGMP Signale in Thrombozyten mit Hilfe von Antikörpern und Western Blot Technik zu quantifizieren. Die Sekretion von Serotonin aus Thrombozyten und die Aktivität der Thromboxansynthase wurden durch die fluorimetrische Bestimmung derivatisierten Serotonins bzw. des Synthaseprodukts Malondialdehyd quantifiziert. Endotheliale Faktoren wie NO oder PG-I2 erhöhen cGMP bzw. cAMP, die zu einer Plättchenhemmung und gleichzeitigen VASP Phosphorylierung führen. In in vitro Versuchen potenzierte Dipyridamol in einer therapeutisch relevanten Konzentration (3,5 µmol/l) nur die cGMP vermittelte, aber nicht die cAMP vermittelte VASP Phosphorylierung. Darüber hinaus konnte Dipyridamol (3,5 µmol/l) die Hemmung von Plättchenfunktionen wie der Serotoninsekretion und die Aktivität der Thromboxansynthase durch einen NO Donor klar verstärken. Schließlich steigerte Dipyridamol die NO vermittelte VASP Phosphorylierung auch in Thrombozyten von Probanden, die vorher Dipyridamol eingenommen hatten. Unter therapeutisch relevanten Bedingungen verstärkt also Dipyridamol NO/cGMP Signalwege und damit die Hemmung von Thrombozyten. Dieser Befund bekräftigt die Vorstellung, dass die Verstärkung endothelialer NO/cGMP Effekte auf Thrombozyten eine wichtige Komponente der Dipyridamol Wirkung unter in vivo Bedingungen darstellt. (Aktas et al., Stroke 2003; 34(3): 764-769) Die Stimulation von Thrombozyten führt u.a. zu einer Sekretion von Plättchenaktivatoren wie Thrombin, Thromboxan A2, ADP oder Serotonin aus dem Zellinnern. Durch diesen Prozess der Degranulierung können nun weitere Thrombozyten aktiviert werden. Die Sekretion stellt somit einen wichtigen, verstärkenden Schritt in der Aktivierung von Thrombozyten während der Hämostase dar. Diese Arbeit zeigt, dass in Thrombozyten eine Gi-Protein Aktivierung nicht nur wie bisher angenommen eine initiale Sekretion durch Gq verstärkt und aufrecht erhält, sondern der eigentliche Stimulus ist, der die Degranulierung von Thrombozyten auslöst. Die Stimulation Gq vermittelter Signalwege ist nur insofern erforderlich, als diese das Auslösen der Sekretion durch eine Aktivierung von Gi-Proteinen ermöglichen. Die Stimulierung beider G-Proteine ist daher essentiell für die thrombozytäre Sekretion. Zudem konnte die Phospholipase D als ein neuer Effektor des P2Y12 nachgewiesen werden, deren Stimulierung wahrscheinlich zur Degranulierung von Thrombozyten führt. Dieser Mechanismus könnte der Entscheidende sein, der der essentiellen Rolle des Gi-Proteins bei der Stimulation der Sekretion und der Aktivierung von Thrombozyten zu Grunde liegt und könnte ein neues Licht auf die Wirkweise des Clopidogrels und des Ticlopidins werfen, die irreversibel an den P2Y12 Rezeptor binden. (Aktas et al., Manuskript in Vorbereitung)