Institut für Hygiene und Mikrobiologie
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- Institut für Hygiene und Mikrobiologie (234)
- Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften (17)
- Graduate School of Life Sciences (13)
- Medizinische Klinik und Poliklinik II (12)
- Institut für Virologie und Immunbiologie (9)
- Institut für Molekulare Infektionsbiologie (8)
- Kinderklinik und Poliklinik (7)
- Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie (4)
- Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie (ab 2004) (4)
- Medizinische Klinik und Poliklinik I (4)
Sonstige beteiligte Institutionen
- Broad Institute, USA (1)
- Department Pharmazie - Zentrum für Pharmaforschung, Ludwig-Maximilians-Universität München (1)
- Department of Hematology and Oncology, Sana Hospital Hof, Hof, Germany (1)
- Department of Laboratory Medicine and Medicine Huddinge, Karolinska Institutet and University Hospital, Stockholm, Sweden (1)
- Department of Medicine A, University Hospital of Münster, Münster, Germany (1)
- Instituto de Higiene, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay (1)
- Instituto de Hygiene Montevideo, Uruguay (1)
- Krankenhaushygiene und Antimicrobial Stewardship (1)
- Krankenhaushygiene und Antimicrobial Stewardship (Universitätsklinikum) (1)
- Leibniz-Institut für Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie Hans-Knöll-Institut (1)
EU-Project number / Contract (GA) number
- 2016 FGR 0053 (1)
- 278864 (1)
- 715466 (1)
- 847507 (1)
Background
Neisseria meningitidis is a naturally transformable, facultative pathogen colonizing the human nasopharynx. Here, we analyze on a genome-wide level the impact of recombination on gene-complement diversity and virulence evolution in N. meningitidis. We combined comparative genome hybridization using microarrays (mCGH) and multilocus sequence typing (MLST) of 29 meningococcal isolates with computational comparison of a subset of seven meningococcal genome sequences.
Principal Findings
We found that lateral gene transfer of minimal mobile elements as well as prophages are major forces shaping meningococcal population structure. Extensive gene content comparison revealed novel associations of virulence with genetic elements besides the recently discovered meningococcal disease associated (MDA) island. In particular, we identified an association of virulence with a recently described canonical genomic island termed IHT-E and a differential distribution of genes encoding RTX toxin- and two-partner secretion systems among hyperinvasive and non-hyperinvasive lineages. By computationally screening also the core genome for signs of recombination, we provided evidence that about 40% of the meningococcal core genes are affected by recombination primarily within metabolic genes as well as genes involved in DNA replication and repair. By comparison with the results of previous mCGH studies, our data indicated that genetic structuring as revealed by mCGH is stable over time and highly similar for isolates from different geographic origins.
Conclusions
Recombination comprising lateral transfer of entire genes as well as homologous intragenic recombination has a profound impact on meningococcal population structure and genome composition. Our data support the hypothesis that meningococcal virulence is polygenic in nature and that differences in metabolism might contribute to virulence.
Staphylococcus aureus (S. aureus) ist einer der häufigsten Erreger schwerer endovaskulärer Infektionen, die häufig mit einer Dissemination des Erregers in andere Organe und lebensbedrohlichen Komplikationen wie Endokarditis, Osteomyelitis oder Abszessen assoziiert sind. Entscheidender Schritt in der Pathogenese endovaskulärer Infektionen ist die Schädigung und Überwindung der Endothelbarriere. Für deren Integrität ist die Intaktheit von Zell-Zell-Verbindungen elementar, diese werden unter anderem durch Src-Kinasen reguliert. Es ist bekannt, dass S. aureus Fibronektin-Bindeproteine (FnBPs) maßgeblich für die Adhärenz und Invasion des Erregers in Endothelzellen sind. Die Invasion erfolgt über eine indirekte Bindung an α5β1-Integrine, invasive Eigenschaften finden sich in nahezu allen klinischen Isolaten. In verschiedenen Tiermodellen konnte außerdem ein Zusammenhang zwischen der Expression von FnBPs und der Dissemination von S. aureus in andere Organe gezeigt werden. Bislang ist jedoch nicht untersucht, welche Auswirkung die S. aureus-Infektion auf die Endothelbarriere hat und welche Mechanismen für die Translokation des Erregers verantwortlich sind.
In dieser Arbeit wurde analysiert, ob die Infektion mit S. aureus- und S. carnosus-Stämmen in vitro zu einer Schädigung der endothelialen Integrität von EA.hy926-Zellen führt. Hierzu wurden Änderungen der transendothelialen Impedanz und der Endothelpermeabeabilität nach Infektion im xCELLigence- bzw. Transwell-System erfasst. Zytotoxische Effekte wurden durch Kristallviolettfärbungen, immunfluoreszenz-mikroskopische Untersuchungen der Mitochondrien und Nuklei sowie die Erfassung der hypodiploiden Zellkerne mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Zur Entschlüsselung des molekularen Mechanismus wurden Veränderungen der Adherens und Tight Junction-Proteine ZO-1 und VE-Cadherin in der Immunfluoreszenz untersucht. Die Rolle von Src-Kinasen wurde durch pharmakologische Inhibition analysiert.
Es konnte gezeigt werden, dass FnBP-exprimierende S. aureus-Stämme eine Abnahme der transendothelialen Impedanz verursachen und dass es 4 und 24 Stunden nach Infektion zu einer signifikanten Zunahme der Endothelpermeabilität kommt. Zytotoxische Effekte auf die Endothelzellen durch die Infektion traten nach 24 Stunden auf, jedoch nicht nach 4 Stunden. VE-Cadherin und ZO-1 zeigten 4 Stunden nach Infektion eine FnBP-abhängige Konformationsänderung und Reduktion der Signalintensität. Außerdem konnte demonstriert werden, dass die Inhibition von Src-Kinasen den Anstieg der Endothelpermeabilität signifikant reduziert.
In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal belegt, dass S. aureus FnBPs eine Erhöhung der Endothelpermeabilität bewirken. Während hierfür zu späten Zeitpunkten Apoptose verantwortlich ist, muss nach 4 Stunden ein anderer Mechanismus ursächlich sein. Da es zu einer Abschwächung der ZO-1- und VE-Cadherin-Signalintensität in der Immunfluoreszenz kam, ist anzunehmen, dass Adherens und Tight Junctions durch die Infektion geschädigt werden. Es ist bekannt, dass Src-Kinasen durch die Infektion mit S. aureus aktiviert werden. Außerdem sind sie elementar für die Regulation der Endothelpermeabilität und vermitteln diesen Effekt unter anderem über eine Phosphorylierung von Adherens und Tight Junction-Proteinen. Eine Src-vermittelte Phosphorylierung von Zell-Zell-Verbindungsproteinen wäre daher eine mögliche Erklärung für die beobachteten Veränderungen von ZO-1 und VE-Cadherin. Dieser Mechanismus könnte Wegbereiter für die parazelluläre Passage über die Endothelbarriere sein. Darüber hinaus könnte die erhöhte Endothelpermeabilität den Zugang zur Extrazellulärematrix und zum größten Pool an Fibronektin und Integrinen ermöglichen und so die Invasion und Transzytose begünstigen. Die hier gewonnenen Ergebnisse tragen dazu bei, die komplexe Interaktion zwischen S. aureus und dem Endothel und somit wichtige Schritte in der Pathogenese endovaskulärer Infektionen besser zu verstehen und neue Zielstrukturen für therapeutische Interventionen zu identifizieren.
The eradication of infectious agents is an attractive means of disease control that, to date, has been achieved for only one human pathogen, the smallpox virus. The introduction of vaccines against Neisseria meningitidis into immunisation schedules, and particularly the conjugate polysaccharide vaccines which can interrupt transmission, raises the question of whether disease caused by this obligate human bacterium can be controlled, eliminated, or even eradicated. The limited number of meningococcal serogroups, lack of an animal reservoir, and importance of meningococcal disease are considerations in favour of eradication; however, the commensal nature of most infections, the high diversity of meningococcal populations, and the lack of comprehensive vaccines are all factors that suggest that this is not feasible. Indeed, any such attempt might be harmful by perturbing the human microbiome and its interaction with the immune system. On balance, the control and possible elimination of disease caused by particular disease-associated meningococcal genotypes is a more achievable and worthwhile goal.
Staphylococcus aureus is a frequent human commensal bacterium and pathogen. Here we report the complete genome sequence of strain 6850 (spa type t185; sequence type 50 [ST50]), a highly cytotoxic and clinically virulent methicillin-sensitive strain from a patient with complicated S. aureus bacteremia associated with osteomyelitis and septic arthritis.
Pathogenic Neisseria meningitidis isolates contain a polysaccharide capsule that is the main virulence determinant for this bacterium. Thirteen capsular polysaccharides have been described, and nuclear magnetic resonance spectroscopy has enabled determination of the structure of capsular polysaccharides responsible for serogroup specificity. Molecular mechanisms involved in N. meningitidis capsule biosynthesis have also been identified, and genes involved in this process and in cell surface translocation are clustered at a single chromosomal locus termed cps. The use of multiple names for some of the genes involved in capsule synthesis, combined with the need for rapid diagnosis of serogroups commonly associated with invasive meningococcal disease, prompted a requirement for a consistent approach to the nomenclature of capsule genes. In this report, a comprehensive description of all N. meningitidis serogroups is provided, along with a proposed nomenclature, which was presented at the 2012 XVIIIth International Pathogenic Neisseria Conference.
Human alveolar echinococcosis (AE) is a potentially deadly disease; recent studies have shown that the endemic area of Echinococcus multilocularis, its causative agent, is larger than previously known. This disease has low prevalence and remains underreported in Europe. Emerging clinical data show that diagnostic difficulties are still common. We report on a 76-year old patient suffering from AE lesions restricted to the left lobe of the liver who underwent a curative extended left hemihepatectomy. Prior to the resection a liver biopsy under the suspicion of an atypical malignancy was performed. After the intervention he developed a pseudoaneurysm of the hepatic artery that was successfully coiled. Surprisingly, during surgery, the macroscopic appearance of the tumour revealed a growth pattern that was rather typical for cystic echinococcosis (CE), i.e., a gross tumour composed of multiple large vesicles with several centimeters in diameter. In addition, there were neither extensive adhesions nor infiltrations of the neighboring pancreas and diaphragm as was expected from previous imaging results. The unexpected diagnosis of AE was confirmed by definite histopathology, specific polymerase chain reaction and serology results. This is a rare case of unusual macroscopic presentation of AE that posed immense diagnostic challenges and had an eventful course. To our knowledge this is the first case of an autochthonous infection in this particular geographic area of Germany, the federal state of Saxony. This report may provide new hints for an expanding area of risk for AE and emphasizes the risk of complications in the scope of diagnostic procedures and the limitations of modern radiological imaging.
Cytosine methylation is a conserved epigenetic feature found throughout the phylum Platyhelminthes
(2013)
Background: The phylum Platyhelminthes (flatworms) contains an important group of bilaterian organisms responsible for many debilitating and chronic infectious diseases of human and animal populations inhabiting the planet today. In addition to their biomedical and veterinary relevance, some platyhelminths are also frequently used models for understanding tissue regeneration and stem cell biology. Therefore, the molecular (genetic and epigenetic) characteristics that underlie trophic specialism, pathogenicity or developmental maturation are likely to be pivotal in our continued studies of this important metazoan group. Indeed, in contrast to earlier studies that failed to detect evidence of cytosine or adenine methylation in parasitic flatworm taxa, our laboratory has recently defined a critical role for cytosine methylation in Schistosoma mansoni oviposition, egg maturation and ovarian development. Thus, in order to identify whether this epigenetic modification features in other platyhelminth species or is a novelty of S. mansoni, we conducted a study simultaneously surveying for DNA methylation machinery components and DNA methylation marks throughout the phylum using both parasitic and non-parasitic representatives.
Results: Firstly, using both S. mansoni DNA methyltransferase 2 (SmDNMT2) and methyl-CpG binding domain protein (SmMBD) as query sequences, we illustrate that essential DNA methylation machinery components are well conserved throughout the phylum. Secondly, using both molecular (methylation specific amplification polymorphism, MSAP) and immunological (enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA) methodologies, we demonstrate that representative species (Echinococcus multilocularis, Protopolystoma xenopodis, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Fasciola hepatica and Polycelis nigra) within all four platyhelminth classes (Cestoda, Monogenea, Trematoda and 'Turbellaria') contain methylated cytosines within their genome compartments.
Conclusions: Collectively, these findings provide the first direct evidence for a functionally conserved and enzymatically active DNA methylation system throughout the Platyhelminthes. Defining how this epigenetic feature shapes phenotypic diversity and development within the phylum represents an exciting new area of metazoan biology.
Haemophilus influenzae is a Gram-negative bacillus and a frequent commensal of the human nasopharynx. Earlier work demonstrated that in H. influenzae type b, l-lactate metabolism is associated with serum resistance and in vivo survival of the organism. To further gain insight into lactate utilization of the non-typeable (NTHi) isolate 2019 and laboratory prototype strain Rd KW20, deletion mutants of the l-lactate dehydrogenase (lctD) and permease (lctP) were generated and characterized. It is shown, that the apparent KM of l-lactate uptake is 20.1μM as determined for strain Rd KW20. Comparison of the COPD isolate NTHi 2019-R with the corresponding lctP knockout strain for survival in human serum revealed no lactate dependent serum resistance. In contrast, we observed a 4-fold attenuation of the mutant strain in a murine model of nasopharyngeal colonization. Characterization of lctP transcriptional control shows that the lactate utilization system in H. influenzae is not an inductor inducible system. Rather negative feedback regulation was observed in the presence of l-lactate and this is dependent on the ArcAB regulatory system. Additionally, for 2019 it was found that lactate may have signaling function leading to increased cell growth in late log phase under conditions where no l-lactate is metabolized. This effect seems to be ArcA independent and was not observed in strain Rd KW20. We conclude that l-lactate is an important carbon-source and may act as host specific signal substrate which fine tunes the globally acting ArcAB regulon and may additionally affect a yet unknown signaling system and thus may contribute to enhanced in vivo survival.
New vaccines targeting meningococci expressing serogroup B polysaccharide have been developed, with some being licensed in Europe. Coverage depends on the distribution of disease-associated genotypes, which may vary by age. It is well established that a small number of hyperinvasive lineages account for most disease, and these lineages are associated with particular antigens, including vaccine candidates. A collection of 4,048 representative meningococcal disease isolates from 18 European countries, collected over a 3-year period, were characterized by multilocus sequence typing (MLST). Age data were available for 3,147 isolates. The proportions of hyperinvasive lineages, identified as particular clonal complexes (ccs) by MLST, differed among age groups. Subjects <1 year of age experienced lower risk of sequence type 11 (ST-11) cc, ST-32 cc, and ST-269 cc disease and higher risk of disease due to unassigned STs, 1- to 4-year-olds experienced lower risk of ST-11 cc and ST-32 cc disease, 5- to 14-year-olds were less likely to experience ST-11 cc and ST-269 cc disease, and ≥25-year-olds were more likely to experience disease due to less common ccs and unassigned STs. Younger and older subjects were vulnerable to a more diverse set of genotypes, indicating the more clonal nature of genotypes affecting adolescents and young adults. Knowledge of temporal and spatial diversity and the dynamics of meningococcal populations is essential for disease control by vaccines, as coverage is lineage specific. The nonrandom age distribution of hyperinvasive lineages has consequences for the design and implementation of vaccines, as different variants, or perhaps targets, may be required for different age groups.
BACKGROUND:
Campylobacteriosis, a zoonotic bacterial disease observed world-wide, is becoming the most commonly recognized cause of bacterial gastroenteritis in humans. This study was done to determine the prevalence and determinants of Campylobacter infection among under-fives with acute watery diarrhea in Mwanza City, Tanzania.
METHOD:
This cross-sectional hospital-based study was conducted at Bugando Medical Centre (BMC) and Sekou Toure Hospital in Mwanza City. All inpatients and outpatients under-fives who met the inclusion criteria from October 2012 to April 2013 were enrolled in the study. Demographic and clinical data were obtained using standardized data collection tools. Stool samples were collected for gram staining and culture for Campylobacter spp. on Preston selective agar media. In addition, blood slides for malaria and HIV tests were done to all patients.
RESULTS:
A total of 300 children were enrolled with a median age of 12 [interquartile range, 8-19] months. Of these, 169 (56.5%) were from BMC and 131 (43.7%) from Sekou-Toure hospital. One hundred and seventy (56.7%) of the participating children were male. Of 300 under-fives with acute watery diarrhea, 29 patients (9.7%) were found to have Campylobacter infection. A significant higher number of children with Campylobacter infection were found in Sekou Toure hospital compared to BMC [16.0% (21/29) versus 4.7% (8/29), p = 0.002)]. Age above 2 years was independently found to predict campylobacter infection (OR: 2.9, 95% CI 1.1-7.7, p = 0.0037). Of 30 patients with a positive blood slide for Plasmodium falciparum, 20.0% were also positive for Campylobacter infection (OR: 3.9, 95% CI 1.2-10.1, p = 0.021).
CONCLUSION:
Campylobacter infection shows a comparatively low prevalence in under-fives with acute watery diarrhea in Mwanza city and is independently associated with positive slides for malaria and an age above 2 years. Further studies are needed to type the most prevalent Campylobacter species and to determine their antibiotic susceptibility pattern.
The life-threatening diseases alveolar and cystic echinococcoses are caused by larvae of the tapeworms Echinococcus multilocularis and E. granulosus, respectively. In both cases, intermediate hosts, such as humans, are infected by oral uptake of oncosphere larvae, followed by asexual multiplication and almost unrestricted growth of the metacestode within host organs. Besides surgery, echinococcosis treatment relies on benzimidazole-based chemotherapy, directed against parasite beta-tubulin. However, since beta-tubulins are highly similar between cestodes and humans, benzimidazoles can only be applied at parasitostatic doses and are associated with adverse side effects. Mostly aiming at identifying alternative drug targets, the nuclear genome sequences of E. multilocularis and E. granulosus have recently been characterized, revealing a large number of druggable targets that are expressed by the metacestode. Furthermore, recent cell biological investigations have demonstrated that E. multilocularis employs pluripotent stem cells, called germinative cells, which are the only parasite cells capable of proliferation and which give rise to all differentiated cells. Hence, the germinative cells are the crucial cell type mediating proliferation of E. multilocularis, and most likely also E. granulosus, within host organs and should also be responsible for parasite recurrence upon discontinuation of chemotherapy. Interestingly, recent investigations have also indicated that germinative cells might be less sensitive to chemotherapy because they express a beta-tubulin isoform with limited affinity to benzimidazoles. In this article, we briefly review the recent findings concerning Echinococcus genomics and stem cell research and propose that future research into anti-echinococcosis drugs should also focus on the parasite’s stem cell population.
A longstanding question in infection biology addresses the genetic basis for invasive behavior in commensal pathogens. A prime example for such a pathogen is Neisseria meningitidis. On the one hand it is a harmless commensal bacterium exquisitely adapted to humans, and on the other hand it sometimes behaves like a ferocious pathogen causing potentially lethal disease such as sepsis and acute bacterial meningitis. Despite the lack of a classical repertoire of virulence genes in N. meningitidis separating commensal from invasive strains, molecular epidemiology suggests that carriage and invasive strains belong to genetically distinct populations. In recent years, it has become increasingly clear that metabolic adaptation enables meningococci to exploit host resources, supporting the concept of nutritional virulence as a crucial determinant of invasive capability. Here, we discuss the contribution of core metabolic pathways in the context of colonization and invasion with special emphasis on results from genome-wide surveys. The metabolism of lactate, the oxidative stress response, and, in particular, glutathione metabolism as well as the denitrification pathway provide examples of how meningococcal metabolism is intimately linked to pathogenesis. We further discuss evidence from genome-wide approaches regarding potential metabolic differences between strains from hyperinvasive and carriage lineages and present new data assessing in vitro growth differences of strains from these two populations. We hypothesize that strains from carriage and hyperinvasive lineages differ in the expression of regulatory genes involved particularly in stress responses and amino acid metabolism under infection conditions.
The interaction with brain endothelial cells is central to the pathogenicity of Neisseria meningitidis infections. Here, we show that N. meningitidis causes transient activation of acid sphingomyelinase (ASM) followed by ceramide release in brain endothelial cells. In response to N. meningitidis infection, ASM and ceramide are displayed at the outer leaflet of the cell membrane and condense into large membrane platforms which also concentrate the ErbB2 receptor. The outer membrane protein Opc and phosphatidylcholine-specific phospholipase C that is activated upon binding of the pathogen to heparan sulfate proteoglycans, are required for N. meningitidis-mediated ASM activation. Pharmacologic or genetic ablation of ASM abrogated meningococcal internalization without affecting bacterial adherence. In accordance, the restricted invasiveness of a defined set of pathogenic isolates of the ST-11/ST-8 clonal complex into brain endothelial cells directly correlated with their restricted ability to induce ASM and ceramide release. In conclusion, ASM activation and ceramide release are essential for internalization of Opc-expressing meningococci into brain endothelial cells, and this segregates with invasiveness of N. meningitidis strains.
Author Summary
Neisseria meningitidis, an obligate human pathogen, is a causative agent of septicemia and meningitis worldwide. Meningococcal infection manifests in a variety of forms, including meningitis, meningococcemia with meningitis or meningococcemia without obvious meningitis. The interaction of N. meningitidis with human cells lining the blood vessels of the blood-cerebrospinal fluid barrier is a prerequisite for the development of meningitis. As a major pathogenicity factor, the meningococcal outer membrane protein Opc enhances bacterial entry into brain endothelial cells, however, mechanisms underlying trapping of receptors and signaling molecules following this interaction remained elusive. We now show that Opc-expressing meningococci activate acid sphingomyelinase (ASM) in brain endothelial cells, which hydrolyses sphingomyelin to cause ceramide release and formation of extended ceramide-enriched membrane platforms wherein ErbB2, an important receptor involved in bacterial uptake, clusters. Mechanistically, ASM activation relied on binding of N. meningitidis to its attachment receptor, HSPG, followed by activation of PC-PLC. Meningococcal isolates of the ST-11 clonal complex, which are reported to be more likely to cause severe sepsis, but rarely meningitis, barely invaded brain endothelial cells and revealed a highly restricted ability to induce ASM and ceramide release. Thus, our results unravel a differential activation of the ASM/ceramide system by the species N. meningitidis determining its invasiveness into brain endothelial cells.
Targeting Echinococcus multilocularis Stem Cells by Inhibition of the Polo-Like Kinase EmPlk1
(2014)
Background
Alveolar echinococcosis (AE) is a life-threatening disease caused by larvae of the fox-tapeworm Echinococcus multilocularis. Crucial to AE pathology is continuous infiltrative growth of the parasite's metacestode stage, which is driven by a population of somatic stem cells, called germinative cells. Current anti-AE chemotherapy using benzimidazoles is ineffective in eliminating the germinative cell population, thus leading to remission of parasite growth upon therapy discontinuation.
Methodology/Principal findings
We herein describe the characterization of EmPlk1, encoded by the gene emplk1, which displays significant homologies to members of the Plk1 sub-family of Polo-like kinases that regulate mitosis in eukaryotic cells. We demonstrate germinative cell-specific expression of emplk1 by RT-PCR, transcriptomics, and in situ hybridization. We also show that EmPlk1 can induce germinal vesicle breakdown when heterologously expressed in Xenopus oocytes, indicating that it is an active kinase. This activity was significantly suppressed in presence of BI 2536, a Plk1 inhibitor that has been tested in clinical trials against cancer. Addition of BI 2536 at concentrations as low as 20 nM significantly blocked the formation of metacestode vesicles from cultivated Echinococcus germinative cells. Furthermore, low concentrations of BI 2536 eliminated the germinative cell population from mature metacestode vesicles in vitro, yielding parasite tissue that was no longer capable of proliferation.
Conclusions/Significance
We conclude that BI 2536 effectively inactivates E. multilocularis germinative cells in parasite larvae in vitro by direct inhibition of EmPlk1, thus inducing mitotic arrest and germinative cell killing. Since germinative cells are decisive for parasite proliferation and metastasis formation within the host, BI 2536 and related compounds are very promising compounds to complement benzimidazoles in AE chemotherapy.
Author Summary
The lethal disease AE is characterized by continuous and infiltrative growth of the metacestode larva of the tapeworm E. multilocularis within host organs. This cancer-like progression is exclusively driven by a population of parasite stem cells (germinative cells) that have to be eliminated for an effective cure of the disease. Current treatment options, using benzimidazoles, are parasitostatic only, and thus obviously not effective in germinative cell killing. We herein describe a novel, druggable parasite enzyme, EmPlk1, that specifically regulates germinative cell proliferation. We show that a compound, BI 2536, originally designed to inhibit the human ortholog of EmPlk1, can also inhibit the parasite protein at low doses. Furthermore, low doses of BI 2536 eliminated germinative cells from Echinococcus larvae in vitro and prevented parasite growth and development. We propose that BI 2536 and related compounds are promising drugs to complement current benzimidazole treatment for achieving parasite killing.
Background
Alveolar echinococcosis (AE), caused by the metacestode of the tapeworm Echinococcus multilocularis, is a lethal zoonosis associated with host immunomodulation. T helper cells are instrumental to control the disease in the host. Whereas Th1 cells can restrict parasite proliferation, Th2 immune responses are associated with parasite proliferation. Although the early phase of host colonization by E. multilocularis is dominated by a potentially parasitocidal Th1 immune response, the molecular basis of this response is unknown.
Principal Findings
We describe EmTIP, an E. multilocularis homologue of the human T-cell immunomodulatory protein, TIP. By immunohistochemistry we show EmTIP localization to the intercellular space within parasite larvae. Immunoprecipitation and Western blot experiments revealed the presence of EmTIP in the excretory/secretory (E/S) products of parasite primary cell cultures, representing the early developing metacestode, but not in those of mature metacestode vesicles. Using an in vitro T-cell stimulation assay, we found that primary cell E/S products promoted interferon (IFN)-γ release by murine CD4+ T-cells, whereas metacestode E/S products did not. IFN-γ release by T-cells exposed to parasite products was abrogated by an anti-EmTIP antibody. When recombinantly expressed, EmTIP promoted IFN-γ release by CD4+ T-cells in vitro. After incubation with anti-EmTIP antibody, primary cells showed an impaired ability to proliferate and to form metacestode vesicles in vitro.
Conclusions
We provide for the first time a possible explanation for the early Th1 response observed during E. multilocularis infections. Our data indicate that parasite primary cells release a T-cell immunomodulatory protein, EmTIP, capable of promoting IFN-γ release by CD4+ T-cells, which is probably driving or supporting the onset of the early Th1 response during AE. The impairment of primary cell proliferation and the inhibition of metacestode vesicle formation by anti-EmTIP antibodies suggest that this factor fulfills an important role in early E. multilocularis development within the intermediate host.
Background
The metacestode of the tapeworm Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis, a lethal zoonosis. Infections are initiated through establishment of parasite larvae within the intermediate host’s liver, where high concentrations of insulin are present, followed by tumour-like growth of the metacestode in host organs. The molecular mechanisms determining the organ tropism of E. multilocularis or the influences of host hormones on parasite proliferation are poorly understood.
Results
Using in vitro cultivation systems for parasite larvae we show that physiological concentrations (10 nM) of human insulin significantly stimulate the formation of metacestode larvae from parasite stem cells and promote asexual growth of the metacestode. Addition of human insulin to parasite larvae led to increased glucose uptake and enhanced phosphorylation of Echinococcus insulin signalling components, including an insulin receptor-like kinase, EmIR1, for which we demonstrate predominant expression in the parasite’s glycogen storage cells. We also characterized a second insulin receptor family member, EmIR2, and demonstrated interaction of its ligand binding domain with human insulin in the yeast two-hybrid system. Addition of an insulin receptor inhibitor resulted in metacestode killing, prevented metacestode development from parasite stem cells, and impaired the activation of insulin signalling pathways through host insulin.
Conclusions
Our data indicate that host insulin acts as a stimulant for parasite development within the host liver and that E. multilocularis senses the host hormone through an evolutionarily conserved insulin signalling pathway. Hormonal host-parasite cross-communication, facilitated by the relatively close phylogenetic relationship between E. multilocularis and its mammalian hosts, thus appears to be important in the pathology of alveolar echinococcosis. This contributes to a closer understanding of organ tropism and parasite persistence in larval cestode infections. Furthermore, our data show that Echinococcus insulin signalling pathways are promising targets for the development of novel drugs.
The unique stem cell system of the immortal larva of the human parasite Echinococcus multilocularis
(2014)
Background
It is believed that in tapeworms a separate population of undifferentiated cells, the germinative cells, is the only source of cell proliferation throughout the life cycle (similar to the neoblasts of free living flatworms). In Echinococcus multilocularis, the metacestode larval stage has a unique development, growing continuously like a mass of vesicles that infiltrate the tissues of the intermediate host, generating multiple protoscoleces by asexual budding. This unique proliferation potential indicates the existence of stem cells that are totipotent and have the ability for extensive self-renewal.
Results
We show that only the germinative cells proliferate in the larval vesicles and in primary cell cultures that undergo complete vesicle regeneration, by using a combination of morphological criteria and by developing molecular markers of differentiated cell types. The germinative cells are homogeneous in morphology but heterogeneous at the molecular level, since only sub-populations express homologs of the post-transcriptional regulators nanos and argonaute. Important differences are observed between the expression patterns of selected neoblast marker genes of other flatworms and the E. multilocularis germinative cells, including widespread expression in E. multilocularis of some genes that are neoblast-specific in planarians. Hydroxyurea treatment results in the depletion of germinative cells in larval vesicles, and after recovery following hydroxyurea treatment, surviving proliferating cells grow as patches that suggest extensive self-renewal potential for individual germinative cells.
Conclusions
In E. multilocularis metacestodes, the germinative cells are the only proliferating cells, presumably driving the continuous growth of the larval vesicles. However, the existence of sub-populations of the germinative cells is strongly supported by our data. Although the germinative cells are very similar to the neoblasts of other flatworms in function and in undifferentiated morphology, their unique gene expression pattern and the evolutionary loss of conserved stem cells regulators suggest that important differences in their physiology exist, which could be related to the unique biology of E. multilocularis larvae.
Flatworm parasites (platyhelminths) cause serious infection diseases in humans, such as schistosomiasis and hydatid disease, mainly prevalent in developing countries. However, the current repertoire of drug armamentarium used to combat flatworm infections is limited. For instance, praziquantel is the only drug available for mass treatment of Schistosoma infections. In contrast to their hosts, flatworm parasites possess a distinct redox arrangement of redox pathways in which the selenoenzyme thioredoxin glutathione reductase (TGR) controls the overall redox homeostasis. Interference with this enzyme leads to parasite death. Hence, this key redox enzyme seems to be a new promising drug target against flatworm infections.
Because most flatworms are difficult to cultivate in the laboratory (e.g. Echinococcus granulosus experimental infection in mice takes about 10 month to develop into cysts), this work was focused on Mesocestoides vogae (syn. corti), a non-human flatworm parasite which is an interesting laboratory model to study other flatworm infections: it is very rare in humans, can be easily manipulated both in vivo and in vitro and grows extremely fast in mice. With the aim to assess TGR inhibitors as possible drugs to treat flatworm infections, the thioredoxin and glutathione pathways of M.vogae were studied. Here, the objectives were to study whether the biochemical pathways that maintain the redox homeostasis in M. vogae conform to the general biochemical scenario proposed for other platyhelminth parasites.
Here, it was proven that M. vogae extracts possess both thioredoxin and glutathione reductase activities. The thioredoxin and glutathione reductase activities were partially purified from total extracts by a combination of ammonium sulfate precipitation, anion exchange and hydroxyapatite chromatography. Both activities co-purified in all steps which strongly indicates the existence of TGR rather than a single TR and GR. Furthermore partially purified activities could be inhibited by the organogold compound auranofin, a known TGR inhibitor. Moreover, the glutathione reductase activity displays hysteresis (a peculiar kinetic behavior) at high concentrations of oxidised glutathione, a feature typical of flatworm TGRs, but not of conventional GR. Although M. vogae activities could not be purified to homogeneity, the overall results strongly indicate that this flatworm possesses TGR and lacks conventional GR and TR.
Furthermore the thiadiazole WPQ75 and the N-oxide VL16E (a furoxan derivate) were identified as inhibitors of TGR activity of M.vogae at a 10 µM concentration. These inhibitors were able to kill M.vogae larval worms in vitro as well as in experimental infection in mice.
Due to the existence of TGR activity in M.vogae, the possibility to inhibit this activity with recently discovered inhibitors of flatworm TGR and the successes achieved by testing these inhibitors both in vitro and in vivo, it is strongly evident that M. vogae would be an excellent model to assess TGR inhibitors in flatworm infections.
Alveolar echinococcosis (AE) is a severe and life-threatening disease caused by the metacestode larva of the fox-tapeworm Echinococcus multilocularis. Parasite entry into the host evokes an early and potentially parasiticidal Th1 immune response that is gradually replaced by a permissive Th2 response. An immunoregulatory environment has also been reported in the host as the disease progresses. As a result of immunomodulation, E. multilocularis larvae persist in the host for decades without being expelled, and thus almost act like a perfect transplant. Very little is currently known on the molecular basis of the host immunomodulation by E. multilocularis. In this work, in vitro cultivation systems were used to assess the influence of metabolites released by the parasite larvae (E/S products) on host immune effector cells. E/S products of cultivated larvae that respresent the early (primary cells) and chronic (metacestode vesicles) phase of AE induced apoptosis and tolerogenic properties (poor responsiveness to LPS stimulation) in host dendritic cells (DC) whereas those of control larvae (protoscoleces) failed to do so. These findings show that the early infective stage of E. multilocularis induces tolerogenicity in host DC, which is most probably important for generating an immunosuppressive environment at an infection phase in which the parasite is highly vulnerable to host attacks. Interestingly, metacestode E/S products promoted the conversion of naïve CD4+ T-cells into Foxp3+ regulatory T-cells in vitro, whereas primary cell and protoscolex E/S products failed to do it. Since Foxp3+ regulatory T-cells are generally known to mediate immunosuppression, the present finding indicates that Foxp3+ regulatory T-cells, expanded by E/S products of the metacestode larva, could play a role in the parasite-driven immunomodulation of the host observed during AE. Furthermore, a substantial increase in number and frequency of suppressive Foxp3+ regulatory T-cells could be observed within peritoneal exudates of mice following intraperitoneal injection of E. multilocularis metacestodes, indicating that Foxp3+ regulatory T-cells could also play an important role in E. multilocularis-driven immunomodulation in vivo. Interestingly, a parasite activin ortholog, EmACT, secreted by metacestodes, was shown to expand host regulatory T-cells in a TGF-β-dependent manner, similarly to mammalian activin A. This observation indicated that E. multilocularis utilizes evolutionarily conserved TGF-β superfamily ligands, like EmACT, to expand host regulatory T-cells. Taken together, the present findings suggest EmACT, a parasite activin secreted by the metacestode and capable of expanding host regulatory T-cells, as an important player in the host immunomodulation by E. multilocularis larvae. Another parasite factor EmTIP, homologous to mammalian T-cell immunomodulatory protein (TIP) was characterized in this work. EmTIP could be detected in the secretions of the parasite primary cells and localized to the intercellular space within the parasite larvae. EmTIP blockade inhibited the proliferation of E. multilocularis primary cells and the formation of metacestode vesicles indicating a major role for parasite development. Furthermore, EmTIP evoked a strong release of IFN-γ by CD4+ T-cells hence suggesting that the secretion of this factor as a result of its role in parasite development could “secondarily” induce a potentially protective Th1 response. In conclusion, this work identified two molecules, EmACT and EmTIP, with high immunomodulatory potential that are released by E. multilocularis larvae. The data presented do provide insights into the mechanisms of parasite-driven host immunomodulation during AE that are highly relevant for the development of anti-parasitic immune therapies.
Background
The metacestode larva of Echinococcus multilocularis (Cestoda: Taeniidae) develops in the liver of intermediate hosts (typically rodents, or accidentally in humans) as a labyrinth of interconnected cysts that infiltrate the host tissue, causing the disease alveolar echinococcosis. Within the cysts, protoscoleces (the infective stage for the definitive canid host) arise by asexual multiplication. These consist of a scolex similar to that of the adult, invaginated within a small posterior body. Despite the importance of alveolar echinococcosis for human health, relatively little is known about the basic biology, anatomy and development of E. multilocularis larvae, particularly with regard to their nervous system.
Results
We describe the existence of a subtegumental nerve net in the metacestode cysts, which is immunoreactive for acetylated tubulin-α and contains small populations of nerve cells that are labeled by antibodies raised against several invertebrate neuropeptides. However, no evidence was found for the existence of cholinergic or serotoninergic elements in the cyst wall. Muscle fibers occur without any specific arrangement in the subtegumental layer, and accumulate during the invaginations of the cyst wall that form brood capsules, where protoscoleces develop. The nervous system of the protoscolex develops independently of that of the metacestode cyst, with an antero-posterior developmental gradient. The combination of antibodies against several nervous system markers resulted in a detailed description of the protoscolex nervous system, which is remarkably complex and already similar to that of the adult worm.
Conclusions
We provide evidence for the first time of the existence of a nervous system in the metacestode cyst wall, which is remarkable given the lack of motility of this larval stage, and the lack of serotoninergic and cholinergic elements. We propose that it could function as a neuroendocrine system, derived from the nervous system present in the bladder tissue of other taeniids. The detailed description of the development and anatomy of the protoscolex neuromuscular system is a necessary first step toward the understanding of the developmental mechanisms operating in these peculiar larval stages.
Background
Published models predicting nasal colonization with Methicillin-resistant Staphylococcus aureus among hospital admissions predominantly focus on separation of carriers from non-carriers and are frequently evaluated using measures of discrimination. In contrast, accurate estimation of carriage probability, which may inform decisions regarding treatment and infection control, is rarely assessed. Furthermore, no published models adjust for MRSA prevalence.
Methods
Using logistic regression, a scoring system (values from 0 to 200) predicting nasal carriage of MRSA was created using a derivation cohort of 3091 individuals admitted to a European tertiary referral center between July 2007 and March 2008. The expected positive predictive value of a rapid diagnostic test (GeneOhm, Becton & Dickinson Co.) was modeled using non-linear regression according to score. Models were validated on a second cohort from the same hospital consisting of 2043 patients admitted between August 2008 and January 2012. Our suggested correction score for prevalence was proportional to the log-transformed odds ratio between cohorts. Calibration before and after correction, i.e. accurate classification into arbitrary strata, was assessed with the Hosmer-Lemeshow-Test.
Results
Treating culture as reference, the rapid diagnostic test had positive predictive values of 64.8% and 54.0% in derivation and internal validation corhorts with prevalences of 2.3% and 1.7%, respectively. In addition to low prevalence, low positive predictive values were due to high proportion (> 66%) of mecA-negative Staphylococcus aureus among false positive results. Age, nursing home residence, admission through the medical emergency department, and ICD-10-GM admission diagnoses starting with “A” or “J” were associated with MRSA carriage and were thus included in the scoring system, which showed good calibration in predicting probability of carriage and the rapid diagnostic test’s expected positive predictive value. Calibration for both probability of carriage and expected positive predictive value in the internal validation cohort was improved by applying the correction score.
Conclusions
Given a set of patient parameters, the presented models accurately predict a) probability of nasal carriage of MRSA and b) a rapid diagnostic test’s expected positive predictive value. While the former can inform decisions regarding empiric antibiotic treatment and infection control, the latter can influence choice of screening method.
Background
Occupational exposure to live meningococci can potentially cause invasive meningococcal disease in laboratory staff. While, until recently, immunization with quadrivalent polysaccharide vaccine represented one cornerstone of protection, data on long-term persistence of antibodies in adults remain scarce.
Methods
We analyzed the relationship of antibody levels and time following quadrivalent polysaccharide vaccination (Mencevax® ACWY, GlaxoSmithKline) in a cross-sectional sample of 20 laboratory workers vaccinated at ages between 16.4 to 40.7 years from Germany. Sera were obtained 0.4 to 158.5 (median 35.3) months after vaccination. At the time of sampling, laboratory workers had been regularly exposed to meningococci for periods between 3.2 to 163.8 (median 41.2) months. Serum bactericidal assay (SBA) with rabbit complement and a microsphere-based flow analysis method were used to determine bactericidal titers and concentrations of IgG, respectively, against serogroups A, C, W135, and Y. Decay of antibodies was modeled using linear regression. Protective levels were defined as SBA titers ≥ 8.
Results
Half-lives of SBA titers against serogroups A, C, W135, and Y were estimated at 27.4, 21.9, 18.8, and 28.0 months, respectively. Average durations of protection were estimated at 183.9, 182.0, 114.6, and 216.4 months, respectively. Inter-individual variation was high; using lower margins of 95% prediction intervals, minimal durations of protection against serogroups A, C, W135 and Y were estimated at 33.5, 24.6, 0.0, and 55.1 months, respectively. The proportion of staff with protective SBA titers against W135 (65.0%) was significantly lower than proportions protected against A (95.0%), C (94.7%), and Y (95.0%). Consistently, geometric mean titer (97.0) and geometric mean concentration of IgG (2.1 μg/ml) was lowest against serogroup W135. SBA titers in a subset of individuals with incomplete protection rose to ≥ 128 (≥ 8 fold) after reimmunization with a quadrivalent glycoconjugate vaccine.
Conclusions
The average duration of protection following immunization with a quadrivalent polysaccharide vaccine in adults was ≥ 115 months regardless of serogroup. A substantial proportion (approximately 23% according to our decay model) of adult vaccinees may not retain protection against serogroup W135 for five years, the time suggested for reimmunization.
Neisseria meningitidis ist ein wichtiger Erreger von Meningitis und Sepsis insbesondere bei jungen Menschen, gleichzeitig sind hohe Raten asymptomatischen Trägertums bekannt. Als die Virulenz begünstigende Faktoren wurden unter anderem die Kapsel, Pili, äußere Membranvesikel (OMV) und Lipopolysaccharid (LPS) identifiziert, die es dem Erreger erleichtern, das menschliche Immunsystem zu überwinden.
Dabei war bisher die Rolle von Neutrophil Extracellular Traps (NETs) als neu beschriebene Komponente der angeborenen Immunantwort nicht untersucht worden. NETs stellen spinnennetzartige DNA-Strukturen mit globulären Proteindomänen dar, die aus neutrophilen Granulozyten entstehen und als antimikrobiell gelten. Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung von NETs auf Meningokokken zu charakterisieren und mögliche Resistenzmechanismen der Bakterien zu identifizieren.
In den vorliegenden Versuchen konnte gezeigt werden, dass Meningokokken an NETs binden und durch diese in ihrer Proliferation gehemmt werden. Eine Lokalisation der Bakterien an die NETs konnte dargestellt werden, LPS und Pili wurden als wichtige Strukturen für die Vermittlung der NET-Bindung identifiziert. OMVs zeigten sich als protektiv gegenüber dem Einfluss der NETs, indem sie die Bindung der Erreger an die NETs blockierten.
Wenig empfindlich zeigten sich die Bakterien gegenüber Histonen als den quantitativ bedeutsamsten NET-Proteinen. Meningokokken schützen sich gegenüber dem Einfluss der NETs durch Ausbildung von Kapsel und LPS mit intakter Phosphoethanolamin-Modifikation. Ebenso vermitteln zwei Cathelicidin-Resistenzgene den Bakterien einen Überlebensvorteil. Keine Rolle bei der NET-Resistenz spielten die untersuchten Effluxmechanismen.
Neuere Untersuchungen von Lappann et al. indentifizierten Meningokokken und OMVs als potente NET-Induktoren. Damit könnten durch die relativ NET-resistenten Mikroorganismen andere Abwehrmechanismen der Neutrophilen konterkariert werden und eine Immunevasion begünstigt werden. Genauere Untersuchungen diesbezüglich stehen noch aus.
Neisseria meningitidis is a facultative human pathogen that occasionally shows strong resistance against serum complement exposure. Previously described factors that mediate meningococcal serum resistance are for example the capsule, LPS sialylation, and expression of the factor H binding protein. I aimed for identification of novel serum resistance factors, thereby following two approaches, i) the analysis of the impact of global regulators of gene expression on serum resistance; and ii) a comparative analysis of closely related strains differing in serum resistance. (i) Of six meningococcal global regulators of gene expression studied, only mutation of the zinc uptake regulator Zur reduced complement deposition on meningococci. Little was known about meningococcal Zur and regulatory processes in response to zinc. I therefore elucidated the yet unidentified meningococcal Zur regulon comparing the transcriptional response of the N. meningitidis strain MC58 under zinc-rich and zinc-deficient conditions using a common reference design of microarray analysis. The meningococcal Zur regulon comprises 17 genes, of which 15 genes were repressed and two genes were activated at high zinc condition. Amongst the Zur-repressed genes were genes involved in zinc uptake, tRNA modification, and ribosomal assembly. A 23 bp meningococcal consensus Zur binding motif (Zur box) with a conserved central palindrome was established (TGTTATDNHATAACA) and detected in the promoter region of all regulated transcriptional units (genes/operons). In vitro binding of meningococcal Zur to the Zur box of three selected genes was shown for the first time using EMSAs. Binding of meningococcal Zur to DNA depended specifically on zinc, and mutations in the palindromic sequence constrained Zur binding to the DNA motif. ii) Three closely related strains of ST-41/44 cc from invasive disease and carriage which differed in their resistance to serum complement exposure were analysed to identify novel mediators of serum resistance. I compared the strains’ gene content by microarray analysis which revealed six genes being present in both carrier isolates, but absent in the invasive isolate. Four of them are part of two Islands of horizontally transferred DNA, i.e. IHT-B and –C. The working group furthermore applied a comprehensive screening assay, a transcriptome and a proteome analysis leading to identification of three target proteins. I contributed to establish the role of these three proteins in serum resistance: The adhesin Opc mediates serum resistance by binding of vitronectin, a negative regulator of the complement system; the hypothetical protein NMB0865 slightly contributes to serum resistance by a yet unknown mechanism; and NspA, recently identified to bind the negative complement regulator factor H, led to considerable reduced complement-mediated killing.
Entry of Neisseria meningitidis (the meningococcus) into human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) is mediated by fibronectin or vitronectin bound to the surface protein Opc forming a bridge to the respective integrins. This interaction leads to cytoskeletal rearrangement and uptake of meningococci. In this study, we determined that the focal adhesion kinase (FAK), which directly associates with integrins, is involved in integrin-mediated internalization of N. meningitidis in HBMEC. Inhibition of FAK activity by the specific FAK inhibitor PF 573882 reduced Opc-mediated invasion of HBMEC more than 90%. Moreover, overexpression of FAK mutants that were either impaired in the kinase activity or were not capable of autophosphorylation or overexpression of the dominant-negative version of FAK (FRNK) blocked integrin-mediated internalization of N. meningitidis. Importantly, FAK-deficient fibroblasts were significantly less invaded by N. meningitidis. Furthermore, N. meningitidis induced tyrosine phosphorylation of several host proteins including the FAK/Src complex substrate cortactin. Inhibition of cortactin expression by siRNA silencing and mutation of critical amino acid residues within cortactin, that encompass Arp2/3 association and dynamin binding, significantly reduced meningococcal invasion into eukaryotic cells suggesting that both domains are critical for efficient uptake of N. meningitidis into eukaryotic cells. Together, these results indicate that N. meningitidis exploits the integrin signal pathway for its entry and that FAK mediates the transfer of signals from activated integrins to the cytoskeleton. A cooperative interplay between FAK, Src and cortactin then enables endocytosis of N. meningitidis into host cells.
Alveolar echinococcosis (AE), a severe and life-threatening disease is caused by the small fox tapeworm Echinococcus multilocularis. Currently, the options of chemotherapeutic treatment are very limited and are based on benzimidazole compounds, which act merely parasitostatic in vivo and often display strong side effects. Therefore, new therapeutic drugs and targets are urgently needed. In the present work the role of two evolutionarily conserved signalling pathways in E. multilocularis, namely the insulin signalling cascade and Abl kinases, has been studied in regard to host-parasite interaction and the possible use in anti-AE chemotherapy.
Neisseria meningitidis, Auslöser der Meningokokken-Meningitis und Sepsis, trägt auch heute noch zur hohen Kindersterblichkeit in Entwicklungsländern bei und sorgt, vor allem im afrikanischen Meningitis-Gürtel, immer wieder für Epidemien mit gravierenden Folgen für die Betroffenen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei an der Pathogenität von N. meningitidis beteiligte Proteine, der Transkriptionsregulator FarR und der Transportkanal HrpB, näher charakterisiert, um weitere Einblicke in die immer noch nicht vollständig entschlüsselte Pathogenese der Meningokokken-Meningitis zu erhalten. Das Neisseria adhesin A NadA ist Bestandteil der sich aktuell in der Entwicklung befindenden Impfung gegen Meningokokken der Serogruppe B. Im dem bekapselten B-Stamm MC58 wurde gezeigt, dass nadA unter der negativen Kontrolle des Transkriptionsregulators FarR steht (Schielke et al., 2009). In den ebenfalls zur Gattung Neisseria gehörenden Neisseria gonorrhoeae (Ng) wurde bereits 2001 ein FarR-Homolog beschrieben (Shafer et al., 2001). NgFarR ist an der Resistenz gegenüber antimikrobiellen, langkettigen Fettsäuren beteiligt, indem es die Expression des FarABEffluxpumpen-Systems reguliert, welches eingedrungene Fettsäuren wieder nach extrazellulär befördert. Dagegen zeigten Palmitinsäure-Resistenztests, dass FarR nicht an der intrinsischen Fettsäure-Resistenz der Meningokokken beteiligt ist. Die Deletion und die Komplementierung von farR hatten weder in bekapselten noch in unbekapselten Meningokokken Einfluss auf das normale Wachstumsverhalten. Ein Western Blot- Nachweis des FarR-Proteins in der frühen, mittleren und späten exponentiellen Wachstumsphase von Wildtyp, Kapsel-Deletionsmutante und farR-Komplementante zeigte, dass die Menge an FarR im zeitlichen Verlauf kontinuierlich zunimmt und FarR damit Wachstumsphasen-abhängig exprimiert wird. Dabei scheint es einer posttranskriptionalen oder posttranslationalen Regulation zu unterliegen, da auch in dem farRkomplementierten Stamm unabhängig vom farR-Promotor eine entsprechende Hochregulation stattfindet. In Infektionsversuchen wurde die Interaktion zwischen Meningokokken und humanen polymorphkernigen Granulozyten untersucht. In den Infektionsassays wurde die farRDeletionsmutante innerhalb des dreistündigen Versuchsrahmens deutlich stärker durch die Granulozyten abgetötet als der Serogruppe B-Wildtyp. Als Mitglied der in Bakterien und Archaeen weit verbreiteten Familie der MarR-Transkriptionsregulatoren (Multiple antibiotic resistance Regulator, MarR) bindet FarR mit hoher Wahrscheinlichkeit auch als Homodimer an seine Bindesequenz auf der DNA. FarR erkennt eine 16 bp lange, palindromische Sequenz in der Promotorregion von nadA (NMB1994), wodurch die nadA-Expression verhindert wird. Außerdem erkennt FarR eine ähnliche Bindesequenz im Promotorbereich von farAB (NMB0318/0319), wobei es aber keinen regulatorischen Einfluss ausübt. Mit einer aus diesen beiden Bindestellen berechneten minimalen Bindesequenz wurde im Genom von MC58 weitere mögliche Bindepartner detektiert. Eine Auswahl dieser möglichen Bindestellen wurde in Electrophoretic Mobility Shift Assays auf eine direkte Interaktion mit dem FarR-Protein hin untersucht, wobei sich allerdings keine direkte Bindung nachweisen ließ. Diese Ergebnisse darauf hin, dass der Transkriptionsregulator FarR hoch spezifisch bestimmte DNA-Bindesequenzen erkennt und die entsprechenden Gene reguliert. In der Promotorregion des TpsB-Proteins HrpB wurde in den sequenzierten Referenzstämmen Z2491, MC58, FAM18 und α14 eine mit der minimalen FarR-Bindesequenz kompatible Sequenz gefunden. In Electrophoretic Mobility Shift Assays konnte allerdings gezeigt werden, dass FarR nicht direkt daran bindet. Um das Transport-Protein HrpB näher zu charakterisieren, wurde das entsprechende Gen in 22 N. meningitidis-Isolaten sequenziert. Dabei zeigte sich, dass das Transportprotein hrpB in allen untersuchten invasiven und nicht-invasiven Stämmen vorhanden ist. Dieses äußerst konservierte Protein weist nur im seinem C-terminalen Bereich eine relativ variable Region auf, was vermutlich auf Rekombinationsereignisse zurückzuführen ist. Ein Alignment der Aminosäure-Sequenz des Serogruppe C-Stamms FAM18 mit der des homologen Bordetella pertussis TpsB-Proteins FhaC zeigte, dass die dreidimensionale Struktur des HrpB ebenfalls eine α-Helix, eine transmembranöse Domäne und variable extrazelluläre Loops enthält. Zusammengenommen erfüllt HrpB somit wichtige Bedingungen, um als Vakzine-Bestandteil in Betracht gezogen zu werden.
Durch die Immunsuppression bei Patienten nach Stammzell- oder Organtransplantation erhöht sich das Risiko für opportunistische Infektionen wie invasive Aspergillose (IA). IA wird hauptsächlich durch den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus, der durch die Luft übertragen wird, verursacht. Deshalb haben Erkennung und Therapie von IA in den letzten Jahren eine immer größere Bedeutung erlangt. Für eine erfolgreiche Behandlung sind die Mechanismen des Immunsystems nach Kontaktaufnahme mit dem Pathogen von zentraler Bedeutung. Die Erstinfektion mit A. fumigatus findet in der Lunge statt. Als Bewohner der Alveolen wurden deshalb dendritische Zellen (DCs) auf ihre Fähigkeiten hin untersucht, das Immunsystem anzuregen. DCs besitzen vor allem die wichtigen Aufgaben, das Immunsystem zu modulieren und T-Lymphozyten zur Proliferation anzuregen. Ein Großteil dieser Arbeit befasst sich mit der Analyse des Einflusses des Immunsuppressivums 40-0-[2-Hydroxyethyl]rapamycin (RAD) auf neutrophile Granulozyten und auf die in vitro Generierung von moDCs sowie deren Fähigkeit mit dem Pathogen A. fumigatus zu interagieren. RAD bindet an das zytosolische FK506 bindende Protein (FKBP12), wodurch die Kinase mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibiert und somit die T-Zellantwort unterdrückt wird. Klinische Anwendung findet RAD bereits, um eine Immunsuppression bei Patienten nach Stammzell- oder Organtransplantation zu erhalten. Der oxidative Burst neutrophiler Granulozyten war nach RAD-Behandlung und Konfrontation mit A. fumigatus signifikant verringert. Die Generierung der moDCs aus Monozyten erfolgte über 7 Tage, wobei ab dem Tag der Isolation der Monozyten 10 nM RAD oder EtOH zur Kontrolle hinzugegeben wurde. RAD zeigte vielfältige Effekte auf die Immunfunktion dendritischer Zellen. Obwohl sich keine Änderung in der Differenzierung der moDCs fand, was durch die Oberflächenmarker CD1a+, CD14- und HLA-DR+ überprüft wurde, zeigte sich eine signifikante Reduktion der Rezeptoren TLR4 und Dectin-1 sowie der kostimulatorischen Moleküle CD40, CD83 und CD86. Nach Konfrontation mit A. fumigatus verblieb CD40 unter RAD Behandlung signifikant reduziert, während CD83 genau dieses Schema als Trend aufwies. Ferner wies CD86 sowohl in der Kontrolle als auch mit RAD-Behandlung die gleiche Expression auf. Nach 6 h Konfrontation der moDCs mit A. fumigatus waren die Zytokine IL-12, TNF-α und CCL20 auf Genexpressionsebene unter RAD reduziert, was sich auf Proteinebene teilweise bestätigen ließ, da sich hier erst nach 12 h eine signifikante Reduktion von IL-12, TNF-α und CCL20 in RAD-behandelten Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen zeigte. Des Weiteren war das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 signifikant reduziert. Die Phagozytose sowohl von FITC-Dextran-Beads als auch von A. fumigatus Konidien und zugleich die Schädigung von A. fumigatus Keimschläuchen war in unreifen RAD-behandelten moDCs signifikant reduziert. Ob moDCs, die mit RAD behandelt wurden, schlechter in der Lage waren, CD8+-T-Lymphozyten zur Proliferation anzuregen, geht nicht mit Sicherheit aus dieser Studie hervor, da große spenderabhängige Unterschiede auftraten. Es wurde zudem ein Vergleich von in vitro aus Monozyten differenzierten DCs (moDCs) und myeloiden DCs (mDCs) angefertigt. Mittels eines home-made Microarrays, der vor allem Gene mit einschloss, die für Zytokine und Rezeptoren von Immunzellen kodieren, konnten in einem Modell der frühen IA in der Lunge differentiell regulierte Gene nach Konfrontation mit A. fumigatus identifiziert werden. Es wurden insgesamt 30 Gene mehr als 2-fach reguliert, wie zum Beispiel die Interleukine und Chemokine IL-1β, IL-8, CXCL2, CCL3, CCL4 und CCL20, der Immunrezeptor PTX3 und der Transkriptionsfaktor Nf-κB. Generell konnte beobachtet werden, dass moDCs mehr regulierte Gene aufwiesen als mDCs. Zuletzt wurde betrachtet, ob der Knock-down von CXCL10, dessen Fehlen ein erhöhtes Risiko für IA nach sich zieht, einen Einfluss auf moDCs hat, so dass sie schlechter auf A. fumigatus reagieren können. Diese Hypothese konnte in dieser Studie nicht bestätigt werden, da kein Unterschied in der Zytokinproduktion oder Expression kostimulatorischer Moleküle zwischen Kontroll-moDCs und moDCs, in denen das CXCL10-Gen ausgeschaltet wurde, festgestellt werden konnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch die Microarray-Analyse wichtige Gene in moDCs und mDCs identifizierbar waren, die nach Konfrontation mit A. fumigatus reguliert wurden. Zudem fanden sich lediglich minimale Unterschiede zwischen artifiziellen DCs und myeloiden DCs, die direkt aus dem Körper isoliert wurden. Eine Behandlung mit RAD erhöht das Risiko eines Patienten an invasiver Aspergillose zu erkranken unabhängig von der Eigenschaft des RAD, die Proliferation von T-Lymphozyten zu inhibieren.
Wie das pathogene Bakterium Neisseria meningitidis kolonisiert auch Neisseria lactamica als Kommensale den oberen Nasopharynx des Menschen. Penicillin G ist ein first-line-Therapeutikum gegen Meningokokkeninfektionen. Reduzierte Empfindlichkeit gegenüber Penicillin wird bei Meningokokken durch Mutationen im penA-Gen verursacht. Horizontaler Gentransfer zwischen den verschiedenen Neisseria spp. wurde auch für das penA-Gen beschrieben. Ziel dieser Arbeit war daher eine phänotypische und genotypische Analyse der Penicillinresistenz von N. lactamica. Aus den Versuchen sollten Prognosen über die zukünftige Resistenzentwicklung von Meningokokken abgeleitet werden. Die phänotypische Analyse von 123 N. lactamica-Stämmen (MIC [Minimum inhibitory concentration]-Bereich: 0,064 – 2,0 µg/ml, Median: 0,38 µg/ml) und 129 N. meningitidis- Stämmen (MIC-Bereich: 0,016 – 0,25 µg/ml, Median: 0,064 µg/ml) zeigte signifikant höhere MIC-Werte gegenüber Penicillin G bei den N. lactamica-Stämmen als bei den untersuchten Meningokokken. Bei Meningokokken sind Polymorphismen (fünf spezifische Mutationen betreffend) im penA-Gen (kodiert für das PBP2 (penicillin binding protein 2)) für verminderte Penicillinsensibilität verantwortlich, weshalb der betroffene Abschnitt des penA-Gens in allen N. lactamica-Stämmen und N. meningitidis-Stämmen untersucht und mit den bekannten Allelen der penA-Datenbank verglichen wurde. Bei den 123 N. lactamica-Stämmen konnten 60 verschiedene penA-Allele nachgewiesen werden, wovon 51 neu in die internationale penA-Datenbank eingefügt werden konnten. Im Gegensatz zu Meningokokken trugen die N. lactamica-Stämme entweder drei oder fünf der für intermediär resistente Meningokokken charakteristischen Mutationen im penA-Gen. N. lactamica-Stämme mit fünf Mutationen (MIC-Bereich: 0,25 – 2,0 µg/ml, Median: 0,5 µg/ml) zeigten signifikant höhere MIC-Werte als Stämme mit drei Mutationen (MIC-Bereich: 0,064 – 0,38 µg/ml, Median: 0,125 µg/ml), aber auch als Meningokokken mit fünf Mutationen (MIC-Bereich: 0,064 – 0,25 µg/ml, Median: 0,125 µg/ml). Eine phylogenetische Analyse aller in der penA-Datenbank hinterlegten Allele zusammen mit den 51 neuen dieser Studie ergab, dass die Allele mit fünf Mutationen unabhängig von der Spezies eine gemeinsame phylogenetische Linie bildeten, während sowohl die Allele mit drei Mutationen (N. lactamica) als auch die ohne Mutationen (N. meningitidis) jeweils eine separate phylogenetische Gruppe formten. Im Rahmen von in vitro-Transformationen mit chromosomaler DNA von N. lactamica konnte der MIC-Wert des Penicillin-sensiblen Meningokokkenstamms 14 in einem single-step-Ereignis durch Übernahme des betreffenden penA-Gens von N. lactamica erhöht werden. Allerdings konnten nur MIC-Werte erreicht werden, die mit intermediär-sensiblen Meningokokken vergleichbar waren und somit weit unter den MIC-Werten der benutzten N. lactamica-Stämme lagen. Dieser Befund legt nahe, dass erhöhte MIC-Werte bei N. lactamica wie auch bei Meningokokken mit Mutationen in der Transpeptidaseregion des PBP2 assoziiert sind. Jedoch sind die im Vergleich zu Meningokokken generell höheren MIC-Werte bei N. lactamica auf andere Faktoren zurückzuführen, die bei N. lactamica eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Penicillin bedingen. In den in vitro-Experimenten der vorliegenden Studie konnten diese Faktoren nicht auf Meningokokken übertragen werden. Demnach kann eine Co-Kolonisation mit N. lactamica zwar die MIC-Werte von Meningokokken erhöhen, das Erreichen von bei N. lactamica beobachteten Resistenzniveaus ist allerdings auf diesem Wege nicht möglich. Es ist somit nicht zu befürchten, dass Meningokokken – wie bei Pneumokokken beobachtet – über kommensale Spezies der gleichen Gattung eine massive Reduktion der Empfindlichkeit gegenüber Penicillin entwickeln werden.
Introduction: Chronic nonbacterial osteomyelitis (CNO) is an inflammatory disorder of unknown etiology. In children and adolescents CNO predominantly affects the metaphyses of the long bones, but lesions can occur at any site of the skeleton. Prospectively followed cohorts using a standardized protocol in diagnosis and treatment have rarely been reported. Methods: Thirty-seven children diagnosed with CNO were treated with naproxen continuously for the first 6 months. If assessment at that time revealed progressive disease or no further improvement, sulfasalazine and short-term corticosteroids were added. The aims of our short-term follow-up study were to describe treatment response in detail and to identify potential risk factors for an unfavorable outcome. Results: Naproxen treatment was highly effective in general, inducing a symptom-free status in 43% of our patients after 6 months. However, four nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) partial-responders were additionally treated with sulfasalazine and short-term corticosteroids. The total number of clinical detectable lesions was significantly reduced. Mean disease activity estimated by the patient/physician and the physical aspect of health-related quality of life including functional ability (global assessment/childhood health assessment questionnaire and childhood health assessment questionnaire) and pain improved significantly. Forty-one percent of our patients showed radiological relapses, but 67% of them were clinically silent. Conclusions: Most children show a favorable clinical course in the first year of anti-inflammatory treatment with NSAIDs. Relapses and new radiological lesions can occur at any time and at any site in the skeleton but may not be clinically symptomatic. Whole-body magnetic resonance imaging proved to be very sensitive for initial and follow-up diagnostics.
Neisseria meningitidis ist mit jahrlich etwa 700.000 Erkrankungsfallen weltweit und einer Mortalitat von circa 7% einer der häufigsten Ausloser der bakteriellen Hirnhautentzündung. Der entscheidende Schritt zur Auslosung einer Meningitis ist die Uberwindung der Blut-Hirn-Schranke. Diese im menschlichen Korper einmalig dichte Barriere wird maßgeblich durch Tight-Junctions spezialisierter Endothelzellen der Hirnkapillaren aufrecht erhalten. Ob N. Meningitidis diese Barriere auf einem parazellulären oder transzellulärem Weg uberwindet, ist nicht vollstandig geklart. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von N. meningitidis auf die Tight-Junction Proteine Occludin und ZO-1 unter Nutzung des HBMEC Zellkulurmodelles untersucht. Neben einer verminderten Genexpression von Occludin zeigte sich dabei eine Abspaltung eines 50 kDa Fragmentes von Occludin. Gleichzeitig konnte eine Umverteilung von Occludin von den Zellgrenzen in das Zytoplasma beobachtet werden. ZO-1 hingegen wurde weder in seiner Exprimierung, noch in seiner intrazellularen Verteilung beeinflusst. Mittels eines in dieser Arbeit etablierten Assays zur Bestimmung der Permeabilitat eines HBMEC-Monolayer als vereinfachtes in-vitro Modell der Blut-Hirn-Schranke konnte bestatigt werden, dass durch die Beeinflussung von Tight-Junction Proteinen die parazellulare Permeabilitat steigt. In weiteren Analysen konnten diese Prozesse auf eine gesteigerte Aktivitat von Matrixmetalloproteinase 8 zurückgefuhrt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen einen neuen Mechanismus auf, durch den N. meningitidis im Stande ist, die-Hinr-Schranke auf einem parazellulärem Weg zu überwinden.
Background: Specific cell targeting is an important, yet unsolved problem in bacteria-based therapeutic applications, like tumor or gene therapy. Here, we describe the construction of a novel, internalin A and B (InlAB)-deficient Listeria monocytogenes strain (Lm-spa+), which expresses protein A of Staphylococcus aureus (SPA) and anchors SPA in the correct orientation on the bacterial cell surface. Results: This listerial strain efficiently binds antibodies allowing specific interaction of the bacterium with the target recognized by the antibody. Binding of Trastuzumab (Herceptin®) or Cetuximab (Erbitux®) to Lm-spa+, two clinically approved monoclonal antibodies directed against HER2/neu and EGFR/HER1, respectively, triggers InlABindependent internalization into non-phagocytic cancer cell lines overexpressing the respective receptors. Internalization, subsequent escape into the host cell cytosol and intracellular replication of these bacteria are as efficient as of the corresponding InlAB-positive, SPA-negative parental strain. This specific antibody/receptormediated internalization of Lm-spa+ is shown in the murine 4T1 tumor cell line, the isogenic 4T1-HER2 cell line as well as the human cancer cell lines SK-BR-3 and SK-OV-3. Importantly, this targeting approach is applicable in a xenograft mouse tumor model after crosslinking the antibody to SPA on the listerial cell surface. Conclusions: Binding of receptor-specific antibodies to SPA-expressing L. monocytogenes may represent a promising approach to target L. monocytogenes to host cells expressing specific receptors triggering internalization.
Disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a hallmark event in the pathophysiology of bacterial meningitis. Several inflammatory mediators, such as tumor necrosis factor alpha (TNF-a), nitric oxide and matrix metalloproteinases (MMPs), contribute to this disruption. Here we show that infection of human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) with Neisseria meningitidis induced an increase of permeability at prolonged time of infection. This was paralleled by an increase in MMP-8 activity in supernatants collected from infected cells. A detailed analysis revealed that MMP-8 was involved in the proteolytic cleavage of the tight junction protein occludin, resulting in its disappearance from the cell periphery and cleavage to a lower-sized 50-kDa protein in infected HBMEC. Abrogation of MMP-8 activity by specific inhibitors as well as transfection with MMP-8 siRNA abolished production of the cleavage fragment and occludin remained attached to the cell periphery. In addition, MMP-8 affected cell adherence to the underlying matrix. A similar temporal relationship was observed for MMP activity and cell detachment. Injury of the HBMEC monolayer suggested the requirement of direct cell contact because no detachment was observed when bacteria were placed above a transwell membrane or when bacterial supernatant was directly added to cells. Inhibition of MMP-8 partially prevented detachment of infected HBMEC and restored BBB permeability. Together, we established that MMP-8 activity plays a crucial role in disassembly of cell junction components and cell adhesion during meningococcal infection.
Hintergrund: Zunehmend wird der Eigenschaft von Staphylococcus aureus als fakultativ intrazellulärem Erreger Bedeutung zugemessen. Ein direkter Nachweis der in vivo Relevanz von fakultativ intrazellulärem S. aureus bleibt allerdings bisher aus. Der Mechanismus zellulärer Invasivität ist bekannt und korreliert mit verschiedenen molekularen Markern (spa-Typ, SCCmec-Typ und pls/Pls). In dieser Studie wurde die Zuverlässigkeit und Ausweitbarkeit dieser Marker getestet. Des Weiteren wurde überprüft, ob sich die zelluläre Invasivität von kolonisierenden und Infektions-assoziierten MRSA-Isolaten unterscheidet und, ob die alleinige Bestimmung molekularer Marker in vitro die Virulenz eines Isolats in vivo abzuschätzen vermag. Methoden:Insgesamt wurden 109 MRSA-Isolate gesammelt, molekular charakterisiert (spa-Typ, BURP-Analyse, SCCmec-Typ, pls, agr-Typ, Hämolyseverhalten) und das Potential zellulärer Invasivität in vitro ermittelt. Die Assoziation eines Isolates mit einer Infektion in vivo wurde nachverfolgt (93 Kolonisierer versus 16 Infektions-assoziierte-Isolate). Zusätzlich wurde eine Referenzgruppe aus 13 S. aureus-Isolaten etabliert, die klinisch mit vergleichsweise invasiven Infektionen assoziiert waren (12 Osteomyelitis-Isolate und 1 Endokarditis-Isolat). Ergebnisse: Die bekannten molekularen Marker zellulärer Invasivität korrelieren zuverlässig in einer Population klinischer MRSA-Isolate und lassen sich auch auf bisher nicht bekannte (spa- und SCCmec-) Typen ausweiten. Das Hämolyseverhalten korrelierte nicht mit der zellulären Invasivität. Der agr-Typ wurde als weiterer molekularer Marker identifiziert. Die zelluläre Invasivität war unabhängig von der Etablierung einer Infektion in vivo (mediane Invasivität der Kolonisierer 100% versus 108% der Infektions-assoziierten Studienisolate und 110% der externen Referenzisolate). Des Weiteren waren die molekularen Marker spa- und agr-Typ nicht in der Lage, die Virulenz eines MRSA-Isolats in vivo abzuschätzen. Diskussion: Die zelluläre Invasivität klinischer MRSA-Isolate korreliert zuverlässig mit molekularen Markern. Allerdings vermögen weder die zelluläre Invasivität, noch mit ihr assoziierte molekulare Marker die Etablierung einer Infektion in vivo vorherzusagen. Beide scheinen also als Surrogat-Parameter zur Abschätzung der klinischen Virulenz eines Isolats ungeeignet. Zur Klärung der Frage, ob molekulare Marker zellulärer Invasivität in anderen Abschnitten der Pathogenese von S. aureus- Infektionen eine Rolle spielen, bedarf es weiterer Studien.
Echinococcus multilocularis besitzt als Lebergewebe - infiltrierender Parasit und Erreger der Alveolären Echinokokkose evolutionär konservierte Faktoren des TGF-β / BMP Signalsystems, die im Konzept der hormonellen Wirt - Parasit Kreuzkommunikation nicht nur hinsichtlich des Wirts - Einflusses auf die Entwicklung des Parasiten sondern auch umgekehrt in Bezug auf Immunantwort und Physiologie des Wirts eine mögliche regulierende Funktion besitzen. Die vorliegende Arbeit befasst sich primär mit den Auswirkungen von TGF-β / BMP Signaling auf den Fuchsbandwurm E. multilocularis. Dazu wurde zunächst durch Immunlokalisation das Vorliegen aller Echinokokken TGF-β / BMP Rezeptoren während einer natürlich aufgetretenen Alveolären Echinokokkose überprüft, sowie die funktionelle Interaktion von EmRSK3 und EmRSK4 mit humanem TGF-β1 in vitro nachgewiesen. Mit Hilfe von humanen Zytokinen (BMP2 und TGF β1) und Rezeptor - spezifischen Inhibitoren (SB431542, Dorsomorphin und LY364947) wurde die Rolle von TGF β / BMP Signaling in Bezug auf Vitalität, Wachstum, Differenzierung und Regeneration von E. multilocularis in verschiedenen Stadien untersucht. Zusätzlich wurde der Einfluss von humanem BMP2 und von SB431542 auf die Genexpression in E. multilocularis analysiert. Die Möglichkeit einer intra - Spezies Kommunikation durch Echinokokken Faktoren des TGF-β / BMP Signaling wurde ebenfalls adressiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass Echinokokken TGF-β / BMP Rezeptoren in vitro durch sekretierte Faktoren aus Metazestoden aktiviert werden können. Auf Basis von Genomsequenzierungsdaten wurden zudem weitere Komponenten des TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis, wie die bisher unbekannten TGF β / BMP Homologe EmBMP2 und EmAct, die Noggin-like Homologe EmNlg1 und 2, ein I-Smad (EmSmadF) sowie ein zweiter BR-Smad (EmSmadE) identifiziert, strukturell charakterisiert und die jeweilige Genexpression in verschiedenen Stadien überprüft. EmSmadE wurde zudem in weiterführenden Studien funktionell charakterisiert. Fragestellungen bezüglich der Spezifität, Funktionalität und Möglichkeit der konstitutiven Aktivierung von TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis wurden auf Basis von EmSmadA, EmRSK3 und EmRSK3b in weiteren molekularbiologischen Studien untersucht und dienen dem tieferen Verständnis von TGF-β / BMP Signaling. In der vorliegenden Arbeit konnten damit alle grundlegenden Faktoren von TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis identifiziert werden und es wurden erstmals die eindeutige Sensierung von Wirts TGF-β / BMP Zytokinen durch Metazestoden sowie die Möglichkeit einer intra - Spezies Kommunikation über Echinokokken TGF-β / BMP Faktoren belegt. Zusätzlich deuten die neu identifizierten potenziell sekretierten TGF-β / BMP Faktoren auf eine mögliche Beeinflussung von Physiologie und Immunantwort des Wirts durch Echinokokken TGF-β / BMP Zytokine hin.
Neisseria meningitidis is a facultatively pathogenic human commensal and strictly adapted to its niche within the human host, the nasopharynx. Not much is known about the regulatory processes required for adaptation to this environment. Therefore the role of the transcriptional regulator NMB1843, one of the two predicted regulators of the MarR family in the meningococcal genome, was investigated. As this gene displayed a high sequence homology to FarR, the Fatty acid resistance Regulator in N. gonorrhoeae, we designated the meningococcal protein FarR (NmFarR). Homology modeling of this protein revealed a dimeric structure with the characteristic winged helix-turn-helix DNA binding motif of the MarR family. NmFarR is highly conserved among meningococcal strains and expression of farR during exponential growth is controlled post-transcriptionally, being highest in the late exponential phase. By means of electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) the direct and specific binding of FarR to the farAB promoter region was shown, comparable to its homologue in gonococci. As FarR is involved in fatty acid resistance in N. gonorrhoeae, susceptibility assays with the medium chain lauric acid (C12:0), the long chain saturated palmitic acid (C16:0) and the long chain unsaturated linoleic acid (C18:2) were performed, testing a wide variety of strains of both species. In contrast to the unusually susceptible gonococci, a high intrinsic fatty acid resistance was detected in almost all meningococcal isolates. The molecular basis for this intrinsic resistance in N. meningitidis was elucidated, showing that both a functional FarAB efflux pump system as well as an intact lipopolysaccharide (LPS) are responsible for palmitic acid resistance. However, even despite circumvention of the intrinsic resistance, FarR could not be connected with fatty acid resistance in meningococci. Instead, FarR was shown to directly and specifically repress expression of the Neisseria adhesin A (nadA), a promising vaccine candidate absent in N. gonorrhoeae. Microarray analyses verified these results and disclosed no further similarly regulated genes, rendering the FarR regulon the smallest regulon in meningococci reported until now. The exact FarR binding site within the nadA promoter region was identified as a 16 bp palindromic repeat and its influence on nadA transcription was proved by reporter gene fusion assays. This repression was also shown to be relevant for infection as farR deficient mutant strains displayed an increased attachment to epithelial cells. Furthermore, farR transcription was attested to be repressed upon contact with active complement components within human serum. Concluding, it is shown that FarR adopted a role in meningococcal host niche adaptation, holding the balance between immune evasion by repressing the highly antigenic nadA and host cell attachment via this same adhesin.
In dieser Arbeit wurde das in vitro Wachstumsverhalten ausgesuchter MRSA in Konkurrenz zu Bakterien der Standortflora unter Optimalbedingungen und unter Mangelbedingungen getestet. Es lässt sich für alle getesteten MRSA-Stämme zusammenfassend sagen, dass ihre klinische Prävalenz nicht mit dem Wachstum in vitro korreliert, d.h. das häufige Spa-Typen nicht besser unter unseren Versuchbedingungen gewachsen sind als seltene. In vitro konnte kein verdrängendes Wachstum des Methicillin sensiblen S. aureus gegenüber den resistenten Stämme beobachtet werden. Vielmehr gelingt es den MRSA-Stämmen, ein Wachstumsgemisch zu ihrem Vorteil zu beeinflussen, indem sie die getesteten anderen Mikroorganismen (S. epidermidis, S. cerivisiae) im Wachstum hemmen, mit Ausnahme von E. faecium. Die Arbeit beleuchtet die Schwierigkeiten der Identifizierung von probiotischen Arten zur Verdrängung eines MRSA. In Zukunft sollte vielleicht an der Optimierung von in vitro Systemen gearbeitet werden (in vitro Organkulturen) oder Tiermodelle verwendet werden. Den Transmissionsunterschieden und der Tenazität sind weiterhin Aufmerksamkeit zu widmen. Wie in der Literatur beschrieben ist es zum Verständnis des Wachstumsverhal-tens der resistenten Stämme wichtig zu wissen, auf welchen molekularbiologischen Grundlagen die Resistenz beruht, da eine einzelne Site-Mutation zusätzliche Resistenzen bedeuten und einen eventuellen Wachstumsnachteil wieder ausgleichen kann. Im Klinikalltag scheinen sich die MRSA-Stämme auszubreiten, die den Wachstumsnachteil bereits ausgeglichen haben, beziehungsweise deren Methicillinresistenz keinen Wachstumsnachteil bedeutet.
OatC ist die O-Acetyltransferase von Serogruppe C Meningokokken. Sie katalysiert die O-Acetylierung der Sialinsäurekapsel. Das Enzym konnte vor Beginn dieser Arbeit keiner bekannten Gruppe von Enzymen zugeordnet werden. Durch in vivo-Versuche und in vitro-Studien sollten weitere Erkenntnisse zu Lage und Struktur des aktiven Zentrums von OatC gewonnen werden. Die vorliegende Arbeit besteht aus drei Teilen: 1. Es sollte eine Meningokokken-Mutante mit einer Deletion des oatC -Gens hergestellt werden. 2. Das oatC -Gen sollte schrittweise verkürzt und in trans auf dem pAP1His Vektor in die oatC-Deletionsmutante eingebracht werden. 3. Gerichtete Mutagenese von Histidinresten, Serin 286 und Aspartat 376 sollte Aussagen über die in vivo-Relevanz der Aminosäuren ermöglichen. Die Mutanten wurden im ELISA auf Ihren O-Acetylierungsstatus hin überprüft. Die oatC -Deletionsmutante war erwartungsgemäß negativ. Bereits die erste Verkürzung von OatC um 16 Aminosäuren führte zu einem vollständigen Verlust der O-Acetylierung, der Austausch der Aminosäuren Histidin 399, Serin 286 und Aspartat 376 durch gerichtete Mutagenese ebenfalls. Wir spekulieren, dass der Verlust des C-Terminus zu einer veränderten Proteinfaltung führt oder eine katalytische Funktion des Histidin 456 eliminiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Hypothese, dass OatC der Gruppe der α/β-Hydrolasen zugeordnet werden kann (s. a. Bergfeld et al. 2009). Das katalytische Zentrum besteht aus Serin 286, Aspartat 376 und Histidin 399. Der Bereich um Histidin 456 beeinflusst die Funktion erheblich.
Neisseria meningitidis ist ein humaner Infektionserreger, der Meningitis und Sepsis hervorruft. Das asymptomatische Trägertum im Nasenrachenraum ist entscheidend für die Übertragung des Bakteriums und dessen Interaktion mit dem menschlichen Wirt. Frühere Beobachtungen legen die Annahme nahe, dass Meningo¬kokken im Tonsillengewebe in einem biofilmähnlichen Stadium vorliegen. Daher werden in vitro Biofilme als Modell für das Trägertum verwendet. Expressionsunterschiede zwischen Biofilmen und planktonisch gewachsenen pathogenen Neisserien wurden in wenigen Transkriptomanalysen untersucht, während bisher keine Proteomanalysen durchgeführt wurden. Kartierungen des Proteoms und des Immunoproteoms von Meningokokken liegen allerdings vor. In dieser Studie wurde das Biofilmproteom des unbekapselten N. meningitidis Stammes WUE3671 im Vergleich zum Proteom der planktonisch gewachsenen Bakterien untersucht. Dazu wurde ein auf Silikonschläuchen basierendes Biofilmmodell mit kontinuierlichem Fluss etabliert. Es erfolgte eine Anreicherung bakterieller Biomasse über 48 h, wobei die kolonie-bildenden Einheiten bei 24 h ein Plateau erreichten. Licht- und Elektronen¬mikroskopie belegten die deutliche Zunahme der Biomasse über 48 h und zeigten zudem eine Struktur-ierung des 48 h Biofilms in eine apikale Region mit überwiegend vitalen Meningokokken und eine basale Region mit einer verstärkten Anzahl von Bakterien mit avitalem Erscheinungs-bild. Das Proteom von N. meningitidis Biofilmen, die 24 beziehungsweise 48 h gewachsen waren, wurde mit dem einer exponentiell gewachsenen planktonischen Kultur mit 2D-Gelelektro¬phorese verglichen. Unterschiedlich exprimierte Proteine wurden mit Massen-spektrometrie identifiziert und die Ergebnisse mit Spectral Counting und, wenn möglich, mit spezifischen Antikörpern abgesichert. Die Expression von ungefähr 2 % aller Proteinspots im Biofilm unterschied sich von der in planktonischen Zellen wenigstens um das 2-fache. Es wurden Veränderungen beobachtet, die mit einem Nährstoff- und Sauerstoffmangel sowie einer Zunahme von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) in Verbindung gebracht werden können. Die Expression der Proteine SodC und MntC war im Biofilm deutlich erhöht, was mutmaßlich auf ROS im Biofilm zurückzuführen ist. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MntC in der Tat essentiell für Biofilmwachstum, nicht aber für planktonisches Wachstum ist. Die Daten zu SodC und MntC legen die Hypothese nahe, dass Meningokokken im Biofilm trainiert werden mit Mediatoren des Immunsystems, wie ROS, umzugehen. Zudem wird NMB0573, ein Lrp-Homolog, als wesentlicher globaler Regulator für metabolische Anpassungen im Biofilm postuliert. Es konnte über die Proteomanalyse hinaus gezeigt werden, dass die Adhäsine Opc und Opa, die unter der Kontrolle von NMB0573 stehen, im Biofilm vermindert exprimiert werden.
Escherichia coli ist ein Kommensale des menschlichen und tierischen Gastrointestinaltraktes. Einige E. coli-Stämme sind in der Lage, extraintestinale Erkrankungen beim Menschen wie Harnwegsinfekte, Neugeborenen-Meningitis und Sepsis, sowie beim Tier aviäre Coliseptikämien, hervorzurufen. Ein wichtiger Virulenzfaktor des Bakteriums ist dabei die aus α-2,8-verknüpften Sialinsäuremonomeren aufgebaute K1-Kapsel, die phasenvariabel mit einer hohen Frequenz O-acetyliert werden kann. Im Jahr 2005 konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem für die O-Acetylierung verantwortlichen Enzym um die O-Acetyltransferase NeuO handelt, die von dem K1-spezifischen Prophagen CUS-3 codiert wird. Die Verteilung von neuO in der E. coli K1-Population sowie die funktionelle Relevanz der K1-Kapsel O-Acetylierung für das Bakterium waren zu Beginn der vorliegenden Arbeit weitestgehend unklar. Eine E. coli K1-Stammsammlung mit 183 Isolaten wurde aufgebaut. Die E. coli K1-Isolate stammten sowohl aus Stuhlproben gesunder Freiwilliger, humanen Harnwegsinfekten, humanen invasiven Erkrankungen (Neugeborenen-Meningitis und Bakteriämie) und aus an Coliseptikämie erkrankten Vögeln. Die Isolate der E. coli K1-Stammsammlung wurden mit der Multilokus-Sequenztypisierung (MLST) typisiert. Es konnten 39 Sequenztypen (ST) sowie fünf Sequenztyp-Komplexe (STC) identifiziert werden. Bei dem mit Abstand häufigsten STC handelte es sich um den STC95, dem 80 Stämme (44%) angehörten. Insgesamt 103 der 183 E. coli K1-Stämme waren neuO-positiv (56%). Das Gen wurde in 78 (98%) der STC95-Isolate, aber nur in 25 (24%) der 103 nicht-STC95-Stämme gefunden. NeuO war also mit dem STC95 assoziiert. Über Sequenzanalysen des CUS-3-Prophagen konnten CUS-3-Genotypen bestimmt werden. Die Gruppierung der CUS-3-Genotypen und der E. coli K1-ST sowie der anschließende Vergleich beider Gruppierungen miteinander offenbarte eine Segregation der Prophagen-Genotypen entsprechend der ST. Daher legen die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse eine Koevolution des Phagen mit seinem Wirt nahe. Einige humane und aviäre E. coli K1-Isolate waren weder auf Basis der MLST bzw. der CUS-3-Genotypisierung noch anhand des Vorhandenseins verschiedener, mit extraintestinal-pathogenen E. coli-assoziierter Gene voneinander unterscheidbar, was die Hypothese einer zoonotischen Transmission dieser Stämme unterstützt. In den in dieser Arbeit durchgeführten funktionellen Analysen konnte weder ein Effekt der NeuO-vermittelten E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung auf die Fähigkeit der Bakterien an humane mikrovaskuläre Gehirnendothelzellen zu adhärieren oder in diese zu invadieren, noch auf die in vivo-Virulenz der Bakterien im Hühnermodell beobachtet werden. Die K1-Kapsel O-Acetylierung verringerte die in vivo-Kolonisierung des Hühner-Gastrointestinaltraktes und die in vitro-Biofilmbildung durch das Bakterium, wohingegen sie die Austrocknungsresistenz von E. coli K1 erhöhte. Möglicherweise dient die phasenvariable neuO-Expression und damit die E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung der Anpassung des Bakteriums an wechselnde Umweltbedingungen.
Die Bedeutung des Zwei-Partner-Sekretionssystems für die Adhärenz von Meningokokken an Epithelzellen
(2009)
Das two-partner secretion-system (TPS-System) ist ein unter Gram-negativen Bakterien weit verbreiteter Weg der Proteinsekretion. Die als TpsA bezeichneten Exoproteine des TPS Systems benötigen ein spezifisches Partnerprotein (genannt TpsB) in Form eines kanalbildenden Transporters. Im sequenzierten Genom des Meningokokkenstammes MC58 finden sich fünf putative tpsA Gene, die als hemagglutinin/hemolysin-related protein (hrps) bezeichnete werden. Neben MC58 finden sich auch in den anderen sequenzierten Meningokokkenstämmen (FAM18, Z2491, alpha14) hrps. Diese weisen N-terminal Homologien zum filamentösen Hämagglutinin (FHA) von B. pertussis auf, das als TpsA-Protein des two-partner-secretion-system (TPS) aus der Zelle transportiert wird. In dieser Arbeit werden die hrps als hrpA Gene bzw. HrpA-Proteine bezeichnet. Alle sequenzierten Meningokokkenstämme verfügen über tpsB homologe Gene (hrpB), die jeweils in enger Nachbarschaft zu den hrpA Genen zu finden sind. Das Vorhandensein von hrpA und hrpB Genen deutet darauf hin, dass auch Meningokokken über ein funktionales TPS-System verfügen. Bei einer Dot-Blot-Analyse von 830 Meningokokkenstämmen aus einer bayerischen Trägerstudie mit Sonden spezifisch für die C-terminalen Bereiche der im Stamm MC58 gefundenen hrpA Gene hybridisierten 80% der ausgewerteten Stämme mit mindestens einer der Sonden. Stämme der hypervirulenten klonalen Komplexen (ST-8, ST-11, ST32, ST-44) zeigten sogar in über 99% eine positive Reaktion. Dagegen wiesen die nicht-hypervirulenten klonalen Komplexe zu 29% im Dot Blot kein hrpA auf, das homolog zu den hrpA Genen von Stamm MC58 ist, wobei es sich hierbei mehrheitlich (82%) um cnl Stämme handelte, so dass sich nur in 10% der untersuchten Kapsel-null-locus-Stämme (cnl) ein zu den hrpA Genen von MC58 homologes Gen nachweisen ließ. Mit der Hypothese, dass auch diese Stämme ein hrpA besitzen, welches sich im C-terimalen Anteil von denen des MC58 unterscheidet wurden in dieser Arbeit Dot Blots durchgeführt, deren Sonde spezifisch für das hrpB NMC0443 war. 97,6% der mit dieser Sonde untersuchten Stämme zeigten die Anwesenheit eines hrpB Homologs. Um die Vermutung zu bestätigen, dass allen hrpB Genen ein zugehöriges hrpA Gen benachbart liegt, wurden repräsentativ PCRs von häufigen klonalen Komplexen durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass ein TPS-System sowohl in den hypervirulenten als auch den nicht-hypervirulenten klonalen Komplexen der Meningokokken vorkommt. Die vielfältigen Funktionen von bereits untersuchten TpsA Proteinen sind zumeist mit der Pathogenität der Bakterien assoziiert. In dieser Arbeit wurde ein möglicher Einfluss der HrpA Proteine auf die Adhäsion der Bakterien an humane Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl eine kapsellose, als auch eine kapsellose, LPS-trunkierte hrpA Deletionsmutante signifikant schlechter an Epithelzellen adhäriert als die parentalen Vergleichsstämme. Ebenso zeigten die analog durchgeführten Infektionsversuche mit der hrpB Deletionsmutante einen Adhärenzverlust, der jedoch nur für die unbekapselte und LPS trunkierte hrpB Deletionsmutante signifikant war. In dieser Arbeit ist es gelungen das HrpB Protein des Stammes 2120 in E. coli zu exprimieren und aufzureinigen, sodass die Entwicklung eines gegen HrpB gerichteten Antikörpers in Auftrag gegeben werden konnte. Mit Hilfe dieses Antikörpers sollen noch offene Fragen zur Synthese und dem Transport des HrpB Transportproteins beantwortet werden. Außerdem können weitere Untersuchungen zur Lage und Verteilung der HrpBs in der Meningokokkenmembran dazu beitragen, weiteren Aufschluss über die Komplexität von Pathogenität und Virulenz von N. meningitidis zu geben.
Staphylococcus aureus reagiert auf veränderte Umweltbedingungen wie Hitze, pH und Chemikalien mit Hilfe globaler Regulatoren wie dem Sae (S. aureus exoprotein expression) Zweikomponenten-System. Subinhibitorische Konzentrationen einiger Antibiotika können die Expression von Virulenzfaktoren erhöhen. In dieser Arbeit wurde die Stressantwort von S. aureus auf subletale Konzentrationen des geläufigen Desinfektionsmittels Perform® untersucht. Dazu wurden biochemische Methoden wie SDS-PAGE und Massen-Spektrometrie sowie molekularbiologische Methoden wie qRT-PCR und Promotoraktivitäts-Assays eingesetzt. Davon abhängige, funktionelle Veränderungen wurden in durchfluss-zytometrischen Invasions-Assays analysiert. Perform wirkt durch die Bildung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS). Das Wachstum von S. aureus in Medien mit subletalen Konzentrationen von Perform verringerte in den Stämmen 6850, COL und ISP479C die Expression mehrerer Proteine, wohingegen im Stamm Newman eine gesteigerte Expression mehrerer Proteine festgestellt werden konnte. In der Literatur werden diese vermehrt exprimierten Proteine als sae-abhängig beschrieben. Der Effekt von Perform konnte durch das im Desinfektionsmittel enthaltene Detergenz SDS nachgeahmt werden, jedoch nicht durch Paraquat oder weitere Detergenzien wie Triton X-100 oder Tween 20. Eine Solubilisierungsreaktion durch die Detergenz-Wirkung konnte ausgeschlossen werden, da der beobachtete Effekt von lebenden Bakterien abhängt. Für Eap (extracellular adherence protein) konnte die deutlichste Steigerung der Proteinexpression festgestellt werden und eine Transkriptionsanalyse bestätigte die gesteigerte Eap-Expression. Die Promotoraktivität des sae Promotors P1 wurde sowohl durch Perform als auch durch SDS verstärkt. Die Anwesenheit von Perform und SDS hatte auch funktionelle Änderungen zur Folge: In durchflusszytometrischen Experimenten erhöhte sich beispielsweise die Invasivität auf das 2,5- bzw. 3,2-fache und die beobachteten Unterschiede konnten durch Lysostaphin Protektions Versuche bestätigt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die gesteigerte Invasivität in Stamm Newman von Eap und dem sae-System abhängig war, während agr, sarA, sigB und FnBPs keinen entscheidenden Einfluss auf die Invasivität hatten. In dieser Arbeit wurde außerdem aufgedeckt, dass die Besonderheit des Stammes Newman durch eine Mutation in saeS (Sensor-Histidinkinase) bedingt war. Obwohl postuliert wird, dass diese Punktmutation ein konstitutiv aktiviertes sae System zur Folge hat, konnte die hohe sae Aktivität durch Perform und SDS jedoch noch weiter gesteigert werden. Durch den Austausch des gesamten sae-Operons konnte gezeigt werden, dass sich der Stamm Newman saeISP479C wie der Stamm ISP479C, und der Stamm ISP479C saeNewman sich analog zu Stamm Newman verhielt. Zusammenfassend kann aus den vorliegenden Ergebnissen geschlussfolgert werden, dass ein Aminosäurenaustausch in der Sensor-Histidinkinase SaeS des Stammes Newman verantwortlich für die gesteigerte Expression von Eap und die daraus resultierende gesteigerte Invasivität nach der Inkubation mit subletalen Konzentrationen von Perform und SDS ist. Diese Daten können dazu beitragen, die Virulenzmechanismen im Stamm Newman, speziell die Rolle des Sae-Systems, aber auch die der generellen Regulation, besser verstehen zu können.
Parodontitis ist eine Erkrankung des Zahnhalteapparates, die durch einen komplexen bakteriellen Biofilm unterhalten wird. Neben Mikroorganismen wie A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, T. denticola und T. forsythensis werden Keime unbekannter Spezies in parodontalen Taschen ausfindig gemacht. Durch die Entschlüsselung von 16S rRNA-Gensequenzen konnte die orale Flora nahezu vollständig katalogisiert werden. Allerdings fehlen bei vielen Phylotypen die entsprechenden Typstämme für weitergehende phänotypische Analysen. Grundlage dieser Arbeit bildeten 59 Patientenisolate der Parodontitis-Stammsammlung des Instituts für Hygiene und Mikrobiologie bei denen partielle 16S rRNA Sequenzen keine Spezieszuordnung ermöglichten. Nahezu vollständige 16S rRNA-Sequenzen wurden erstellt und mit Datenbankeinträgen verglichen. Bei mehr als der Hälfte der Stämme konnte keine taxonomische Zuordnung auf Sequenzierebene getroffen werden. 43 Isolate wuchsen unter aerober Atmosphäre, 16 benötigten eine anaerobe Umgebung. Alle Kulturmorphologien und nach Gram gefärbten mikroskopischen Präparate wurden fotografisch dokumentiert und katalogisiert. Die hier untersuchten Stämme, die zufällig auf der Basis taxonomischer Fragestellungen ausgewählt wurden, waren zum überwiegenden Teil auf Amoxicillin und Metronidazol empfindlich. Diese Antibiotika finden alle ihre Verwendung bei der Parodontitistherapie. Ciprofloxacin, das wegen seiner intrazellulären Wirkung ein interessantes Agens ist, wies v.a. bei Actinomyceten und Streptokokken Wirkungslücken auf. Es bleibt zu diskutieren, ob dieser Umstand nachteilig ist, da auf der einen Seite diese Genera ein orales Reservoir für Gyrasehemmer-Resistenzen ausbilden können, auf der anderen Seite diese grampositiven Keime möglicherweise parodontalprotektiv wirken könnten. In dieser Studie konnte eine Stammsammlung charakterisiert werden, die zukünftig insbesondere angesichts der zu erwartenden Entschlüsselung des oralen Metagenoms für weitere funktionelle Untersuchungen von Interesse sein dürfte.
Die Alveoläre Echinokokkose ist eine bedeutende, gefährliche Parasitose des Menschen. Über die molekularen Grundlagen und Mechanismen der Wirt-Parasit- Interaktion ist bislang nur wenig bekannt. In den letzten Jahren konnten Hinweise erlangt werden, dass Wirt und Parasit über evolutionsgeschichtlich konservierte Signalsysteme kommunizieren. Eines dieser Systeme ist das TGF-b/BMP-Signaltransduktionssystem. TGF-β-Signaltransduktionskomponenten steuern grundlegende Prozesse der Entwicklung und Differenzierung in allen Tieren. Über dieses Signalsystem wird ein weites Spektrum von zellulären Prozessen wie Proliferation, Apoptose und Differenzierung reguliert. Dieses System besteht aus strukturell verwandten Zytokinen der TGF-β (transforming growth factor β) bzw. BMP (bone morphogenetic protein)-Familie, membranständigen Rezeptoren der TGF-β-Rezeptorfamilie (Typ I und Typ II) sowie intrazellulären Signaltransduktoren der Smad-Familie. Bislang konnten verschiedene Echinokokken Smad-Faktoren (EmSmadA, EmSmadB, EmSmadC und EmSmadD) sowie drei Echinokokken Rezeptoren der Typ I Familie (EmRSK1, EmRSK2, EmRSK3) in E. multilocularis identifiziert werden. Ein Mitglied der TGF-β Typ II-Rezeptorfamilie war bislang noch nicht beschrieben. In dieser Arbeit wird ein solches Molekül vorgestellt, EmRSK4 (=TGF-b Typ IISerin/ Threonin Kinase Rezeptor aus Echinococcus multilocularis). Genexpressionsanalysen und immunhistochemische Untersuchungen zeigen an, dass EmRSK4 in der Germinalschicht des E. multilocularis Metacestoden zusammen mit EmRSK1 (=BMP Typ I-Serin/Threonin Kinase Rezeptor) exprimiert wird. Studien an heterolog exprimierten Rezeptoren zeigten, dass EmRSK4 funktionell aktiv ist und mit humanen Typ I-Rezeptoren einen Komplex bilden kann. Diese Studien zeigen auch, dass EmRSK4 mit EmRSK1 einen aktiven heterologen Typ I-/Typ II-Rezeptorkomplex in HEK293-T Zellen bildet, der durch Wirts-BMP2 stimuliert wird und EmSmadB aktiviert. In Untersuchungen mit EmRSK2 (= TGF-β Typ ISerin/ Threonin Kinase Rezeptor) konnte gezeigt werden, dass bei Anwesenheit beider Rezeptoren, EmRSK2 und EmRSK4, eine Phosphorylierung von EmSmadC nachweisbar ist, während eine Phosphorylierung von EmSmadA auch ohne die Anwesenheit von EmRSK4 stattfindet. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass der Inhibitor SB-431452 die Kinaseaktivität von EmRSK2 hemmt. Nach Zugabe von exogenem BMP2 zu Metazestodenvesikel konnten Hinweise erhalten werden, dass ein bislang noch nicht charakterisiertes, zusätzliches EmSmad aktiviert wird. Zusammengenommen lässt die Co-Expression von EmRSK1 mit EmRSK4 in der Germinalschicht, die Bildung eines BMP-responsiven Komplexes aus beiden Rezeptoren und die Phosphorylierung mindestens eines zellulären Faktors nach exogener Zugabe von Wirts-BMP2 zu Metacestodenvesikeln darauf schließen, dass beide Rezeptoren während einer Infektion an der Sensierung von BMP Signalen des Wirts beteiligt sein könnten
Die alveoläre Echinokokkose ist eine, vorrangig in der nördlichen Hemisphäre verbreitete, parasitäre Erkrankung. Verursacht wird sie beim Menschen durch das Larvenstadium des Fuchsbandwurms. Homeoboxgene sind hochkonservierte Gene, die die Morphogenese von Lebewesen steuern. Die Anzahl und die Bedeutung von Homeoboxgenen in der Entwicklung von E.multilocularis waren bislang unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit Hilfe von Sequenzanalysen im Genom des Fuchsbandwurms erstmals Homeoboxgene identifiziert und deren Expressionsmuster mittels PCR in verschiedenen Larvenstadien charakterisiert werden. Von insgesamt 23 gefundenen Homeoboxgenen wurden 15 Gene auf ihre larvenstadienspezifische Expression untersucht. Neun der untersuchten Gene zeigten in dem gewählten Versuchsaufbau eine Expression in den untersuchten Larvenstadien, fünf davon zeigten eine verstärkte Expression in den späten Larvenstadien. Für acht dieser neun Gene ließen sich darüber hinaus Hinweise auf eine Prozessierung ihrer mRNA über den Mechanismus des Trans-Spleißens finden. Vorangehende Versuche der Arbeitsgruppe von Prof. Brehm hatten einen Zusammenhang zwischen einer Stimulation früher Entwicklungsstadien der Parasitenlarven mit dem Zytokin BMP-2 und dessen rascherer Entwicklung in spätere Entwicklungsstadien nahegelegt. Die Auswirkung einer Behandlung früher Entwicklungsstadien mit dem Zytokin BMP-2 auf die jeweilige Genexpression wurde daher für die ausgewählten 15 Gene überprüft. Fünf Gene zeigten unter dessen Einfluss eine verstärkte Expression. Zwei darunter waren solche, die eine stärkere Expression in späten Larvenstadien aufwiesen. Diese zwei Gene stellen nun Kandidaten dar, die an der Entwicklung von E.multilocularis maßgeblich beteiligt sein könnten. Durch die Untersuchungen dieser Arbeit ergaben sich wichtige Hinweise auf die Entwicklung und die Regulationsmechanismen der Genexpression von E. multilocularis. Sie bilden eine Grundlage, die Rolle der Homeoboxgene für den Fuchsbandwurm näher zu beschreiben und die hormonelle Kreuzregulation zwischen Parasit und Wirt weiter zu studieren.
Die Detektion von Umweltsignalen und die gezielte zelluläre Reaktion ist eine zentrale und für das Überleben aller Lebewesen essentielle Fähigkeit. Candida albicans, als dominierender humanpathogener Pilz, ist hochgradig verschiedenen biochemischen und physikalischen Umweltbedingungen ausgesetzt, welche sowohl die Zellmorphologie als auch die Virulenz dieses Erregers beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Kohlendioxid, als ubiquitär vorkommendes Gasmolekül, auf die Zellmorphologie und Virulenz untersucht. Erhöhte Konzentrationen von Kohlendioxid stellen ein äußerst robustes Umweltsignal dar, welches die morphologische Transition vom Hefewachstum zum hyphalen Wachstum, einem Hauptvirulenzfaktor, in Candida albicans stimuliert. In diesem Zusammenhang wurde die Rolle der putativen Carboanhydrase Nce103 durch die Generation von knock – out Mutanten untersucht. Die Disruption von NCE103 in C. albicans führt zu einem Kohlendioxid – abhängigen Phänotyp, welcher Wachstum unter aeroben Bedingungen (ca. 0,033% CO2) nicht zulässt, jedoch unter Bedingungen mit einem erhöhten CO2 Gehalt von ca. 5% ermöglicht. NCE103 ist also für das Wachstum von C. albicans in Wirtsnischen mit aeroben Bedingungen essentiell. Durch Untersuchungen zur Enzymkinetik mittels Stopped – flow wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass Nce103 die Funktion einer Carboanhydrase erfüllt. Die biochemische Funktion dieser Carboanhydrase besteht in der Fixation von CO2 bzw. HCO3ˉ in der Zelle zur Unterhaltung der wesentlichen metabolischen Reaktionen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Induktion hyphalen Wachstums durch CO2 in C. albicans nicht durch den Transport von CO2 mittels des Aquaporins Aqy1 beeinflusst wird. CO2 bzw. HCO3ˉ aktiviert in der Zelle direkt eine Adenylylcyclase (Cdc35), welche sich grundlegend von den bisher gut charakterisierten G-Protein gekoppelten Adenylylcylasen unterscheidet. Die Generation von cAMP beeinflusst in der Folge direkt die Transkription hyphenspezifischer Gene und nachfolgend die morphologische Transition vom Hefewachstum zum elongierten, hyphalen Wachstum. Dieser Mechanismus konnte sowohl in Candida albicans als auch in Cryptococcus neoformans nachgewiesen werden, was auf einen panfungal konservierten Signaltransduktionsmechanismus schliessen lässt. Die Inhibition dieser spezifischen Kaskade eröffnet neue Ansätze zur Entwicklung spezifischer antimykotischer Wirkstoffe.
Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis (AE), a life-threatening disease with limited options of chemotherapeutic treatment. Anti-AE chemotherapy is currently based on a single class of drugs, the benzimidazoles. Although acting parasitocidic in vitro, benzimidazoles are merely parasitostatic during in vivo treatment of AE and cause severe site effects. In the case of operable lesions, the resection of parasite tissue needs to be supported by a prolonged chemotherapy. Thus, the current treatment options for AE are inadequate and require alternatives. In the present work, the flatworm signaling pathways were analyzed to establish potential targets for novel therapeutic approaches. I focused on factors that are involved in development and proliferation of E. multilocularis using molecular, biochemical and cell biological methods. Among the analysed factors were three MAP kinases of the parasite, EmMPK1, an Erk-1/2 orthologue, EmMPK2, a p38 orthologue and EmMPK3, an Erk7/8 orthologue. Further, I identified and characterized EmMKK2, a MEK1/2 orthologue of the parasite, which, together with the known kinases EmRaf and EmMPK1, forms an Erk1/2-like MAPK module. Moreover, I was able to demonstrate several influences of host growth factors such as EGF (epidermal growth factor) and insulin on worm signaling mechanisms and larval growth, including the phosphorylation of Elp, an ezrin-radixin-moesin like protein, EmMPK1, EmMPK3 and increased mitotic activity of Echinococcus cells. In addition, several substances were examined for their efficacy against the parasite including (i) general tyrosine kinase inhibitors (PP2, leflunamide), (ii) compounds designed to inhibit the activity of receptor tyrosine kinases, (iii) anti-neoplastic agents (miltefosine, perifosine), (iv) serine/threonine kinase inhibitors that have been designed to block the Erk1/2 MAPK cascade and (v) inhibitors of p38 MAPKs. In these studies, EmMPK2 proved to be a promising drug target for the following reasons. Amino acid sequence analysis disclosed several differences to human p38 MAPKs, which is likely to be the reason for the observed enhanced basal activity of recombinant EmMPK2 towards myelin basic protein in comparison to human recombinant p38 MAPK-α. In addition, the prominent auto-phosphorylation activity of the recombinant EmMPK2 protein together with the absence of an interaction with the Echinococcus MKKs suggest a different mechanism of regulation compared to the human enzyme. EmMPK2 activity could be effectively inhibited in vitro and in cultivated metacestode vesicles by treatment with SB202190 and ML3403, two ATP-competitive pyridinyl imidazole inhibitors of p38 MAPKs, in a concentration-dependent manner. Moreover, both compounds, in particular ML3403, caused parasite vesicle inactivation at concentrations which did not affect cultured mammalian cells. Likewise, during the cultivation of Echinococcus primary cells, the presence of ML3403 prevented the generation of new vesicles. Targeting members of the EGF signaling pathway, particulary of the Erk1/2-like MAPK cascade, with Raf and MEK inhibitors prevented the phosphorylation of EmMPK1 in metacestodes cultivated in vitro. However, although parasite growth was prevented under these conditions, the structural integrity of the metacestode vesicles maintained during long-term cultivation in the presence of the MAPK cascade inhibitors. Similar results were obtained when studying the effects of other drugs mentioned above. Taken together, several targets could be identified that reacted with high sensitivity to the presence of inhibitory substances, but did not cause the parasite’s death with one exception, the pyridinyl imidazoles. Based on the presented data, I suggest pyridinyl imidazoles as a novel class of anti-Echinococcus drugs and imply EmMPK2 as survival signal mediating factor, the inhibition of which could be used for the treatment of AE.