Institut für Klinische Neurobiologie
Refine
Has Fulltext
- yes (2)
Is part of the Bibliography
- yes (2)
Year of publication
- 2010 (2) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (2)
Language
- German (2)
Keywords
- Axon (1)
- EGFR (1)
- Embryonalentwicklung (1)
- Genexpression (1)
- Großhirnrinde (1)
- Kinasen (1)
- Kortikogenese (1)
- Migration (1)
- Motoneuron (1)
- Neurogenese (1)
Die Rolle der Hirnrinde als Zentrum komplexer Funktionen wie Lernen und Ge-dächtnis wird nicht zuletzt durch deren komplexe, in Schichten organisierte Architek-tur ermöglicht. Von entscheidender Bedeutung ist die präzise Positionierung von Nervenzellen, die im Laufe der Embryonalentwicklung in der Ventrikularzone (VZ) geboren werden und anschließend in radialer Richtung zu ihrem Bestimmungsort wandern. Die Funktion des Neurotrophin-Rezeptors TrkB an der Entwicklung des zerebralen Kortex war Gegenstand dieser Arbeit. Am Tag 12,5 der Embryonalentwicklung konnte die Expression von TrkB so-wohl in den Zellen der VZ als auch in neu geborenen Neuronen der Präplatte nach-gewiesen werden. Die Phosphorylierung des Rezeptors erfolgte dabei unabhängig von den beiden Liganden BDNF und NT-3. Ebenso führten BDNF oder NT-3 zu keiner zellulären Antwort in isolierten kortikalen Vorläuferzellen, wohingegen die Stimulation mit EGF eine Phosphorylierung von TrkB an der PLCγ- und der Shc-Bindungsstelle hervorrief. Durch pharmakologische Inhibition und die Überexpression dominant negativer Src-Mutanten konnte die Beteiligung des EGF-Rezeptors und zweier neuronal exprimierter Src-Kinasen, cSrc und Fyn, an dieser Transaktivierung von TrkB durch EGF gezeigt werden. Durch die Zugabe von EGF kam es im Zuge der Aktivierung von TrkB auch zur Umverteilung des Rezeptors von intrazellulären Kompartimenten zur Zellmem-bran. Die Retention des Rezeptors im Zytoplasma wurde über post-translationelle Modifikation reguliert. Die Verhinderung von N-Glykosylierung durch Tunicamycin-Behandlung kortikaler Vorläuferzellen führte zur Exposition von TrkB an der Zellober-fläche und konnte so Responsivität gegenüber BDNF herstellen. Die physiologische Bedeutung einer Transaktivierung von TrkB durch EGF wurde durch das Fehlen der TrkB-Aktivierung in EGFR KO-Mäusen am Embryonal-tag 12,5 gezeigt. Dies hatte eine fehlerhafte Positionierung kortikaler Nervenzellen zum Zeitpunkt E15,5 zur Folge. Anhand eines Migrationsassays konnte schließlich gezeigt werden, dass die EGF-induzierte Wanderung kortikaler Vorläuferzellen in vitro mit einer asymmetrischen Translokation von TrkB einhergeht. Über die Transaktivierung von TrkB in frühen Phasen der Kortexentwicklung spielt EGF eine wichtige Rolle bei der Induktion neuronaler Differenzierung und ist an der Regulation der Wanderung postmitotischer Neurone in der Hirnrinde beteiligt.
In dieser Arbeit sollte die Funktion der Ribosomalen S6 Kinase 2 (RSK2) auf neuronaler Ebene untersucht werden. Dahingehend gab es, z.B. auf Grund der Phänotypen von Fliegen und Mäusen mit Mutationen im entsprechenden Gen oder von Patienten mit Coffin-Lowry-Syndrom (CLS) nur Vermutungen. Es bestand letztlich die Hoffnung, einen Beitrag zur Aufklärung der Pathophysiologie des CLS zu leisten. Es stellte sich auf Grund von Experimenten sowohl in vivo als auch in vitro in verschiedenen Modellsystemen in dieser Arbeit heraus, daß RSK2 einen negativen Einfluß auf das Neuriten- und Synapsenwachstum hat. In kultivierten Motoneuronen führte der KO von RSK2 zu längeren Axonen und die Überexpression eines konstitutiv aktiven RSK2-Konstrukts zu kürzeren Axonen. In PC12-Zellen führte die Expression von konstitutiv aktiven RSK2 Konstrukten zur Verkürzung der Neuriten und die Expression eines Kinase-inaktiven RSK2 Konstrukts zu längeren Neuriten. In vivo war die neuromuskuläre Synapse bei RSK2-KO Mäusen vergrößert und hatte bei Drosophila rsk Mutanten mehr Boutons. Das RSK2-Protein ist in Motoneuronen der Maus und in überexprimierter Form in den Boutons der neuromuskulären Synapse bei Drosophila nachweisbar. Damit wurde zum ersten Mal die Funktion von RSK2 auf neuronaler Ebene beschrieben. Bezüglich des Mechanismus, wie RSK2 das Nervenwachstum beeinflußt gab es deutliche Hinweise, die dafür sprechen, daß RSK2 dies über eine in der Literatur schon häufiger beschriebene Hemmung der MAPK ERK1/2 erreicht. Für diese Hypothese spricht die Tatsache, daß die ERK-Phosphorylierung in murinen Motoneuronen und im Rückenmark embryonaler Mäuse der RSK2-Mutante erhöht ist und der Axonwachstumsdefekt durch eine Hemmung von MEK/ERK behoben werden kann. Auch ist die ERK-Phosphorylierung an der murinen Muskel-Endplatte in der Mutante erhöht. Zudem zeigen genetische Epistasis-Experimente in Drosophila, daß RSK die Bouton-Zahl über ERK/RL hemmt. RSK scheint also in Drosophila von der Funktion her der RSK2-Isoform in Wirbeltieren sehr ähnlich zu sein. Ein weiteres wichtiges Ergebnis ist die Beobachtung, daß RSK2 bei Motoneuronen keinen wesentlichen Einfluß auf das Überleben der Zellen in Gegenwart neurotropher Faktoren hat. Möglicherweise spielen hier redundante Funktionen der RSK Familienmitglieder eine Rolle. Ein bislang unerklärter Befund ist die reduzierte Frequenz spontaner Depolarisationen bzw. damit einhergehender Ca2+ Einströme bei RSK2-KO Motoneuronen in Zellkultur. Die Häufigkeit und Dichte von Ca2+-Kanälen und aktive Zonen Proteinen war in Motoneuronen nicht von der Anwesenheit des RSK2-Proteins abhängig. Im Hippocampus konnte außerdem das RSK2-Protein präsynaptisch in den Moosfaser-Boutons der CA3 Region nachgewiesen werden. Es befindet sich auch in den Pyramidenzellen, aber nicht in den Pyramidenzell-Dendriten in CA3. Bezüglich der Bedeutung dieser Befunde für die Aufklärung der Pathologie des CLS ist zu folgern, daß der neuro-psychologische Phänotyp bei CLS Patienten wahrscheinlich nicht durch reduziertes Überleben von Neuronen, sondern eher durch disinhibiertes Axonwachstum oder Synapsenwachstum bedingt ist. Dies kann grob sowohl für die peripheren als auch die zentralen Defekte gelten, denn die Synapsen im ZNS und am Muskel sind in ihrer molekularen Ausstattung z.B. im Bereich der Vesikel, der aktiven Zonen oder der Transmitterausschüttung sehr ähnlich. Weiterhin könnte eine veränderte synaptische Plastizität u.a. an der Moosfaser-Pyramidenzell-Synapse in der CA3 Region des Hippocampus eine Rolle bei den kognitiven und mnestischen Einschränkungen der Patienten spielen. Die Entdeckung, daß aktiviertes ERK bei den beobachteten Effekten eine Rolle spielt kann für die Entwicklung von Therapiestrategien eine wertvolle Erkenntnis sein.