Institut für Hygiene und Mikrobiologie
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Sonstige beteiligte Institutionen
- Broad Institute, USA (1)
- Department Pharmazie - Zentrum für Pharmaforschung, Ludwig-Maximilians-Universität München (1)
- Department of Hematology and Oncology, Sana Hospital Hof, Hof, Germany (1)
- Department of Laboratory Medicine and Medicine Huddinge, Karolinska Institutet and University Hospital, Stockholm, Sweden (1)
- Department of Medicine A, University Hospital of Münster, Münster, Germany (1)
- Instituto de Higiene, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay (1)
- Instituto de Hygiene Montevideo, Uruguay (1)
- Krankenhaushygiene und Antimicrobial Stewardship (1)
- Krankenhaushygiene und Antimicrobial Stewardship (Universitätsklinikum) (1)
- Leibniz-Institut für Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie Hans-Knöll-Institut (1)
EU-Project number / Contract (GA) number
- 2016 FGR 0053 (1)
- 278864 (1)
- 715466 (1)
- 847507 (1)
1. Zusammenfassung Neisseria meningitidis ist weltweit ein bedeutender Erreger invasiver Infektionen bei Kindern und Heranwachsenden. Der in vielen Ländern niedrigen Inzidenz stehen hohe Raten asymptomatischer Kolonisation des menschlichen Nasopharynx mit Meningokokken gegenüber. Während die Pathogenese durch Meningokokken ausführlich untersucht ist, wurde dem Trägertum von Meningokokken bisher wenig Aufmerksamkeit geschenkt, nicht zuletzt auch wegen des Fehlens eines geeigneten Tiermodells. Kürzlich publizierte Daten lassen die asymptomatische Persistenz von Meningokokken in einem Biofilm-ähnlichen Stadium auf und innerhalb des Tonsillengewebes vermuten. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Etablierung eines Biofilmmodells für Meningokokken als ein Modell für asymptomatisches Trägertum. Es wurde zudem die Biofilmbildung von Meningokokken unterschiedlichster klonaler Linien mit dem Ziel untersucht, auf molekularer Ebene die Biofilmbildung bei Meningokokken zu verstehen. In statischen Biofilmtests konnte gezeigt werden, dass Biofilmbildung eine ubiquitäre Eigenschaft von Meningokokken ist, solange diese keine Kapsel exprimieren. Hierbei war es unerheblich, ob Trägerisolate oder Isolate aus invasiven Meningokokkenerkrankungen untersucht wurden. Durch die Konstruktion fluoreszierender Meningokokkenstämme und die Etablierung eines Minimalmediums konnte für Meningokokken ein standardisiertes Biofilmmodell unter Flussbedingungen erstellt werden. Das Flussmodell für Meningokokkenbiofilme erwies sich als äußerst robust und reproduzierbar. Es wurde deutlich, dass Meningokokken Biofilme unterschiedlicher Struktur ausbildeten, die teilweise über 120 Stunden in vitalem Zustand gehalten werden konnten. Die Mehrzahl der Stämme bildete heterogene Biofilme mit distinkten Mikrokolonien aus, während andere Stämme homogene Biofilme ohne Mikrokolonien ausbildeten. Diese strukturellen Unterschiede hatten keinen Effekt auf die Antibiotika-Empfindlichkeit der Biofilme. Es konnte gezeigt werden, dass Meningokokkenbiofilme durch Ciprofloxacin und Rifampicin, nicht aber durch Penicillin im Wachstumsmedium abgetötet werden konnten. Diese Ergebnisse passen zu in vivo-Befunden, die zeigen, dass Ciprofloxacin und Rifampicin im Gegensatz zu Penicillin sehr zuverlässig das Trägertum von Meningokokken eradizieren können. Durch die Untersuchung der Biofilmbildung von PilX- und PilE-Mutanten konnte die Bedeutung der Twitching Motility für die Mikrokoloniebildung im Meningokokkenbiofilm aufgezeigt werden. Ausgeprägte Motilität führte zu Mikrokoloniebildung, während weitgehend unbewegliche Stämme flache unstrukturierte Biofilme bildeten. In der vorliegenden Arbeit konnte der Verlust der Mikrokoloniebildung bei der PilX-Mutante durch Reduktion der Piliierung, die zu verminderter Motilität führte, erklärt werden. Autoaggregation der Zellen spielte für die Mikrokoloniebildung keine Rolle, was im Widerspruch zur kürzlich publizierten Rolle von PilX steht. Initiale Schritte der Biofilmbildung bei Meningokokken könnten von extrazellulärer DNA (exDNA) abhängen, da die Zugabe von DNase zur Vorkultur die Biofilmbildung verhinderte, jedoch bestehende reife Biofilme nicht auflöste. Die Funktion, der Mechanismus der Freisetzung, sowie die Menge und Verteilung dieser exDNA in Meningokokkenbiofilmen wird Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein.
Helicobacter pylori (H. pylori) is a gram-negative, microaerophilic, spiral-shaped bacterium. It resides in the gastric mucous layer and epithelial lining of the stomach, often clustering at the junction of epithelial cells. H. pylori colonization usually occurs during childhood, and, when left untreated, generally persists for the host’s lifetime. Persistent H. pylori infection can cause chronic superficial gastritis and gastric duodenal ulcers, which is possibly linked to the development of gastric carcinoma and primary gastric lymphoma, especially of the mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) type. It was recently defined as a class 1 carcinogen. The gastric inflammatory response to H. pylori infection is characterized by infiltration of the mucosa by neutrophils, T and B cells, plasma cells and macrophages. This reaction is initially induced by H. pylori attachment, followed by cytokine release by gastric epithelial cells. Epidemiological studies revealed that more than 50% of adults are infected with H. pylori all over the world. However, interestingly, only a subset of individuals develops serious H. pylori-related disease, while most infected individuals show no clinical symptoms. Gastric epithelial cells, like intestinal epithelial cells, express a subset of Toll-like receptors (TLRs) and similar pattern recognition receptors, which are important for the activation of the innate immune system. Bacterial components such as lipopeptides, peptidoglycan, LPS, flagellin, and CpG DNA are the ligands of TLRs. Thus, TLRs in gastric epithelial cells might be able to contribute to innate immune responses to H. pylori infection. However, there is scant knowledge about the mechanisms of innate immune response to acute and chronic H. pylori infection. This study is focused on host cell interaction with H. pylori flagellins, which are major components of the flagellar apparatus, and innate immune responses against them. The flagellins, which are essential for bacterial motility, are important for H. pylori to survive in the stomach mucus during the whole infectious cycle. Flagellins are known to act as the main determinant of many mucosal pathogenic bacteria that mediates proinflammatory signaling, including transcriptional factor NF-B activation via TLR5. In the first part of the study, we investigated the effects of H. pylori flagellins on TLR5 expression, NF-B activation and IL-8 production in various human intestinal and gastric epithelial cell lines by using Western blotting, semi-quantitative RT-PCR and ELISA. IL-8 is a potent neutrophil-activating chemokine expressed by gastric epithelial cells. When we stimulated the cells with the native form of or E. coli-expressed recombinant H. pylori flagellins, FlaA and FlaB, IL-8 was not induced in any case, while S. typhimurium flagellin (FliC) induced it significantly. H. pylori was able to modulate TLR5 protein expression and NF-B activation in epithelial cells regardless of the presence of flagellins. Having established the finding that H. pylori flagellins have unusually low immune-stimulatory properties, we further investigated to find out possible reasons why H. pylori flagellins are distinct from other flagellins of pathogenic bacteria in terms of immune-stimulatory activity. From amino acid sequence comparisons, we found that some regions in the terminal D0D1 protein domains of H. pylori flagellins are different from flagellins of other pathogenic bacteria. D0D1 is the domain which is known to interact with TLR5 in Salmonella FliC. To examine whether the differences endow H. pylori flagellins with low immune-stimulatory properties, we created several mutated H. pylori flagellins (FlaA and FlaB) by site-directed mutagenesis that contain one to four epitopes of Salmonella flagellin D0D1 domain amino acid sequences. The mutant flagellins expressed both in H. pylori and E. coli were used to determine their influence on TLR5-signaling mediators and cytokines, such as MAPkinases, (ERK, p38), NF-B, IL-8, and MIP-3. Salmonella FliC expressed in E. coli induced activation of p38, IB and NF-B leading to IL-8 and MIP-3 production in gastric epithelial cells. However, none of the H. pylori flagellin mutants activated MAP kinases or induced those cytokines. In a co-immunoprecipitation assay none of the recombinant wild type or mutated H. pylori flagellins showed any direct physical interaction with TLR5, while Salmonella FliC significantly co-precipitated with TLR5. Interestingly, we found H. pylori flagellins bind to the surface of gastric epithelial cells like FliC, although they do not bind to or stimulate TLR5. Based on the physical interaction of H. pylori flagellins and FliC with human gastric epithelial cells, we further analyzed transcriptional regulation by H. pylori flagellin in these host cells using microarray analysis. The result showed that H. pylori flagellins modulate host cell gene expression, and many of the identified regulation events overlap with the genes regulated by FliC. These findings imply that H. pylori flagellins do play a role in gene regulation of host cells probably through still unknown factors or receptors, although they do not trigger TLR5-related signaling pathways. The results of our study suggest that, in addition to the low immune-stimulatory activity of H. pylori LPS, the evolutionary reduction in stimulating activity of H. pylori flagellins on the local innate immune responses in the stomach in vivo might be a further strategy of this chronic mucosal pathogen to evade and minimize deleterious host responses, thereby promoting life-long persistence in the host, and possibly contributing to cancerogenesis.
The insulin receptor ortholog EmIR of the fox-tapeworm Echinococcus multilocularis displays significant structural homology to the human insulin receptor (HIR) and has been suggested to be involved in insulin sensing mechanisms of the parasite’s metacestode larval stage. In the present work, the effects of host insulin on Echinococcus metacestode vesicles and the proposed interaction between EmIR and mammalian insulin have been studied using biochemical and cell-biological approaches. Human insulin, exogenously added to in vitro cultivated parasite larvae, (i) significantly stimulated parasite survival and growth, (ii) induced DNA de novo synthesis in Echinococcus, (iii) affected overall protein phosphorylation in the parasite, and (iv) specifically induced the phosphorylation of the parasite’s Erk-like MAP kinase orthologue EmMPK1. These results clearly indicated that Echinococcus metacestode vesicles are able to sense exogenous host insulin which induces a mitogenic response. To investigate whether EmIR mediates these effects, anti-EmIR antibodies were produced and utilized in biochemical assays and immunohistochemical analyses. EmIR was shown to be expressed in the germinal layer of the parasite both on the surface of glycogen storing cells and undifferentiated germinal cells. Upon addition of exogenous insulin to metacestode vesicles, the phosphorylation of EmIR was significantly induced, an effect which was suppressed in the presence of specific inhibitors of insulin receptor-like tyrosine kinases. Furthermore, upon expression of EmIR/HIR receptor chimera containing the extracellular ligand binding domain of EmIR in HEK 293 cells, a specific autophosphorylation of the chimera could be induced through the addition of exogenous insulin. These results indicated the capability of EmIR to sense and to transmit host insulin signals to the Echinococcus signaling machinery. The importance of insulin signaling mechanisms for parasite survival and growth were underscored by in vitro cultivation experiments in which the addition of an inhibitor of insulin receptor tyrosine kinases led to vesicle degradation and death. Based on the above outlined molecular data on the interaction between EmIR and mammalian insulin, the parasite’s insulin receptor orthologue most probably mediates the insulin effects on parasite growth and is, therefore, a potential candidate factor for host-parasite communication via evolutionary conserved pathways. In a final set of experiments, signaling mechanisms that act downstream of EmIR have been analyzed. These studies revealed significant differences between insulin signaling in Echinococcus and the related cestode parasite Taenia solium. These differences could be associated with differences in the organo-tropism of both species.
Neisseria meningitidis kann rasch tödlich verlaufende Erkrankungen wie die Meningokokken-Meningitis und –Sepsis hervorrufen. In den Industriestaaten werden diese Infektionen meist durch Meningokokken der Serogruppen B und C hervorgerufen. Während für die Serogruppe C bereits ein suffizienter Polysaccharidimpfstoff existiert, konnte ein solcher für Stämme der Serogruppe B aufgrund der Immuntoleranz gegen deren N-acetylneuraminsäure noch nicht gefunden werden. Eine Lebendvakzine könnte dieses Problem lösen, da hier viele verschiedene Antigene, welche eine Immunantwort im menschlichen Körper induzieren, zur Verfügung stünden. Die Voraussetzung für eine Lebendvakzine ist Attenuierung eines B-Meningokokken-Stammes durch die Deletion verschiedener Gene. In früheren Untersuchungen ergaben sich Hinweise darauf, dass die LOS-Sialylierung einen Virulenzfaktor darstellt. Das lst-Gen codiert für die α-2,3-Sialyltransferase, deren Aufgabe es ist, die Sialinsäurereste an die Lacto-N-Neotetraose des LOS zu binden. In unserer Arbeit konnten wir zeigen, dass eine lst-Deletionsmutante des Serogruppe-B-Stammes MC58 herstellbar ist. Das Wachstumsverhalten der Mutante in PPM+-Medium unterschied sich nicht von dem des Wildtyps. Auch die Resistenz der Bakterien gegenüber humanem Serum (bis 80%) blieb von der Deletion des lst-Gens unbeeinflusst. Bei der Interaktion mit Epithel- und Endothelzellen allerdings zeigte sich bei der Mutante eine erhöhte Invasivität. Da die Invasion durch Oberflächenproteine wie Opa und Opc vermittelt wird, wäre eine mögliche Begründung für diese Veränderung die bessere Zugänglichkeit dieser Proteine durch das Fehlen der LOS-Sialylierung. Meningokokken mit nicht sialyliertem LOS wurden außerdem von dendritischen Zellen signifikant besser phagozytiert als Wildtyp-Bakterien. Besonders deutlich zeigte sich dies bei fehlender Kapsel. Auch hier ist sicherlich die Maskierung von Bindungsstellen durch Sialinsäuregruppen ein Grund für diese Beobachtung. Weiterhin wurde die Interaktion von Meningokokken verschiedener Serogruppen mit dendritischen Zellen unter besonderer Berücksichtigung des Einflusses der Polysaccharidkapsel untersucht. Die Meningokokken der untersuchten Serogruppen A, B und C wurden von dendritischen Zellen gut phagozytiert und abgetötet. Allerdings waren sowohl die Adhärenz als auch die Phagozytose bei Vorhandensein einer Polysaccharidkapsel stark inhibiert. Neisseria meningitidis-Stämme aller drei getesteten Serogruppen induzierten eine starke Ausschüttung der Zytokine TNF-α, IL-6 und IL-8. Als ein Induktor dieser Substanzen erwiesen sich die Lipooligosaccharide der Meningokokken. Allerdings zeigte sich in den Versuchen auch, dass noch weitere Bakterienbestandteile eine Zytokinausschüttung hervorrufen können. Die Sialylierung der Lipooligosaccharide hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Menge der produzierten Zytokine. Mit dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass dendritische Zellen mit der Ausschüttung von Zytokinen und der Phagozytose von Bakterien eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Erkrankungen durch Meningokokken spielen könnten. Auch beim Zusammenspiel mit DC-s wirkt die Kapsel als Schutzfaktor vor dem Angriff des menschlichen Immunsystems. Dieser Schutz kann durch die LOS-Sialylierung zusätzlich gesteigert werden. Die Deletion des lst-Gens könnte also als ein Baustein für die Konstruktion eines attenuierten Lebendvakzine-Stammes fungieren.
Haemophilus influenzae ist ein fakultativ anaerobes, Gram-negatives Bakterium aus der Familie der Pasteurellacaea. Das physiologische Merkmal von H. influenzae ist die essentielle, aber defiziente Hämin- und Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) Biosynthese. Während Hämin für aerobes Wachstum benötigt wird, ist NAD+ sowohl für aerobes, als auch für anaerobes Wachstum essentiell. Als NAD+-abhängiger Organismus fehlen H. influenzae die meisten Enzyme für die NAD+-Biosynthese. Daher kann dieses Bakterium nur eine begrenzte Anzahl an Vorläufermolekülen, wie NAD+(P), Nikotinamid-Mono-Nukleotid (NMN) und Nikotinamid-Ribosid (NR) aus der Umwelt zur NAD+-Synthese nutzen. Andere NAD+-unabhängige Pasteurellacaea-Spezies, wie Haemophilus ducreyi, Pasteurella multocida und Actinobacillus actinomycetemcomitans, können auch kein NAD+ aus der de novo Biosynthese bereitstellen, diese Arten können aber zusätzlich auf Nikotinamid (NAm) wachsen. Die Erforschung des NAD+-Aufnahmesystems kann für die Entwicklung antimikrobieller Therapeutika von großem Interesse sein. Von unserer Arbeitsgruppe wurde die NAD+-Aufnahmeroute aufgeklärt; so werden NAD+(P) und NMN von e(P4) und NadN zu NR degradiert, nachdem NAD+ und NMN durch OmpP2 in das Periplasma gelangt sind. NR wird schließlich, als einziges Substrat, durch einen putativen Transporter in das Zytoplasma aufgenommen. In dieser Arbeit wurde der putative NR-Transporter als das hypothetische Gen HI1077.1 im Genom von H. influenzae identifiziert, welches nur 13,8% Identität zu Escherichia coli pnuC und 43,6% Identität zu P. multocida pnuC aufwies. Es konnten zwei Sequenzierungsfehler im original-annotierten Genom von H. influenzae gefunden werden, die zu einer Leserasterverschiebung geführt haben. HI1077.1 wurde zu pnuCHi reannotiert und weist nun eine 19,7% Identität zu pnuCEc und 71,4% Identität zu pnuCPm auf. Es wurde eine HI1077.1 Mutante konstruiert, die ein Wachstumsdefizit auf BHI-Platten bis zu einer NAD+-Konzentration von 15 mM bzw. unterhalb einer NR-Konzentration von 0,1 mM zeigte. Im Transport-Assay transportierte die HI1077.1 Mutante nur noch etwa 1% des eingesetzten NAD+- bzw. NR-Labels. Im Rattenversuch konnte gezeigt werden, dass das in vitro nicht essentielle pnuC in vivo sehr wohl essentiell ist. Die HI1077.1 Mutante verursachte, im Gegensatz zum Wildtyp und zur pnuC-Komplementante keine Bakteriämie mehr. Bei einer Komplementation mit NadV, kodierend für eine Nikotinamid-Phosphoribosyltransferase von H. ducreyi, wurde ebenfalls eine mit dem Wildtyp vergleichende Bakteriämie verursacht. Da bisher noch keine H. influenzae Isolate bekannt sind, die nadV besitzen, würde sich der hier identifizierte NR-Transporter von H. influenzae gut als antimikrobielles Ziel eignen. Die Protein-Topologie von PnuC wurde hinsichtlich der Membranlokalisation analysiert und PnuC konnte als ein Transmembranprotein bestätigt werden, das in der cytosolischen Membran lokalisiert ist. Durch PhoA und LacZ Analysen konnte die Topologie von PnuC aufgeklärt werden. Demnach besitzt PnuC acht Transmembrandomänen (TMD), wobei die N- und C-Termini im Cytosol lokalisiert sind. Die Analyse der strukturellen Funktion ergab, dass PnuC nur eine Unterbrechung der sechs letzten C-terminalen Aminosäuren (AS) toleriert, während die Proteinfunktion durch einen fusionierten C- und N-terminaler His-Tag nur mäsig beeinflusst wird. Des Weiteren wurde die Substratspezifität von PnuC untersucht. Dabei zeigte sich, dass der lange geglaubte NMN-Transporter von E. coli ebenfalls als NR-Transporter fungiert. Die Substratspezifität wurde auch bei A. actinomycetemcomitans und P. multocida untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass A. actinomycetemcomitans und P. multocida ebenfalls als einziges Substrat NR transportieren können, aber im Gegensatz zu H. influenzae NAD+ und NMN nicht als NR-Quellen verwerten können, was wahrscheinlich auf das Fehlen von e(P4) und NadN zurückzuführen ist. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit das Gen HI0308 untersucht. Um dem Aspekt der Energetisierung des PnuC-Transporters näher zu kommen, sind die Gencluster HI1078-HI1080 und HI0164-HI0171 in die Untersuchung mit einbezogen worden. Die Na+-NQR-Oxidoreduktase wurde im Hinblick ihrer Dehydrogenase-Aktivität genauer charakterisiert. Die Suche nach möglichen Inhibitoren von PnuC führte zu 3-Aminopyridin-Analoga. Durch eine Mutantenanalyse konnte gezeigt werden, dass 3-AADP, 3-AAD und 3-AmPR der selben Aufnahmeroute folgen wie NADP+, NAD+ und NR, und via PnuC in die Zelle aufgenommen werden. Darüber hinaus konnten wir nachweisen, dass NadR aus 3-AmPR und ATP das 3-AAD synthetisiert, welches als kompetitiver Inhibitor mit NAD+ in den zellulären Redoxreaktionen konkurriert und dadurch den Stoffwechsel hemmt. Des Weiteren wurden mehrere spontan 3-Aminopyridin-resistente H. influenzae Mutanten isoliert.
Im Rahmen der Etablierung eines Bettnetzprojektes zur Prävention der Malaria wurden eine städtische (n=60) und eine ländliche Probandengruppe (n=60) in Nigeria im Großraum Abeokuta vor und ein Jahr nach Einführung von mit Insektizid behandelten Bettnetzen (ITN) untersucht. Dabei war das Ziel dieser Arbeit (1) die epidemiologische Malariasituation im Untersuchungsgebiet zu erfassen; (2) Wissen durch Informationsgespräche zu den Themen Prävention, Diagnostik und Therapie der Malaria zu vermitteln; (3), Akzeptanz und Gebrauch der ITN zu dokumentieren; (4), den Effekt von ITN am Verlauf klinischer und labortechnischer Parameter zu verfolgen und (5) die Prävalenz und Höhe von Antikörpern (NANP19) gegen das Circumsporozoiten (CS) Protein, ein Hauptoberflächenprotein der Sporozoiten vor Projektbeginn zu erfassen, sowie ihre Veränderung ein Jahr nach Einführung von ITN. Bei den Untersuchungen zeigte sich, dass Malaria eines der wichtigsten Gesundheitsprobleme der Region ist. Wissensvermittlung förderte die Akzeptanz und den regelmäßigen Gebrauch von ITN. Die klinischen und labortechnischen Untersuchungen bestätigen den protektiven Effekt durch Benutzung von ITN. Fast alle Parameter (Anzahl der Fieberepisoden/Jahr, Anzahl der arbeitsunfähigen Tage, Milzuntersuchung, Ausstrichuntersuchungen und Untersuchung auf Ak) zeigten für die Bettnetzbenutzergruppen Verbesserungen, von denen einige im Vergleich zum Vorjahr hochsignifikant waren. Die Resultate dieser Arbeit weisen darauf hin, dass im hochendemischen Südwesten Nigerias ITN effektiv zur Prävention der Malaria eingesetzt werden können. Der schwere Zugang zu medizinischer Versorgung für ländliche Bevölkerungsgruppen empfiehlt ihren Einsatz besonders in diesen Regionen. Hohe Infektionsraten mit der Gefahr rezidivierender Infektionen, besonders für Kinder, könnten dadurch gesenkt werden. Durch die gezeigte signifikante Reduktion der Krankeheitstage bei regelmäßiger ITN-Benutzung könnte ein zusätzlicher ökonomischer Benefit für Familien sein.
Untersuchungen zur Pathogenität von Helicobacter hepaticus : genomische und funktionelle Aspekte
(2006)
Helicobacter hepaticus stellt den Prototyp der enterohepatischen Helicobacter dar und führt zu einer persistenten Infektion von Mäusen. In immundefizienten Tieren kann er eine chronische Entzündung des Darmtraktes auslösen, welche den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen des Menschen, Morbus Crohn und Colitis Ulcerosa, ähnelt. Deshalb wird H. hepaticus bevorzugt als Modellorganismus zur Untersuchung der immunologischen Ursachen von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im Tiermodell eingesetzt. Ebenfalls kann eine Infektion mit H. hepaticus in suszeptiblen Mäusestämmen (z.B. Balb/c, C3H/An) zu Entzündungen der Leber und Gallengänge führen, welche sich bis zu einer Hepatitis und Leberkarzinomen ausweiten können. In den meisten Studien wurde H. hepaticus bisher aber hauptsächlich als Auslöser dieser Erkrankungen eingesetzt, während die bakterielle Seite kaum betrachtet wurde. Im Rahmen dieser Arbeit wurde in einer Kooperation mit MWG Biotech, GeneData und dem Massachusetts Institute of Technology (MIT) die Gesamtgenomsequenz des H. hepaticus Referenzstammes ATCC 51449 bestimmt und annotiert. Das Genom hat eine Größe von 1.799.146 bp und kodiert für 1.875 Proteine. Die globale Ähnlichkeit des Genoms von H. hepaticus ist etwa gleich groß zu den sequenzierten Genomen von H. pylori und C. jejuni. Es fehlen H. hepaticus aber die meisten Virulenzfaktoren von H. pylori wie Adhäsine (SabA, BabA, AlpA), VacA und die meisten Proteine der cag-Pathogenitätsinsel, während Homologe zu Pathogenitätsfaktoren von C. jejuni wie CDT und Peb1 vorhanden sind. Das Genom von H. hepaticus enthält neben vielen kleineren genomischen Inseln eine Genominsel mit einer Größe von 71 kb, welche als HHGI1 benannt wurde. Sie kodiert mutmaßlich für ein TypIV-Sekretionssystem und enthält weitere Virulenzfaktoren. In Microarray- basierten Gesamtgenomvergleichen konnte gezeigt werden, dass die Insel in sieben von 13 untersuchten Stämmen großteils oder komplett fehlt. Während Mäuse, aus denen HHGI1-positive Stämme isoliert wurden, pathologische Veränderungen der Leber aufwiesen, wies keine von den Mäusen, aus denen HHGI1-negative Stämme isoliert wurden, Auffälligkeiten in der Leber oder dem Gallentrakt auf. In einem Tiermodell wurde in Kooperation mit dem MIT gezeigt, dass zwei Insel-negative Stämme zu einer geringeren Besiedlung und einer schwächeren Entzündung der Leber als der Insel-positive Referenzstamm ATCC 51449 führen. Durch die Genomvergleiche konnte auch gezeigt werden, dass verschiedene H. hepaticus-Stämme trotz einer niedrigen Sequenzvariabilität eine hohe Variation des Genomgehalts aufweisen und dass neben der HHGI1-Insel weitere kleinere Inseln in einzelnen Stämmen fehlen. Es wurden in der vorliegenden Arbeit erstmals verschiedene isogene Mutanten von H. hepaticus in der HHGI-1-Insel hergestellt, die in vitro eine verringerte Immunstimulation in Makrophagen zeigten. Der Mechanismus dieser Immunsuppression konnte noch nicht vollständig aufgeklärt werden, sie werden jedoch derzeit in Mausmodellen weiter auf ihre krankheitsauslösenden Eigenschaften untersucht. Da bisher keine gut charakterisierten Zellkulturmodelle für die in vitro-Untersuchung von H. hepaticus vorlagen, wurden solche im Rahmen dieser Arbeit etabliert. Dazu wurden die intestinale murine epitheliale Zelllinie m-ICcl2, welche das primäre Habitat von H. hepaticus (Krypten im Dünndarm) imitiert, die murine Hepatozytenzelllinie NCTC Klon 1469, welche ein mögliches sekundäres Habitat (Lebercanaliculi) imitiert und die murine Makrophagenzelllinie J774 benutzt. Während J774 und NCTC Klon 1469 durch die meisten Liganden für Mustererkennungsrezeptoren stimuliert werden konnten, reagierten m-ICcl2- Zellen substantiell nur auf den TLR4-Liganden E. coli-LPS. Dementsprechend induzierte H. hepaticus in J774 und NCTC Klon 1469 eine starke proinflammatorische Antwort, während m-ICcl2 trotz guter Adhärenz nur schwach von H. hepaticus stimuliert wurde. Es wurde gezeigt, dass LPS und Flagelline von H. hepaticus nur eine geringe immunstimulatorische Wirkung besitzen, während Lipoproteine und vermutlich auch Peptidoglykan die wichtigsten PAMPs von H. hepaticus darstellen. Durch die Analyse der durch H. hepaticus ausgelösten globalen Genregulation in J774 und NCTC Klon 1469 wurde nachgewiesen, dass H. hepaticus nicht primär über NF-κB, sondern über MAP-Kinasen eine proinflammatorische Antwort auslöst. Außerdem wurde gezeigt, dass H. hepaticus untypisch für extrazelluläre Bakterien eher eine Wirtsantwort auslöst, welche der durch intrazelluläre Bakterien ähnelt. In diesen Modellen führten HHGI1-negative Stämme oder Mutanten der HHGI1-Insel zu einer leicht verringerten proinflammatorischen Antwort. Dies spiegelte sich auch in der transkriptionellen Regulation von Schlüsselfaktoren der angeborenen Immunantwort wie TLR2, IL-12, NOD2 oder Tollip wieder. In m-ICcl2-Zellen führte eine Koinkubation mit lebenden H. hepaticus oder Lysaten zu einer verringerten durch E. coli-LPS ausgelösten Induktion von MIP-2. Darauf basierend wurde gezeigt, dass LPS von H. hepaticus einen wesentlichen Faktor für diese Inhibierung der proinflammatorischen Antwort darstellt, nicht jedoch die HHGI-1-Insel oder andere vermutete Virulenzfaktoren. Zumindest auf mRNA-Ebene wurde durch H. hepaticus auch die Induktion anderer Cytokine wie TNF-α oder MIP-1α gehemmt. Eine primäre Koinkubation von m-ICcl2 mit E. coli-LPS führte zu einer Toleranzinduktion gegenüber einer zweiten Stimulation. Diese Toleranzinduktion wurde durch eine Inkubation mit H. hepaticus ebenfalls gehemmt. Die Hemmung der proinflammatorischen Antwort durch H. hepaticus-LPS konnte auch in NCTC Klon 1469 und unter serumfreien Bedingungen für die durch S. typhimurium- Flagellin induzierte IL-8 Sekretion in der humanen Kolonkarzinomzelllinie Caco2 nachgewiesen werden. Damit war diese Hemmung weder zellspezifisch noch spezifisch für die TLR4-abhängige Stimulation. Basierend auf dieser Arbeit wurde ein Modell für die Entstehung einer chronischen Entzündung im Intestinaltrakt entwickelt, welches Erklärungsansätze für die Entwicklung einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung im Menschen liefern könnte.
Es wird angenommen, dass die invasiven Stadien parasitärer Helminthen zur Organfindung und zur Weiterentwicklung auf die Sensierung spezifischer Wirts-Signale angewiesen sind, wobei die molekulare Natur dieser Signale bislang weitgehend ungeklärt ist. Vorangegangene Untersuchungen am Fuchsbandwurm Echinococcus multilocularis, dem Erreger der alveolären Echinokokkose, hatten bereits ergeben, dass dessen Metacestoden-Larvenstadium zur Weiterentwicklung kleine, lösliche Wirtsmoleküle benötigt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals ein axenisches (Wirtszell-freies) Kultursystem für das Metacestoden-Stadium entwickelt, mittels dessen sich diese Fragestellungen in vitro angehen lassen. Mit Hilfe dieses Kultursystems konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die drei Wirts-Hormone/Zytokine, Insulin, epidermal growth factor (EGF) und bone morphogeneic protein 2 (BMP2), einen Einfluss auf die Proliferation und die Differenzierung von E. multilocularis haben. Während für Insulin und EGF Wachstums-stimulierende Effekte gezeigt werden konnten, förderte BMP2 die Differenzierung des Metacestoden zum nächsten Larvenstadium, dem Protoscolex. In Modellorganismen wie Säugern, Drosophila und Caenorhabditis elegans verlaufen die durch Insulin- und EGF-ähnlichen Zytokine induzierten Signalmechanismen über die sogenannte mitogen activated protein (MAP)-Kinase-Kaskade. Um zu untersuchen, ob die externe Zugabe von Wirts-Insulin bzw. -EGF in einer Stimulierung der MAPK-Kaskade des Parasiten führt, wurden in dieser Arbeit zunächst die Komponenten dieses Signalweges bei E. multilocularis auf molekulargenetischer und biochemischer Ebene charakterisiert. Die Arbeiten umfassten Studien zu kleinen GTPasen des Parasiten (EmRas, EmRap1, EmRap2, EmRal), zu einem Orthologen der Kinase Raf (EmRaf), sowie Orthologen der Kinasen MEK (EmMKK) und ERK (EmERK). Es konnte gezeigt werden, dass diese Faktoren in E. multilocularis Teil einer MAP-Kinase-Kaskade sind. Zudem wurde nachgewiesen, dass diese Faktoren stromabwärts eines EGF-Rezeptor-Orthologen (EmER) des Parasiten fungieren, welches ebenfalls in der vorliegenden Arbeit analysiert wurde. Damit wurden die Voraussetzungen geschaffen, den Einfluss exogen zugegebenen Insulins bzw. EGFs auf die Aktivierung der MAP-Kinase-Kaskade im Parasiten zu untersuchen. Erste Analysen zeigten bereits, dass die zentrale Komponente dieser Kaskade, EmERK, durch die genannten Wirts-Zytokine aktiviert wird. Dies legt nahe, dass Wirt-Parasit-Kommunikationsmechanismen über evolutionsgeschichtlich konservierte Signalsysteme eine wichtige Rolle im Infektionsgeschehen der alveolären Echinokokkose spielen. Aufbauend auf dem axenischen Kultursystem ist es in dieser Arbeit auch erstmals gelungen, Primärzellkulturen für E. multilocularis anzulegen und die Parasitenzellen zur in vitro Neubildung von Metacestoden-Vesikeln anzuregen. Erste Experimente zur genetischen Manipulation dieser Primärzellen konnten erfolgreich durchgeführt werden. Aufbauend auf der hier vorgestellten Methodik sollte es in künftigen Untersuchungen möglich sein, stabil transfizierte Echinococcus-Zellen zu generieren und diese zur Herstellung vollständig transgener Parasiten-Stadien zu nutzen. Dies würde die zur Untersuchung der E. multilocularis-Entwicklung und der Wirt-Parasit-Interaktionsmechanismen bei einer Infektion zur Verfügung stehenden Methoden entscheidend erweitern und könnte u.a. zur weiteren biochemischen Analyse der in dieser Arbeit dargestellten Signalmechanismen des Parasiten herangezogen werden.
Die molekularen Mechanismen der Wirt-Parasit-Interaktion bei der durch den Zestoden Echinococcus multilocularis ausgelösten Erkrankung der alveolären Echinokokkose sind bislang ungeklärt. Zudem liegen keine Daten über Entwicklungs- und Differenzierungsmechanismen dieses Parasiten vor, die für die Entwicklung neuer Antiparasitika genutzt werden könnten. Ein bei der Evolution der Metazoen bereits frühzeitig entstandener Signaltransduktionsmechanismus zur Steuerung von Entwicklungsvorgängen ist das TGFβ/BMP-System, das aus strukturell verwandten Zytokinen der TGFβ (transforming growth factor β) bzw. BMP (bone morphogenetic protein)-Familie, oberflächenständigen Rezeptoren der TGFβ-Rezeptorfamilie (Typ I und Typ II) und intrazellulären Signaltransduktoren der Smad-Familie besteht. Außer an Entwicklungsvorgängen tierischer Organismen könnte diesem System eine wichtige Rolle bei der Wirt-Helminth-Kommunikation während Infektionsprozessen zukommen, wie in vorherigen Studien am Nematoden Brugia malayi und am Trematoden Schistosoma mansoni gezeigt werden konnte. Erste, wichtige Schritte zur Charakterisierung von TGFβ und BMP-Signalsystemen in Zestoden wurden in der vorliegenden Arbeit getan. Aufbauend auf einem vorherigen Bericht zu einem Transmembranrezeptor (EmRSK1) und einem Smad-Homologen (EmSmadA) aus Echinococcus multilocularis wurde die Liste der TGFβ/BMP Signaltransduktionsfaktoren in E. multilocularis in dieser Arbeit deutlich erweitert und erstmals umfangreiche funktionelle Studien durchgeführt. Die hier charakterisierten Faktoren umfassen zwei weitere Serin/Threonin-Kinasen der TGFβ/BMP-Rezeptorfamilie (EmRSK2, EmRSK3) sowie intrazelluläre Transduktoren der R-Smad-Subfamilie (EmSmadB, EmSmadC) und ein Homologes zur MAP-kinase-kinase-kinase TAK1 (TGFβ activated kinase 1), genannt EmTAK1. Zudem konnte erstmals für einen parasitären Helminthen ein Zytokin der BMP-Subfamilie, EmBMP, auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen legen nahe, dass E. multilocularis sowohl ein TGFβ wie auch ein BMP-Signalsystem exprimiert. Ersteres wird sehr wahrscheinlich durch die Kinase EmRSK2 und den Smad-Faktor EmSmadC gebildet, letzteres durch EmRSK1 und EmSmadB. EmSmadA nimmt eine Sonderstellung ein, da es sowohl durch TGFβ- wie auch durch BMP-Rezeptoren aktiviert werden kann. Die genaue Rolle von EmRSK1 und EmTAK1 wäre durch weitere Untersuchungen zu klären. Signifikante funktionelle Homologien zwischen den TGFβ/BMP-Signalsystemen des Parasiten und Säugern konnten nachgewiesen werden, die sich u.a. darin äußern, dass die Echinococcus Smad-Proteine durch entsprechende Rezeptoren des Menschen aktiviert werden können. Darüber hinaus konnten jedoch auch einige deutliche Unterschiede zwischen den Systemen aus Parasit und Wirt nachgewiesen werden, die sich als Angriffspunkte zur Entwicklung von Chemotherapeutika eignen könnten. So fehlt den Smad-Faktoren EmSmadA und EmSmadC eine MH1-Domäne, die sonst unter allen R-Smads hoch konserviert ist. Zudem sind einige bislang noch nie beschriebene, strukturelle Besonderheiten der Echinococcus TGFβ/BMP-Rezeptoren zu verzeichnen. Auch die Regulation dieser Faktoren und die Kreuz-Interaktion mit weiteren intrazellulären Signalwegen (z.B. der MAP Kinase Kaskade) scheint in E. multilocularis anders zu verlaufen als bislang für Vertebraten, Insekten oder Nematoden beschrieben. Schließlich konnte, als sehr wichtiger Befund, auch nachgewiesen werden dass mindestens ein Rezeptor des Parasiten, EmRSK1, mit einem Zytokin des Wirts (BMP2) in vitro funktionell interagiert. Da BMP2 in Zellkultursystemen, die das Wachstum des Parasiten am befallenen Wirtsorgan nachstellen, einen deutlichen Effekt auf E. multilocularis ausübt, könnte die hier beschriebene EmRSK1/BMP2 – Interaktion von entscheidender Bedeutung für die Wirt-Parasit-Interaktion bei der alveolären Echinokokkose sein.
C.dubliniensis kann, wie auch die nahe verwandte Spezies C.albicans, als Antwort auf eine Reihe von Umweltfaktoren von der Hefeform in echtes filamentöses Wachstum übergehen. Bei der Regulation des pH-abhängigen Dimorphismus von C.dubliniensis spielt, wie bei verschiedenen anderen Pilzspezies der Zinkfinger-Transkriptionsfaktor Rim101 eine zentrale Rolle. Dieser weist mit 85% zwar eine im Speziesvergleich geringe Aminosäure-identität zu C.albicans-Rim101 auf, zeigt jedoch die gleiche pH-abhängige Expression wie C.albicans-RIM101, ist in C.albicans funktionell aktiv und kann die typischen Defekte einer C.albicans-rim101-Nullmutante komplementieren. C.dubliniensis-Rim101 ist zudem beteiligt an der Regulation des Wachstums bei 45°C und der Koloniefärbung auf CHROM agar-Candida, zwei Eigenschaften, in denen sich C.albicans und C.dubliniensis unterscheiden. Ursache für diese speziesspezifische Merkmalsausprägung ist die bei C.dubliniensis deutlich stärkere Expression von RIM101. Ein weiterer phänotypischer Unterschied zwischen C.albicans und C.dubliniensis betrifft mit der Fähigkeit zu Filamentierung und invasivem Wachstum zwei für C.albicans nachgewiesenermaßen wichtige Virulenzfaktoren. Auf Kochblutagar, nach 24 - 48-stündiger Inkubation bei 37°C und 5% CO2, bildet C.dubliniensis glatte, weiß-glänzende, scharf begrenzte halbkugelförmige Kolonien, während C.albicans-Kolonien eine rauhe, grau erscheinende Oberfläche aufweisen und mit Ausläufern in den umgebenden Agar einwachsen. Auslösend für die ausgeprägte Filamentierung von C.albicans ist das additive Zusammenwirken von erhöhtem CO2-Gehalt, erhöhter Temperatur und einem noch nicht endgültig identifizierten Bestandteil des Kochblutagars. Mit einer Sensitivität von 95,8% und einer Spezifität von 100% eignet sich dieses Verfahren auch als einfacher diagnostischer Test. Auf molekularer Ebene sind Efg1 und Cph1 an der Filamentierungsauslösung beteiligt, wobei Efg1 aber eine wesentlich größere Bedeutung zukommt. Rim101 scheint keinen Einfluss zu haben.
Molekulare Identifizierung von Neisseriaceae und Moraxellaceae mittels ribosomaler DNA-Sequenzierung
(2005)
Die schnelle und verlässliche Identifizierung mikrobiologischer Isolate ist ein fundamentales Ziel der klinischen Mikrobiologie. Bei einigen gram–negativen Spezies ist die klassische phänotypische Identifizierung, basierend auf metabolischen, enzymatischen oder serologischen Methoden erschwert, zeitraubend oder nicht suffizient. Durch die Sequenzierung partieller Abschnitte der 16S- oder 23S-rDNA können Bakterien meist exakt spezifiziert werden. Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, hypervariable rDNA Abschnitte zu finden, die von stark konservierten Regionen flankiert werden, um auf molekularer Ebene Mitglieder der Familie Neisseriaceae und Moraxellaceae zu diskriminieren. Die inter- und intragenetischen Beziehungen von insgesamt 94 Stämmen wurden untersucht. Im Vergleich zu den Referenzstämmen der Genera waren bei der partiellen 16S-rDNA (E. coli Position 54 – 510) je Spezies durchschnittlich 30 polymorphe Positionen vorhanden. Die partiellen 23S-rDNA Abschnitte (E. coli Position 1400 – 1600) zeigten durchschnittlich 11 polymorphe Positionen. Neisseria macacae und N. mucosa subsp. mucosa (ATCC 19696) zeigten identische 16S- und 23S-rDNA Sequenzen. Die Gruppierung verschiedener Isolate war bei Acinetobacter lwoffii, Moraxella lacunata und Neisseria mucosa an beiden untersuchten Genabschnitten heterogen. Im Fall von N. meningitidis konnte mit Hilfe der 23S-rDNA Daten nicht suffizient gruppiert werden. Die Ergebnisse zeigen eine Überlegenheit der untersuchten partiellen 16S-rDNA zur Diagnostik der Neisseriaceae und Moraxellaceae. Eine Referenzdatenbank zur Diagnostik von Mikroorganismen sollte mehr als ein Isolat einer Spezies enthalten und zudem einen polyphasischen Ansatz verfolgen. Die Sequenz–Chromatogramme und weitere diagnostisch relevante Informationen wurden mit der „offline“-Datenbank RIDOM_Tool gesammelt und sind ein Teil des Internet-basierenden Service von RIDOM (www.ridom-rdna.de). Eine eingegebene Sequenzfolge kann online eingefügt und damit ein direkter Vergleich mit den in der RIDOM Referenzdatenbank existierenden Datensätzen initiiert werden.
Invasive Pilzinfektionen haben in den letzten Jahren stetig zugenommen und bedrohen insbesondere immunsupprimierte Patienten. Nach der Zulassung von neuen antimykotisch wirksamen Substanzen hat sich das verfügbare Spektrum an therapeutischen Optionen deutlich erweitert. Demgegenüber steckt die verfügbare Technik zur Resistenztestung humanpathogener Pilze noch weitgehend in den Kinderschuhen. Die Analyse zur Verfügung stehender Techniken ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Zu diesem Zweck werden zunächst die Daten von 728 klinischen Isolaten von Candida spp., die zwischen April 2000 und November 2002 am Institut für Hygiene und Mikrobiologie der Universität Würzburg unter Anwendung des Mikrodilutionsverfahrens nach DIN getestet wurden, unter epidemiologischen Aspekten ausgewertet. Es zeigt sich ein deutliches Überwiegen von Candida albicans (53%), gefolgt von Candida glabrata (26%). Candida parapsilosis und Candida tropicalis hatten jeweils einen Anteil von ca. 7%. Sowohl Candida albicans wie auch Candida glabrata verhielten sich gegen Fluconazol, Amphotericin B und 5-Flucytosin in hohem Maße sensibel. Candida krusei und Candida tropicalis wurden zu einem nennenswerten Anteil resistent, vor allem gegen Fluconazol und 5-Flucytosin, getestet. Im zweiten Teil der Arbeit wird anhand von 56 Candida spp. ein Vergleich des Mikrodilutionsverfahrens nach DIN und des internationalen Standardverfahrens nach NCCLS durchgeführt. Es zeigen sich sowohl hinsichtlich Reproduzierbarkeit, Ablesezeitpunkt der minimalen Hemmkonzentration sowie Stabilität der Testergebnisse über den angestrebten Ablesezeitpunkt hinaus deutliche Vorteile des NCCLS- gegenüber dem DIN-Verfahren. Der wesentliche Unterschied zwischen beiden Protokollen liegt im verwendeten Wachstumsmedium. Ein Problem beider Verfahren besteht im großen Zeitaufwand, weshalb das YeastOne-Testverfahren, ein kommerziell erhältliches Mikrodilutionsverfahren, das den Farbindikator Alamar Blue zur Erleichterung der visuellen Endpunktbestimmung beinhaltet, im dritten Teil der Arbeit für die Anwendung am Institut in Würzburg gegenüber der NCCLS-Methode evaluiert wird. Es zeigt sich eine hohe Reproduzierbarkeit mit ca. 96% bei Fluconazol, Amphotericin B und 5-Flucytosin und eine gute Korrelation zum Standardverfahren nach NCCLS. Entscheidende Vorteile gegenüber dem NCCLS-Protokoll sind eine frühere Endpunktbestimmung für Azole, die bereits nach 24 Stunden erfolgen kann, sowie in der Zeitersparnis zwischen 64% und 94%. Ergänzend werden einige Schimmelpilze sowohl mit dem NCCLS- als auch mit dem YeastOne-Verfahren getestet, wobei sich eine hohe Korrelation der YeastOne- mit den NCCLS-Ergebnissen zeigt und sich für beide Vorgehensweisen der Ablesezeitpunkt bei gutem Wachstum nach 48 Stunden festlegen lässt. Die Resistenztestung klinischer Isolate wurde daraufhin im Institut für Hygiene und Mikrobiologie auf das YeastOne-System umgestellt. In ersten Anwendungen wurden dabei gute Ergebnisse erzielt.
Neisseria meningitidis ist einer der wichtigsten Erreger bakterieller Meningitiden und gefürchtet für das Potential Epidemien auszulösen. Die Meningokokken-Meningitis bleibt bis heute auch in Industrieländern mit hoher Mortalität verbunden. Um eine Meningitis verursachen zu können, müssen Meningokokken die Blut-Hirn/Liquor-Schranke überqueren. Dies erfolgt vermutlich über den transzellulären Weg durch die Endothelzellbarriere der Gehirnkapillare. Ereignisse unmittelbar vor der bakteriellen Internalisierung sind vielfach untersucht, noch wenig erforscht sind jedoch die in der Endothelzelle durch den initialen Kontakt des Erregers ausgelösten Signalkaskaden. Die Rolle des für eine ADP-Ribosyltransferase kodierenden narE Gens in der Pathogenese der Meningokokken-Infektion und die mögliche Bedeutung in der Aktivierung von Signaltransduktionsmechanismen wird diskutiert. Eine narE Insertionsmutante wurde hergestellt und charakterisiert. Anschließend wurde die Aktivierung der extracellular signal regulated kinase (ERK) im Verlauf von Infektionsassays in HBMEC (human brain microvascular endothelial cell) mittels Western Blot untersucht. Eine Zu- oder Abnahme in der Phosphorylierung von ERK und folglich eine Aktivierung oder Deaktivierung der ERK-vermittelten Signalkaskaden in HBMEC konnte jedoch im Laufe der Infektion bei der narE Mutante im Vergleich zum Wildtypstamm nicht festgestellt werden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen Meningokokken intrazellulär einzeln aber auch zu mehreren in phagosomenähnlichen membranumgebenen Strukturen. Die Fähigkeit von N. meningitidis sich intrazellulär zu replizieren wurde mittels Infektions-assay untersucht. Bekapselte Meningokokken waren in der Lage, sich sowohl in Epithel- als auch in Endothelzellen zu replizieren, während unbekapselte Erreger intrazellulär abgetötet wurden. Bei Meningokokken wie auch beim Erreger neonataler Meningitiden E. coli K1 wird eine O-Acetylierung des Kapselpolysaccharids beobachtet. Die biologische Bedeutung der O-Acetylierung der Sialinsäure wurde in Infektionsassays mit einem nicht acetylierten E. coli K1 Stamm und einer isogenen konstitutiv acetylierten Mutante untersucht. In der Adhärenz an und Invasion in HBMEC konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Eine stärker ausgeprägte intrazelluläre Replikation wurde jedoch nach einer Verzögerung von mehreren Stunden bei dem nicht acetylierten Isolat beobachtet. Um die Neisseria containing Vacuole (NCV) näher zu charakterisieren und mögliche Interaktionen mit dem Endozytoseweg in HBMEC zu untersuchen, wurde eine dreifache Immunfluoreszenzfärbung zur simultanen Darstellung intrazellulärer Meningokken und spezifischer Marker des frühen bzw. späten Endosoms und Lysosoms etabliert. Eine Akquirierung des Transferrinrezeptors als Marker für das frühe Endosom und des Lamp-1 (lysosomal associated membrane protein 1) als Marker für das späte Endosom konnte durch Kolokalisationsstudien mittels Immunfluoreszenzmikroskopie gezeigt werden.
Interaktion von Neisseria meningitidis mit den Zellen der menschlichen Blut-Hirn/Liquor-Schranke
(2005)
Ein zentrales Ereignis in der Pathogenese einer bakteriellen, durch Neisseria menigitidis verursachten Meningitis stellt die Interaktion der Bakterien mit den Zellen der menschlichen Blut-Hirn/Liquor-Schranke dar. In der vorliegenden Arbeit konnten in Infektionsversuchen mit immortalisierten HBMEC-Zellen als etabliertem in-vitro Modell des okklusiven menschlichen Hirnendothels und N. meningitidis Isolaten unterschiedlicher klonaler Linien Pathomechanismen für die Interaktion von Meningokokken mit dem Endothel der menschlichen Blut-Hirn/Liquor-Schranke identifiziert werden. Diese unterscheiden sich von jenen Pathomechanismen, die die Interaktion von Meningokokken und Epithelzelllinien bzw. peripheren Endothelzellen bestimmen. Die untersuchten hypervirulenten klonalen Linien ST-32, ST-11 und ST-1 zeigen in-vivo signifikante Unterschiede in ihrem Ausbreitungsverhalten und meist unterschiedliche Krankheitsverläufe. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen vermuten, dass die molekularen Mechanismen der Adhärenz und Invasion von N. meningitidis Serogruppe A, B und C Isolaten in ihrer Abhängigkeit von Außenmembrankomponenten und externen Faktoren differieren. Die Invasion von Serogruppe B Meningokokken konnte in Infektionsversuchen mit dem Serogruppe B Stamm MC58 als repräsentativem Vertreter der hypervirulenten klonalen Linie ST-32 als Folge einer trifaktoriellen Interaktion mit den Zellen der menschlichen Blut-Hirn/Liquor-Schranke identifiziert werden: (I) Die Internalisierung der Serogruppe B Isolate in HBMEC-Zellen ist von der Expression des Außenmembranproteins Opc sowie (II) von der Anwesenheit des Serumglykoproteins Fibronektin abhängig, das als invasionsfördernde Komponente humanen Serums die Bindung von Meningokokken an spezifische Rezeptoren auf HBMEC-Zellen vermittelt. Fibronektin bindet (III) als Brückenmolekül an RGD-Bindungsmotive der 51-Integrine auf HBMEC-Zellen. Diese stellen spezifische Rezeptoren der Fibronektin-vermittelten Invasion Opc-exprimierender Serogruppe B Meningokokken in zerebrale menschliche Hirnendothelzellen dar. Weder für Serogruppe A noch für Serogruppe C Meningokokken konnte in der vorliegenden Arbeit eine Serum-vermittelte Invasion in HBMEC-Zellen beschrieben werden. Als ursächlich können die natürlicherweise fehlende Opc-Expression durch Isolate des ST-11 Komplexes sowie eine ausgeprägte Variabilität der Opc-Expression durch die analysierten ST-1 Isolate diskutiert werden. Die wesentliche Bedeutung der Zytoskelettfunktion für die Invasion von N. meningitidis in HBMEC-Zellen konnte in Infektionsversuchen mit eukaryontischen Zytoskelettinhibitoren nachgewiesen werden. Mikrofilamente und Mikrotubuli als Elemente des Zytoskeletts wurden als essentielle Komponenten einer effizienten Internalisierung Opc-exprimierender Serogruppe B Meningokokken in HBMEC-Zellen identifiziert.
Charakterisierung von NadR : das essentielle Enzym der NAD-Synthese bei Haemophilus influenzae
(2005)
I Zusammenfassung Haemophilus influenzae, ein Gram-negatives, Bakterium der Familie Pasteurellaceae, kann beim Menschen eine Vielzahl an Erkrankungen auslösen: Die bekapselte Stämme, v. a. mit Typ b Kapsel können Cellulitis, septische Arthritis, Epiglottitis und Meningitis verursachen. Die nicht-bekapselte Stämme können Otitis media, Sinusitis, Pneumonie und in selteneren Fällen Bakterämie verursachen. Ein besonderes Merkmal des Metabolismus von H. influenzae ist dessen Unfähigkeit Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) de novo zu synthetisieren. Daher sind die Enzyme bzw. Transporter, die an NAD+ Aufnahme und Resynthese beteiligt sind, als putative antimikrobielle Ziele von Interesse. In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass NAD+ zu Nikotinamidribosyl degradiert werden muss, bevor es in die Zelle aufgenommen werden kann. Auch Proteine, die an der Degradation des exogenen NAD+ zu Nikotinamidribosyl und dessen anschließender Aufnahme in die Zelle verantwortlich sind, konnten identifiziert und charakterisiert werden. Wie Nikotinamidribosyl im Cytoplasma wiederum zu NAD+ synthetisiert wird, ist auch erst kürzlich geklärt worden: für NadR konnte sowohl eine Ribosyl-Nukleotid-Kinase (RNK) Aktivität als auch eine Nikotinamid-Mononukleotid-Adenylyltransferase (NMNAT) Aktivität in vitro gezeigt werden. Die Kristallstruktur von hiNadR im Komplex mit NAD+ wurde auch aufgeklärt. In dieser Arbeit sollte NadR, insbesondere dessen RNK Domäne, in vivo und in vitro näher charakterisiert werden. Um zu untersuchen, ob beide Domänen in vivo essentiell sind, wurden Deletionsmutanten erzeugt, bei welchen die komplette bzw. der C-terminale Teil der RNK Domäne fehlten. Diese Deletionen konnten im nadV+ Hintergrund erzeugt werden. Die Deletionen konnten in H. influenzae nur zusammen mit dem nadV-Gen transferiert werden oder alternativ nur in die Zellen, die mit pNadRKan Plasmid transformiert wurden. Dies verdeutlicht, dass nicht nur die NMNAT Domäne sondern auch die RNK Domäne bzw. sogar nur wenige C-terminal fehlende Aminosäuren des NadR Proteins essentiell für die Lebensfähigkeit von H. influenzae sind. Gleichzeitig zeigen diese Experimente, dass die RNK-Domäne in Anwesenheit von NadV redundant ist. Ein weiterer Phänotyp der RNK-Deletionsmutante zeigte sich beim Nikotinamidribosyl-Transport. Im Gegensatz zum Wt, welcher ca. 60-80% des 14C-Nikotinamidribosyls aufnahm, konnte für die RNK-Deletionsmutante nur 2-5% Aufnahme gemessen werden. Dies konnte durch das pNadRKan Plasmid komplementiert werden. Weiterhin wurde festgestellt, dass spontan Aminopyridin-resistente H. influenzae Zellen Mutationen im nadR Gen haben, insbesondere im Walker A-Motif (P-Loop) der RNK Domäne. Zusätzlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass NadR aus Aminopyridin und ATP Aminopyridin-Adenin-Dinukleotid synthetisieren kann. Somit konnte gezeigt werden, dass die wachstumshemmende Wirkung eigentlich durch das aus Aminopyridin synthetisierte Aminopyridin-Adenin-Dinukleotid entsteht, welches NAD+ in Redox-Reaktionen verdrängt, wodurch es letztendlich zum Stillstand des Metabolimus kommt. Durch Einführen von gezielten AS-Substitutionen im Walker A und B Motif und in der LID-Domäne von NadR, konnten einige Aminosäuren identifiziert werden, welche essentiell für die Aktivität der RNK Domäne sind. Alle Aminosäuren-Substitutionen führten zum Verlust der RNK Aktivität, die NMNAT Aktivität jedoch war nicht beeinträchtigt. Desweiteren wurden diese NadR Punktmutanten in vivo untersucht. Für alle konnte eine signifikante Defizienz in der Nikotinamidribosyl-Aufnahme beobachtet werden, die gemessene Aufnahme lag im Bereich der RNK-Deletionsmutante. Dadurch konnte eine direkte Korrelation zwischen der RNK Aktivität und der Nikotinamidribosyl-Aufnahme gezeigt werden. In weiteren in vitro Experimenten konnte für NadR eine Feedback-Inhibition durch das NAD+ gezeigt werden, wobei NAD+ in erster Linie die RNK Domäne von NadR inhibiert. Eine graduelle Erhöhung der NAD+ Konzentration führte in den in vitro Assays zu einer graduellen Abnahme der RNK. Bei der NMNAT Aktivität jedoch zeigte sich keine signifikante Inhibition in Anwesenheit von NAD+. Begleitende in vivo Experimente, zeigten eine 2/3 Reduktion der Nikotinamidribosyl-Aufnahme bei den Zellen, die mit NAD+ inkubiert wurden, d. h. höhere intrazelluläre NAD+ Konzentration hatten. Für die genauere Analyse der Feedback-Inhibition durch NAD+ wurden weitere Punktmutanen hergestellt. Bei zwei der Punktmutanten wurde eine Beeinträchtigung der NadR-Aktivität beobachtet, daher wurden diese Punktmutanten von weiteren Analysen im Bezug auf NAD+-Feedback Inhibition ausgeschlossen. Eine Mutante (NadRW256F) jedoch, zeigte ähnliche Aktivität wie das Wt-NadR. In Anwesenheit von NAD+ wurde die RNK Aktivität dieser Punktmutante, im Gegensatz zum Wt-Protein, kaum gehemmt. Dadurch konnte W256 als eine der Aminosäuren identifiziert werden, die an der Vermittlung der NAD+-bedingten Inhibition der RNK-Domäne beteiligt ist.
Neisseria meningitidis (Meningokokken) stellen einen häufigen Erreger von bakterieller Meningitis und generalisierter Sepsis bei Kleinkindern und Jugendlichen dar. Diese Bakterienspezies ist sehr kompetent für horizontalen DNA-Austausch durch Transformation, was zur einer sehr heterogenen Populationsstruktur führt. Innerhalb der Population gibt es wenige klonale Linien, die für die Mehrzahl der Erkrankungen verantwortlich sind, aber bei gesunden Trägern relativ selten gefunden werden. In den Achtziger Jahren trat ein hypervirulenter Klon in Kanada auf und war dort für die Mehrzahl der Erkrankungen verantwortlich. Dieser Klon wird als Elektrophoretischen Typ 15 (ET-15) bezeichnet und führt zu besonders schweren Erkrankungsverläufen, und einer hohen Letalität. In den Neunziger Jahren breitete sich dieser Klon in der Tschechischen Republik aus und trat 1998 im bayerischen Landkreis Rottal/Inn bei einem Ausbruch in Erscheinung. In der vorliegenden Arbeit wurde die Verbreitung von ET-15-Meningokokken unter 8000 Kindergartenkindern, Schülern und Bundeswehrsoldaten in elf Landkreisen und kreisfreien Städten sowie in sechs Bundeswehrkasernen untersucht. Die allgemeine Trägerrate an Meningokokken betrug 10,3%. Bei vier Probanden aus zwei Orten wurden ET-15-Meningokoken isoliert, was einer Trägerrate von 0,05% entspricht. Im Landkreis Rottal/ Inn wurden keine ET-15-Meningokokken gefunden. Während des Beobachtungszeitraumes ereigneten sich in Bayern vier Erkrankungsfälle durch diesen Bakterienklon. Der anschließende Vergleich der chromosomalen DNA mittels Pulsfeldgelelektrophorese nach SpeI-Verdau legte nahe, dass es sich bei den Trägerstämmen nicht um vier identische Klone handelte. Ebenso war kein gemeinsames Bandenmuster zwischen den vier Trägerisolaten und den vier Erkrankungsstämmen zu erkennen. Parallel dazu wurden die Träger- und Erkrankungsstämme mit identischen Referenzstämmen aus der Tschechischen Republik und aus Rottal/Inn verglichen, wobei sich auch hier kein gemeinsames DNA-Muster zeigte. Bei den Träger- als auch bei den Erkrankungsisolaten aus dem Untersuchungszeitraum in Bayern handelt es sich um neue Varianten des ET-15-Klones, die in Folge klonaler Expansion entstanden sein könnten. Die Inzidenz des ET-15-Trägertums in Bayern im Beobachtungszeitraum ist als niedrig einzuschätzen.
Ich praesentiere hier die Klonierung und Funktion eines ACAT-aehnlichen Enzyms von Toxoplasma gondii (T. gondii), das lebensnotwendig fuer T. gondii zu sein scheint. Medikamente, die gegen die menschliche ACAT gerichtet sind, erhoehen in geringen Konzentrationen die ACAT-Aktivitaet von T. gondii. In hoeheren Konzentrationen schraenken sie jedoch die Vitalitaet von T. gondii ein.
In der vorliegenden Dissertation wurde für die Entwicklung eines Lebendimpfstoffs zum Schutz vor Infektionen durch Neisseria meningitidis Serogruppe B zunächst ein geeigneter Impfstamm aus mehreren Neisserienstämmen der Serogruppe B, ST-32 Komplex, ausgewählt. In diesem sollte anschließend die Sicherheit für den Impfstoff-Empfänger durch die unabhängige Deletion sowohl eines Virulenzgens als auch eines Gens, das die homologe Rekombination der Neisserien bedingt, garantiert werden. Als Virulenzgen wurde siaD deletiert, das für ein essentielles Enzym der Kapselbiosynthese kodiert (Edwards et al., 1994). Dabei wurde eine neue Transformationsmethode eingesetzt (modifiziert nach Gunn und Stein; Gunn und Stein, 1996). Die kapsellose siaD-Deletionsmutante wurde dann genotypisch und phänotypisch anhand verschiedener Adhärenz- und Invasionsassays an humanen Epithel-, Endothel- und Dendritischen Zellen geprüft. Dabei fanden sich Unterschiede im Adhärenz und Invasionsverhalten im Vergleich zu einer anderen siaD-Mutante des gleichen Wildtyps. Diese Unterschiede wurden durch eine im Westernblot nachgewiesene, bei beiden siaD-Mutanten unterschiedliche Opa-Expression begründet, da das Opa-Protein als Protein der äußeren Bakterienmembran Oberflächenproteine von humanen Epithel- und Endothelzellen bindet und so zur Adhärenz an die Zielzellen führt (Virji et al., 1993, 1995). Weiterhin sollte in der siaD-Deletionsmutante das für die homologe Rekombination essentielle recA-Gen deletiert werden (Koomey und Falkow, 1987; Miller und Kokjohn, 1990). Der Nachweis einer recA-Deletion gelang trotz mehrfacher Ansätze mit der neuen Transformationsmethode nicht, da die Deletionsrate von recA wahrscheinlich unter der Sensitivität der hier verwendeten Analysemethoden lag.
Die Anwendbarkeit eines Oligonukleotid-basierten Microarray-Systems zur Transkriptomanalyse von Neisserie meningitidis Serogruppe B wurde im Vergleich mit einem cDNA-basierten System demonstriert. Hierzu wurde für ein Subset von 60 Genen die Eigenschaften anhand von Parallelhybridisierungen sowie eines vormals etablierten Hitzeschock Modells untersucht. Aufgrund der Vergleichsdaten wurde ein Gesamtgenmom-Array auf Oligonukleotidbasis etabliert und zur Analyse der Hitzeschock-Reaktion verwendet. Schließlich wurde mit diesem Array-System ein Modell zur Untersuchung der Transkriptomänderung nach Konfrontation mit humanem Serum realisiert. Insgesamt zeigten 284 Gene (13% des Genoms) eine differentielle Regulation mit ebenmäßigem Verhältnis von Hoch- und Herunterregulation. Die Anwendbarkeit im Hinblick auf die Suche nach potentiellen Vakzinekandidaten wurde diskutiert.
Neisseria meningitidis ist Auslöser der Meningokokkenmeningitis und der gefürchteten Meningokokkensepsis, die mit einer hohen Letalität belastet sind. Meningokokken lassen sich anhand ihrer Polysaccharidkapsel in verschiedene Serogruppen einteilen, wobei die Serogruppen A, B, C, W135 und Y mit Krankheit assoziiert sind. Krankheitsisolate aus Serum oder Liquor sind fast ausnahmslos bekapselt, während Trägerisolate, die aus dem Nasopharynx von ca. 10% der gesunden Bevölkerung isoliert werden können, häufig unbekapselt sind. Das Komplementsystem, das einen wichtigen Abwehrmechanismus gegen Meningokokken darstellt, ist Teil der unspezifischen angeborenen Immunabwehr und besteht aus mehreren Serumproteasen, die in einer Kaskade der Reihe nach aktiviert werden, um am Ende eine Pore (MAC) in der Membran des Pathogens zu bilden. In dieser Arbeit wurden Faktoren untersucht, die Neisseria meningitidis dazu befähigen, im Serum zu überleben und der Lyse durch das Komplementsystem zu entgehen. Ein Schwerpunkt lag dabei auf den Serumresistenzmechanismen von Serogruppe A Meningokokken, vergleichend wurden anschließend die Mutanten der Serogruppen B, C, W135 und Y untersucht. Um den Einfluss verschiedener Pathogenitätsfaktoren auf die Serumresistenz zu beurteilen, wurden isogene knock-out Mutanten verwendet, die durch ELISA und Tricingel auf ihre Kapsel- und LPS Struktur überprüft wurden. Die Serumresistenz der Mutanten wurde durch Bakterizidietests bestimmt; zur Detektion der Bindung von Komplementkomponenten, Immunglobulinen und regulatorischen Proteinen wurden FACS Analysen, Western Blot und ELISA benutzt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Kapsel der Serogruppe A Meningokokken essentiell für das Überleben im Serum ist. Die Expression der Polysaccharidkapsel führte auch bei den übrigen Serogruppen zu einer verminderten Deposition von Komplementkomponenten (C3, C4 und MAC) auf der Bakterienoberfläche. Die verminderte Komplementdeposition war nicht durch veränderte Antikörperbindung bedingt. Die bekapselten und unbekapselten Bakterien zeigten die gleichen Bindungsmuster von IgG und IgM. Auch Faktor H, ein wichtiger Regulator des Komplementsystems, ist an der Vermittlung der Serumresistenz durch die Kapsel nicht beteiligt. Die serumsensiblen unbekapselten Mutanten banden mehr Faktor H, als die entsprechenden bekapselten Meningokokken. Aus der Literatur ist bekannt, dass LPS Immunotyp und LPS Sialysierung die Serumresistenz pathogener Neisserien beeinflussen kann. Für den Serogruppe A Stamm konnte nur dann ein Überlebensvorteil durch LPS Sialysierung gezeigt werden, wenn die unbekapselte Mutante untersucht wurde. Die Expression eines verkürzten L8 LPS hingegen führte bei diesem Stamm unabhängig von der Kapselexpression zu einer erhöhten Serumresistenz. Besonders auffällig bei den entsprechenden Kontrollexperimenten mit Derivaten anderer Serogruppen war die außergewöhnliche Komplementdeposition durch den Serogruppe Y Stamm. In weiterführenden Experimenten konnten wir in Kooperation mit Dr. Sanjay Ram, Boston, zeigen, dass besondere Phosphoethanolamin Substitutionen des LPS für dieses Phänomen verantwortlich waren. Die vorliegende Arbeit beleuchtet die Komplexität der Auseinandersetzung von Meningokokken mit dem Komplementsystem. Sie zeigt auf, dass Klon spezifische Unterschiede für das Verständnis der Serumresistenz von Bedeutung sind. Die Experimente belegen, dass bei Serogruppe A Meningokokken neben der Kapsel auch das LPS einen modulierenden Einfluss auf die Serumresistenz hat.