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- Center for Interdisciplinary Clinical Research, Würzburg University, Würzburg, Germany (1)
- Department of Paediatric Radiology, Institute of Diagnostic and Interventional Radiology, Josef-Schneider-Straße 2, Wuerzburg 97080, Germany (1)
- IZKF Nachwuchsgruppe Geweberegeneration für muskuloskelettale Erkrankungen (1)
- Lehrstuhl für Regeneration Muskuloskelettaler Gewebe (1)
- Muskuloskelettales Centrum Würzburg (MCW) (1)
Introduction
Spindle cell rhabdomyosarcoma of the head and neck is a very rare tumor in adults. We report on one case with long-term survival.
Case presentation
A 41-year-old nonsmoking Caucasian man presented in June 2007 with a painless swelling under his tongue. A diagnosis of a soft tissue sarcoma, and a myofibrosarcoma in particular, was made via biopsy. After multimodal treatment, including local and systemic therapy, our patient remained disease-free until September 2010. The local recurrence was treated unsuccessfully with various chemotherapy regimens. In September 2011, our patient underwent surgical resection again, and a spindle cell rhabdomyosarcoma was diagnosed. To analyze the mismatch between the original diagnosis of a myofibrosarcoma and the second diagnosis, the two specimens were reassessed, and a final diagnosis of a spindle cell rhabdomyosarcoma was made. In 2012 and 2013, our patient suffered further recurrences that were surgically treated, and he is still alive with disease six years and 10 months after the initial diagnosis in June 2007.
Conclusions
In adults, the spindle cell rhabdomyosarcoma tumor is very rare in the head and neck region. In contrast to childhood tumors, spindle cell rhabdomyosarcoma in adulthood is often associated with a poor prognosis. In the present case, the radical surgical treatment might have helped to prolong the patient’s overall survival, which has lasted more than six years. To our knowledge, this is the longest overall survival reported so far for this tumor entity in the head and neck region.
Background
Rhabdomyosarcoma is the most frequent malignant intraorbital tumour in paediatric patients. Differentiation of tumour recurrence or metastases from post-therapeutic signal alteration can be challenging, using standard MR imaging techniques. Diffusion-weighted MRI (DWI) is increasingly considered a helpful supplementary imaging tool for differentiation of orbital masses.
Case presentation
We report on a 15-year-old female adolescent of Caucasian ethnicity who developed isolated bilateral thickening of extraocular eye muscles about two years after successful multimodal treatment of orbital alveolar rhabdomyosarcoma. Intramuscular restricted diffusion was the first diagnostic indicator suggestive of metastatic disease to the eye muscles. DWI subsequently showed signal changes consistent with tumour progression, complete remission under chemoradiotherapy and tumour recurrence.
Conclusions
Restricted diffusivity is a strong early indicator of malignancy in orbital tumours. DWI can be the key to correct diagnosis in unusual tumour manifestations and can provide additional diagnostic information beyond standard MRI and PET/CT. Diffusion-weighted MRI is useful for monitoring therapy response and for detecting tumour recurrence.
Background
Renal cell carcinoma (RCC) is marked by high mortality rate. To date, no robust risk stratification by clinical or molecular prognosticators of cancer-specific survival (CSS) has been established for early stages. Transcriptional profiling of small non-coding RNA gene products (miRNAs) seems promising for prognostic stratification. The expression of miR-21 and miR-126 was analysed in a large cohort of RCC patients; a combined risk score (CRS)-model was constructed based on expression levels of both miRNAs.
Methods
Expression of miR-21 and miR-126 was evaluated by qRT-PCR in tumour and adjacent non-neoplastic tissue in n = 139 clear cell RCC patients. Relation of miR-21 and miR-126 expression with various clinical parameters was assessed. Parameters were analysed by uni- and multivariate COX regression. A factor derived from the z-score resulting from the COX model was determined for both miRs separately and a combined risk score (CRS) was calculated multiplying the relative expression of miR-21 and miR-126 by this factor. The best fitting COX model was selected by relative goodness-of-fit with the Akaike information criterion (AIC).
Results
RCC with and without miR-21 up- and miR-126 downregulation differed significantly in synchronous metastatic status and CSS. Upregulation of miR-21 and downregulation of miR-126 were independently prognostic. A combined risk score (CRS) based on the expression of both miRs showed high sensitivity and specificity in predicting CSS and prediction was independent from any other clinico-pathological parameter. Association of CRS with CSS was successfully validated in a testing cohort containing patients with high and low risk for progressive disease.
Conclusions
A combined expression level of miR-21 and miR-126 accurately predicted CSS in two independent RCC cohorts and seems feasible for clinical application in assessing prognosis.
Background
Suboccipital craniectomy is a conventional approach for exploring cerebellopontine angle lesions. A variety of techniques have been successfully employed to reconstruct a craniectomy. This is the first report about the histological findings after performing a cranioplasty by using a mixture of autologous bone chips and human allogenic fibrin glue.
Case presentation
A 53-year-old German woman underwent left lateral suboccipital retrosigmoidal craniectomy for treatment of trigeminal neuralgia in 2008. Cranioplasty was perfomed by using a mixture of autologous bone chips and human allogenic fibrin glue. Due to recurrent neuralgia, a second left lateral suboccipital craniectomy was performed in 2012. The intraoperative findings revealed a complete ossification of the former craniotomy including widely mature trabecular bone tissue in the histological examination.
Conclusion
A mixture of autologous bone chips and human allogenic fibrin glue seems to provide sufficient bone-regeneration revealed by histological and neuroradiological examinations.
Arterial embolism with lower limb ischemia is a rare manifestation of paraneoplastic hypercoagulability in cancer patients. We report a unique case of fatal thromboembolism involving both circulations associated with a poorly differentiated neuroendocrine tumor of the lung with rapid progress despite high doses of unfractioned heparin and review the current literature on anticoagulative regimen in tumour patients.
Adrenocortical tumors consist of benign adenomas and highly malignant carcinomas with a still incompletely understood pathogenesis. A total of 46 adrenocortical tumors (24 adenomas and 22 carcinomas) were investigated aiming to identify novel genes involved in adrenocortical tumorigenesis. High-resolution single nucleotide polymorphism arrays (Affymetrix) were used to detect copy number alterations (CNAs) and copy neutral losses of heterozygosity (cnLOH). Genomic clustering showed good separation between adenomas and carcinomas, with best partition including only chromosome 5, which was highly amplified in 17/22 malignant tumors. The malignant tumors had more relevant genomic aberrations than benign tumors, such as a higher median number of recurrent CNA (2631 vs 94), CNAs >100 Kb (62.5 vs 7) and CN losses (72.5 vs 5.5), and a higher percentage of samples with cnLOH (91% vs 29%). Within the carcinoma cohort, a precise genetic pattern (i.e. large gains at chr 5, 7, 12, and 19, and losses at chr 1, 2, 13, 17, and 22) was associated with a better prognosis (overall survival: 72.2 vs 35.4 months, P=0.063). Interestingly, >70% of gains frequent in beningn were also present in malignant tumors. Notch signaling was the most frequently involved pathway in both tumor entities. Finally, a CN gain at imprinted “IGF2” locus chr 11p15.5 appeared to be an early alteration in a multi-step tumor progression, followed by the loss of one or two alleles, associated with increased IGF2 expression, only in carcinomas. Our study serves as database for the identification of genes and pathways, such as Notch signaling, which could be involved in the pathogenesis of adrenocortical tumors. Using these data, we postulate an adenoma-carcinoma sequence for these tumors.
Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunkrankheit, welche durch Infiltration autoreaktiver Immunzellen in das Zentrale Nervensystem (ZNS) gekennzeichnet ist. Hierbei gelten insbesondere Th1- und Th17-Zellen als wichtige Mediatoren der ZNS-Entzündungsreaktion. Beide T-Helfer-Zellarten können durch regulatorische T-Zellen (Tregs) in ihrer Funktion supprimiert werden. NFAT(Nuclear Factors of Activated T cells)-Transkriptionsfaktoren werden nach TCR-Antigen-Stimulation induziert und regeln – als pleiotrope Transkriptionsfaktoren – viele funktionelle Prozesse in T-Zellen. Um die Rolle dieser Faktoren bei der Immunpathogenese von MS zu analysieren, wurden unterschiedliche NFAT-defiziente Mausstämme auf den Krankheitsverlauf des Tiermodells Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) hin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl der einzelne Verlust von NFATc1 und NFATc2 in CD4+ T-Zellen als auch das Fehlen einer spezifischen C-terminalen Proteinmodifikation von NFATc1, die SUMOylierung, sich abmildernd auswirkten. Der verminderte klinische Ausgang der EAE beruhte allerdings je nach knock-out auf unterschiedlichen Mechanismen. Im Fall des T-Zell-spezifischen Verlustes von NFATc1 (Nfatc1fl/fl x Cd4cre+ Mäuse), erwies sich die EAE aufgrund einer stark eingeschränkten Aktivierung und Effektorzellentwicklung von CD4+ T-Zellen als vermindert. Dies konnte durch eine reduzierte Produktion an pathogenen Effektorzytokinen, wie IFNγ, IL-17A, GM-CSF sowie IL-22 und weniger an IL-17A+ IFNγ+ Doppelproduzenten im ZNS gezeigt werden. Der Verlust von NFATc2 resultierte in einer starken Th2-Antwort im ZNS von Nfatc2-/- EAE-Mäusen einhergehend mit protektiven IL-4- und IL-10-Produzenten. Interessanterweise konnten auch mehr nicht-pathogene Th17-Zellen nachgewiesen werden. Nfatc1/CΔSUMO CD4+ T-Zellen sezernierten sowohl nach in vitro als auch nach in vivo Stimulation erhöhte Mengen von IL-2. In vitro Kulturen von Th1- und Th17-Zellen wiesen neben dieser erhöhten IL-2-Sekretion eine verminderte Produktion von IFNγ und IL-17A auf. In Übereinstimmung mit diesen in vitro Befunden zeigte sich auch in der EAE ein reduziertes Krankheitsbild mit weniger Th1- und Th17-Zellen, dafür aber eine IL-2-geförderte Erhöhung der Treg-Population. Anhand der Erkenntnis, dass NFAT-Faktoren die (Auto)-Immunreaktion entscheidend beeinflussen, könnte die Inhibition einzelner NFAT-Faktoren ein neues Ziel für eine MS-Therapie darstellen.
Peritonitis is a common disease in man, frequently caused by fungi, such as Candida albicans; however, in seldom cases opportunistic infections with Saccharomyces cerevisiae are described. Resident peritoneal macrophages (prMΦ) are the major group of phagocytic cells in the peritoneum. They express a broad range of surface pattern recognition receptors (PRR) to recognize invaders. Yeast infections are primarily detected by the Dectin-1 receptor, which triggers activation of NFAT and NF-κB pathways.
The transcription of the Nfatc1 gene is directed by the two alternative promoters, inducible P1 and relatively constitutive P2 promoter. While the role of P1-directed NFATc1α-isoforms to promote survival and proliferation of activated lymphocytes is well-established, the relevance of constitutively generated NFATc1β-isoforms, mainly expressed in resting lymphocytes, myeloid and non-lymphoid cells, remains unclear. Moreover, former work at our department indicated different roles for NFATc1α- and NFATc1β-proteins in lymphocytes.
Our data revealed the functional role of NFATc1 in peritoneal resident macrophages. We demonstrated that the expression of NFATc1β is required for a proper immune response of prMΦ during fungal infection-induced acute peritonitis. We identified Ccl2, a major chemokine produced in response to fungal infections by prMΦ, as a novel NFATc1 target gene which is cooperatively regulated through the NFAT- and canonical NF-κB pathways. Consequently, we showed that NFATc1β deficiency in prMΦ results in a decreased infiltration of inflammatory monocytes, leading to a delayed clearance of peritoneal fungal infection.
We could further show that the expression of NFATc1β-isoforms is irrelevant for homeostasis of myeloid and adaptive immune system cells and that NFATc1α- (but not β-) isoforms are required for a normal development of peritoneal B1a cells. In contrast to the situation in myeloid cells, NFATc1β deficiency is compensated by increased expression of NFATc1α-isoforms in lymphoid cells. As a consequence, NFATc1ß is dispensable for activation of the adaptive immune system.
Taken together our results illustrate the redundancy and indispensability of NFATc1-isoforms in the adaptive and innate immune system, indicating a complex regulatory system for Nfatc1 gene expression in different compartments of the immune system and likely beyond that.
Zur Identifizierung geeigneter Routinemarker für die Prognose von Ependymompatienten führten wir immunhistochemische Untersuchungen und statistische Auswertungen an Ependymomen und Daten von 32 Erwachsenen und 23 pädiatrischen Patienten durch. Davon wurden bei drei Tumoren auch Rezidive untersucht, so dass insgesamt 59 Ependymome in die Untersuchung eingeschlossen wurden. Im Einzelnen handelte es sich um 11 myxopapilläre Ependymome, 6 Subependymome, 19 Ependymome und 23 anaplastische Ependymome. Die größten Fallgruppen bildeten pädiatrische Patienten unter drei Jahren und Erwachsene zwischen 50 und 70 Jahren. Bei Kindern war mit 45,8% die infratentorielle, bei Erwachsenen mit 65% die spinale Tumorlokalisation am häufigsten. Die untersuchten spinalen Ependymome entsprachen zu gleichen Teilen myxopapillären Ependymomen WHO Grad I und Ependymomen WHO Grad II. In supratentorieller Lage fanden sich mit 67% überwiegend anaplastische Ependymome WHO Grad III. Auch bei den infratentoriell gelegenen Ependymomen waren mit 63% die Mehrzahl anaplastische Ependymome, daneben fanden sich 29,6% Ependymome WHO Grad II. Beim Vergleich des von uns definierten und bestimmten Ki67-Scores als Zeichen für die Ependymomproliferation und der immunhistochemischen Positivität für HCK fiel nach Anwendung des Chi-Quadrat-Tests mit p=0,067 ein deutlicher Trend zu schwächerer punktförmiger Positivität bei höherem Ki67-Score auf. Dieser Trend setzte sich in der Erwachsenengruppe separat fort, während er in der Kindergruppe allein nicht nachweisbar war. In der Erwachsenengruppe war mit 28% ein deutlicher Anteil myxopapillärer Ependymome vorhanden, welche bei den Kindern nur 8% ausmachten.Möglicherweise spielt die veränderte HCK-Expression in der Subgruppe der myxopapillären Ependymome eine Rolle. Unsere Untersuchungen zeigten außerdem mit p=0,057 einen deutlichen Trend zu längerem Überleben bei immunohistochemischer DBC1-Negativität. Die Multivarianzanalyse mittels Cox-Regression wies eine Positivität für DBC1 als unabhängigen Risikofaktor für eine kürzere Überlebenszeit nach. Des Weiteren konnte eine mit p=0,013 signifikante Korrelation zwischen immunhistochemischer Positivität für DBC1 und höherem Ki67-Score gezeigt werden. Auch mit höherem WHO-Grad korrelierte die DBC1-Positivität mit p=0,009. Besonders infratentoriell gelegene Ependymome zeigten DBC1-Reaktivität. Hier treten bekannterweise häufiger anaplastische Ependymome mit höherem Proliferationsindex auf. Unsere Ergebnisse legen somit die Eignung des Markers DBC1 als immunhistochemische Routineuntersuchung für die Beurteilung der vom Resektionsstatus unabhängigen Prognose und Überlebenszeit von Ependymompatienten nahe.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Expressionshäufigkeiten von MAGE-A-Antigenen, E -Cadherin, Laminin-5-gamma-2, MMP2 und MMP9 in Plattenepithelkarzinomen im Kopf- und Halsbereich untersuchen. Hierbei findet der Vergleich zwischen Primärtumoren und korrespondierenden Lymphknotenmetastasen besondere Beachtung. Um die Hypothese zu verifizieren, dass die o.g. Parameter einen signifikanten Einfluss auf die Progression und Metastasierung haben, wird der Zusammenhang zwischen den in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Ergebnissen und diversen klinischen Parametern mittels Korrelationsanalyse untersucht.
The transcription factor NFATc1 has been shown to regulate the activation and differentiation of T-cells and B-cells, of DCs and megakaryocytes. Dysregulation of NFAT signaling was shown to be associated with the generation of autoimmune diseases, malignant transformation and the development of cancer [71]. The primary goal of this work was to gain insights on Nfatc1 induction and regulation in lymphocytes and to find new direct NFATc1 target genes. Three new BAC -transgenic reporter mouse strains (tgNfatc1/Egfp, tgNfatc1/DE1 and tgNfatc1/DE2) were applied to analyze Nfatc1 induction and regulation in primary murine B- and T-cells. As a result, we were able to show the persistent requirement of immunoreceptor-signaling for constant Nfatc1 induction, particularly, for NFATc1/αA expression. Furthermore, we showed that NF-κB inducing agents, such as LPS, CpG or CD40 receptor engagement, in combination with primary receptor-signals, positively contributed to Nfact1 induction in B-cells [137]. We sought to establish a new system which could help to identify direct NFATc1 target genes by means of ChIP and NGS in genom-wide approaches. We were able to successfully generate a new BAC-transgene encoding a biotinylatable short isoform of NFATc1, which is currently injected into mice oocyte at the TFM in Mainz. In addition, in vivo biotinylatable NFATc1–isoforms were cloned and stably expressed in the murine B-cell lymphoma line WEHI-231. The successful use of these cells stably overexpressing either the short NFATc1/αA or the long NFATc1/βC isoform along with the bacterial BirA biotin ligase was confirmed by intracellular stainings, FACS analysis, confocal microscopy and protein IP. By NGS, we detected 2185 genes which are specifically controlled by NFATc1/αA, and 1306 genes which are exclusively controlled by NFATc1/βC. This shows that the Nfatc1 locus encodes “two genes” which exhibit alternate, in part opposite functions. Studies on the induction of apoptosis and cell-death revealed opposed roles for the highly inducible short isoform NFATc1/αA and the constantly expressed long isoform NFATc1/βC. These findings were confirmed by whole transcriptome-sequencing performed with cells overexpressing NFATc1/αA and NFATc1/βC. Several thousand genes were found to be significantly altered in their expression profile, preferentially genes involved in apoptosis and PCD for NFATc1/βC or genes involved in transcriptional regulation and cell-cycle processes for NFATc1/αA. In addition we were able to perform ChIP-seq for NFATc1/αA and NFATc1/βC in an ab-independent approach. We found potential new target-sites, but further studies will have to address this ambitious goal in the future. In individual ChIP assays, we showed direct binding of NFATc1/αA and NFATc1/βC to the Prdm1 and Aicda promoter regions which are individually controlled by the NFATc1 isoforms.
In Lymphozyten wird nach Antigenaktivierung die Expression des Nfatc1-Gens durch Aktivierung des P1-Promoters stark induziert. Dagegen ist die, durch den Promoter P2 vermittelte Expression ebenso wie die der anderen NFAT Faktoren c2 und c3 konstitutiv. Die Akkumulation der dabei gebildeten Isoform NFATc1/αA ist sowohl für Effektorfunktionen wie die Zytokinproduktion sowie die Proliferation und das Überleben der aktivierten Zellen wichtig (Chuvpilo et al., 2002). Um die Expression des Nfatc1-Gens auf Einzelzellebene messen zu können, wurden BAC (bacterial artificial chromosom) transgene Mauslinien generiert, die einen 210kb großen Bereich des Nfatc1-Gens der Maus enthalten. In diesen Lokus wurde ein eGFP-Reportergen innerhalb des allen Isoformen gemeinsamen, dritten Exons integriert. In dieser Arbeit wird durch semiquantitative RT-PCR-Experimente von Gesamt-Milzzellen und TLymphozyten gezeigt, dass in den B6/NFATc1-eGFP-BAC-Reportermäusen die Expression der eGFP-cDNA analog zum endogenen Nfatc1-Lokus der Kontrolle der beiden Promotoren P1 und P2 unterliegt. In Western Blot Experimenten wird in diesen Zellen mittels eines NFATc1α-spezifischen Antikörpers eine induzierbare und CsA-sensitive α-GFP-Isoform - vergleichbar mit der endogenen NFATc1α-Isoform - nachgewiesen. Gleichzeitig zeigen NFATc1-Antikörper das konstitutiv exprimierte GFPβ-Protein. Die Korrelation der Expression von NFATc1 und GFP auf mRNA- und Proteinebene machen in B6/NFATc1-eGFP-BAC-Reportermäusen das GFP-Protein somit zu einem sensitiven und spezifischen Marker der NFATc1-Aktivität. In FACS-Analysen gibt der Anstieg der GFP-Fluoreszenzintensität bei Stimulation von Gesamt- Milzzellen bzw. T-Lymphozyten um bis auf das Dreifache die Induktion von NFATc1 wider. Unter dem Einfluss von CsA verbleibt die GFPFluoreszenzintensität auf dem Niveau unstimulierter Zellen. Die GFPFluoreszenz korreliert darüber hinaus bei Primärstimulation mit der Expression des IL-2-Gens, dessen Promotor mit 5 NFAT-Bindestellen den Prototyp eines NFATc1-Targets darstellt (Serfling et al., 1989). Die Analyse der Koexpression von NFATc1 und GFP mittels Fluoreszenzmikroskopie zeigt in allen stimulierten, GFP-positiven CD4+-Lymphozyten die nukleäre Lokalisation von 75 NFATc1, vor allem von NFATc1α. Die Analyse des GFP-Phänotyps in alloreaktiven T-Zellen zeigt bei Abstoßungsreaktionen in vitro („Mixed Lymphocyte Reactions“) eine selektive Zunahme der Fluoreszenz dieser Zellen um bis auf das Vierfache, was die Rolle von NFATc1 für die Effektorfunktion aktivierter T-Lymphozyten verdeutlicht. GFP und das endogene NFATc1 werden bei Stimulation konventioneller T-Zellen (Tcons, CD4+CD25-FoxP3-) stark exprimiert, während natürliche regulatorische T-Zellen (nTregs, CD4+CD25+FoxP3+) konstant geringe NFATc1- und GFP-Konzentrationen zeigen. In induzierten regulatorischen T-Lymphozyten (iTregs) supprimiert TGF- β konzentrationsabhängig die GFP-Fluoreszenz bis auf das Niveau unstimulierter Lymphozyten. Während in nTregs die Suppression des Nfatc1- Gens im wesentlichen durch FoxP3 erfolgt (Torgerson et al., 2009), scheint dies in iTregs vor allem über den TGF-β Signalweg vermittelt zu werden. Die Analyse der GFP-Expression in den verschiedenen Stadien der TZellentwicklung zeigt weiterhin deutliche Unterschiede in der Aktivität des Nfatc1-Gens. Dies wird durch die starke Aktivität des BAC-Genlokus in CD4- CD8- DN Thymozyten, welche eine sechsfach höhere GFP-Expression aufweisen als CD4+CD8+ DP Zellen, deutlich.
Natalizumab is a recombinant monoclonal antibody raised against integrin alpha-4 (CD49d). It is approved for the treatment of patients with multiple sclerosis (MS), a chronic inflammatory autoimmune disease of the CNS. While having shown high therapeutic efficacy, treatment by natalizumab has been linked to progressive multifocal leukoencephalopathy (PML) as a serious adverse effect. Furthermore, drug cessation sometimes induces rebound disease activity of unknown etiology. Here we investigated whether binding of this adhesion-blocking antibody to T lymphocytes could modulate their phenotype by direct induction of intracellular signaling events. Primary CD4+ T lymphocytes either from healthy donors and treated with natalizumab in vitro or from MS patients receiving their very first dose of natalizumab were analyzed. Natalizumab induced a mild upregulation of IL-2, IFN-c and IL-17 expression in activated primary human CD4+ T cells propagated ex vivo from healthy donors, consistent with a pro-inflammatory costimulatory effect on lymphokine expression. Along with this, natalizumab binding triggered rapid MAPK/ERK phosphorylation. Furthermore, it decreased CD49d surface expression on effector cells within a few hours. Sustained CD49d downregulation could be attributed to integrin internalization and degradation. Importantly, also CD4+ T cells from some MS patients receiving their very first dose of natalizumab produced more IL-2, IFN-c and IL-17 already 24 h after infusion. Together these data indicate that in addition to its adhesion-blocking mode of action natalizumab possesses mild direct signaling capacities, which can support a pro-inflammatory phenotype of peripheral blood T lymphocytes. This might explain why a rebound of disease activity or IRIS is observed in some MS patients after natalizumab cessation.
In effector T and B cells immune receptor signals induce within minutes a rise of intracellular Ca++, the activation of the phosphatase calcineurin and the translocation of NFAT transcription factors from cytosol to nucleus. In addition to this first wave of NFAT activation, in a second step the occurrence of NFATc1/αA, a short isoform of NFATc1, is strongly induced. Upon primary stimulation of lymphocytes the induction of NFATc1/αA takes place during the G1 phase of cell cycle. Due to an auto-regulatory feedback circuit high levels of NFATc1/αA are kept constant during persistent immune receptor stimulation. Contrary to NFATc2 and further NFATc proteins which dampen lymphocyte proliferation, induce anergy and enhance activation induced cell death (AICD), NFATc1/αA supports antigenmediated proliferation and protects lymphocytes against rapid AICD. Whereas high concentrations of NFATc1/αA can also lead to apoptosis, in collaboration with NF-κB-inducing co-stimulatory signals they support the survival of mature lymphocytes in late phases after their activation. However, if dysregulated, NFATc1/αA appears to contribute to lymphoma genesis and – as we assume – to further disorders of the lymphoid system. While the molecular details of NFATc1/αA action and its contribution to lymphoid disorders have to be investigated, NFATc1/αA differs in its generation and function markedly from all the other NFAT proteins which are expressed in lymphoid cells. Therefore, it represents a prime target for causal therapies of immune disorders in future.
Die Unterscheidung zwischen körpereigenen und körperfremden Strukturen ist eine grundlegende Herausforderung der spezifischen Immunantwort. Pathologische Veränderungen dieser Abgrenzung können zu schwerwiegenden Autoimmunerkrankungen wie beispielsweise Diabetes Mellitus, Rheumatischer Arthritis oder Multipler Sklerose führen. Um unerwünschte (Auto-) Immunreaktionen zu verhindern, existieren verschiedene Formen von peripheren Toleranzmechanismen, die durch viele Transkriptionsfaktoren wie z. B. ICER (inducible cAMP early repressor), NFAT (nuclear factor of activated T cells) und Foxp3 (forkhead box protein p3) kontrolliert werden. Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Tregs) sind spezialisierte immun-suppressive Lymphozyten, welche die Aktivierung anderer Immunzellen unterdrücken können. Einer der möglichen Mechanismen ist der Transfer zyklischen Adenosin-Monophosphats (cAMP) von Tregs in konventionelle T- und B-Lymphozyten. Die erhöhte intrazelluläre Konzentration an cAMP führt in Effektorzellen zur Induktion und Kerntranslokation von ICER. Der transkriptionelle Repressor ICER supprimiert die Expression vieler NFAT-regulierter Gene und hemmt darüber hinaus die Induktion der NFATc1/αA-Isoform selbst. Diese Isoform wird speziell in pro-inflammatorischen Effektorzellen hochreguliert und ist maßgeblich an deren spezifischem transkriptionellen Programm beteiligt. Foxp3 ist ein zentraler Faktor für die Bildung und Funktion sowohl Thymus-generierter nTregs als auch peripher (TGFβ-) induzierter iTregs. Die Kontrolle des Foxp3-Gens wird in iTregs – überraschenderweise aber nicht in nTregs – durch NFAT-Faktoren reguliert. Allerdings hemmt Foxp3 durch eine negative Rückkopplung wiederum die Induktion und Aktivität von NFATc1/αA. Dies stellt somit ein weiteres Regulativ dar, wobei Foxp3 nicht nur die Plastizität, sondern auch die Funktion von immun-suppressiven T-Zellen steuert. Zusätzlich regulieren die verschiedenen NFAT-Faktoren auch die Antigen präsentierenden dendritischen Zellen (DCs). Während NFATc1 und NFATc2 die Differenzierung und Proliferation von DCs beeinflussen, reguliert NFATc3 deren Zytokinexpression und steuert indirekt auch die nachfolgende T-Zell-Immunantwort. Die Kontrolle der Genregulation in Immunzellen durch die Transkriptionsfaktoren ICER, NFAT und Foxp3 erfüllt somit spezifische Funktionen der Immunität, reguliert aber gleichzeitig wichtige Aspekte der peripheren Toleranz, um schädliche (Auto-) Immunreaktionen zu verhindern.
Der menschliche Organismus ist zeitlebens von malignen Neoplasien bedroht, die durch lokales oder metastasiertes Wachstum lebensnotwendige Funktionen des Körpers beeinträchtigen können. Als wichtigstes Werkzeug zur Abwehr dieser Neoplasien wurde in den letzten Jahrzehnten die natürliche Immunität aufgedeckt. Besonders die Antikörper der innaten Immunität spielen eine entscheidende Rolle. BARB-4 ist ein humaner, tumorspezifischer Antikörper und Teil dieser natürlichen Immunität. Er wurde mit Hilfe der Hybridomatechnologie aus einem Patienten mit Siegelringkarzinom des Magens isoliert, und ist einer der wenigen Vertreter innater humaner IgG Antikörper. Diese Arbeit gibt einen ersten Überblick über die Bindungsspezifität und die funktionellen Eigenschaften des BARB-4-Antikörpers. In den immunhistochemischen Färbungen konnte die Tumorspezifität des Antikörpers nachgewiesen werden. Bei dem zugehörigen Antigen handelt es sich um eine Variante des TAF15, einem Protein der FET-Familie, die intrazelluläre Aufgaben bei Transkriptionsvorgängen haben, bei denen zudem aber auch eine Beteiligung an Adhäsions- und Migrationsvorgängen vermutet wird. Diese Variante ist bei malignen Zellen an der Oberfläche lokalisiert, was die Ergebnisse der Durchflußzytometrie belegen. Durch konfokale Mikroskopie mit Fluoreszenz-markiertem BARB-4 konnte diese Oberflächenbindung an Tumorzellen bestätigt werden. Im weiteren zeitlichen Verlauf konzentrierte sich der Antikörper im Zellinneren. Die Präsenz des Antikörpers führte bei Versuchen mit Tumorzellen zu einer bemerkenswerten Hemmung der Adhäsions- und Migrationsfähigkeit der Zellen. Beide stellen Schlüsseleigenschaften für die Metastasierung von Tumorzellen dar. Diese Eigenschaften könnten BARB-4 für einen möglichen, therapeutischen Einsatz zur Prävention von Tumormetastasen qualifizieren.
Zervikale Lymphknoten stellen einen typischen Manifestationsort des klassischen Hodgkin-Lymphoms dar. Eine primäre extranodale Manifestation dieses Tumors wird in der Mehrheit der wissenschaftlichen Berichte als selten angesehen. Diese Dissertation hatte zum Ziel, möglichst viele Fälle mit dem speziellen Krankheitsbild eines klassischen Hodgkin-Lymphoms mit primär extranodaler Manifestation im Kopf-Hals-Bereich zu analysieren. Anhand der ermittelten Ergebnisse sollten Antworten auf bislang offene Fragestellungen gegeben werden. In der ersten Datenerhebungsphase wurde eine umfangreiche Analyse der bislang zu dieser Thematik veröffentlichten deutsch- und englischsprachigen Fachliteratur durchgeführt. Aus den Jahren 1924 bis 2010 konnten 103 einzeln aufgelistete Patienten ermittelt werden. Diese geeigneten Fallberichte wurden mit allen verfügbaren Einzelheiten zu histologischen, epidemiologischen und klinischen Befunden tabellarisch dokumentiert. In der zweiten Phase der Datenerhebung wurde am Lymphknotenreferenzzentrum des pathologischen Institutes der Julius-Maximilians-Universität Würzburg ein eigenes Patientenkollektiv ermittelt. Von 1999 bis zum Jahr 2008 konnten 21 Patienten analysiert werden. Auch dieses Kollektiv wurde auf histologische, epidemiologische und klinische Parameter untersucht. Die herausgearbeiteten Ergebnisse der 124 Patienten wurden in allen Einzelheiten diskutiert und die eingangs aufgestellten Fragestellungen abschließend beantwortet.
Knochensialoprotein (BSP) ist ein Protein der extrazellulären Matrix im Knochen und mineralisierten Geweben, wird aber auch von verschiedenen Tumorzellen exprimiert (Bellahcene et al., 1994, 1997, 1998). Dies ist assoziiert mit einer schlechten Prognose und einem erhöhten Risiko für eine spätere Entwicklung von Knochenmetastasen. Diel et al. (1999) konnte zeigen, dass ein erhöhter Serum-BSP-Wert bei Patientinnen mit Mammakarzinom zu einem gehäuften Auftreten von Knochenmetastasen im Laufe der Erkrankung führt. BSP scheint ein Marker für die Entstehung von Knochenmetastasen zu sein. In der Literatur ist ein Antikörper beschrieben, der ein Epitop des BSP erkennt, welches im BSP aus Tumorzellen nicht glykosyliert ist, im BSP aus mineralisiertem Gewebe allerdings schon (Armbruster et al., 2009). Im Tiermodell konnte gezeigt werden, dass Knochenmetastasen verhindert werden können bei gleichzeitiger Gabe von Tumorzellen und Antikörpern gegen BSP beziehungsweise, dass bei vorhandenen Knochenmetastasen eine Behandlung der Tiere mit einem Anti-BSP-Antikörper die Metastasen zurückbildet (Bäuerle et al., 2005, 2006). In der aktuellen Arbeit wird die Expression von BSP an menschlichem Gewebe von Knochenmetastasen mit unterschiedlichen Primärtumoren mittels Immunhistochemie untersucht. Insgesamt wurden 35 Fälle von Knochenmetastasen mit Primärtumor eines Mammakarzinoms untersucht, wobei 22,9% eine BSP Expression aufweisen, davon 5,7% eine starke. Knochenmetastasen mit dem Primärtumor Prostatakarzinom sind mit 8 Fällen repräsentiert, wobei 75% positiv für BSP sind, davon 25% stark positiv. Die einzelnen Fälle zeigen eine starke BSP Expression im Stroma und eine schwache BSP Expression der Tumorzellen. Diese Ergebnisse des Antikörpers gegen normal glykosyliertes BSP wurden verglichen mit dem Antikörper gegen nicht glykosyliertes BSP. Der Nachweis von BSP in Tumorzellen zeigt dasselbe Ergebnis, BSP im Stroma wird durch den Antikörper gegen nicht- glykosyliertes BSP intensiver dargestellt. Daraus lässt sich folgern, dass der Antikörper gegen nicht- glykosyliertes BSP nicht spezifisch für die Isoform des BSP aus Tumorzellen ist, sondern gleichermaßen in der Routinediagnostik von BSP eingesetzt werden kann. Die Untersuchung könnte sogar darauf hinweisen, dass dieser Antikörper die nicht- glykosylierte Isoform im Stroma erkennt und damit bei Untersuchung des Stromas die bessere Alternative darstellt.
Die vorliegende Arbeit entstand durch die Notwendigkeit, den Histopathologiekurs der Zahnmedizinstudierenden an der Universität Würzburg u.a. wegen verbrauchter Präparate neu zu konzipieren. Nach der Anschaffung eines Präparatescanners lag es nahe, zeitgemäße multimediale Lernmethoden und virtuelle Mikroskopie in den Studierendenkurs einzuführen. Nun gibt es ein Online-Projekt, in welchem kursbegleitend virtuell mikroskopiert werden kann. Ein solches Projekt existierte vorher, speziell den Bedürfnissen der Würzburger Zahnmedizin-Studierenden angepasst, nicht und stellt daher eine Innovation dar. Im Falle des Würzburger Histopathologiekurses wurden erst vorhandene Online-Projekte anderer Universitäten miteinander verglichen und besonders positive Aspekte herausgearbeitet. Diese sollten in das eigene Projekt übernommen werden. Unter Berücksichtigung studentischer Wünsche wurden daraufhin neu zusammengestellte Präparate eingescannt und auf eine Onlineplattform gestellt. In der retrospektiven Evaluation hielten die Studierenden das Angebot einer virtuellen Mikroskopiermöglichkeit für eine ausgezeichnete und ausbaufähige Lernergänzung und sind bereit, diese kursbegleitend zu nutzen. Die virtuelle Mikroskopie stellt das ideale Werkzeug für multimediale Lernangebote in der medizinischen Hochschulausbildung im Fach Pathologie dar.
Viele humane Sarkome sind durch spezifische chromosomale Translokationen oder typische genetische Amplifikationen definiert, welche in der Differentialdiagnostik insbesondere in Fällen, bei denen klinische Daten, Morphologie und Immunhistochemie alleine nicht ausreichend wegweisend sind. Die Formalin-fixiertem Paraffin-eingebetteten (FFPE-) Gewebe von 15 Ewing-Sarkomen, 4 Klarzellsarkomen, 9 Synovialsarkomen, 4 alveolären und 7 embryonalen Rhabdomyosarkomen und 25 Liposarkomen verschiedenen Subtyps wurden mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) untersucht um ein Sarkom-spezifisches FISH-Sondenset zur Detektion spezifischer chromosomaler Aberrationen in der Routinediagnostik zu etablieren. Es konnte gezeigt werden, dass die FISH in diesem Aufgabenfeld im Vergleich zur PCR ebenfalls eine hoch effiziente zytogenetische Methode mit hoher Spezifität und hohen positiven Vorhersagewerten mit dem Vorteil der unproblematischen Anwendung an FFPE-Geweben ist. Zur Detektion des Isochromosom 12p , i(12p), als Beispiel für komplexere chromosmale Aberrationen, wurden 7 FFPE-Gewebe aus Keimzelltumoren mit 12p- und 12q-detektierenden FISH-Sonden hybridisiert. Die Detektion des i(12p) konnte im Rahmen dieser Arbeit mittels FISH nicht erreicht werden. Zusammenfassend ist die FISH eine hoch effiziente zytogenetische Methode zur Detektion spezifischer chromosomaler Aberrationen in FFPE-Geweben aus humanen Sarkomen mit hoher Eignung zur Anwendung in der Routinediagnostik.
Ziel dieser Arbeit war es, die telepathologische Zusammenarbeit mit einem Krankenhaus eines medizinisch unterentwickelten Landes zu überprüfen und zu bewerten. Für die Untersuchungen wurden die Daten von 545 Patienten aus Peramiho/Tansania übermittelten Fälle analysiert. Dabei wurden die telepathologisch erstellten Diagnosen anhand der nachträglich nach Würzburg übersandten Paraffinblöckchen der Gewebeproben und dort erfolgten Nachbegutachtung nach deutschen Standards überprüft. Die Ergebnisse zeigten, dass der Einsatz telepathologischer Techniken für die Unterstützung unterentwickelter Länder geeignet ist und die Qualität der medizinischen Versorgung langfristig verbessert.
SUMMARY GABP is a heterodymeric member of Ets-family transcription factors. It consists of two subunits – GABPa which contains DNA binding domain and GABPb, which provides transcriptional activation domain and nuclear localization signal. GABPa/b complex is essential for transcriptional activation of multiple lineage-restricted and housekeeping genes, several viral genes, and in some cases might function as transcriptional repressor. Large variety of data indicates involvement of GABP in the complex regulation of cell growth, specified by quiescence, stimulation/proliferation, apoptosis and senescence. Expression level of GABPa subunit is rapidly increased when resting cells enter S-phase, and GABPa/b complex is critical to promote the continuity of the cell cycle. Conditional inactivation of GABPa expression in mouse embryonic fibroblasts results in a complete block of proliferation and acquisition of senescence-like phenotype. However, the influence of GABP on the other cell growth determinant – the apoptosis – remains largely obscure. Therefore we aimed to investigate the influence of GABPa/b expression level on the cell growth in vitro. Using siRNA approach we achieved efficient but only transient down-regulation of GABPa expression which precluded further cell growth studies. Persistent increase of the expression of GABPb subunit only resulted in a positive effect on the cell growth speed. Simultaneous conditional overexpression of both GABPa and GABPb subunits though, strongly reduced the growth of the affected cell cultures in reversible and in expression level dependent manner. Interestingly, GABPa/b overexpressing cells did show neither cell cycle arrest nor massive induction of apoptosis. However, more detailed analyses revealed that dampened apoptotic processes were taking place in GABPa/b−overexpressing cells, starting with a prominent activation of caspase-12. Interestingly, activation of downstream effector caspases was rather suppressed explaining a weak increase of apoptotic cells in GABPa/b overexpressing cultures. This effect suggests that the activation of caspase-12 by elevated amounts of exogenous GABPa/b reflects the normal physiological mechanism of caspase-12 regulation.
Orale Plattenepithelkarzinome entwickeln sich häufig aus Präkanzerosen. Trotz der Frühdiagnostik ist es für den Kliniker und den Pathologen meist schwierig eine Präkanzerose, die zur Entartung neigt, rechtzeitig als solche zu erkennen. MAGE-A-Antigene sind Tumorantigene, die nur in malignen Zellen vorkommen. Diese Antigene können dazu dienen, Karzinome früher als solche zu erkennen. Das Ziel dieser Studie war, diese Hypothese zu bestätigen, indem gutartige, präkanzeröse und karzinomatöse Veränderung untersucht wurden. Dazu wurden retrospektiv Biopsien der oralen Schleimhaut (orale Ulzera, Epulitiden, follikuläre Zysten, Lichen planus, Leukolakien, epitheliale Dysplasien und Carcinomata in situ) untersucht. Diese wurden immunhistochemisch mit dem polyklonalen Antikörper MAGE-A 57B angefärbt. Dabei stellte sich heraus, dass MAGE-A-Antigene nicht in gutartigen Veränderungen vorkommen, jedoch zu 33-65% in präkanzerösen und malignen Läsionen. Ein weiteres Ziel umfasste die Untersuchung der kritischen Randbereiche. Hier wurde bei den positv gefärbten Präparaten eine eindeutige Grenze zwischen benigner und maligner Schleimhaut durch die Anfärbung mit mAb-57B sichtbar.
Natalizumab ist ein monoklonaler gegen alpha 4-Integrine (CD49d) gerichteter Antikörper, der zur Therapie der schubförmigen Multiplen Sklerose zugelassen ist. Sein Hauptwirkmechanismus beruht auf einer Blockade von VLA-4 (CD49d/CD29) auf Leukozyten, deren Extravasation an der Blut-Hirn-Schranke hierdurch gehemmt wird. Gemäß seiner Konzeption sollte Natalizumab neben seiner blockierenden Eigenschaft keinen weiteren Einfluss auf seine Zielzellen ausüben. Der hohen therapeutischen Effektivität stehen jedoch Begleiterscheinungen gegenüber, die auf direkte oder indirekte immunmodulatorische Kapazitäten von Natalizumab hindeuten. In verschiedenen Studien konnten VLA-4, sowohl durch Antikörper- als auch durch Liganden-vermittelte Aktivierung, Eigenschaften als kostimulatorisches Molekül humaner T-Zellen zugewiesen werden. Ob der Antikörper Natalizumab auf VLA-4 rein blockierend wirkt oder ob er (ko-)stimulatorische Signale in T-Zellen induziert, ist bis heute unbekannt. Vor diesem Hintergrund wurden RNA-Expressionsanalysen von humanen CD4+ T Zellen mittels Microarrays durchgeführt. Tatsächlich konnte eine erhöhte Expression der Gene IL2 und IFNG sowie der Th17-Effektorzytokine IL17A, IL17F und IL21 durch Anwesenheit von Natalizumab festgestellt werden. Ebenfalls wurde eine gesteigerte Genexpression der Transkriptionsfaktoren FOXP3, TBX21 und RORC beobachtet. Die erhöhte Genexpression von IL2, FOXP3, TBX21 und RORC wurde mittels qRT-PCR validiert. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden verschiedene Effektorzytokine durchflusszytometrisch untersucht. Hierbei zeigten neben IL2 die Interleukine IL17 und IFNγ eine erhöhte Syntheserate unter dem Einfluss des therapeutischen Antikörpers. Die Allgemeingültigkeit des kostimulatorischen Effekts wurde anhand der Fähigkeit von Natalizumab verschiedene T-Zellstimuli zu verstärken verdeutlicht. Die Ergebnisse belegen eine direkte Korrelation zwischen der Anwesenheit von Natalizumab und der Ausbildung proinflammatorischer IL2+, IL17+ und IFNγ+CD4+ T-Zellen in vitro und deuten u.a. auf eine verstärkte Polarisierung naïver CD4+ T-Zellen in Richtung Th1- und Th17-Zellen hin. Übereinstimmend mit direkten immunmodulatorischen Eigenschaften über Bindung und Aktivierung von VLA-4 resultierte die Anwesenheit von Natalizumab nicht nur bei Jurkat-Zellen sondern auch in primären humanen CD4+ T-Zellen in einer erhöhten ERK-Phosphorylierung. Weiterhin konnte ein direkter Zusammenhang zwischen der Gabe des Therapeutikums und der CD49d-Reduktion auf humanen CD4+ Effektorzellen bzw. CD4+ Gedächtnis-T-Zellen in vitro hergestellt werden. Dieses Resultat erhärtet den Verdacht, dass es sich bei dem Verlust an VLA-4 auf verschiedenen Leukozytenpopulationen, der bereits in mehreren Studien in vivo beobachtet werden konnte, um eine direkte Auswirkung von Natalizumab handelt. Die in vitro an isolierten T-Zellen von gesunden Spendern gewonnenen Resultate konnten anhand von Zellen aus MS-Patienten reproduziert werden. Bereits 24h nach Natalizumab-Erstgabe wurde sowohl eine deutliche Reduktion an CD49d als auch eine erhöhte IL2-, IL17-, IFNγ- und IL12/IL23p40-Sekretion nachgewiesen. Das unterstreicht die klinische Relevanz dieser Ergebnisse und lässt vermuten, dass Natalizumab neben der Hemmung der Leukozyten-Transmigration ins ZNS Signal-gebende Eigenschaften besitzt, die zu ungewünschten Nebenwirkungen führen können.
Bei vielen Karzinomen spielt EGFR und das KRAS-Onkogen eine wichtige Rolle in der Tumorentstehung. Da bei den seltenen Karzinomen an Kopfspeicheldrüsen sehr wenig über molekulare Mechanismen der Tumorgenese bekannt ist, war es das Ziel der Arbeit den EGFR-Signalweg zu untersuchen. Es wurden Paraffinschnitte von 43 Speicheldrüsenkarzinomen von den Typen ACC, MEC und Adeno-Ca NOS mit dem phosphorylierten EGFR-Antikörper gefärbt und mit klinisch-pathologischen Daten korreliert. Weiterhin wurde eine Mutationsanalyse der kras-Gensequenz durchgeführt. In allen Fällen war das kras-Gen vom Wildtyp. Bei der Expressionsanalyse von EGFR stellte sich heraus, dass 79% der Proben einen aktivierten EGF-Rezeptor besitzen. Statistisch signifikante Korrelationen gab es zwischen der EGFR-Expression und dem Patientenalter, dem zervikalen Lymphknotenbefall und der Tumorgröße. Der EGF-Signaltransduktionsweg ist bei den untersuchten Karzinomen der Kopfspeicheldrüsen im überwiegenden Masse aktiviert, ohne dass eine autonome Aktivierung beim KRAS-Onkogen vorliegt.
Das Follikuläre Lymphom (FL) ist nach dem Diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom (DLBCL) das häufigste Non-Hodgkin-Lymphom in der westlichen Welt. Die aktuelle WHO-Klassifikation für Tumoren der Hämatopoetischen und Lymphoiden Gewebe aus dem Jahr 2008 unterteilt dieses maligne Lymphom nach Histologie und Wachstumsmuster in vier Gruppen, FL 1 bis FL 3A und FL 3B. Obwohl die FL 1 und FL 2 zu den indolenten Tumoren gezählt werden, und FL 3A und FL 3B tendenziell eher als aggressiv gelten, so wurde in einigen Studienarbeiten gezeigt, dass das FL 3A aufgrund seiner immunhistologischen und genetischen Charakteristika, insbesondere dem Vorhandensein der BCL2/IGH t(14;18)(q32;q21) Translokation, eher den low-grade-Lymphomen (FL 1 und FL 2) nahe steht, während das FL 3B durchaus Eigenschaften des DLBCL, wie das Fehlen einer BCL2/IGH-Translokation und das vermehrte Auftreten von Aberrationen des BCL6-Gens, zeigt. In verschiedenen Arbeiten wurde des Weiteren eine Einteilung in reine FL 3B und FL 3B mit Anteilen eines DLBCL (+ DLBCL) vorgenommen, da sich auch diese beiden Subgruppen durch unterschiedliche Proteinexpression und genetische Eigenschaften auszeichnen würden. Laut den bislang in der Literatur vorliegenden (spärlichen) Daten zeigen FL 3A und FL 3B unterschiedliche Antigen-Profile und offenbar auch unterschiedliche (primäre) genetische Veränderungen, wobei gerade für das FL 3B nur wenige Daten vorliegen. Während Grad 3A-Tumoren einige Ähnlichkeiten zu den FL 1 und 2 zeigen, scheint das FL 3B im Immunphänotyp wie in der Genetik eher dem DLBCL zu ähneln. Allerdings lässt sich bei kritischer Durchsicht der Literatur erkennen, dass die meisten Fälle eines FL Grad 3 entweder gar nicht den Graden 3A oder 3B zugeordnet, beziehungsweise in diese unterschieden wurden, oder häufig bereits einen zusätzlichen diffusen Wachstumstyp aufweisen, nach den Regeln der WHO-Klassifikation für Tumoren der Hämatopoetischen und Lymphatischen Gewebe (2008) also als DLBCL mit einem zusätzlichen follikulären Wachstumsanteil klassifiziert würden. Somit sind die Daten insbesondere über die rein follikulär wachsenden FL 3B äußerst spärlich. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der immunhistochemischen und genetischen Charakterisierung der FL 3B. Von besonderem Interesse war die Bestimmung der Häufigkeit der BCL2/IGH t(14;18)(q32;q21), BCL6/IGH t(3;14)(q27;q32) und MYC/IGH t(8;14)(q24;q32) Translokationen in den verschiedenen Typen der FL. Weiterhin sollte der Frage nachgegangen werden, ob die Anwendung der Tissue Microarray (TMA)-Technik und der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) an TMAs robuste Daten zu dieser Fragestellung liefern kann. In einem ersten Schritt wurden vorhandene TMAs von FL, DLBCL und MALT-Lymphomen mit break-apart-Sonden für BCL2, BCL6, MYC und IGH hybridisiert, und die gewonnenen Ergebnisse mit Daten der konventionellen Zytogenetik abgeglichen. Hierdurch sollte nachgewiesen werden, dass die FISH in Kombination mit der TMA-Technik eine valide Testmethode zur Aufdeckung der gesuchten chromosomalen Aberrationen darstellt, die in Sensitivität und Spezifität der klassischen Zytogenetik nicht nachsteht. In einem zweiten Schritt wurden FL aus dem Archiv des Pathologischen Instituts der Universität Würzburg anhand der aktuellen WHO-Kriterien in die Grade 1, 2, 3A und 3B eingeteilt (und reklassifiziert). Diese Tumoren wurden im TMA und im Vollschnitt durch immunhistochemische Färbungen auf ihre Protein-Expression und mittels FISH auf ihre genetischen Eigenschaften untersucht und charakterisiert.
The Nuclear Factors of Activated T cells (NFATs) are critical transcription factors playing major roles in the control of the cell cycle, apoptosis and, probably, also cancerogenesis. Of all the four genuine NFATc family members, NFATc1 has the unique induction property which appears to be essential for T and B cell development, along with its considerable role in cytokine gene expression and function in non-lymphoid tissues and during organ development (such as in the development of muscle and heart cells). A number of studies have proved the potential role of NFATc1 protein in development of lymphomas and leukemias and provided evidence of differential expression of the same gene in different tumours (Suppression in classical Hodgkin lymphomas but overexpression in T-ALLs). Although the most commonly accepted pathway is the dephosphorylation of NFAT by calcineurin upon a rise in intracellular Ca++ leading to nuclear translocation followed by transcription of Il2 gene and related cytokines, it is quite possible that signaling mechanisms other than (or in addition to) calcineurin activation lead to NFATc1 induction as well. One of the major isoforms of NFATc1, NFATc1/αA, is the short inducible factor, produced upon full T and B cell activation. Here we used two different conditional knock-out mice as our study model. Inactivation of the murine Nfatc1 gene in bone marrow (of Cd79a/mb-1-cre x Nfatc1flx/flx mice) and spleen (of Cd23-cre x Nfatc1flx/flx mice) resulted in complete ablation of NFATc1 expression in splenic B cells. Although no severe developmental defects were found for the generation of ‘conventional’ B2 cells, NFATc1 inactivation in bone marrow B-cells led to a strong decrease in the peritoneal B1a cell population. In-vitro studies showed a clear-cut decrease in proliferation and an increase in Activation Induced Cell Death (AICD) of NFATc1-/- splenic B cells upon BCR stimulation. While NFATc1 appears to control directly the AICD of peripheral B cells, further studies revealed an effect of NFATc1 on proliferation by a sustained differentiation program controlling Ca++ flux and calcineurin activity which are needed to maintain transcription and proliferation of primary B cells. Re-expression of NFATc1 at a low dose could protect cells against AICD, whereas at a higher dose it initiated AICD. These data suggest an important dual role of NFATc1 in controlling proliferation and apoptosis of peripheral B lymphocytes. NFATc1 ablation also impaired the Ig class switch to IgG3 by T cell-independent (TI) type II antigens and impaired IgG3+ plasmablast formation when studied in-vivo by NP-Ficoll immunization or in-vitro using an in-vitro class-switch model. Contrary to the immunizations with TI-type II antigen, no significant differences were documented in Ig class switch upon immunization with NP-KLH, a T-cell dependent (TD) antigen. Taken together, the data indicate NFATc1/αA as a crucial player in the activation and function of splenic B cells upon BCR stimulation. Missing or incomplete NFATc1/αA induction appears to be one reason for the generation of B cell unresponsiveness, whereas uncontrolled NFATc1/αA expression could lead to unbalanced immune reactions and autoimmune diseases.
In der vorliegenden Studie haben wir mit Hilfe von SHARP-Screening, einer 16S-rRNA-basierten Heterogenitäts- und phylogenetischen Analyse, die mikrobielle Diversität in entzündlichen Lymphadenitiden ohne vorherige Kenntnis der jeweiligen Erreger an einer Serie von 15 Lymphknoten untersucht. Die Methode wurde erstmals auf diese Fragestellung angewandt. Sie konnte für die Verwendung von paraffineingebettetem Gewebe adaptiert werden, so dass auch Gewebeproben analysiert werden konnten, von denen kein Gefriermaterial zur Verfügung stand und die in Routineverfahren eingebettet und nach Standardmethoden gefärbt wurden. SHARP-Screening beinhaltet zwei komplementäre Schritte: Zuerst erfolgte die Erstellung einer Genbank aller bakteriellen Gene aus der gesamten extrahierten DNA des analysierten Gewebes durch gezielte Amplifikation des 16S-rRNA-Gens mittels universeller eubakterieller Primer. Als zweiter Schritt wurde nach der Transformation mittels Analyse des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus die Selektion der jeweiligen unterschiedlichen Phylotypen der enthaltenen 16S-rRNA-Gene durchgeführt (insgesamt 400). Nach der Sequenzierung wurden die 16S-rRNA-Gene durch den Vergleich mit bekannten bakteriellen Sequenzen mit Hilfe des „Basic-Local-Alignment-Search-Tool“ (BLAST) identifiziert. SHARP-Screening hat sich als geeignete Methode zur Analyse der gesamten, in einer Gewebeprobe enthaltenen bakteriellen Flora erwiesen. Dabei wurden zum Teil andere Erreger gefunden, als aus dem histologischen Bild vermutet wurden. So konnte zum Beispiel mit dem Nachweis von Gluconacetobacter sacchari, als potentieller Erreger einer septischen Granulomatose, eine alternative Differentialdiagnose zur histologisch vermuteten Katzenkratzkrankheit aufgezeigt werden. Darüber hinaus konnten auch gleichartige histologische Bilder bei dem gleichen identifizierten Erreger beobachtet werden. Zum Beispiel konnten im Zusammenhang mit dem Auftreten von Ödemen, Nekrosen, granulomatös eitrigen Veränderungen und einer ausgeprägten Sinus-histiozytose im Lymphknotengewebe immer wieder Comamonadaceae bzw. Janthinobacterium nachgewiesen werden. Oft zeigte sich nicht ein einzelner Erreger der Lymphadenitis, sondern ein ganzes Spektrum, wobei aus dem Vorhandensein der 16S-rRNA nicht auf das Vorhandensein vitaler Erreger geschlossen werden kann. Dennoch erlaubt die Häufigkeit der entsprechenden Klone eine semiquantitative Abschätzung der Bedeutung des jeweiligen Erregers. So wies SHARP-Screening auch Homologien zu Paracoccus yeeii nach. Eine Spezies, die mit klassischen Methoden häufig übersehen wird, die in Lymphknoten jedoch eine pathogene Rolle spielen kann. Im Zusammenhang mit dem histologischen Verdacht auf ein Malignom wurden in einigen Fällen Streptomyces, Roseomonas gilardii rosea und Stenotrophomonas maltophila nachgewiesen, die auch in der Literatur häufig bei immunsupprimierten Patienten vorkommen. Bei dem Verdacht auf ein Lymphgranuloma venerum wurde eine Cyanobacterium-Spezies detektiert, die es nach Literaturangaben Chlamydia trachomatis erst möglich macht, den eigenen Aminosäurestoffwechsel zu betreiben. Insgesamt dürften vom SHARP-Screening noch weitere tiefgreifende Erkenntnisse der bakteriellen Diversität und kausaler Erregerassoziationen in Erkrankungen des lymphatischen Systems zu erwarten sein.
Basierend auf die vorangegangene Studie der Abteilung für Neuropathologie des Pathologischen Instituts der Universität Würzburg, in der genetische Aberrationen auf dem Chromosom 9 in Ependymome beschrieben wurden, sollte eine Screeninguntersuchung des gesamten Chromosoms sowie eine verfeinerte Analyse der zuvor auffälligen Regionen erfolgen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mögliche Tumorsuppressorgene oder Onkogene, die mit der Entstehung oder Progression von Ependymome verbunden sind, zu definieren. Weiterhin sollte eine Korrelation zu den klinischen Daten erfolgen. Dabei konnte bei erwachsenen Patienten gezeigt werden, dass Aberrationen auf Chromosom 9 die Prognose verbessern. Speziell der Marker D9S1872 bei DCR1 (DBCCR1) zeigte einen Trend zu einem Überlebensvorteil bei Erwachsenen. Deshalb könnte er in Zukunft zur prognostischen Einteilung von Ependymompatienten in der Klinik beitragen. Des Weiteren konnten bei Kindern in supratentoriellen Tumoren signifikant mehr Aberrationen gefunden wurden als in infratentoriellen. Dies deutet darauf hin, dass Ependymome zumindest bei Kindern abhängig von der Lokalisation unterschiedliche Entstehungswege haben. Es konnten zwei Regionen identifiziert werden, in denen sich häufig Aberrationen fanden: 9p21.1-22.3 und 9q31.3-33.3. Weiterhin konnten Lokalisation und Resektionsausmaß als unabhängige Prognosefaktoren bestätigt werden.
Der humane, monoklonale IgG Antikörper BARB-4 konnte mit Hilfe der Hybridomatechnologie aus einem an Magenkarzinom erkrankten Patienten isoliert werden. BARB-4 stellt aufgrund seiner Keimbahnkodierung einen Bestandteil der innaten Immunität dar und ist eines der wenigen tumorspezifischen IgG Immunglobuline, die diesem Teil des Immunsystems zugeordnet werden können. Innerhalb dieser Arbeit konnte die Zielstruktur des Antikörpers identifiziert und näher charakterisiert werden. Das BARB-4 Antigen wurde hierbei über ein affinitätschromatographisches Verfahren aus Tumorzellmembranextrakten aufgereinigt und anschließend mittels MALDI-MS über die Peptidmassen-Fingerprint Methode analysiert. Das dabei isolierte Protein konnte eindeutig als humanes TAF15 identifiziert werden. Diese auf der Zellmembran von Tumoren exprimierte TAF15 Variante besitzt ein Molekulargewicht von etwa 78 kDa. Sie kommt im Gegensatz zum Wildtyp exklusiv in Tumorzellen vor und konnte nicht in Normalgewebe nachgewiesen werden. Immunhistochemische Untersuchungen mit BARB-4 und Anti-TAF15 Antikörper auf Tumor- und Normalgewebe deuteten dabei auf eine Koexistenz von Wildtyp und tumorspezifischer TAF15-Variante in malignem Gewebe hin und legten somit eine tumorspezifische Modifikation des TAF15BARB-4 nahe. Ein Carbohydrat-Epitop, wie es sehr häufig bei den natürlichen IgM Antikörpern vorkommt, konnte hier jedoch ausgeschlossen werden. In funktionellen Analysen konnte gezeigt werden, dass die Bindung des BARB-4 Antikörpers auf Tumorzellen einen Einfluss auf diverse zelluläre Prozesse ausübt. Durch die Bindung hemmte der Antikörper das Zellwachstum von Tumorzellen und induzierte deren Apoptose. Weitere interessante Eigenschaften des BARB-4, die bei Tumorzellen beobachtet werden konnten, sind vor allem für metastasierende Zellen von Bedeutung. Nach erfolgter Antikörperinkubation konnte bei Tumorzellen eine Inhibierung der Zelladhäsion und der Zellbeweglichkeit nachgewiesen werden. Diese beiden zellulären Prozesse sind wichtig für sich im Körper ausbreitende, maligne Zellen. In allen durchgeführten Analysen handelte es sich um vom Antikörper direkt vermittelte Effekte. Weitere Untersuchungen wurden durchgeführt, um das Bindungsverhalten des Antikörpers genauer charakterisieren zu können. Immunfluoreszenzanalysen zeigten dabei, dass der Antikörper BARB-4 nach der Bindung an die Tumorzellmembran internalisiert wird. Die Erforschung des BARB-4 Antikörpers und seiner Zielstruktur TAF15BARB-4 auf Krebszellen ermöglicht sowohl neue Einblicke in die Funktionsweise der innaten Immunität als auch neue Optionen für die zielgerichtete Tumortherapie. Die Identifizierung einer extrazellulären, tumorspezifischen TAF15 Variante bietet eine neue Möglichkeit für Diagnostik- und Therapieansätze. Durch die exklusive Expression auf Tumorzellen ermöglicht diese TAF15-Variante gezielt maligne Zellen zu attackieren ohne dabei gesunde Zellen zu beeinflussen. Durch das Vorkommen des TAF15BARB-4 in den verschiedensten Tumorentitäten könnte diese Zielstruktur für die Therapie vieler unterschiedlicher, maligner Erkrankungen genutzt werden. Aufgrund seiner funktionellen Eigenschaften, wie der Hemmung der Tumorzellmotilität und Tumorzelladhäsion, könnte der BARB-4 Antikörper besonders für die Prävention einer Metastasierung von Bedeutung sein.
In dieser Arbeit wurde die Etablierung und Charakterisierung einer großen Daten-, Gewebe- und DNA-Bank an einem Kollektiv von 311 Patienten mit Prostatakarzinom und bekanntem klinischem Follow-up mit einem Beobachtungszeitraum von im Durchschnitt 5 Jahren beschrieben. Sämtliche Fälle wurden von einem Beobachter einheitlich nach einem standardisierten Katalog re-klassifiziert. Die erhobenen Daten konnten durch Korrelation mit den klinischen Verläufen auf Plausibilität überprüft und dadurch validiert werden. Die untersuchten Fälle entsprachen bezüglich Häufigkeitsverteilung in Tumorstadium und Gleason-Grading den aus Literaturangaben zu erwartenden Häufigkeiten. Statistisch signifikante Risikofaktoren bezüglich eines Tumorrezidivs, das hier als postoperativer Wiederanstieg des PSA im Serum definiert wurde, waren ein hohes Tumorstadium, hoher Gleason-Score, extraprostatische Perineuralscheideninfiltrate und unvollständige Resektion, während der Nachweis von Lymphknotenmetastasen zum Zeitpunkt der Operation innerhalb des hier verfügbaren Nachbeobachtungszeitraums zwar einen Trend, jedoch keine statistische Signifikanz aufwies. In einer multivariaten Analyse war die unvollständige Tumorresektion der histologische Parameter mit der höchsten prädiktiven Aussagekraft bezüglich eines Rezidivs. Patienten mit fraglich knapp im Gesunden entfernten oder fraglich durchtrennten Karzinomen wiesen eine signifikant erhöhte Rezidivrate auf und sollten klinisch als Risikopatienten betrachtet werden. Die beschriebene Daten- und Gewebebank legt eine wichtige und wertvolle Grundlage für zukünftige wissenschaftliche Untersuchungen mittels Immunhistochemie, Immunfluoresezenz, Molekulargenetik und andere DNA-basierte Methoden. Die in diesen Untersuchungen erhobenen Befunde können mit den in der Datenbank abgelegten histopathologischen Parametern korreliert und anhand der klinischen Verläufe auf prognostische Relevanz überprüft werden.
Humane Antikörper sind aufgrund ihrer spezifischen, zielgerichteten Eigenschaften die idealen therapeutischen Waffen unserer modernen Medizin. Schon im ausgehenden letzen Jahrhundert gelang es dem pathologischen Institut der Universität Würzburg einige rein humane monoklonale Antikörper aus Geweben sowohl gesunder, als auch an einem Tumorleiden erkrankter Patienten zu isolieren. Zwei dieser Antikörper galt es im Rahmen dieser Arbeit näher zu untersuchen: LM-1 und PAM-1 , beides rein humane monoklonale IgM-Antikörper. Mithilfe immunhistochemischer Färbungen auf Paraffinschnitten von Adenocarcinomen des Colons, Carcinomen des Pancreas und Adeno- und Plattenepithelcarcinomen der Lunge ließ sich eindeutig demonstrieren, daß bei beiden Antikörpern eine tumorspezifische Reaktivität ohne Kreuzreaktion mit den umgebenden gesunden Geweben auf fast allen der ausgewählten Fälle der begutachteten Tumorarten vorlag. Daraus lässt sich eine zuverlässige und selektive Expression der jeweiligen Antigene auf den maligne entarteten Zellen folgern, die sich auch bei Betrachtung der Stadien der Tumoren und des Gradings der Zellen konstant zeigte. Damit scheint soweit keinen Zusammenhang zwischen der Entdifferenzierung der tumorösen Zellen, als auch der Größe und des Fortschreiten des Tumors erkennbar. Die hier demonstrierten Ergebnisse lassen sowohl PAM-1 als auch LM-1 als verlässliche Marker für multiple epitheliale Tumoren und deren Vorstufen erscheinen und können somit als wertvolles diagnostisches und wahrscheinlich auch therapeutisches Mittel eingestuft werden, doch muss die Diskussion dieser Aspekte weiterführenden Untersuchungen überlassen werden.
Bekanntermaßen führt die H.pylori Infektion des Magens über eine komplexe Modulation des Chemokinsystems zur Ausbildung der H.pylori Gastritis. Die Chemokinrezeptorexpression in der H.pylori Gastritis ist jedoch bisher noch fast nicht untersucht. Das Ziel der Arbeit war die Charakterisierung der Chemokinrezeptorexpression im Magen und die Testung eines Einfluss von H.pylori auf die Expression von Chemokinrezeptoren. In vitro führt die Inkubation von neutrophilen Granulozyten mit H. pylori zu einer schnellen Herunterregulation von CXCR1 und CXCR2 auf Proteinebene durch Rezeptorinternalisation und intrazellulären Abbau. Der Effekt ist unabhängig vom cag Status von H. pylori, sowie von TNF-α- oder IL-8. Als möglicher Signaltransduktionsmechanismus für diesen Effekt wäre die direkte Interaktion von H. pylori mit „toll-like receptors“ (TLRs) denkbar. Auf mRNA Ebene kommt es in vitro bei der Inkubation von neutrophilen Granulozyten mit H. pylori zu einer Herunterregulation von CXCR1 und CXCR2 mRNA nach 3 Stunden. Dieser Effekt tritt bei Inkubation mit einem cag positiven H. pylori Stamm verstärkt auf und könnte bedingt sein durch autokrine Herunterregulation der Expression von CXCR1 und CXCR2 durch IL-8. In vivo exprimieren neutrophile Granulozyten in der H. pylori Gastritis in den Krypten ebenfalls vermindert CXCR1 und CXCR2. Sowohl die Expression der Chemokine als auch der korrespondierenden Chemokinrezeptoren wird somit durch H.pylori beeinflusst. Es lässt sich somit der folgende Pathomechanismus postulieren: Nach dem Eintritt der neutrophilen Granulozyten in die Schleimhaut, kommt es über den direkten Kontakt mit H.pylori zum Verlust der Chemokinrezeptoren. Die neutrophilen Granulozyten können somit nicht mehr auf Chemokinsignale reagieren und werden in der Magenschleimhaut immobilisiert. Dort setzen sie reaktive Sauerstoffradikale, proinflammatorische Zytokine und Chemokine frei, die zur Schleimhautschädigung führen. Magenkarzinome exprimieren die Chemokinrezeptoren CXCR4 und CCR7. Die Expression wird mit der Neigung zur Metastasierung und einer schlechten klinischen Prognose assoziiert. In unseren Untersuchungen wird CXCR4 in vivo während des Prozess der Karzinogenese im Magen ab dem Stadium der intestinalen Metaplasie exprimiert. Bei Inkubation der Zelllinien mit cagA positiven und cagA negativen H. pylori – Stämmen, kommt es zu keiner Änderung der Expression von CXCR4. Die Infektion mit H. pylori ist zwar die Voraussetzung für die Genese der intestinalen Metaplasie, scheint jedoch nicht ursächlich an der Expression von CXCR4 beteiligt zu sein. CCR7 tritt in vivo auf den Magenepithelien der H. pylori Gastritis, der intestinalen Metaplasie, Dysplasie und Magenkarzinomen auf. In vitro führt die Koinkubation von CCR7 tragenden Magenzelllinien mit H. pylori zur Hochregulation von CCR7 kommt. Die Expression von CCR7 auf Karzinomzellen wird ebenfalls möglicherweise durch eine begleitende Infektion mit H. pylori begünstigt. Der Effekt der CCR7 Induktion durch H. pylori in vitro ist unabhängig vom cag Status des für die Infektion verwendeten H. pylori Stammes. Die Hochregulation von CCR7 ist möglicherweise bedingt durch die intrazelluläre Aktivierung von NFκB infolge der H. pylori Infektion. Denkbar wäre auch eine Induktion der Expression von CCR7 in den Magenepithelzellen in TLR abhängiger Weise, äquivalent zu Mechanismen, die in dendritischen Zellen beschrieben wurden. Es lässt sich abschließend feststellen, dass die H.pylori Infektion nicht nur die Freisetzung von Chemokinen, sondern auch die Expression von Chemokinrezeptoren wesentlich beeinflusst. Neutrophile Granulozyten verlieren in direktem Kontakt zu H.pylori die Chemokinrezeptoren CXCR1 und CXCR2. Auf Epithelzellen führt der direkte Kontakt zu H.pylori zur vermehrten Expression von CCR7. Die direkte Regulation von Chemokinrezeptoren durch H.pylori scheint also sowohl bei der H.pylori Gastritis, als auch bei der Entstehung und Progression von Magenkarzinomen eine Rolle zu spielen.
MALT1 zusammen mit CARMA1 und BCL10 spielt eine wesentliche Rolle bei Signalübermittlung von B-Zell-Rezeptor und nachfolgender NF-kappa-B Aktivierung. Bei Extranodaler MZBZL vom MALT-Typ ist MALT1-Gen häufig durch unterschiedliche chromosomale Aberrationen, die vermutlich zu einer konstitutiven NF-kappa-B Aktivierung führen, betroffen. Um einen Zusammenhang zwischen genetischen Aberrationen des MALT1-Gens und Aktivität des MALT1 induzierten NF-kappa-B Signale zu untersuchen, wurden genomische Aberrationen sowie MALT1-Expression in eine Serie von 20 MZBZL vom MALT-Typ der Speicheldrüsen untersucht. Dabei ließen sich Gewinne eines zusätzlichen MALT1-Signals in 9/18 (50%) sowie t(14;18)(q32;21) in 2/18 Fällen nachweisen. Die Mikrosatellitenanalyse zeigte eine Amplifikation des 18q21 Locus in 7/20 (35%) der Fälle. In 4 Fällen wurde eine spezifische Amplifikation des MALT1-Gens mit qRT-PCR bestätigt. Andere Translokationen, MSI oder LOH des MALT1-Gens waren nicht nachweisbar. Weiterhin wurden alle 20 MALT-Lymphom-Fälle auf Expression des MALT1-Proteins immunhistochemisch untersucht. Bei den Fällen mit genomischen Zugewinnen des MALT1 wurde gehäuft eine MALT1-Expression im Zellkern beobachtet. Konfokalmikroskopie zeigte, dass das MALT1-protein in Lymphomzellen direkt im Zellkern und in stark ausgebildeten filamentären Strukturen um den Zellkern herum lokalisiert ist. Zudem zeigten die Lymphomzellen mit filamentären MALT1-Strukturen eine kräftige p65-Expression im Zellkern, was einem aktivierten NF-kappa-B Zustand entspricht. Zusammenfassend, sind MALT-Lymphome der Speicheldrüsen durch häufige genomische Aberrationen des Chromosoms 18 gekennzeichnet, wobei Zugewinne des genomischen Materials am häufigsten zu finden sind. Im Gegensatz zu extranodalen Lymphomen anderer Lokalisationen sind bei MALT-Lymphomen der Speicheldrüsen die chromosmalen Translokationen selten. Die Zugewinne des Chromosoms 18 sind mit Relokalisation des MALT1-Proteins im Zellkern und um den Zellkern herum liegenden filamentären Strukturen und NF-kappa-B Aktivierung assoziiert. Somit bekräftigen die hier dargestellten Ergebnisse eine führende Rolle des MALT1-Oncogens in der Pathogenese von MZBZL vom MALT-Typ der Speicheldrüsen.
Die Entdeckung der Autoimmunkrankheit APECED führte zur Entdeckung des verantwortlichen Gens AIRE (autoimmune regulator), das einen Einblick in die Verhinderung oder Entstehung von Autoreaktivität im Thymus bietet. Durch Aktivierung des AIRE-Gens und Expression des AIRE-Proteins werden organspezifische Selbstantigene in medullären Thymusepithelzellen exprimiert und entweder direkt oder nach Transfer auf dendritsche Zellen unreifen T-Zellen präsentiert. Durch Elimination autoreaktiver Zellen entsteht Toleranz gegenüber den körpereigenen Geweben. Da das Immunsystem bei steigendem Alter tiefgreifende Veränderungen erfährt, die zum Teil durch die Thymusinvolution bedingt sind, ist es von Interesse, den Verlauf von AIRE über verschiedene Altersstufen hinweg zu untersuchen. Zielsetzungen dieser Arbeit waren daher die quantitative und räumliche Untersuchung der AIRE+ -Zellen im Alter und im Kontext einer prototypischen organspezifischen Autoimmunerkrankung, der Myasthenia gravis. Diese Fragestellungen wurden bei Normalthymi, entzündlich veränderten Thymi mit assoziierter Myasthenie und an B1-Thymomen untersucht. Als Ergebnis konnte erarbeitet werden, dass der Gehalt an AIRE+ -Zellen mit dem Alter abnimmt, wobei bis in die neunte Lebensdekade noch AIRE+ -Zellen vorhanden waren. Der Gehalt an AIRE+ Zellen stellte sich als stärker mit dem Lebensalter korreliert dar als beispielsweise die Thymusfläche. AIRE scheint damit ein mit der Thymusinvolution eng assoziiertes Gen zu sein. Es fand sich eine hochsignifikante Co-Lokalisation von AIRE+ Zellen und Hassall-Körperchen, die besonders durch die Untersuchungen von Typ B1 Thymomen mit und ohne Hassall-Körperchen bestätigt werden konnte. In Übereinstimmung mit aktuellen Forschungsergebnissen in Mausmodellen fand sich kein Zusammenhang zwischen der Anzahl oder der räumlichen Anordnung regulatorischer T-Zellen und AIRE+ -Zellen. Myoidzellen nahmen mit zunehmendem Alter ebenfalls ab. Ihre Rolle in der Entstehung der Myasthenie ist bei Patienten mit early und late onset wahrscheinlich unterschiedlich; die abnehmende Zahl an Myoidzellen stellt möglicherweise vor allem bei Patienten mit late onset einen Risikofaktor dar.
Die histologische Technik der Tissue-Microarrays ist eine sehr effiziente Methode, um eine große Anzahl auch heterogener Lymphome wie des Hodgkin-Lymphoms bei hohem Durchsatz unter homogenen Färbebedingungen zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass ein Probeschnitt zur vorherigen Auswahl stanzwürdigen Tumorareals nicht nötig ist. Die so genannte Blindstanzung trug weniger als einen Prozentpunkt (0,9%) zum Verlust der auswertbaren Fälle bei. Dennoch war bei einzelnen Parametern (LMP1 und EBER) ein hoher Gewebeverlust zu beobachten. In einer Stichprobe von 2696 Stanzen waren es 24% (631 Stanzen) bedingt durch die Färbetechnik, aber auch durch unterschiedliche Vorbehandlungen und Originalfixationen des Probematerials. In dieser Studie wurden 1212 Fälle zur Immuntypisierung von Tumorzellen des klassischen und nodulär lymphozyten-prädominanten Hodgkin-Lymphoms untersucht. Die Fälle von c-HL wiesen eine häufige Expression von CD30- und CD15-Oberflächenmarkern und kaum B-Zell-Marker auf, während im NLP-HL die Expression in umgekehrter Häufigkeit vorlag. Diese bisher größte Untersuchung von T-Zell-Markern an H-/RS-Zellen, erstmalig auch an NLP-HL, ergab eine bis zu 6-fach höhere Frequenz in der NLP-HL bei häufigerer B-Zell-Marker-Expression. Die in der Literatur beschriebene Rangordnung der Expressionshäufigkeit von Oberflächenantigenen im c-HL (CD2 > CD4 > CD3 > CD5 > CD8) wurde bestätigt und wich nur in den Markern CD3 und CD5 ab: Perforin >> CD4 > CD5 > CD3 > CD8 > GranzymB > TIA-1 > CD7. Tzankov et al. [45] fanden in ihrer Untersuchung mit 259 c-HL-Fällen eine Häufigkeit von 5% T-Zell-Marker-Expression. Die vorliegende Arbeit mit 1147 untersuchten c-HL-Fällen kam zum Ergebnis einer deutlich höheren T-Zell-Marker-Expressionshäufigkeit von 20,1%. Der pathophysiologische Mechanismus der T-Zell-Marker-Expression ist bis heute noch unklar, könnte aber als eine alternative Signalkaskade zur Aufrechterhaltung des Zellzyklus unter geändertem Zellmilieu gedeutet werden. Ein weiterer Fokus dieser Arbeit betraf die Gruppe der Studienteilnehmer 60 Jahre und älter, um Hinweisen auf das „age-related“ EBV-associated Lymphom und der Rolle der Mikrosatelliten-Instabilität nachzugehen. So fand sich eine signifikante Häufung von Markern für eine EBV-Infektion (EBER, LMP1) in der Gruppe der über 60-Jährigen. Die Expression von DNA-Reparaturenzymen, deren Ausbleiben auf Mikrosatelliten-Instabilität gedeutet hätte, unterschied sich zwischen jüngeren und älteren Studienteilnehmern nicht.
Obwohl sie die Mehrzahl der T-Zell-Lymphome darstellen, war über die Genetik der PTC-NOS und ALK-negativen ALCL bisher nur wenig bekannt. Klassische zytogenetische Untersuchungen dieser Gruppe wiesen auf komplexe chromosomale Veränderungen hin. Aufgrund der Seltenheit dieser Neoplasien basierten die Berichte bis jetzt nur auf einer geringen Anzahl von Fällen. Für die heterogene Gruppe von PTCL-NOS konnten bisher keine charakteristischen genetischen Veränderungen beschrieben werden. Zudem waren die genetische Beziehung zwischen ALK-negativen ALCL und PTCL-NOS, die Genetik von kutanen ALCL und die sekundären genetischen Veränderungen in ALK-positiven ALCL unklar. In dieser Untersuchung wurden 42 PTCL-NOS und 37 ALCL, davon 17 anaplastisch-großzellige Kinase (ALK)-negative ALCL, 9 ALK-positive ALCL und 11 kutane ALCL, durch komparative genomische Hybridisierung analysiert und charakteristische rekurrente genetische Alterationen nachgewiesen. Unter 36 primär diagnostizierten PTCL-NOS fanden sich rekurrente chromosomale Verluste auf den Chromosomen 13q (minimal überlappende Region 13q21, 36% der Fälle), 6q und 9p (6q21 und 9p21-pter, in 31% der Fälle), 10q und 12q (10q23-24 und 12q21-q22, in 28% der Fälle) und 5q (5q21, 25% der Fälle). Rekurrente Zugewinne wurden auf Chromosom 7q22-qter (31% der Fälle) gefunden. In 11 PTCL-NOS wurden High-level-Amplifikationen beobachtet. Bei den PTCL-NOS konnte zudem eine Gruppe von nicht-zytotoxischen nodalen CD5-positiven T-Zell-Lymphomen abgegrenzt werden, die durch rekurrente chromosomale Verluste auf den Chromosomen 5q, 12q und 10q charakterisiert ist. Während kutane und ALK-positive ALCL wenige rekurrente chromosomale Veränderungen zeigten, fielen bei ALK-negativen ALCL wiederholt Zugewinne auf Chromosom 1q (1q41-qter, 46%) und Verluste auf Chromosom 6q (6q21, 31%) und 13q (13q21-q22, 23%) auf. Insgesamt können somit PTCL-NOS von ALK-negativen ALCL durch Verluste auf den Chromosomen 5q und 9p (bei PTCL-NOS) sowie durch Zugewinne auf Chromosom 1q (bei ALCL) abgegrenzt werden. PTCL-NOS und ALK-negative ALCL unterscheiden sich genetisch außerdem von anderen T-NHL, wie Enteropathie-assozierte T-Zell-Lymphome, Prolymphozyten-Leukämien vom T-Zell-Typ und adulte T-Zell-Leukämien/Lymphomen.
Das Nebennierenrindenkarzinom ist ein seltener maligner, epithelialer Tumor mit einer jährlichen Inzidenz in Deutschland von 2 pro 1 Million Einwohnern. Es ist für etwa 0,2% aller Krebstodesfälle verantwortlich. Die Seltenheit der Erkrankung erschwert die Entwicklung wirksamer Therapieansätze erheblich. Erst in letzter Zeit gelang es, größere Patientenkohorten in kontrollierten Studien zu behandeln (Allolio et al. 2006) und größere Fallzahlen an Tumorgewebe wissenschaftlichen Untersuchungen zuzuführen. Erstmalig besteht damit auch die Möglichkeit, die Expression eventuell relevanter Proteine für moderne Therapiekonzepte auch an großen Fallzahlen zu untersuchen. Bislang liegen nur sehr lückenhafte diesbezügliche Studien vor. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression einiger möglicherweise therapeutisch relevanter Proteine mittels immunhistochemischer Analyse unter Zuhilfenahme der Tissue Microarray-(TMA)-Technik in einer großen Serie von 104 NNR-Ca untersucht und mit der von Nebennierenadenomen und normalem Nebennierengewebe verglichen. Insgesamt 9 verschiedene Proteine wurden immunhistochemisch dargestellt: Als wichtigster Befund wurde eine Überexpression der Alpha-methylacyl-CoA Racemase (AMACR) in 89% der untersuchten NNR-Ca festgestellt. Interessanterweise zeigte auch die Mehrzahl der untersuchten Nebennierenadenome (80%) zumindest eine schwache AMACR-Reaktivität, während die mituntersuchten normalen Nebennieren negativ blieben. Diese bislang nicht beschriebene Beobachtung gleicht den bekannten Befunden z.B. in der Prostata, in der sowohl die dort entstehenden Adenokarzinome, als auch deren Vorläuferläsionen (PIN) eine AMACR-Expression zeigen. EGFR, ein Tyrosinkinaserezeptor, auf den der bereits etablierte therapeutische Antikörper Cetuximab (Erbitux®) zielt, wurde in 49% der untersuchten NNR-Ca verstärkt exprimiert, so dass eine gegen den EGFR gerichtete Therapie in ausgewählten Fällen eine Behandlungsoption zu eröffnen scheint. Die Suche nach Mutationen in diesem potentiellen Zielprotein könnte weitere Ansatzpunkte für Wirkstoffe aufzeigen, Studien gibt es dazu bislang keine. Ähnliche Ergebnisse fanden sich in dieser Studie für VEGF, das von 19% der untersuchten NNR-Ca mäßig oder stark exprimiert wurde. Auch hier könnte eine entsprechende Therapie mit einem bereits kommerziell erhältlichen spezifischen Antikörper (Bevacizumab/Avastin®) in einem Teil der Fälle eine Behandlungsoption, ggf. auch als supportive Maßnahme, eröffnen. Angesichts der Expression von VEGF in nur rund einem Drittel der Fälle, wäre hier aber eine vorangehende Bestimmung des Expressionsstatus am Tumorgewebe unerläßlich. Weitere Untersuchungen sollten auch den VEGF-Rezeptor als möglichen Ansatzpunkt neuer Wirkstoffe, wie z.B. der Multi-Tyrosinkinase-Inhibitor Sunitinib [SU11248; SUTENTTM] (Le Tourneau et al., 2007), erforschen. Im Gegensatz dazu wurde eine wesentliche Expression weiterer untersuchter Proteine (CD117/C-kit, Her-2/neu, Östrogen- und Progesteronrezeptor) in NNR-Ca in dieser Studie nicht in einem Maße gefunden, welches in einer signifikanten Zahl von Fällen eine Therapieoption eröffnen würde. Eine immunhistochemisch bestimmbare Expression von p53, als Surrogatmarker für ein mutiertes p53-Gen wurde in 85% der untersuchten NNR-Ca nachgewiesen. Dies weist auf eine zentrale Bedeutung von p53-Mutationen in der Genese von NNR-Ca hin. (Reincke et al., 1994; Gicquel et al., 2001; Barzon et al.I, 2001; Soon et al., 2008) Auch die Proliferationsfraktion, bestimmt als Ki67-Index, war in den untersuchten Karzinomen gegenüber den Adenomen und den mitgeführten normalen Nebennieren deutlich erhöht, was das aggressive Wachstumspotential der Mehrzahl der NNR-Ca wiederspiegelt.
Histomorphologische Charakteristika klinisch gesicherter Bisphosphonat-assoziierter Kiefernekrosen
(2009)
Bisphosphonate finden seit mehr als 25 Jahren klinischen Einsatz. Ihre Verabreichung ist mittlerweile fester Bestandteil der medikamentösen Therapie von Osteoporose, Morbus Paget, Plasmozytomen und tumorbedingten Osteolysen. Auf eine dabei für den Patienten sehr schwerwiegende und aufgrund der Therapieresistenz oftmals schwierig zu behandelnde Nebenwirkung wurde im Jahr 2003 erstmals aufmerksam gemacht. Als sicher gilt heute, dass es unter Bisphosphonat-Therapie zu Osteonekrosen im Kieferbereich kommen kann. In der vorliegenden Studie wurden 24 Fälle (14 Frauen, 10 Männer; Durchschnittsalter 66 Jahre) Bisphosphonat-assoziierter Kiefernekrosen untersucht. Die Patienten erhielten alle Aminobisphosphonate - in mehr als der Hälfte der Fälle handelte es sich dabei um das hochwirksame Zometa® (Zolendronat; Novartis). In 91,6% der Fälle waren ossär metastasierende Malignome (Mamma- und Prostata-CAs) sowie Plasmozytome/multiple Myelome Grund der Applikation. Klinisch waren freiliegender Knochen, ulzerierende Schleimhautveränderungen, Wundheilungsstörungen nach zahnärztlichen Eingriffen, Abszessbildung, Fistelung, Parästhesien, rezidivierende bzw. zunehmende Schmerzen und gelockerte Zähne zu beobachten. Die dabei auftretenden Symptome besitzen jedoch keine ausreichende Spezifität, so dass es dem Kliniker nur über die genaue Kenntnis der Anamnese möglich ist eine Bisphosphonat-assoziierte Kiefernekrose zu diagnostizieren. Die licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen ergaben variable Ausprägungsmuster der Nekrose. In der Mehrheit der Fälle lag dabei eine eitrige Nekrose, in 20,8% der Fälle hingegen eine aseptische Nekrose vor. In 79,2% der Fälle trat ein Actinomyces-Befall unterschiedlicher Befallsstärke auf. In 33,3% konnten Epithelproliferate und in seltenen Fällen Anzeichen eines reaktiven Knochenumbaus (16,7%) beobachtet werden. Insgesamt besitzen die histopathologischen Veränderungen wenig Spezifität, so dass der Pathologe ohne Kenntnis des klinischen Gesamtaspektes nicht eindeutig eine Bisphosphonat-assoziierte Kiefernekrose diagnostizieren kann und zur Diagnose klinisch-anamnestische Daten und histologische Befund zusammengeführt werden müssen. Ein hinsichtlich formalpathogenetischer Überlegungen wichtiges histomorphologisches Ergebnis stellte die signifikante Zunahme der Trabekeldicken (p < 0.04) Bisphosphonat behandelten Knochens im Vergleich zu gesundem dar. Die Sklerosierung führt konsekutiv zu einer Verschlechterung der Durchblutungs- und Ernährungssituation und damit auch der Abwehrlage des Kieferknochens und stellt den entscheidenden Ausgangspunkt für die Entstehung von Osteonekrosen dar. Konsens besteht aufgrund der bisherigen Forschungsergebnisse darüber, dass zur Entwicklung der unter Bisphosphonat-Therapie beobachteten Kiefernekrosen jedoch eine Reihe zusätzlicher Risikofaktoren im Sinne eines multifaktoriellen Geschehens bedeutsam sind. In Übereinstimmungen zu anderen Forschungsarbeiten konnte in der eigenen Arbeit der zahnärztliche Eingriff als ein wichtiger Risikofaktor identifiziert werden.
Tumors of the hematopoietic and lymphoid system are classified into Hodgkin lymphoma and non-Hodgkin lymphoma (NHL). Approximately 80% of non-Hodgkin lymphomas (NHL) are B-cell lymphomas (B-NHL) and the remainder include T-cell and NK-cell lymphomas as well as immunodeficiency-associated lymphoproliferative disorders. The presence of genetic alterations such as translocations involving the immunoglobulin (Ig) receptor loci in B-NHL, e.g. the translocation t(14;18)(q32.33;q21.3) in follicular lymphoma (FL), are of great value for the classification and of importance in the pathogenesis of these neoplasms. In analogy to the Ig receptor genes in B-NHL, the T-cell receptor (TCR) gene loci are targeted by chromosomal breaks in approximately 30% of precursor T-cell lymphoblastic leukemias/lymphomas involving various translocation or inversion partners. Most of these events result in the overexpression of an oncogene by juxtaposing it to the regulatory sequences of the TCR genes. However, the pathogenesis of mature T-cell NHL (T-NHL) and the underlying molecular mechanisms are only poorly understood so far. To determine the exact frequency of breakpoints occurring in the TCR loci of 227 mature T-NHL cases, we designed fluorescence in situ hybridization (FISH) assays for the TCR loci that are applicable for large scale analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) lymphoma specimens in a tissue microarray format. This approach revealed only two mature T-NHL cases with a chromosomal breakpoint in one of the TCR loci making the rearrangement of TCR loci a very rare event in these neoplasms that occurs in less than 1% of cases.FL is the second most frequent type of B-NHL that can show predominantly follicular, combined follicular and diffuse, or predominantly diffuse growth patterns. The characteristic genetic hallmark of FL is the translocation t(14;18)that occurs in approximately 90% of cases and leads to a deregulated expression of the anti-apoptotic BCL2 proto-oncogene. FL has yet been a subject of many studies deciphering morphological, clinical and molecular features of this entity. However, only little information exists about cases lacking this translocation. In this thesis we divided 184 FL cases by polymerase chain reaction (PCR) and by FISH assays into FL cases with and without t(14;18) and investigated their respective gene expression profiles and copy number alterations. For FISH analysis we followed the refined conditions established for the T-NHL study. The only genetic alterations that differed significantly by comparative genomic hybridization (CGH) analysis between FL cases with and without t(14;18) were frequent gains or amplifications in 18q11-q21 in 32% of t(14;18)-positive and 0% of t(14;18)-negative cases. Gene expression profiling and geneset enrichment analysis (GSEA) revealed an enrichment of germinal center B-cell (GCB) signatures in t(14;18)-positive cases whereas an enrichment of activated B-cell (ABC) like, NFkB-, proliferation-, cell cycle-, interferon and bystander cell signatures were observed in t(14;18)-negative cases. A validation approach by immunohistochemistry (IHC) on an independent test set of FL cases (n=84) revealed a more frequent expression of the germinal center (GC) marker CD10/MME in cases with t(14;18) and a higher expression of the post GC marker IRF4/MUM1, the proliferation marker Ki67 and the cytotoxic T-cell marker GZMB in cases without t(14;18). Although these results may suggest a post-GCB phenotype for translocation t(14;18)-negative cases, ongoing somatic hypermutations of the immunoglobulin heavy chain genes in these cases rather point to a late GC stage of B-cell differentiation in FL without t(14;18). In an independent study with 35 predominantly diffuse FL cases, it was furthermore possible to define another subset of t(14;18)-negative FL characterized by a chromosomal deletion (del) in 1p36 and distinct morphological and clinical features by IHC, classical chromosome banding, FISH and gene expression profiling. The gene expression profiles of predominantly diffuse FL cases fell into the spectrum of FL. However, by GSEA they showed a significant enrichment of T-cell, NK-cell- and two dendritic-cell subset signatures, whereas a significant enrichment of GCB cell-, proliferation-, cell cycle- and B-cell signatures was observed in a control group of “classic” FL cases. Remarkably, patients with diffuse FL frequently presented with low clinical stage and large, but localized inguinal tumors. In conclusion, our results suggest that t(14;18)-negative FL are part of the spectrum of FL in general, but nevertheless show distinct molecular and clinical features. In particular, predominantly diffuse FL with (del)1p36, low clinical stage and large but localized inguinal tumors may represent a distinct t(14;18)-negative FL subtype.
Eine grundlegende Aufgabe unseres Immunsystems ist der Schutz unseres Organismus durch die Abwehr von Erregern. Im Zentrum jeder Immunantwort liegt die Unterscheidung zwischen dem „Selbst“ (der Erkennung körpereigener Antigene) und dem „Nicht-Selbst“ (der Erkennung körperfremder Antigene). Ein wichtiger Faktor in der Aufrechterhaltung der zentralen Toleranz ist das AIRE-Protein. In der Thymusmedulla, dem Ort der stärksten AIRE-Expression, erfolgt die sog. negative Selektion der heranreifenden autoreaktiven T-Zellen. Es wird angenommen, dass AIRE durch Regulation der Präsentation von Selbst-Antigenen in mTECs und DCs die Thymozyten auf Autoreaktivität kontrolliert und potentielle Auslöser einer Autoimmunkrankheit eliminiert. Thymome sind epitheliale Tumoren des Thymus, die häufig mit Autoimmunphänomenen, insbesondere paraneoplastischer Myasthenia gravis, einhergehen. Da bei Thymomen meist ein vollständiger Verlust von AIRE sowohl auf Transkriptions- als auch Proteinebene vorliegt, lag es nahe, einen Zusammenhang mit dem Auftreten Thymom-assoziierter Autoimmunerkrankungen zu vermuten. Thymome wurden initial in einer histogenetischen Klassifikation aufgrund morphologischer Kriterien in „medulläre“ und „corticale“ Typen unterteilt. Dieses Konzept sollte in der vorgelegten Arbeit überprüft werden. Durch Kombination verschiedener Gen-Expressions-Datensätze wurden „medulläre Thymusgene“ identifiziert und in 3 Gruppen (Gene ohne Beeinflussung durch AIRE bzw. Gene mit positiver bzw. negativer Regulation durch AIRE) unterteilt. Unter den hier identifizierten, durch AIRE positiv regulierten Genen fanden sich zahlreiche Gene mit potentieller Bedeutung für die Immunregulation bzw. die Entstehung experimenteller und humaner Autoimmunerkrankungen. Eine Analyse verschiedener Thymom-Subtypen ergab weder eine erkennbare „AIRE-Verlust-Signatur“ noch eine medulläre Gensignatur in den „medullären“ Typ A Thymomen. Die erhobenen Befunde wären aber mit einem Stammzellmodell der Thymomentstehung vereinbar, nach dem die unterschiedlichen Thymom-Subtypen aus unterschiedlich determinierten Stamm- oder Progenitorzellen mit verschiedenen Reifungsblockaden hervorgehen könnten.
Erste tumorassoziierte Veränderungen finden im Glykosilierungsmuster von Glykoproteinen und Glykolipiden statt. Die dabei entstehenden tumorassoziierten Carbohydrat-Antigene sind prominente Zielstrukturen der natürlichen Tumorimmunität (Immune Surveillance) und gewinnen in der Onkologie als immunogene Epitope zunehmend an Bedeutung. Der humane monoklonale IgM-Antikörper SAM-6 ist Teil der tumorspezifischen Immunität. Er wurde mit Hilfe der konventionellen Hybridomatechnologie direkt aus einem an Magenkarzinom erkrankten Menschen isoliert. Neben der Erforschung seines außergewöhnlichen Apoptose-mechanismus konnte innerhalb dieser Arbeit eine Zielstruktur des Antikörpers identifiziert und charakterisiert werden. Der humane monoklonale IgM-Antikörper SAM-6 bindet an eine neue Isoform des Hitzeschockproteins GRP78 (GRP78SAM-6). Das Antigen wurde über mehrstufige chromatographische Verfahren aus Tumorzellmembranextrakten aufgereinigt und nach tryptischen Verdau über die Methode des Peptidmassen-Fingerprinting eindeutig als humanes GRP78 identifiziert. Die auf der Zellmembran lokalisierte Variante des GRP78 besitzt ein Molekulargewicht von 82 kD und wird auf vielfältigen Tumorgeweben stabil exprimiert. GRP78SAM-6 liegt parallel zur 78 kD-Wildtyp-Variante co-exprimiert vor und konnte im Gegensatz zur Wildtyp-Variante nicht auf gesundem Gewebe nachgewiesen werden. Bei der SAM-6-spezifischen Variante des GRP78 handelt es sich um eine posttranslational modifizierte Form des GRP78, die spezifisch auf der Zellmembran lokalisiert ist, nicht jedoch intrazellulär zu finden ist. Sie unterscheidet sich durch zusätzliche Glykosilierungen vom GRP78-Wildtypen, wobei O-glykosidisch verknüpfte Glykane für die Bindung und die Reaktion mit dem SAM-6 Antikörper essentiell sind. Der SAM-6-Rezeptor stellt eine tumorspezifische Isoform des Hitzeschockproteins GRP78 dar, deren O-glykosilierte Carbohydrat-Regionen als Epitop fungieren. Durch die Bindung an GRP78SAM-6 hemmt der Antikörper SAM-6 in vitro als auch in vivo konzentrationsabhängig das Wachstum von Magen- und Pankreaskarzinomzellen und induziert eine neue Art des apoptotischen Zelltodes, die sog. Lipoptose. Es handelt sich um einen durch den Antikörper vermittelten direkten Effekt, der sich ausschließlich auf malignes Gewebe beschränkt. Schlüsselpunkt der apoptotischen Wirkung ist die Akkumulation zytotoxischer Mengen an Cholesterol und Triglyceridestern, die nach Bindung an den Antikörper in Form von Lipoprotein-Partikeln in die Tumorzelle gelangen. Der pentamere IgM-Antikörper bindet neben membranständigem GRP78SAM-6 der Tumorzelle, die ApoB 100-haltigen Lipoproteine VLDL und LDL. Insbesondere oxidativ modifizierte Formen des LDL (oxLDL) zeigten dabei die höchste Bindungsaffinität zum SAM-6 Antikörper. In deren Anwesenheit war ein maximaler lipotoxischer Effekt zu beobachten. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, weite Teile des Lipoptose-Mechanismus aufzuklären. Eigenen Immunfluoreszenzstudien zufolge wird der SAM-6 Antikörper über rezeptorvermittelte Endozytose internalisiert. Die GRP78-vermittelte Internalisierung von oxLDL-beladenem Antikörper scheint daher plausibel und für die tödliche Anhäufung der Lipide verantwortlich zu sein. Die SAM-6-induzierte Apoptose verläuft anschließend über einen spezifischen Signalweg, der Gemeinsamkeiten mit dem intrinsischen Signalweg aufweist, jedoch wie beim extrinsischen Signalweg über externe pro-apoptotische Liganden angeregt wird. Infolge der unphysiologisch hohen intrazellulären Konzentration an oxLDL kommt es zur Induktion einer Caspasenkaskade, die nach der initialen Freisetzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien über die Initiatorcaspasen 8 und 9 verläuft und letztendlich durch die Aktivierung der terminalen Caspasen 3 und 6 den apoptotischen Zelltod einleitet. Die Entdeckung von extrazellulär exprimiertem GRP78 auf Tumorzellen bietet die Möglichkeit neuer Therapieansätze in der Onkologie. Die SAM-6-spezifische Variante des GRP78 bietet insbesondere die Möglichkeit eines gezielten Angriffs auf die Tumorzelle, ohne gesunde Zellen zu tangieren. Sie wird auf Tumorgeweben verschiedenster Ätiologie stabil exprimiert und infolge ihres tumorspezifischen Auftretens zur optimalen Zielstruktur der natürlichen körpereigenen Immunantwort gegen Tumore. Der natürliche IgM-Antikörper ist Teil der natürlichen Immunität. Diese verfügt über ein breites Repertoire an Rezeptoren und garantiert die permanente Überwachung und Reaktion gegen modifizierte körpereigene Zellen. Sie ist dafür verantwortlich, dass Tumore sich nur in Ausnahmefällen manifestieren.
Humane oder humanisierte monoklonale Antikörper haben sich in den letzten zehn Jahren als Arzneimittel etabliert. Sie sind hochspezifisch und zeigen in ihrer Anwendung im Vergleich zu konventionellen Therapeutika viel weniger Nebenwirkungen. In den 80er Jahren gelang es am Pathologischen Institut der Universität Würzburg eine Reihe von humanen Antikörpern aus Patienten zu isolieren, die hochspezifisch mit malignen Zellen reagieren und diese sowohl in vitro als auch im experimentellen Tiermodel selektiv durch Induktion von Apoptose töten. Um die Wirkungsweise von monoklonalen Antikörpern in der Krebstherapie zu erhöhen, werden die meisten in Kombination mit herkömmlichen Methoden, wie Chemotherapie, eingesetzt. Die ideale Therapieform sind hinsichtlich der Nebenwirkungen sog. Cocktails aus verschiedenen monoklonalen Antikörpern. Allerdings sind die Studien hierzu noch wenig fortgeschritten. Das Ziel dieser Arbeit war es, in präklinischen Versuchsreihen den Einsatz verschiedener tumorspezifischer humaner monoklonaler Antikörper als Cocktail und in Kombination mit Chemotherapie zu evaluieren. Hierzu wurden neun Antikörper in 32 verschiedenen Antikörperkombinationen hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die in vitro Proliferation einer Pankreaskarzinom-Zellinie untersucht. In Immunfluoreszenz-Aufnahmen ließ sich zeigen, dass kombinierte Antikörper an unterschiedlichen Stellen an der Zelle binden, was eindeutig auf verschiedene Zielstrukturen hinweist. Einige werden dabei endozytiert, während andere auf der Zellmembran bleiben. Interessanterweise ließen sich Kombinationen identifizieren, deren antiproliferative Wirkung sowohl additiv als auch synergistisch ist, das heißt größer als die Summe ihrer Einzelaktivitäten. Wurden Antikörper mit Zytostatika (5-Flurouracil) kombiniert, so ließen sich ebenfalls synergistische Effekte beobachten. In FACS-Analysen zeigt sich ein gesteigertes Bindungsverhalten der Antikörper, wenn die Zellen mit 5-FU vorinkubiert wurden. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die Beobachtung, dass die Wirkung humaner monoklonaler Antikörper in Kombination mit Chemotherapie erhöht werden kann. Für die Zukunft humaner Antikörper als Therapiemittel gegen maligne Erkrankungen mag allerdings noch wichtiger sein, dass Antiköper in Cocktails tatsächlich synergistische Wirkung zeigen können.
Die primären genetischen Veränderungen gastraler MALT-Lymphome zeigen verschiedene Pathogenesen auf. In 20 bis 30 Prozent der DLBCL kann eine Translokation t(14;18)(q32;q21) nachgewiesen werden, bei der das antiapoptotisch wirkende Bcl-2-Gen transloziert wird. Dies führt zu einer Überexpression von Bcl-2. Die Translokation t(11;18)(q21;q21) wurde in bis zu 50 Prozent der MZBZL vom MALT-Typ und wenigen DLBZL nachgewiesen. Dabei werden unterschiedlich lange Teile des MALT1-Gens in BIRC3 (ehemals: Apoptose- Inhibitor- Gen API2) auf 11q21 integriert. Mit den Translokationen scheint man bei einem Teil der gastrointestinalen Lymphome die primäre genetische Veränderung entdeckt zu haben. Bei Lymphomen, bei denen die Pathogenese nicht durch Translokationen vorangetrieben wird, könnten die gleichen, von Translokationen betroffen Gene durch Amplifikationen/ Mutationen überexprimiert/ aktiviert werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden die Gene MALT1 und Bcl-2 hinsichtlich Amplifikationen der genomischen DNA untersucht. Amplifikationen des Bcl-2-Gens konnten kürzlich bei einigen t(14;18)(q32;q21)-negativen DLBCL und follikulären Lymphomen nachgewiesen und auch im Rahmen dieser Doktorarbeit gezeigt werden. Mittels semiquantitativer PCR konnte in vier von 30 untersuchten DLBCL-Fällen (13,3 Prozent) eine Amplifikation des Bcl-2-Gens nachgewiesen werden. Die Hypothese, dass Bcl-2-Amplifikation mit folgender Überexpression des Bcl-2-Proteins (neben Bcl-2-Translokation) eine wichtige Rolle in der Pathogenese bei DLBCL spielt, wird mit diesen Ergebnissen gestützt. Zudem zeigten zwei von 14 MZBZL-Fällen (14,3 Prozent) eine Bcl-2-Amplifikation. Hieraus ergibt sich die Vermutung, dass Bcl-2 auch eine wichtige Rolle bei der Entstehung der MZBZL vom MALT-Typ spielen könnte. Bisher konnten Bcl-2-Gen-Beteiligungen (zum Beispiel t(14;18)(q32;q21)) nicht nachgewiesen werden. Amplifikationen des MALT1-Gens wurden kürzlich als mögliche primäre Ursache für die Entstehung von Lymphomen beschrieben. In vier der 30 untersuchten DLBCL-Fällen (13,3 Prozent) und einem t(11;18)(q21;q21)-negativem MZBZL-Fall konnten mittels semiquantitativer PCR Amplifikationen von MALT1 detektiert werden. Die Ergebnisse zeigen, dass MALT1 als dominantes Onkogen in der Pathogenese von gastralen MZBZL vom MALT-Typ und primär gastralen DLBCL zu agieren scheint. Es kann sowohl durch Translokationen, wie auch durch genomische Amplifikationen dysreguliert werden.
Das follikuläre Lymphom ist eines der häufigsten Non-Hodgkin Lymphome und überwiegend eine Erkrankung des erwachsenen Menschen. In der WHO-Klassifikation ist es als ein Lymphom von Keimzentrumszellen definiert, das follikulär und/oder diffus wachsen kann. Zur Subklassifikation follikulärer Lymphome empfiehlt die WHO-Klassifikation eine Unterscheidung der Grade 1, 2 und 3 durch Auszählen der Zentroblasten pro zehn Gesichtsfelder in starker Vergrößerung. Beim Grad 3A liegen neben Zentroblasten auch Zentrozyten vor. FL Grad 3B bestehen ausschließlich aus Zentroblasten. Hinsichtlich der Zytomorphologie, Immunhistologie und Genetik bestehen deutliche Unterschiede zwischen FL Grad 1, 2 und 3A gegenüber FL Grad 3B. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die weit überwiegende Zahl der follikulären Lymphome Grad 1, 2 und 3A ein prädominant follikuläres Wachstumsmuster aufwies. Ein follikulärer und diffuser Wuchstyp lag seltener vor. Noch seltener war ein überwiegend bzw. „rein“ diffuses Wachstumsmuster. Die mitotische und proliferative Aktivität stieg mit dem Tumorgrad linear an. Hinsichtlich der CD10 Reaktivität, der BCL-2 und p53 Expression sowie des Nachweises einer sekretorischen Differenzierung ergaben sich beim Vergleich der FL Grad 1 bis 3A keine statistisch signifikanten Unterschiede. Die BCL-2 Expression nahm allerdings bei den FL1-3A mit zunehmendem Grad ab. In zytogenetischen Untersuchungen wurden in allen follikulären Lymphomen Grad 1 bis 3A primäre bzw. sekundäre Chromosomenaberrationen gefunden. Unter den rekurrenten chromosomalen Alterationen trat die Translokation t(14;18)(q32;q21) am häufigsten auf und war insbesondere bei follikulären Lymphomen Grad 1 und 2, in etwas geringerem Maße auch bei FL Grad 3A anzutreffen. Diese Translokation scheint also in einem frühen Stadium der B-Zell-Entwicklung aufzutreten und führt primär zu einem höher differenzierten (zentrozytenreichen) Lymphom. Die t(14;18) bedingt zumeist eine Überexpression des BCL-2 Gens, die sich auch immunhistochemisch nachweisen lässt und diagnostische Verwendung findet. Das BCL-2 Protein ist daher von Nutzen für die Unterscheidung neoplastischer von reaktiven Follikeln, nicht aber, um follikuläre von anderen „low grade“ B-Zell Lymphomen zu unterscheiden. Die sekundären Alterationen charakterisieren bestimmte undifferenzierte Stadien mit hohem Blastenanteil und einer hohen mitotischen und proliferativen Aktivität. In zytogenetischen Untersuchungen von überwiegend diffus wachsenden FL konnte keine Translokation t(14;18)(q32;q21) nachgewiesen werden. Die identische Morphologie dieser Lymphome und die identischen Veränderungen auch auf genetischer Ebene deuten auf die nahe Verwandtschaft der überwiegend diffus wachsenden FL mit den typischen Keimzentrums-lymphomen hin. Es handelt sich jedoch um eine eigenständige Identität, die differenzierten Keimzentrumslymphome, die wahrscheinlich aufgrund des Fehlens einer t(14;18)(q32;q21) ein primär und ausgeprägt diffuses Wachstumsmuster aufweisen.
Mantelzell-Lymphome gehören mit einem Anteil von ca. 5-10 % der B-Zellneoplasien zu den aggressiven lymphatischen Tumoren und sind, neben der histologisch-morphologischen und klinischen Präsentation, in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle durch eine chromosomale Translokation t(11;14) sowie die Expression der Oberflächenmarker CD5, CD20 und Cyclin D1 gekennzeichnet (sog. Cyclin D1-posive Tumoren). Bei einigen fehlt jedoch eine Expression von Cyclin D1 (sog. Cyclin D1-negative Tumoren). Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die genetische Charakterisierung von 77 Mantellzell-Lymphomen mittels komparativer genomischer Hybridisierung, die Detektion vorhandener chromosomaler Imbalanzen sowie der Vergleich beider Gruppen bezüglich ihrer Aberrationsmuster.
MALT-Lymphome der Lunge gehören als extranodale Marginalzonen-B-Zell-Lymphomen zu den malignen Non-Hodgkin-Lymphomen. Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass rekurrenten genetischen Translokationen eine wichtige Rolle bei der Tumorgenese zukommt. Eine zentrale Rolle nimmt die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkappaB ein, die Folge solcher rekurrenter Translokationen (z.B. t(11;18)(q21;q21), t(14;18)(q32;q21), t(1;14)(p22;q32)) und numerischer Chromosomenaberrationen (Trisomie 3, Trisomie 18) ist. In der vorliegenden Arbeit haben wir 60 Fälle extranodaler Marginalzonen-B-Zell-Lymphome der Lunge bezüglich der genannten genetischen Translokationen untersucht. Es ist dies die größte bisher in der Literatur beschriebene Serie von MALT-Lymphomen in dieser Lokalisation. Die Untersuchung der t(11;18) ergab in der vorliegenden Arbeit eine geringere Häufigkeit als in der Literatur beschrieben, wobei zu berücksichtigen ist, dass die bisher vorgestellten Studien deutlich geringere Fallzahlen aufwiesen. Bezüglich der Translokationen t(14;18), t(1;14), t(3;14) und der Trisomie 3 waren in der vorliegenden Studie ähnliche Häufigkeiten zu finden, wie sie in der Literatur beschrieben sind. Als möglichen alternativen Aktivierungsweg des Zellzyklus zeigte sich in dieser Studie neben den genannten Translokationen sowohl eine Trisomie 3 als auch eine Amplifikation der Genkopienzahl von MALT1. Im Vergleich der genetischen und immunhistochemischen Ergebnisse bezüglich der FOXP1- und der BCL10-Expression zeigte sich für FOXP1 eine hohe Korrelation zwischen immunhistologischer Expression und genetischem Nachweis einer Genaktivierung, während für BCL10 eine starke Diskrepanz bezüglich Sensitivität und Spezifität gefunden wurde, so dass die immunhistologische Analyse nur einen Hinweis auf das Vorliegen einer genetischen Translokation zu geben vermag, aber nicht als Surrogatmarker zu verwenden ist.
Das Harnblasenkarzinom ist eines der häufigsten urogenitalen Karzinome. In den letzten Jahren wurden zunehmend neue molekulare Marker entwickelt, um Karzinome nicht-invasiv detektieren zu können, darunter die chromosomale Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung. In der vorliegenden Studie sollte die Durchführbarkeit der Methode an bereits zytologisch aufbereiteten (gefärbten) Präparaten untersucht, bereits erhobene zytologische Untersuchungsergebnisse mit den FISH-Resultaten verglichen, zytologisch zweifelhafte Befunde geklärt und retrospektiv festgestellt werden, ob eine im Verlauf beobachtete Karzinomentwicklung (positives follow-up) zu einem früheren Zeitpunkt bei noch negativen zytologischen Resultaten durch die FISH-Methode nachweisbar gewesen wäre. In die vorliegende Studie gingen 79 zytologische Präparate ein, darunter HE- und Papanicolaou-gefärbte Präparate. Alle Präparate wurden nach mehreren Waschschritten in einer Proteaselösung inkubiert und danach mit der Sondenmischung des UroVysion™ Bladder Cancer Recurrence Kits inkubiert, die mit zentromerspezifischen Chromosomensonden und einer Lokus-spezifischen Sonde die Chromosomen 3, 7, 17 und den Lokus 9p21 fluoreszenzmarkiert. Anschließend erfolgte die Hybridisierung und das Gegenfärben. Bei der Befundung nach Vysis™-Kriterien musste das Präparat für eine positive (maligne) Befundung vier oder mehr der 25 Zellkerne mit einer Zunahme der Signale der Chromosomen 3, 7 oder 17 oder 12 oder mehr Zellkerne mit einem oder keinem Signal für 9p21 aufweisen. Nach den Kriterien der Basler Arbeitsgruppe galt ein Präparat mit 2 oder mehr Zellkernen mit Signalzunahme bei Chromosom 3, 7 und 17 oder bei Verlust eines oder beider 9p2-Signale als maligne. Im Hinblick auf die erbrachten Ergebnisse war FISH nach Vysis-Schema deutlich sensitiver als die Zytologie (79,2 % vs. 54,2 %). Die Auswertung nach Basel war gleich sensitiv, jedoch mit 76,4 % deutlich weniger spezifisch (Vysis-Verfahren 92,7 %, Zytologie 98,2 %). Zytologie und FISH waren bei höher-gradigen Karzinomen gleich sensitiv (je 100 %). Die Sensitivität nahm mit dem Grad der Zellaberrationen ab. 91 % betrug die Sensitivität der FISH bei G2-Karzinomen gegenüber 72,7 % der Zytologie. Daneben kann von einer prognostischen Aussagekraft aktuell falsch-positiver Vysis-Ergebnisse ausgegangen werden. Ungefärbte Präparate und HE-gefärbte Präparate zeigten sich unabhängig von der Gewinnungsmethode des Zellmaterials als uneingeschränkt zugänglich für eine FISH-Auswertung. Papanicolaou-gefärbte Routinepräparate waren in der Auswertung unbefriedigend mit falsch-negativen Resultaten. Die Klärung zytologisch zweifelhafter Befunde gelang auch mit FISH nur unbefriedigend. Beide Verfahren hatten im schwierig diagnostizierbaren Bereich der niedriggradigen Karzinome Sensitivitätseinbußen und kamen bei den G1-Karzinomen auf eine Sensitivität von je 60 %. Höhergradige Karzinome (G3) wurden von beiden Verfahren sicher detektiert. Retrospektiv konnte festgestellt werden, dass FISH in vielen Fällen eine im Verlauf beobachtete Karzinomentwicklung (positives follow-up) zum Zeitpunkt der negativen zytologischen Beurteilung hat nachweisen können. Zusammenfassend erwies sich FISH als ein Untersuchungsverfahren mit guter diagnostischer und prognostischer Aussagekraft.
Ziel der in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Untersuchungen war eine nähere Charakterisierung von peripheren T-Zell-Lymphomen (PTCL). Hierfür wurden im Wesentlichen zwei Ansätze verfolgt: Im ersten Ansatz sollten für die Tumorzellen der verschiedenen PTCL korrespondierende Normalzellen identifiziert werden, um deren Eigenschaften und Funktionen mit denen der neoplastischen Zellen vergleichen zu können. Im zweiten Ansatz sollten die hierdurch gewonnenen Erkenntnisse in weiterführende Untersuchungen umgesetzt werden, um Hinweise auf die Mechanismen der Tumorzelltransformation in den verschiedenen PTCL zu erhalten. Zur Bearbeitung des ersten Ansatzes wurde eine PCR-basierte Methode entwickelt, mit der sich das in den Tumorzellen klonal rearrangierte T-Zell-Rezeptor (TCR)Vbeta-Segment bestimmen lässt, um anschließend den Phänotyp der Tumorzellen unter Zuhilfenahme eines gegen dieses Segment gerichteten Antikörpers in immunhistochemischen Mehrfachfärbungen zu definieren. Es konnte gezeigt werden, dass sich angioimmunoblastische T-Zell-Lymphome (AILT) und großzellig anaplastische Lymphome (ALCL) jeweils einer T-Effektorzell-Population und eine Untergruppe der peripheren T-Zell-Lymphome, nicht weiter spezifiziert (PTCL-NOS) einer T-Gedächtniszell-Population zuordnen lassen. Ausgehend vom Phänotyp bereits bekannter T-Zell-Subpopulationen wurde darüber hinaus versucht, aus der heterogenen Gruppe der PTCL-NOS weitere Untergruppen einem bestimmten T-Zell-Entwicklungsstadium zuzuordnen. Die diesbezüglichen Ergebnisse legen nahe, dass es eine seltene Gruppe von PTCL gibt, die sich von regulatorischen T-Zellen ableitet, und sich durch einen sehr aggressiven Krankheitsverlauf auszeichnet. Diese Erkenntnis könnte in Zukunft Auswirkungen auf das therapeutische Vorgehen, beispielsweise in Form einer individuell abgestimmten, aggressiveren Therapie, haben. Als wegweisender Nebenbefund der durchgeführten PCR-basierten immun-histochemischen Untersuchungen sind die Ergebnisse der Analysen von ALCL anzusehen. Bei diesen Tumoren konnte gezeigt werden, dass die fehlende Expression von TCR sowie TCR-assoziierten Molekülen trotz des Vorhandenseins klonal rearrangierter TCR ein wesentliches Merkmal dieser Entität darstellt. Diese Erkenntnis stellt eine neue vereinigende Eigenschaft von ALK- (anaplastic lymphoma kinase) und ALK+ ALCL dar, die insbesondere auch zur Abgrenzung gegenüber anderen CD30+ PTCL in der Diagnostik herangezogen werden kann. Inwiefern das Fehlen der über den TCR vermittelten Signale, die normalerweise über den JAK/STAT Weg die Proliferation hemmen und letztlich zu Wachstumsstopp und Apoptose führen, auch zur Tumorzelltransformation beiträgt, muss in weiteren Untersuchungen geklärt werden. TCR-knock-out/down Experimente bzw. die Reexpression eines TCR in entsprechenden ALCL-Zelllinien könnten diese Aspekte weiter beleuchten. Ein weiterer interessanter Aspekt sind die Parallelen zu dem morphologisch ähnlichen Hodgkin-Lymphom, das sich von B-Zellen ableitet, jedoch ebenfalls keinen B-Zellrezeptor (BCR) exprimiert. Das abberante TCR/BCR-Signaling könnte zu der ungewöhnlichen, anaplastischen Morphologie der neoplastischen Zellen in beiden Lymphomen beitragen, da auch Veränderungen des Aktin-Zytoskeletts durch diese Signalkaskaden vermittelt werden. Hier könnten insbesondere vergleichende Untersuchungen zu einem besseren Verständnis dieser Tumoren beitragen. Der Befund, dass die Tumorzellen des AILT einen Effektorzellphänotyp aufweisen, hat uns dazu veranlasst, nach Ursachen zu suchen, die in den Tumorzellen die bei diesem Zelltyp zu erwartende Apoptose verhindern. SNP-Analysen und immunhistochemische Untersuchungen der Apoptose-assoziierten CTLA-4- und FAS-Gene bzw. deren Expression haben jedoch keine Hinweise auf einen hier gelegenen Apoptosedefekt ergeben. Es sind somit weiterführende Untersuchungen der FAS- und CTLA-4-Signalwege sowie anderer Apoptose-assoziierter Moleküle nötig, um der nach wie vor naheliegenden Hypothese eines Apoptosedefekts als pathogenetisch relevanten Faktor in AILT nachzugehen. Aus den in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Untersuchungen haben sich zahlreiche neue Aspekte ergeben, die Ausgangspunkt für ein besseres Verständnis der Biologie dieser Erkrankungen sein können. Nicht zuletzt könnten diese Ergebnisse dazu beitragen eine Klassifikation der T-Zell-Lymphome zu erstellen, die sich analog zu der Klassifikation der B-Zell-Lymphome an der korrespondierenden Normalzelle orientiert und letztlich die Diagnostik und Therapie und damit die Prognose dieser Tumoren verbessert.
NFAT transcription factors play critical roles in gene transcription during immune responses. Besides regulation of lymphokine promoters in T lymphocytes, NFAT factors are also expressed in other cell types and regulate the activity of numerous genes that control the generation of cardiac septa and valves in embryonic heart, the formation of blood vessels, the outgrowth of neuronal axons and the differentiation of osteoclasts during bone formation [10, 24]. Here we show that the induction of NFATc/αA in effector T cells is controlled by a strong inducible promoter, P1. It results in splicing of exon 1 to exon 3 transcripts and, in concert with the activity of a poly A site downstream of exon 9, leads to the massive synthesis of NFATc/αA in effector Th1 cells. A second, weak promoter, P2, lies in front of exon 2 and directs the synthesis of longer NFAT β isoforms. Both P1 and P2 direct the synthesis of three different RNAs: αA, αB, αC and βA, βB, βC correspondingly. The B and C isoforms arise from alternative splicing and poly A addition at the distal site pA2. P1 but not P2 activity is autoregulated by NFAT factors which bind to two tandemly arranged NFAT sites within P1 and enhance its induction. In resting T cells, the NFATc1/β RNAs are the most prominent nfatc1 transcripts and their synthesis is reduced upon T-cell activation. However, following activation in primary effector T cells or in T-cell lines of human or murine origin, a 15–20-fold induction of NFATc1/αA RNA was detected, whereas only a 2–5-fold increase was observed for the NFATc1/αB or NFATc1/αC RNAs. Optimal induction of P1 promoter require involving of a persistent increase in free cytosolic Ca2+ induced by ionomycin, which stimulates the nuclear translocation and transcriptional activation of all NFATc factors and phorbol esters, which activate protein kinase C and other protein kinase pathways in T cells. This suggests that both TCR and co-receptor signals contribute to give full P1 nfatc1 induction. Because NFATc1/αA induction is unaffected in NFATc2+c3 double-deficient T cells, NFATc1 autoregulates its own synthesis by controlling P1 activity and NFATc1/αA induction. P1 promoter contains tandemly arranged NFAT core binding motif TGGAAA to witch bind monomeric NFATc1 proteins and numerous conservative binding sites of other transcriptional factors like CREB, Fos, ATF-2, Sp1, NF-kB and GATA suggesting complex multi-factor regulation of NFATc1 gene. We also highlight that initial phase of nfatc1 transcription in naive CD4+ T cells is controlled by the promoter P2 which is constitutively active in resting T cells. The activation of resting T cells results in a decrease of P2 and the induction of P1 activity and, under optimal conditions, in the predominant synthesis of NFATc1/αA in effector T cells. In addition to the high concentrations of poly A factors required for optimal pA1 function, the levels of transcription factors, in particular NFATs, must also increase for P1 induction. That could be explained by achievement of certain threshold levels for transcriptional activation. Finally, the altered transactivation potential of NFATc1/αA suggests a specific role for this NFATc1 protein in gene control, such as in Th1 effector cells where NFATc1/αA is synthesized at high concentrations.
In vorangegangenen Studien an extranodalen diffus großzelligen B-Zell-Lymphomen des Magens, im Englischen als „gastric diffuse large B-cell lymphoma“ bezeichnet (DLBCL), hat unsere Studiengruppe einige genomische Aberrationen entdeckt. Eine dieser Aberrationen - „loss of heterozygosity“ (LOH) - befand sich auf dem langen Arm des Chromosoms 7. Um diese auffällige Region und das gesamte Chromosom 7 noch näher auf Aberrationen zu untersuchen, wurde eine Analyse mit 29 Mikrosatellitenmarker durchgeführt und eine genaue Chromosomenkarte der genetischen Aberrationen auf Chromosom 7 erstellt. In dieser Studie fanden sich 5 sogenannte Hot-Spots von Aberrationen. Insgesamt fanden wir bei 42% der 31 untersuchten DLBCL eine solche Aberration. Die häufigste genetische Aberration auf Chromosom 7 (20,7% der informativen Fälle) war der Verlust einer Region in der zytogenetischen Bande 7p21.1. Ein weiterer LOH-Hot-Spot auf 7p wurde in 3 Lymphomen (10%) bei 7p12.1-13 identifiziert. In diesem Hot-Spot liegt der Gen-Lokus für das Ikaros-Gen. Der lange Arm von Chromosom 7 wies mehrere Aberrationen auf: erstens in der Bande 7q31.1-32.2, zweitens bei 7q34-36.3. Zusätzlich identifizierten wir einen Amplifikations-Hot-Spot auf dem langen Arm; er war in der Bande 7q22.3-31.1 lokalisiert und kam bei 4 Tumoren vor (12,9%). Das Vorkommen genetischer Aberrationen auf Chromosom 7 bei DLBCL ist deutlich höher als anfänglich erwartet. Solch häufige genetische Auffälligkeiten sprechen dafür, dass mögliche neue Tumorsuppressorgene und Onkogene in den oben näher bezeichneten Regionen lokalisiert sind.
In this study, murine ES cells and DT40 B cells were used in parallel to disrupt the Nfatc1 gene and to study the function of individual 6 Nfatc1 isoforms, especially the function of highly inducible NFATc1/aA.We found that the short isoform NFATc1/aA protects DT40 B cells against apoptosis while the long isoform NFATc1/aC appears to enforce apoptosis. DNA microarray studies have shown that in NFATc1" DT40 B cells expressing ectopically human NFATc1/aA, the pkc-theta gene is several fold stronger expressed as in wild type cells. Our results of EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays) and ChIP (chromatin immuno-precipitation) experiments demonstrated the binding of NFATc1/aA to the pkc-theta promoter in vitro and in vivo. NF-kappa B was also found to bind to the NFATc1 P1-promoter in vitro and in vivo. These data suggest and further prove that NF-kappa B contributes to the induction of the NFATc1 P1 promoter upon activation of T cells. So, NFATc1/aA and NF-kappa B were found to cross-talk in the transcriptional upregulation of their target genes, such as the IL-2 gene and the Nfatc1 gene itself, at multiple steps upon induction of apoptosis. While the pro-apoptotic mechanism of NFATc1s long isoform(s) remains unclear, its corresponding “death partners” are worth further studies. The elucidation of functional roles of NFATc1s short or long isoforms in the control of apoptosis of lymphocytes helps to understand apoptosis regulation, and thereby, the fate of lymphocytes.
Sowohl NFAT- (Nukleäre Faktoren aktivierter T-Zellen) als auch MEF2- (’myosin-enhancer factor 2’) Transkriptionsfaktoren spielen eine wichtige Rolle bei der Differenzierung, Proliferation oder Apoptose vieler eukaryotischer Zellen. Sie sind in einer Vielzahl von Zellen aktiv und können dort die Transkription ihrer Zielgene nach Stimulation der Zellen mit anschließendem Calcium-Einstrom aktivieren. Dabei kooperieren sie oft mit anderen Transkriptionsfaktoren. Kurz vor Beginn dieser Arbeit erschienen zwei Veröffentlichungen, die eine Kooperation von MEF2D mit NFATc2 bei der Aktivierung des nur77-Promotors, der bei der negativen Selektion von T-Zellen aktiv ist, beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit sollte nun das Bindungsverhalten verschiedener NFAT-Proteine an den nur77-Promotor und ihre Kooperationsfähigkeit mit MEF2D bei der Aktivierung des nur77- und anderer Promotoren untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass verschiedene NFAT-Faktoren direkt an ein Oligonukleotid des nur77-Promotors (von Position -274 bis -247 bp reichend) binden. Diese Bindung wird zwar durch eine Bindung von MEF2-Faktoren an den Promotor unterstützt, ist jedoch nicht wesentlich beeinträchtigt, wenn MEF2-Faktoren aufgrund von einer Mutation in ihrer Bindungssequenz nicht binden können. Dagegen führt eine Mutation der NFAT-Bindungsstelle zu einer aufgehobenen Bindung von NFAT-Faktoren an den Promotor. Desweiteren zeigte sich, dass nicht nur endogenes NFATc2 sondern auch verschiedene NFATc1-Isoformen an den Promotor binden können. In ihrer Fähigkeit mit MEF2D zu kooperieren, zeigte sich kein Unterschied zwischen den getesteten NFAT-Isoformen NFATc1/αA, NFATc1/αC oder NFATc2. So aktivierten in Transfektionsversuchen in Jurkat T-Zellen und 293 T-Zellen alle NFAT-Proteine die Luciferase-Reporter-Gen-Konstrukte gemeinsam mit MEF2D in etwa additiver Weise. Dies konnte an verschiedenen Luciferase-Reporter-Genen (nur77-gesteuert, hFasL-gesteuert und desmin-gesteuert) nachgewiesen werden, was auf eine mögliche Kooperation der verschiedenen NFAT-Faktoren mit MEF2D (und evtl. auch anderen MEF2-Faktoren) nicht nur bei der Apoptose von T-Zellen sondern auch in anderen Zellen hinweist.
Vor fast 100 Jahren postulierte Paul Ehrlich ein körpereigenes System, das in der Lage ist, Tumorentstehung zu erkennen und zu eliminieren. Die Weiterentwicklung dieser Hypothese führte in den Folgejahren zum Modell der „immunosurveillance“, einer angeborenen Wachfunktion des Immunsystems, welche im Regelfall die Entstehung von manifesten Tumoren verhindern kann. Neben zellulären Bestandteilen wie Makrophagen und natürlichen Killerzellen kommt dabei eine entscheidende Bedeutung den B-Lymphozyten mit ihrer Fähigkeit zur Produktion eines variablen Antikörperrepertoires zu. Diese angeborene, IgM-vermittelte, humorale Abwehrfunktion richtet sich insbesondere auch gegen glykopeptidische Oberflächenantigene maligner körpereigener Zellen. Allerdings scheint sich in seltenen Einzelfällen ein Tumorprozess durch Fluchtmechanismen dem Zugriff der Immunabwehr entziehen zu können. Die intensiven Wechselwirkungen von Immunsystem und Tumorwachstum sind Ziel weitreichender Forschung geworden, angetrieben von der Hoffnung, in naher Zukunft neue immunologische Therapieverfahren gegen maligne Tumoren aufbieten zu können. Bisher wenig untersucht ist allerdings die lokale Situation der humoralen Immunität innerhalb von Tumorgewebe. Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit eine Sequenzanalyse des exprimierten Immunglobulin-Repertoires in situ, also aus gewebeständigen tumorinfiltrierenden B-Lymphozyten und solchen aus tumorfreiem Gewebe vorgenommen. Als Ausgangsmaterial diente Gewebe aus Magenkarzinomen und tumorfreier Magenschleimhaut des Magenantrums von acht Patienten mit fortgeschrittener Tumorerkrankung. Adenokarzinome des Magens stellen eine multifaktoriell bedingte, weltweit häufig auftretende Tumorentität mit besonders schlechter Prognose dar. In der Tat zeigen sich in den vorliegenden Ergebnissen signifikante Unterschiede zwischen Tumor und Antrum in den variablen Schwerkettengenen der gewebeständigen B-Lymphozyten. Diese betreffen sowohl die IgVH- Familienzugehörigkeit als auch die Mutationsraten und Mutationsmuster der einzelnen Sequenzen. Die entscheidenden Beobachtungen im Rahmen dieser Arbeit sind der in situ- Nachweis von naiven, nicht immunitätsgereiften Immunglobulinen der primären Immunantwort, insbesondere der mit Antitumoraktivität in Verbindung gebrachten IgVH3-Familie innerhalb des untersuchten Antrumgewebes sowie deren Fehlen innerhalb des Tumorprozesses. Der Nachweis affinitätsgereifter Immunglobuline innerhalb des Tumorprozesses legt eine zwar intensive, aber letztendlich ineffektive Auseinandersetzung des Immunsystems mit dem sich offenbar in diesem Stadium nicht mehr als ausreichend immunogenen erweisenden Tumorprozess nahe. Diese Ergebnisse heben die entscheidende Bedeutung der naiven Immunität für die Verhinderung von Tumoren (Immunüberwachung) hervor. Unklar sind allerdings nach wie vor die Escape-Mechanismen, die es einem Tumor erlauben, sich dieser primären Immunantwort zu entziehen. Weitere Forschungsarbeit im Bereich naiver Immunglobuline mit Antitumoraktivität, wie beispielsweise dem selektiv an Magenkarzinomzellen bindenden und Apoptose auslösenden Antikörper SC-1, könnte dazu beitragen, zukünftig völlig neue adjuvante immunologische Therapieverfahren in der Tumortherapie zu etablieren.
In der vorliegenden Arbeit wurden Lymphoproliferationen und maligne Non-Hodgkin-Lymphome der B-Zellreihe, die eine Infektion der Tumorzellen mit dem Epstein-Barr Virus aufwiesen, hinsichtlich ihres Immunphänotyps und ihrer zytogenetischen Aberrationen durch Fluoreszenz in-situ Hybridisierung charakterisiert. Von besonderer Bedeutung war es, durch eine detaillierte Analyse der klinischen Daten Vorerkrankungen/Zweiterkrankungen mit einer möglichen Immunsuppression zu identifizieren. Die erhaltenen Daten wurden mit denen EBV-negativer diffuser grosszelliger B-Zell Lymphome verglichen. In der Gewebe-Array-Technik konnten letztlich 69 Fälle detailliert charakterisiert werden. Von 53/69 (77%) dieser Lymphoproliferationen, die sämtlich eine EBV-Assoziation aufwiesen, konnten klinische Daten erhalten werden. Die detaillierte Analyse dieser Daten zeigte, dass in der grossen Mehrzahl der Fälle eine für eine EBV-Infektion prädisponierende Vor- bzw. Grunderkrankung vorlag (44/69 Fälle, 64%). Dabei handelte es sich in 9 Fällen um eine HIV-Infektion, in 12 Fällen um eine Post-Transplantations lymphoproliferative Erkrankung, in 19 Fällen um einen Zustand nach vorangegangener, therapierter Lymphomerkrankung und in vier Fällen um einen Zustand bei Methotrexatbehandlung oder vergleichbarer medikamentöser Immunsuppression. In neun Fällen war nachweislich keine zu einer möglichen Immunsuppression führende Grunderkrankung eruierbar; diese Tumoren, die bei Patienten mit einem Durchschnittsalter von 72,7 Jahren auftraten, entsprechen wahrscheinlich den in der Literatur beschriebenen „senilen“ EBV-assoziierten Lymphoproliferationen, bei denen eine durch das fortgeschrittenen Lebensalter bedingt reduzierte Fähigkeit des Immunsystems zu einer adäquaten Viruskontrolle diskutiert wird. Klinische Angaben, die auf eine mögliche Immunsuppression und damit auf eine mögliche EBV-Assoziation hindeuten, lagen zum Zeitpunkt der Vorstellung des Falles im Referenzzentrum bemerkenswerterweise nur in 26/69 Fällen (38%) vor.EBV-assoziierte Lymphoproliferationen und Lymphome gehören signifikant häufiger dem (immunhistochemisch definierten) non-GCB-Subtyp als dem GCB-Subtyp der DLBCL an (73% versus 37%; p<0,0001). Hier lag ein zusätzlicher interessanter Aspekt vor: EBV-assoziierte Lymphoproliferationen, die aufgrund ihrer Reaktivität der Tumorzellen für CD10 dem GCB-Typ zugeordnet worden waren, exprimierten nur in einer Minderzahl der Fälle (1 von 12; 8%) gleichzeitig auch BCL-6, ein Befund, der bei sporadischen, EBV-negativen DLBCL nur äußerst selten zu finden war (1 von 50; 2%). Weitere immunhistochemische Unterschiede zwischen EBV-assoziierten und EBV-negativen DLBCL lagen für die Expression des Aktivierungsmarkers CD30, der bei EBV-negativen DLBCL eher selten exprimiert wird, aber bei EBV-positiven DLBCL/-Lymphoproliferationen signifikant häufiger positiv ist, und auch für CD138 vor. Auch dieser Marker einer plasmazellulären Differenzierung war bei EBV-positiven DLBCL häufiger exprimiert, wohingegen die Expression von BCL-2 und BCL-6 in den Tumorzellen EBV-assoziierter LPD seltener war. Der häufigere non-GCB-Status, die vermehrte Expression von CD138 und die geringere Reaktivität für BCL-6 legen nahe, dass EBV-assoziierte DLBCL/Lymphoproliferationen offensichtlich aus B-Zellen bestehen oder hervorgegangen sind, die die Keimzentrumsreaktion bereits durchlaufen hatten. Die Analyse der interphasenzytogenetischen Daten und ihr Vergleich zu klassischen zytogenetischen Daten einer Kontrollgruppe von sporadischen DLBCL zeigte, dass chromosomale Bruchereignisse und auch eine TP53 Mutation (ausgewiesen durch die immunhistochemisch nachgewiesene Überexpression des Gens) nur bei denjenigen Fällen auftrat, die konventionell-morphologisch als DLBCL charakterisiert worden waren. Im Vergleich zur Kontrollgruppe wurde eine signifikant häufigere Rearrangierung von CMYC in EBV-assoziierten DLBCL gefunden; im Gegensatz hierzu waren Bruchereignisse im BCL2- und im BCL6-Locus ohne signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe. Als „Nebenbefund“ konnte in dieser Studie eine Infektion eines – offenbar primär nodalen – DLBCL vom immunoblastisch-plasmoblastischen Subtyp bei einem HIV-positiven Patienten durch das humane Herpesvirus 8 (HHV8) nachgewiesen werden. Diese Konstellation stellt insofern eine Rarität dar, da HHV8-positive DLBCL zumeist extranodal, z.B. in Form des sogenannten „Primären Effusions-Lymphoms“ (PEL) oder in Assoziation zu einer multizentrischen Castleman-Erkrankung bei HIV-positiven Patienten auftreten.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine detaillierte Analyse des Chromosom 17p-Status in DLBCL durchgeführt, welches das TSG TP53 beinhaltet. Eine monoallelische Deletion dieses Gens fand sich in 16% der Patienten (28/172), darüber hinaus lag in 3% (6/172) der Patienten ein Verlust in Chromosom 17p ohne Alteration des TP53-Lokus vor. Zur Untersuchung des zweiten TP53-Allels wurden an allen 28 Patienten mit sowie an 27 Patienten ohne TP53-Deletion Mutationsanalysen durchgeführt. Eine vollständige Inaktivierung des TP53-Gens durch Deletion und Mutation konnte in 46% der 17p-deletierten Fälle (13/28) gezeigt werden. In 54% der 17p-deletierten DLBCL (15/28) lag lediglich eine monoallelische TP53-Deletion ohne gleichzeitige Mutation des zweiten Allels vor. 26% der DLBCL mit nicht-deletiertem TP53 (7/27) zeigten eine monoallelische Mutation des TP53-Gens. Diese Ergebnisse deuteten auf weitere TSG in der chromosomalen Region 17p13 hin. Mit der Durchführung einer detaillierten Deletionsanalyse von Chromosom 17p13.1 bis 17p13.3 wurden folgende Ergebnisse erzielt. In insgesamt 41% der DLBCL mit nicht-deletiertem TP53-Gen (11/27) konnte eine minimal deletierte Region identifiziert werden, welche die chromosomale Bande 17p13.3 einschließlich des genetischen Lokus des TSG HIC1 betraf. Eine Deletion von TP53 war in allen untersuchten Fällen mit einem subtotalen Verlust des kurzen Armes von 17p einschließlich der o.g. minimal deletierten Region verbunden. Mehrere Hinweise deuten darauf hin, dass die Inaktivierung von HIC1 eine entscheidende Rolle in der Pathogenese von DLBCL einnimmt. In 55% der untersuchten DLBCL (30/55) wurde eine Hypermethylierung des HIC1-Promoters nachgewiesen. In 90% der HIC1-hypermethylierten DLBCL (27/30) lag zudem eine gleichzeitige Deletion des HIC1-Lokus vor, was eine biallelische Inaktivierung des TSG, analog der „two-hit“-Hypothese nach Knudson, nahe legte. Eine vollständige durch Hypermethylierung und Deletion verursachte HIC1-Inaktivierung konnte auch in sieben Fällen mit Wildtyp TP53-Status gezeigt werden. Die Überlebenszeit von Patienten mit einer gleichzeitigen HIC1- und TP53-Inaktivierung war im Vergleich zu Patienten mit alleiniger Inaktivierung von TP53 deutlich verkürzt. Es konnte somit gezeigt werden, dass in den untersuchten DLBCL, über die klinisch bedeutsame und prognostisch relevante Inaktivierung von TP53 hinaus, ein weiteres TSG unabhängig von oder in Kombination mit TP53 alteriert ist, und einen Einfluss auf die Überlebenszeit der Patienten hat.
Angeborene Immunität des Menschen : Kreuzreaktionen tumorspezifischer monoklonaler IgM-Antikörper
(2007)
Die von CD5-positiven B-Zellen produzierten natürlichen Antikörper sind humorale Bestandteile des angeborenen Immunsystems. Sie kommen im Körper bereits vor, ohne dass ein Antigen-Kontakt stattgefunden hat und dienen dazu, den Organismus schnell und effektiv vor eindringenden Pathogenen zu schützen, möglichst noch bevor die erworbene Immunabwehr aktiviert werden muss. Zudem werden körpereigene Moleküle erkannt, die normalerweise geschützt intrazellulär vorliegen und erst bei Zellnekrose freigesetzt und so dem Immunsystem zugänglich gemacht werden. Außerdem konnten mit Hilfe der humanen Hybridoma Technologie aus Krebspatienten und gesunden Probanden natürliche Antikörper isoliert werden, die transformierte Zellen erkennen und beseitigen. Die natürlichen Antikörper sind keimbahncodiert und erhöhen im Gegensatz zu Antikörpern der erworbenen Immunabwehr nicht ihre Variabilität durch Mutationsereignisse und Reifung. In früheren Studien wurde beobachtet, dass natürliche Antikörper nicht spezifisch ein Antigen binden, sondern dass bestimmte häufig vorkommende und in der Evolution konservierte Antigen-Muster erkannt werden. Daraus folgerte man, dass natürliche Antikörper ihre Antigene „unspezifisch“ binden, so dass sich eine Vielzahl von Kreuzreaktionen mit verschiedenen Antigenen ergibt. Derartige Kreuzreaktionen der natürlichen Antikörper wurden bereits 1986 beschrieben. Ziel der vorliegenden Arbeit war zu zeigen, dass es innerhalb der natürlichen Antikörper verschiedene Pools mit unterschiedlichen Aufgaben gibt und dass natürliche Antikörper nicht wahllos beliebige Antigene binden, sondern dass sich ihr Reaktionsmuster aus ihrer Aufgabe innerhalb des menschlichen Immunsystems ergibt. Es wurden anhand des ELISA-Verfahrens Kreuzreaktionen der natürlichen Antikörper mit humaner DNA, körpereigenen Zytoskelettproteinen (Actin, Myosin, Keratin, Desmin, Vimentin) und Molekülen untersucht, die die innate Immunabwehr über Toll-like-Rezeptoren aktivieren können (LPS, LTS, PGN, Flagellin, HSP 70, bakterielle DNA, H.pylori-CagA und -VacA). Es konnte gezeigt werden, dass den 17 untersuchten Antikörpern CM-1, CM-2, LM-1, M6, NORM-1, NORM-2, NORM-3, NORM-4, PAM-1, PM-1, PM-2, SAM-1, SAM-3, SAM-4, SAM-5, SAM-6, SC-1 hauptsächlich die Aufgabe zukommt, transformierte Zellen zu beseitigen. Ihre Reaktionsweise ist also nicht „unspezifisch“, sondern „oligospezifisch“ innerhalb ihres Aufgabenbereichs. Zudem fiel in früheren Studien eine deutliche Korrelation zwischen der Anzahl durchgemachter Mutationen und dem Reaktionsmuster der Antikörper mit Tumorzellen auf: keimbahncodierte Antikörper ohne Mutationen reagierten immer mit einem breiten Spektrum verschiedener Tumore oder sogar Vorläuferläsionen, wohingegen das Spektrum der Reaktionen mit steigender Zahl von Mutationen abnahm. Bei den in dieser Arbeit untersuchten Antigen-Antikörper-Reaktionen konnte kein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Reaktionsweise und dem genetischen Ursprung oder der Anzahl durchgemachter Mutationen hergestellt werden.
Sumoylation of transcription factors modulate their activity (either upregulating or downregulating) by altering protein-protein interactions as well as subcelluar/subnuclear localization. The transcription factor family of NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) plays an important role in cytokine gene regulation in T cells. Due to alternative usage of two promoters (P1 & P2), two polyadenylation sites (pA1 and pA2) and alternative splicing events, NFATc1 is expressed in six isoforms which are NFATc1/alphaA, betaA, alphaB, betaB, alphaC and betaC, where alpha and beta refer to two different 1st exons and A, B, C to the differentially spliced and extended C-termini. The short isoforms of NFATc1 (NF-ATc1/A) contain a relatively short C terminus whereas, the longer isoforms, B and C, span the extra C-terminal peptides of 128 and 246 aa, respectively. To analyze the specific biological effects of NFATc1 isoform, a yeast two hybrid screening of a human spleen cDNA library with extra C-terminal peptide of NFATc1 as a bait, was performed. At the end of the assay, the proteins involved in the sumoylation pathway such as Ubc9, PIAS1 were detected with highest frequencies and subsequently were were able to demonstrate that NFATc1 is sumoylated. The extent of sumoylation is isoform specific. While NFATc1/A, harboring only one sumoylation site, shows very weak sumoylation, the two additional sites within NFATc1/C lead to efficient sumoylation. This modification directs NFATc1/C into SUMO-1 bodies, which in turn colocalize with PML-nbs. Furthermore, sumoylated NFATc1/C recruits the transcriptional co-repressors HDAC (both class I as well as class II HDACs) which results in a significant decrease of the level of histone acetylation on the IL-2 promoter, an important NFATc1 target gene. As a consequence of this, a decrease of IL-2 production was observed, while NFATc1/C, which can no longer be sumoylated due to mutating the target lysines, exhibited dramatic elevated transcriptional potential on the IL2 promoter. This supports our finding from IL-2 promoter-driven reporter gene assay, which shows downregulation of NFATc1/C transactivation upon sumoylation. Hence, sumoylation exerts a negative effect on NFATc1 transcriptioanl activity. Immunofluorescence studies showed SUMO modification to relocate NFATc1/C also into transcriptionally inactive heterochromatin regions, demonstrated by H3K9 m3 (tri-methylated histone lysine 9) colocalization studies. Interestingly, in the absence of sumoylation, NFATc1 was partially colocalized with transcriptional hotspots in the nucleus, which might contribute to the higher transcription potentiality of the non-sumoylated NFATc1. It is important to note that, the transcriptional activity of other NFATc1 target genes (IL-13, IFN-gamma etc.) was positively upregulated upon sumoylation of NFATc1, suggesting a non-universal effect of sumoylation on NFATc1/C function. In conclusion, sumoylation directs NFATc1 into nuclear bodies where it interacts with transcriptional co-repressors and relocalize itself with heterochromatin, leading to repression of NFATc1/C-mediated transcription. Most importantly, the effect of NFATc1/C sumoylation is promoter specific. Taken together, SUMO modification alters the function of NFATc1 from an activator to a site-specific transcriptional repressor. This study unraveled a novel regulatory mechanism, which controls isoform specific NFATc1 function.
The Nuclear Factors of Activated T cells (NFATs) are critical transcription factors that direct gene expression in immune and non-immune cells. Interaction of T cells with Ag-presenting cells results in the clustering of T-cell antigen receptor (TCR), co-receptors and integrins. Subsequent signal transduction resulting in NFAT activation leads to cytokine gene expression. Among the NFATs expressed in T cells, NFATc1 shows a unique induction property, which is essential for T cell differentiation and activation. It was revealed before that 3 major isoforms of NFATc1 are generated in activated T cells – the inducible short NFATc1/A, and the longer isoforms NFATc1/B and C. However, due to alternative splicing events and the existence of two different promoters and two alternative polyadenylation, we show here that 6 isoforms are synthesized in T cells which differ in their N-terminal and C-terminal peptides. In these experiments, we have identified these 6 isoforms by semi-quantitative long distance RT-PCR in several T cells subsets, and the inducible properties of 6 isoforms were investigated in those cells. The short NFATc1/A which is under control of the P1 promoter and the proximal pA1 polyadenylation site was the most prominent and inducible isoform in T effector cells. The transcription of the longer NFATc1/B and C isoforms is constitutive and even reduced in activated T lymphocytes. In addition to NFATc1 autoregulation, we tried to understand the NFATc1 gene regulation under the control of PKC pathways by microarray analysis. Compared to treatment of T cells with ionomycin alone (which enhances Ca++ flux), treatment of cells with the phorbolester TPA (leading to PKC activation) enhanced the induction of NFATc1. Microarray analysis revealed that PKC activation increased the transcription of NF-B1, Fos and JunB, which are important transcription factors binding to the regulatory regions of the NFATc1 gene. Besides the promoting effect of these transcription factors, we provided evidence that p53 and its targeting gene, Gadd45, exerted a negative effect on NFATc1 gene transcription. Summarizing all these results, we drew novel conclusions on NFATc1 expression, which provide a more detailed view on the regulatory mechanisms of NFATc1 transcription. Considering the high transcription and strong expression of NFATc1 in various human lymphomas, we propose that similar to NF-B, NFATc1/A plays a pivotal role in lymphomagenesis.
Diffuse großzellige B-Zell Lymphome stellen weltweit die größte Gruppe maligner B-Zell Non-Hodgkin-Lymphome dar und umfassen eine biologisch, genetisch und klinisch heterogene Gruppe lymphoider Tumoren, die als Hauptmerkmal große transformierte B-Lymphozyten mit vesikulären Kernen und prominenten Nukleoli aufweisen. Nur ungefähr 40% der Patienten zeigen ein Ansprechen auf eine konventionelle Chemotherapie. Um von einer präziseren Prognose profitieren zu können, ist eine reproduzierbare Klassifizierung dieser „inhomogenen Entität“ nicht nur für die Betroffenen wünschenswert. Dadurch könnten Krankheitsverläufe genauer vorhergesagt und die Therapie optimiert werden. Während akute Leukämien häufig mit einer Translokation assoziiert sind, zeigt sich bei B-Zell-Lymphomen ein weitaus komplexeres Bild an zytogenetischen Aberrationen. Diese werden einerseits mit der Etablierung des malignen Phänotyps, andererseits mit der Tumorprogression und der klonalen Evolution eines Tumors in Verbindung gebracht. Obwohl die meisten Neoplasien rekurrente und Tumor-spezifische klonale chromosomale Aberrationen aufweisen, ist es noch nicht gelungen, durch Etablieren genetischer „Marker“ eine zuverlässige Aussage über Verlauf und Ansprechen und damit über die Prognose dieser Erkrankung zu machen. Solche Aussagen sind bis dato nur auf Basis allgemeiner klinischer Parameter wie dem Allgemeinzustand der Patienten und der Höhe der Lactat-Dehydrogenase (LDH) im Serum gesichert möglich, die neben anderen Parametern im „International Prognostic Index“ zusammengefasst sind. Zytogenetische, molekulargenetische und in den letzten Jahren auch Hochdurchsatz-Untersuchungen, wie z.B. die Mikroarray-Technologie, haben bereits zu einem besseren Verständnis dieser molekularen Unterschiede geführt. Die WHO-Klassifikation stellt im Hinblick auf die Definition ‚biologischer’ Tumorgruppen einen deutlichen Fortschritt dar. Diese neueren Untersuchungen zeigen auf der Basis des Genexpressionsprofils von diffusen großzelligen B-Zell-Lymphomen die mögliche Unterteilbarkeit dieser diagnostischen Kategorie anhand zweier unterschiedlicher Phänotypen: GC-DLBCL zeigen eine molekulare Signatur, die vergleichbar mit normalen Keimzentrumszellen ist. Die andere Gruppe (ABC-DLBCL bzw. non-GC-DLBCL) entsteht aus Zellen, die die Keimzentrumsreaktion bereits durchlaufen haben. GC- und ABC-DLBCL-Patienten weisen bei einer Anthracyclin-haltigen Chemotherapie (z. B. CHOP) in retrospektiven klinischen Studien einen deutlichen Unterschied in der 5-Jahres-Überlebensrate auf (etwa 60% für GC-DLBCL und 35% für ABC-DLBCL). Somit scheint die Annahme, dass mindestens zwei Entitäten vorliegen, gerechtfertigt. In der vorliegenden Studie konnten das zytogenetische Aberrationsspektrum mittels eines Algorithmus anhand des Genexpressionsprofiles mit zwei verschiedenen Subgruppen – den GC-DLBCL und den non-GC-DLBCL - korreliert werden. Es entstand die bisher umfangreichste zytogenetische Charakterisierung dieser postulierten Phänotypen. Es konnte gezeigt werden, dass GC-DLBCL, die durch die Translokation t(14;18) charakterisiert sind, häufiger Zugewinne bei Chromosom 7 aufweisen, während non-GC-DLBCL mit dem Vorliegen einer Trisomie 3 und Zugewinnen bei 3p und 3q assoziiert sind. Zwei Modelle könnten eine Erklärung für die Assoziation genomischer Instabilitäten mit den unterschiedlichen Genexpressionsprofilen sein. Einerseits könnte eine gewisse Region für die Kodierung eines Schlüsselregulatorgenes verantwortlich sein, welches die Zellbiologie und damit die Genexpression verändert. Andererseits könnten die Subgruppen der DLBCL auf verschiedenem Wege entstehen und somit unterschiedliche Ereignisse für die verschiedenen Aberrationen verantwortlich sein. Es gilt nun, einerseits diese Mechanismen, die zu einer veränderten Genexpression beitragen, aufzudecken und andererseits ein diagnostisches Vorgehen zu etablieren, bei dem beispielsweise nach dem erfolgten Nachweis von Index-Aberrationen eine bestimmte molekulare Signatur überprüft wird. Es ist anzunehmen, dass molekulare Analysen in absehbarer Zeit vermehrt Einzug in den klinischen Alltag halten und therapeutische Entscheidungen mit beeinflussen werden. In Zukunft wird anhand der Expression von Schlüsselgenen die Zuordnung eines Falles in diagnostische Untergruppen erfolgen. Außerdem könnte durch Peptidblockade dieser Schlüsselgene eine zusätzliche Therapieoption bestehen – eine Vermutung, die weitere Studien erforderlich macht.
Diffuse großzellige B-Zell Lymphome (DLBCL) gehören zu den häufigsten lymphatischen Tumoren. Die histologische Klassifikation dieser großen Gruppe von Tumoren ist dabei noch immer durch die mangelnde Reproduzierbarkeit in der Diagnostik geprägt. Außerdem verhalten sich DLBCL klinisch ausgesprochen heterogen. In der vorliegenden Arbeit wurden DLBCL mittels komparativer genomischer Hybridisierung (CGH) untersucht. Die DLBCL waren im Vorfeld von uns unabhängig mittels microarray-basierter Genexpressionsanalyse in solche vom Keimzentrumstyp (GCB-DLBCL) sowie solche vom aktivierten B-Zelltyp (ABC-DLBCL) eingeteilt worden. Weiterhin enthielt das untersuchte Kollektiv primär mediastinale DLBCL (PMBCL). Die CGH sollte hierbei Aufschluss über rekurrente chromosomale Aberrationen geben. Die drei Subtypen zeigten dabei für sie charakteristische genetische Veränderungen. So fanden sich für die GCB-DLBCL Zugewinne auf Chromosom 12, für die ABC-DLBCL Zugewinne auf den Chromosomen 3 und 18 sowie Verluste auf Chromosom 6, für die PMBCL Zugewinne auf den Chromosomen 2 und 9. Die mittels Genexpressionsanalyse definierten Subtypen der DLBCL unterscheiden sich somit eindeutig auf genetischer Ebene und zeigen für sie charakteristische chromosomale Aberrationen.
Risikostratifikation grosszelliger B-Zell Non-Hodgkin Lymphome anhand immunhistochemischer Parameter
(2007)
Die diffusen großzelligen B-Zell-Lymphome (DLBCL) stellen den häufigsten Typ aller Non-Hodgkin-Lymphome dar, sind aber morphologisch, immunologisch, genetisch und klinisch eine sehr heterogene Gruppe. Aufgrund dieser Heterogenität von DLBCL wurde in mehreren Studien untersucht, ob eine molekulare Heterogenität der Tumoren vorläge, bzw. versucht, eine molekulare Reklassifikation zu erreichen. Resultat dieser Bemühungen war eine Unterscheidung bzw. Definition einer Keimzentrums- ähnlichen (GCB-cell-like) Gruppe und einer aktivierten B-Zellen-ähnlichen (ABC-like) Gruppe, die sich in ihrem Ansprechen auf übliche Therapieschemata, mit einer deutlich besseren Prognose für die GCB-like-Gruppe, unterschieden. Die hierbei angewendete Microarray-Technologie hat den entscheidenden Nachteil, dass hierfür qualitativ hochwertige RNA zur Verfügung stehen muss. Neu ist der Ansatz, unterschiedliche Proteinexpressionsmuster am Paraffinmaterial zur Unterscheidung prognostisch relevanter Gruppen heranzuziehen. Die hierbei erzielten Daten sind allerdings in Ihren Aussagen hinsichtlich der prognostischen Wertigkeiten widersprüchlich. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst verschiedene biologische Parameter am Paraffinmaterial hinsichtlich ihrer prognostischen Wertigkeit in der Risikostratifikation von DLBCL untersucht. In einem ersten Schritt wurden klinische Daten von 99 de novo entstandenen großzelligen B-Zell-Lymphomen erhoben, bei denen es sich um 84 DLBCL und um elf DLBCL mit einer weiteren Komponente eines follikulären Lymphoms Grad 3B bzw. auch um vier Fälle mit ausschließlich follikulärem Wachstumsmuster handelte. Die Klassifikation der Fälle nach dem Internationalen Prognostischen Index (IPI) sowie der einzelnen klinischen Parameter des IPI zeigte eine deutliche prognostische Relevanz. In einem zweiten Schritt wurden immunhistochemische Färbungen mit verschiedenen Antikörpern durchgeführt und auf ihre prognostische Bedeutung überprüft. Als negative prognostische Parameter erwiesen sich die Negativität für CD10 sowie BCL-6, also Antigene, die mit einer Keimzentrumszell-Differenzierung assoziiert werden, sowie eine Überexpression von MUM-1, das mit einer postfollikulären Differenzierung assoziiert wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass einer Expression von BCL-2 und einem Ki67-Index von unter 80 % eine negative prognostische Bedeutung zukommt. Die Stratifikation der Fälle in einen GCB- und einen ABC- Typ anhand des Hans-Klassifikators zeigte nur eine schwache Korrelation zur Überlebenswahrscheinlichkeit. In einem dritten Schritt wurde gezeigt, dass die kombinierte Analyse jeweils zweier Parameter eine relative Abhängigkeit ihrer Expression von der Expression weiterer Marker erkennen ließ. Aus diesem Grunde wurde ein Modell einer sequentiellen Addition negativer prognostischer Indikatoren entwickelt, in der bei Anwesenheit einer negativen Variable (CD10-Negativität, BCL-6 < 20%, BCL-2 positiv, MUM-1≥ 50% und Ki67 < 80%) ein negativer Faktor gewertet und die Summe dieser als Risiko-Score angegeben wurde. Die Stratifikation der Patienten anhand dieses „kombinierten immunhistochemischen Risiko-Scores“ zeigte drei prognostisch deutlich unterschiedliche Gruppen: In der Gruppe von Patienten ohne Risikofaktoren verstarb lediglich eine Patientin (die eine Behandlung abgelehnt hatte); in der Hochrisikogruppe (Score 5) verstarben alle Patienten innerhalb eines Jahres. Die multivariate Analyse des Scores ergab dabei eine Unabhängigkeit von den Parametern des IPI. In der intermediären Gruppe mit einem Risiko-Score von 1-4 zeigten sich der IPI sowie eine LDH-Erhöhung und das Vorhandensein einer B-Symptomatik als geeignete Parameter, um hier eine weitere Stratifizierung durchzuführen. Die vorliegende Arbeit stellt somit eine Erweiterung der publizierten Ansätze einer Erfassung prognostischer Indikatoren in kombinierten Algorithmen dar. Eine Verifizierung der gezeigten Ergebnisse in einer homogen behandelten Patientengruppe innerhalb einer klinischen Studie muss Ziel weiterer Untersuchungen sein.
In this thesis we have investigated the effect of NFAT (Nuclear Factor of Activated T Cell) transcription factors on the expression of Rag-(Recombination Activating Genes) genes in murine thymus. The protein products of Rag genes, RAG1 and RAG2, are critical for the recombination and generation of the TCR (T Cell Receptor) repertoire during thymocyte development, and their expression can be suppressed by the activity of NFAT factors. In thymus, the expression of Rag1 and Rag2 genes is induced at the double-negative (DN, CD4-8-) 3 stage, down-regulated at the DN4 stage, re-induced at the double-positive (DP, CD4+8+) stage, and suppressed again at the single-positive (SP, CD4+8- or CD4-8+) stage. Although it is known that TCR signaling suppresses the expression of Rag1 and Rag2 at the SP stage, the signals that mediate the Rag gene down-reulation remain elusive. Here we report that both the calcineurin-NFAT-signaling and MAPKinase signaling pathways, which are activated by TCR signaling during positive selection, mediate the Rag gene down-regulation in DP thymocytes. The calcineurin-NFAT pathway suppresses both the Rag1 and the Rag2 gene expression. This pathway has a stronger suppressive effect on the Rag1 than the Rag2 gene. A synergistic activity between the two NFAT factors NFATc2 and NFATc3 is essential for calcineurin-NFAT signaling to efficiently suppress the Rag gene expression in DP thymocytes. It is likely that the calcineurin-NFAT signaling down-regulates Rag gene expression by suppressing both the Rag anti-silencer element (ASE) activity and the Rag promoter activity. Similarly, MEK-ERK signaling of MAPK signaling pathway mediates the Rag gene suppression in DP thymocytes although the mechanism through which MEK-ERK mediates the Rag gene down-regulation has to be elucidated. In DN thymocytes, it appears that neither the calcineurin-NFAT signaling nor MAPK signaling is involved in the Rag gene down-regulation. However, a role for these two signaling pathways in the Rag gene up-regulation in DN thymocytes is not excluded. In DN thymocytes, pre-TCR signaling stimulates the expression both Nfatc1 and Nfatc2 genes but has no effect on Nfatc3 gene expression. In DN thymocytes, pre-TCR signaling activates Nfatc1α expression but not Nfatc1ß expression, i.e. the two promoters controling Nfatc1 gene xpression are differently controled by pre-TCR signals. Nfatc1α gene expression in DN thymocytes is mainly regulated by the MAPK signaling pathway because activation of Nfatc1α is mediated by MEK-ERK signaling but opposed by JNK signaling. Calcineuirn-NFAT and p38 signaling pathways are not involved in Nfatc1α promoter regulation in DN thymocytes. In DP thymocytes, TCR signaling up-regulates Nfatc1 and Nfatc2 expression but down-regulates Nfatc3 expression. In DP thymocytes, TCR signaling activates Nfatc1α expression. The activation of Nfatc1α in DP thymocytes is mediated by NFATc1, but not or to a less degree by NFATc2 and NFATc3. MEK-ERK, JNK, and p38 signaling pathways are involved in Nfatc1α gene activation in DP thymocytes, probably by activating NFAT trans-activation activity. All these findings illustrate that in thymocytes the expression of NFAT transcription factors – which are essential for thymic development - is controled at multiple levels.
Die Rolle von NFAT-Transkriptionsfaktoren bei der Regulation der Apoptose peripherer T-Zellen
(2006)
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der NFAT-Transkriptionsfaktoren NFATc2 und NFATc3 beim AICD (Activation induced cell death) von peripheren T-Lymphozyten untersucht. Dazu wurde die Auslösbarkeit der Apoptose mittels Anti-CD3-Antikörper bei Wildtyp- bzw. Knock-out-Mäusen mit folgender NFAT-Ausstattung verglichen: NFAT c2+/+c3-/-, c2-/-c3+/+, c2-/-c3-/+, c2-/-c3-/-. Mittels FACS-Analyse von T-Helfer-Zellen aus den Lymphknoten dieser Mäuse zeigte sich, dass die CD3-vermittelte Apoptose - im Gegensatz zur Fas-vermittelten - mit dem Gesamtgehalt der Zellen an NFATc2 und NFAT c3 korreliert und diesbezüglich eine direkte Proportionalität angenommen werden kann.
Bei T-Zell-Lymphomen sind im Gegensatz zu B-Zell-Lymphomen wenige spezifische genetische Aberrationen bekannt. In dieser Arbeit wurden 39 periphere T-Zell-Lymphome (30 PTCL NOS und 9 EATCL) mit der Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung untersucht. Es wurde ein Screening auf Aberrationen vorgenommen, die zu einem Teil bei B-Zell-Lymphomen eine Rolle spielen, zum anderen bereits für T-Zell-Lymphome beschrieben wurden. Alle untersuchten EATCL wiesen Zugewinne in 9q34 auf. Diese waren signifikant häufiger bei EATCL als bei PTCL NOS. Diese Ergebnisse decken sich mit den CGH-Untersuchungen von Zettl et al.(2002,2004). Ein Vergleich mit Daten aus der Literatur zeigt, daß diese Zugewinne unter peripheren T-Zell-Lymphomen gegenwärtig als spezifisch für EATCL anzusehen sind. Dies ist die erste beschriebene spezifische Aberration bei EATCL. Das Philadelphiachromosom mit der Translokation t(9;22)(q34;q11), das bei der chronisch myeloischen Leukämie gefunden wird, wurde bei EATCL nicht nachgewiesen. Welches das relevante Gen in der Region 9q34 ist, ist noch nicht geklärt. Inwiefern Amplifikationen des NOTCH1-Gen für die Pathogenese der EATCL eine Rolle spielen, müssen weitere Untersuchungen zeigen. Bei PTCL NOS fand sich in 30% der Fälle eine Deletion im langen Arm von Chromosom 5. Dabei war in jedem Fall die Bande 5q21/22 betroffen. Es zeigte sich eine Tendenz zu häufigeren Deletionen von 81c5 als vom proximal gelegenen APC-Gen und in 5q31. Bei den diploiden Fällen war dieser Unterschied statistisch signifikant. Es ist somit anzunehmen, daß der Genlocus distal des APC-Gens und proximal von 5q31 in der Nähe von 81c5 liegt. Verluste in 5q21/22 sind bislang bei T-Zell-Lymphomen nur im Rahmen einer CGH-Studie für PTCL NOS beschrieben worden. Nach unseren Daten scheinen sie bei EATCL keine Rolle zu spielen. Deletionen in 6q21 und von TP53 spielen als sekundäre Aberrationen sowohl bei PTCL NOS als auch bei EATCL eine Rolle. Bei PTCL NOS waren sie signifikant häufiger bei den tetraploiden Fällen zu finden. So waren Deletionen von TP53 bei allen tetraploiden Fällen nachzuweisen. Ein Zusammenhang mit der Progression der Tumoren kann vermuten werden. Dieser Unterschied zwischen diploiden und tetraploiden Fällen fand sich bei EATCL nicht. Aberrationen von ATM, die bei B-Zell-Lymphomen beschrieben wurden, haben bei PTCL NOS und EATCL nach den vorliegenden Daten keine Bedeutung. Bezüglich Deletionen von ATM unterscheiden sich PTCL NOS und EATCL signifikant von T-PLL, bei denen Deletionen von ATM beschrieben wurden. Deletionen von D13S25 wurden zwar sowohl bei PTCL NOS als auch bei EATCL gefunden. Allerdings zeigt ein Vergleich mit der Literatur, dass die minimale überlappende Region der Deletionen eher distal in Bande 13q21 zu suchen ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals mit der Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung spezifische Aberrationen bei PTCL NOS und EATCL beschrieben werden. Zudem konnten weitere Aberrationen nachgewiesen werden, die bei diesen Entitäten eine Rolle in der Pathogenese zu spielen scheinen. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um ihre Bedeutung in der Diagnostik und Therapie der Malignome zu klären.
Eine primäre Aberration wurde bei den extranodalen diffusen großzelligen B-Zell-Lymphomen bisher nicht definiert. Das in dieser Arbeit untersuchte Chromosom 1 birgt dennoch eine Vielzahl an genomischen Veränderungen, die möglicherweise als sekundäre Aberrationen an der Pathogenese der extranodalen DLBCL beteiligt sein könnten. Durch die in der vorliegenden Untersuchung angewandten Mikrosatellitenanalyse war es möglich, diese genomischen Aberrationen aufzudecken. Als Hotspot unserer Untersuchung gilt die Chromosomenbande 1p36.32, die den Locus für das Gen TP73 enthält. Deletionen in diesem Bereich wurden in 34,8% der informativen Fälle nachgewiesen. Die am zweithäufigsten von Deletionen betroffene Region (20% der Patienten) war 1q32.3-41. Die Bereiche 1p22 und 1q21-23 waren nicht auffällig verändert. Wir vermuten, dass Aberrationen dieser Bereiche in der Pathogenese der gastralen DLBCL von untergeordneter Bedeutung sind. Lediglich 1,44% aller Genotypen zeigten Mikrosatelliteninstabilität, high frequency MSI konnte dabei in keinem der Fälle nachgewiesen werden. Bei Betrachtung des Alters der Patienten, die MSI aufwiesen, fällt ein signifikanter Zusammenhang zwischen höherem Alter und steigender MSI-Inzidenz auf. Eine Korrelation zwischen Tumorstadium und MSI-Inzidenz konnte nicht festgestellt werden. Der für die Mikrosatelliteninstabilität stehende Mutator Pathway scheint keine bedeutende Rolle in der Pathogenese der DLBCL einzunehmen. Die Ergebnisse unserer Untersuchung veranlassen uns jedoch dazu, dem Tumorsuppressor Pathway eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der extranodalen DLBCL zuzuschreiben.
Die vorliegende Arbeit hatte zur Aufgabe, die EBV-infizierte Zelle bei infektiöser Mononukleose, Hodgkin Lymphom, Post-Transplantations-Lymphoproliferation(PTLD) und seniler Lymphoproliferation zu beschreiben. Da die Einordnung der senilen Lymphoproliferation als eigenständige Entität unbefriedigend ist, sollte der Bezug zu PTLD oder Hodgkin Lymphom untersucht werden.Sowohl bezüglich des Latenztyps des EBV, der Oberflächenantigen- und Transkriptionsfaktorenexpression als auch der fehlenden Immunglobulinsekretion entsprachen sich Hodgkin Lymphom und senile Lymphoproliferation. Zwischen seniler Lymphoproliferation und PTLD dagegen fanden sich diesbezüglich große Unterschiede. Daher sind die senilen Lymphoproliferationen im Ergebnis dieser Doktorarbeit als Hodgkin Lymphome des höheren Alters anzusehen. Als Nebenbeobachtung stellten sich die hier untersuchten Hodgkin Zellen als CD27 negativ dar, die im Unterschied stehen, zur CD27 und CD30 positiven Memoryzelle, welche als korrespondierende Normalzelle postuliert wurde. Der Vergleich EBV-negativer und EBV-positiver Hodgkin Lymphome erbrachte in dieser Hinsicht jedoch keine Unterschiede. Die CD27-Negativität der Hodgkin Zelle ist somit nicht als EBV-spezifisches Phänomen zu verstehen und bedarf weiterer Klärung.
Das Somatostatin-Analogon Octreotid ist ein in der Diagnose von Thymomen und Thymuskarzinomen wertvolles Hilfsmittel, da praktisch 100 % der Fälle eine kräftige Anreicherung in der Octreotid-Szintigraphie aufweisen, während entzündlich veränderte und nicht-neoplastische Thymi meist nicht anreichern. Auch therapeutisch zeigten 5 der 8 hier untersuchten Thymome eine ausgeprägte, objektivierbare Tumorregression unter einer Kombinationstherapie von Octreotid und Prednison, allerdings zählte die Mehrzahl der Fälle mit gutem Ansprechen zu der Gruppe der klinisch gutartigen Typ A und AB Thymome, während alle Fälle ohne Ansprechen ungünstige Typ B3 Thymome und Thymuskarzinome waren. Das unterschiedliche Anreicherungsverhalten von Normalthymi und Thymomen war nicht durch Unterschiede im immunhistochemischen Expressionmuster von SSTR-Isoformen erklärbar. Die für die Bindung von Octreotid hauptverantwortlichen Somatostatinrezeptor (SSTR) Subtypen 2A, 3 und 5 zeigten in Normalthymi und nahezu allen untersuchten Thymomen und Thymuskarzinomen eine kräftige zytoplasmatische Expression, während membranständige SSTR in Normalthymi nicht, in Thymomen und Thymuskarzinomen nur in etwa 5 % der Fälle beobachtet wurden. Auch das unterschiedliche Ansprechen der einzelnen Thymome bzw. Thymuskarzinome korrelierte nicht mit einem erkennbar unterschiedlichen Expressionsprofil der einzelnen SSTR. Die Befunde sind in erster Linie durch unterschiedliche Kinetiken bei der Internalisierung der SSTR, möglicherweise auch durch Heterokomplexbildung mit anderen Rezeptortypen erklärbar. Eine weitere Erklärungsmöglichkeit wäre eine unterschiedliche Kompetition von Octreotid mit intrinsischem Somatostatin. Unsere Ergebnisse sprechen gegen eine gängige Auffassung, nach der ausschließlich membranständige SSTR durch eine Octreotid-Therapie „attackiert“ werden können. Die Aussagekraft der in der Bildgebung objektivierten Tumorregression und der histologischen Befunde vor und nach Octreotidtherapie ist allerdings mit Vorbehalt zu bewerten, da in allen Fällen eine Kombinationstherapie mit Steroiden durchgeführt wurde und mittlerweile bekannt ist, dass auch Steroide allein bei einem Teil der Fälle zu einer Tumorremission führen können.
Follikuläre Lymphome (FL) machen etwa 25-40% der Non-Hodgkin-Lymphome aus und sind in der Regel bereits bei Diagnosestellung nicht mehr auf den Lymphknoten beschränkt, sondern systemische Erkrankungen. In jüngeren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die selten diagnostizierten limitierten Stadien (Ann Arbor I und II) der Erkrankung häufig einen nur partiellen Befall der betroffenen Lymphknoten durch das Lymphom zeigen. In diesen frühen Stadien kolonisieren follikuläre Lymphome präexistente Follikel (in situ- Lymphom) und breiten sich dann offenbar auf die übrigen Follikel des Lymphknotens aus, bevor ein systemischer Befall des gesamten Organismus feststellbar ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zunächst zu untersuchen, auf welchem Weg die Zellen eines Tumorklons im follikulären Lymphom die Keimzentren eines Lymphknotens kolonisieren. Dazu wurde die genetische Verwandtschaft der einzelnen Tumorsubklone untereinander anhand ihrer individuellen Mutationsmuster bestimmt. Mit Hilfe von daraus berechneten phylogenetischen Stammbäumen konnte die Ausbreitung der Subklone auf die vorbestehenden Keimzentren nachvollzogen werden. Zweitens sollte in dieser Studie der Frage nachgegangen werden, ob die Tumorsubklone auch unter dem Einfluss der Keimzentrumsumgebung stehen, die in der physiologischen B-Zell-Reifung für die enorme Vielfalt der Antikörperspezifität sorgt (Hypermutation). Anhaltende Mutationen (ongoing mutations) innerhalb eines Tumorklons würden auf einen solchen erhaltenen Einfluss der Hypermutationsmaschinerie hinweisen. Schließlich sollte untersucht werden, ob es auch in follikulären Lymphomen eine antigenabhängige B-Zell-Reifung gibt, wie sie bei der physiologischen „Optimierung“ von Antikörpern auf die korrespondierenden Antigene zu finden ist. Material und Methode: Sieben Fälle von follikulären Lymphomen von vier Patienten (davon einer mit einem und einer mit zwei Rezidiven ihrer Lymphomerkrankung) wurden morphologisch und immunhistochemisch reevaluiert. Pro Fall wurden bis zu zehn Follikel mikrodisseziert und pro Follikel die VH-Gene von bis zu zehn Subklonen sequenziert. Computerunterstützt wurden sowohl die genetische Verwandtschaft der Tumorsubklone untereinander und ihre Verteilung auf die einzelnen Follikel, als auch das Verhältnis von R- zu S- Mutationen in den verschiedenen Abschnitten des BCR-Gens und damit ein möglicher Antigen-Einfluss auf die Hypermutation analysiert. Ergebnisse: Ein FL Grad I zeigte ein deutliches Clustering von genetisch miteinander verwandten Tumorsubklonen im selben Follikel. Dennoch fand sich ein moderater interfollikulärer Austausch der Subklone. Bei morphologisch höhergradigen FL (Grad II und IIIa) nahm das Clustering deutlich ab und der interfollikuläre Austausch zu, bis im zweiten Rezidiv eines Patienten ein weitgehend diffuses Wachstum resultierte. Als Ausdruck des erhaltenen Einflusses des Keimzentrums zeigten alle Primärtumoren (FL Grad I und II) noch ongoing mutations, während bei FL in Progression keine ongoing mutations mehr feststellbar waren. Eine Häufung von R-Mutationen in den antigenbindenden Domänen des B-Zell-Rezeptors (CDR) und S-Mutationen in den strukturellen Domänen (FR) als Hinweis auf eine antigen-gesteuerte Hypermutation in den Tumorsubklonen fand sich nur in einem FL Grad I. Aus den genetischen Analysen ergaben sich aber Hinweise auf eine erhaltene Funktionalität des B-Zell-Rezeptors in allen sieben Fällen.
Die t(11; 18)-negativen gastralen Marginalzonen B-Zell Lymphome (MZBCL) vom MALT-Typ (Mukosa-assoziiertes lymphatisches Gewebe) können zu hoch-malignen gastralen diffusen großzelligen B-Zell Lymphome (DLBCL) transformieren. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war die noch offene Frage, ob und in welchem Ausmaß die DLBCL als blastäre Transformation gastraler MZBCL vom MALT-Typ zu verstehen sind, zu beantworten. So konnten wir zeigen, dass eine direkte Progression möglich ist: 44,4% der sequenzierten Fälle haben eine klonale Identität der simultanen Tumorkomponenten aufgewiesen. Wir konnten aber auch feststellen, dass manche sekundäre gastrale DLBCL keine klonale Verwandtschaft zu dem simultanen MZBCL vom MALT-Typ aufweisen und somit als „de novo“ entstandene Tumoren zu betrachten sind. Das Ausmaß und die Bedeutung molekulargenetischer Veränderungen in der Pathogenese und Tumorprogression der gastralen MZBCL vom MALT-Typ sind derzeit ebenfalls noch nicht geklärt. Mittels Mikrosatellitenanalyse konnten wir zeigen, dass 3q Amplifikationen (21,05% der Fälle) und 6q Deletionen (36,84%) häufig vorkommen und somit eine Rolle in der Tumorprogression spielen können. Diese Aberrationen schließen sich in den von uns untersuchten Fällen gegenseitig aus, d.h. Fälle mit 3q Aberrationen weisen keine 6q Deletionen auf und umgekehrt. Die klonal identischen Tumoren weisen auch die gleichen Aberrationen auf, im Gegensatz zu den nicht klonal verwandten Tumoren. Als Ergänzung zu den Aussagen vorangegangener Studien weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass eine direkte Progression nicht nur über 3q Amplifikationen sondern auch über 6q Deletionen möglich ist und dass unterschiedliche Aberrationen mit klonal unteschiedlichen Tumoren korrelieren. Der „mutator pathway“ mit dem Kennzeichen der Mikrosatelliteninstabilität spielt nach unseren Erkenntnissen keine bedeutende Rolle in der Entstehung und Progression der gastralen MZBCL vom MALT-Typ, vielmehr ist die chromosomale Instabilität in Form von Amplifikationen und Deletionen von Bedeutung. Die Tumorprogression der gastralen MZBCL ist ein komplexer Prozess der auch mit zusätzlichen hier nicht untersuchten genetischen Aberrationen verbunden ist.
Zielsetzung dieser Arbeit war die Untersuchung von Gehirngewebe in der asymptomatischen Phase der SIV-Infektion zur Erfassung immunologischer Vorgänge bei der Entstehung einer SIV-Enzephalitis am Beispiel der gewebeständigen Lymphozyten und Makrophagen. Wir benutzten das etablierte SIV-AIDS Modell mit Makakenaffen. Untersucht wurden 24 Versuchstiere im Zeitraum von bis zu 20 Wochen, die zuvor mit einem der beiden Virusstämme (SIVmac251/ 32H oder SIVmac251/ MPBMC) infiziert worden waren, vier der Versuchstiere entwickelten eine SIV-Enzephalitis, eines dieser Tiere war mit Selegilin behandelt worden. Fünf weitere infektfreie Makaken dienten als Kontrollen. Nach definierten Zeiträumen wurden die Versuchstiere getötet, die Gehirne präpariert und mittels Immunhistochemie Lymphozyten und Makrophagen angefärbt. Im weiteren führten wir eine lichtmikroskopische Morphometrie, getrennt nach einzelnen Kompartimenten des Gehirns, wie Cortex, subcorticalem weißem Mark und perivaskulärem Raum, durch. Die Ergebnisse unserer Arbeit — die infizierte, asymptomatische Tiere mit den Kontrolltieren vergleicht — zeigen eine ausgeprägte lymphozytäre Reaktion speziell im Cortex, zum Teil auch im subcorticalen Mark. Die Makrophagen zeigen eine Zunahme der Zelldichte perivaskulär und im Cortex, welche quantitativ deutlich unter der der Lymphoyzten bleibt. Die Tiere mit Enzephalitis zeigen allesamt eine corticale, wie auch subcorticale Zunahme der lymphozytären Zelldichte, bei den Makrophagen zeigt sich eine überwiegend generelle Stimulierung in allen drei Kompartimenten. Die Ergebnisse unserer Arbeit — die sich durch die Untersuchung asymptomatischer Versuchstiere sehr gut an die Verhältnisse bei der HIV-Infektion annähert — lassen vermuten, daß es dem Immunsystem mit Hilfe der gewebeständigen Lymphozyten im Cortex und subcorticalen Mark für eine ganze Weile gelingt, den Ausbruch einer Enzephalitis und damit der AIDS Erkrankung zu verzögern.
Clonality analysis in B-Cell Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL) associated with Richter's syndrome
(2006)
B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) comprises 90% of chronic lymphoid leukemias in Western countries and patients with B-CLL have a heterogeneous clinical course. Approximately 3-5% of B-CLL patients encounter transformation to an aggressive lymphoma, mainly diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) or Hodgkin’s lymphoma (HL) which has been defined as Richter’s syndrome and is associated with a poor clinical outcome. The mutational status of the immunoglobulin heavy chain variable region (IgVH) gene not only implies the developmental stage at which the neoplastic transformation occurs in a given B-cell lymphoma, but also constitutes an important prognostic factor in B-CLL, since B-CLL patients with unmutated IgVH genes usually have a poor clinical outcome. Sparse molecular analyses performed in Richter’s syndrome so far suggest that it can occur in B-CLL patients carrying mutated or unmutated IgVH genes, and tumor cells in DLBCL or HL can be clonally identical to the B-CLL clone or arise as an independent, secondary lymphoma. To determine the clonal relationship between DLBCL or Hodgkin/Reed-Sternberg (HRS) cells and pre-existing B-CLL cells in a larger series, to identify the IgVH gene usage and the mutational status and to explore possible prognostic factors in B-CLL undergoing Richter’s transformation, we utilized a PCR-based GeneScan approach with subsequent sequencing of the IgVH genes. In cases with HRS/HRS-like cells laser capture microdissection (LCM) was employed to isolate these cells. In addition, a thorough morphological and immunohistochemical analysis was performed. In total, specimens from 48 patients were investigated including 40 cases of Richter’s syndrome and additional 8 cases of B-CLL cases with the presence of CD30-positive HRS-like cells. Among 40 cases of Richter’s syndrome, 34 B-CLL cases showed transformation to DLBCL and 6 cases transformed from B-CLL to HL. Sequencing was performed in 23 paired B-CLL and DLBCL cases. In 18 cases, B-CLL and DLBCL were clonally identical, whereas DLBCL developed as a clonally independent neoplasm in 5 patients. Among the clonally related pairs, 11 out of 15 cases carried unmutated IgVH genes in both the B-CLL and DLBCL component, whereas 5 of 6 B-CLL cases that showed transformation to HL carried mutated IgVH genes. HRS cells in two samples and HRS-like cells in one sample were clonally distinct from the B-CLL clone and infected by EBV, whereas one sample of HRS-like cells was related to the clone from the surrounding B-CLL cells and did not express latent membrane protein-1 (LMP1). The VH genes VH3-23, VH3-74, VH1-2 and VH3-9 were overused in B-CLL cases that transformed to DLBCL, whereas VH4-34 and VH3-48 were used in over half of the B-CLL cases with transformation to HL. Immunohistochemical staining of ZAP70 was significantly associated with unmutated IgVH genes in B-CLL cases undergoing Richter’s transformation. Clinical follow-up data could be obtained from 24 patients. The median survival times of B-CLL patients with transformation to DLBCL or HL were 7 and 21 months, respectively. No significantly different survival times were found between clonally related or unrelated cases, or between IgVH-mutated or -unmutated cases. We conclude that in Richter’s transformation, DLBCL can evolve by clonal transformation of the pre-existing B-CLL clone or occur as an independent, clonally unrelated neoplasm. In the majority of cases (78% in our series), B-CLL and DLBCL are clonally identical. In a subset of patients, however, DLBCL develops as an independent secondary neoplasm that is not clonally related to the B-CLL. Clonal transformation into DLBCL predominantly occurs in B-CLL patients with unmutated IgVH genes, whereas most B-CLL patients that show transformation to HL or CD30-positive HRS-like cells carry mutated IgVH genes. The tendency that IgVH-unmutated B-CLL transforms to DLBCL and IgVH-mutated B-CLL transforms to HL implies different transformation pathways in the two subtypes of Richter’s syndrome. In addition, important pathogenetic differences are likely to exist between DLBCL cases derived from a pre-existing B-CLL as compared to de novo DLBCL cases, since de novo DLBCL is usually characterized by mutated IgVH genes. The biased usage of IgVH genes in the two subtypes of Richter’s syndrome suggests a possible role for antigen involvement in tumorigenesis also in B-CLL cases that undergo Richter’s transformation. Finally, EBV-association in the HL variant of Richter’s syndrome occurs more frequently in clonally unrelated secondary malignancies.
Diffuse großzellige B-Zell Non-Hodgkin Lymphome (DLBCL) stellen eine heterogene Kategorie maligner Lymphome dar. In der vorliegenden Arbeit sollte die Frage beantwortet werden, ob sich die morphologische Variante der multilobulierten centroblastischen Lymphome (CB multilobuliert) von anderen in der Kiel-Klassifikation definierten morphologischen Untergruppen großzelliger B-Zell Lymphome hinsichtlich ihres Immunphänotyps und des klinischen Verlaufs unterscheiden. Insbesondere ergab sich die Frage nach einem möglichen Keimzentrumsursprung der Tumoren. Insgesamt wurden 72 Fälle aus dem Referenzzentrum für Lymphknotenpathologie untersucht. 46 Lymphome zeigten ein rein diffuses Wachstumsmuster und 26 CB multilobuliert wiesen ein partiell follikuläres Wachstumsmuster auf. Bemerkenswert war die Tatsache, dass häufig nur partielles Infiltrationsmuster vorlag, oft in Form eines subkapsulären Randsaums. Dieser Befund legt nahe, dass im Rahmen der Tumorausbreitung reaktive Follikel kolonisiert werden, die in der Weiterentwicklung des Tumors konfluieren. Die Auswertung der in der Technik der „Tissue Microarray“ -Stanzen (TMA) hergestellten Schnittpräparate zeigte, dass CB multilobuliert weitaus häufiger als andere Entitäten von DLBCL den (prognostisch günstigeren) Keimzentrums-ähnlichen (GC-like) Lymphomen zugeordnet werden können. Klinische Daten konnten von insgesamt 46 Patienten mit CB multilobuliert erhoben werden. Sie wurden mit einer Kontrollgruppe von 54 nodalen DLBCL, 14 FL 3B und 47 FL 1-3A korreliert. Die Analysen der Überlebensdaten der Patienten zeigten ein signifikant besseres Gesamtüberleben der Patienten mit CB multilobuliert im Vergleich zu nodalen DLBCL anderer Differenzierung. Bemerkenswert war auch das signifikant bessere Überleben der Patienten mit CB ohne Immunoblasten (CB multilobuliert/monomorph) vs. DLBCL mit Immunoblasten (CB polymorph und IB/PB). In der Zusammenschau der Daten legen diese Befunde nahe, dass CB multilobuliert eine dem Keimzentrum nahe stehende Differenzierungsstufe großzelliger B-Zell Lymphome repräsentieren. Die relativ gesehen bessere Prognose dieser Tumoren gegenüber insbesondere den centroblastischen Lymphomen vom polymorphen Subtyp ist offenbar in ihrer sehr häufigen Keimzentrums-ähnlichen Differenzierung begründet. 75% der in der vorliegenden Serie untersuchten Tumoren ließen ein „GCB-like“ Proteinexpressionsmuster nachweisen. Aus Genexpressionsuntersuchungen größerer Serien von DLBCL ist die „Keimzentrums-Signatur“ in der Regel mit einer besseren Prognose assoziiert.
Die Ursachen des Rotatorenmanschettensyndroms sind vielfältig, ausgehend von der Hypothese, dass die vorbestehenden Muskelatrophie die postoperative Refunktionalisierung beeinflusst, wurde in der vorliegenden Arbeit eine semiquantitative Bestimmung der Expression des fetalen Acetylcholinrezeptottyps untersucht. bei neurogenen Schädigung der Skelettmuskulatur kommt es zu einer Überexpression des fetalen Acetylcholinrezeptors. Ein RT-PCR-basiertes Verfahren zur Bestimmung der Expression des fetalen Acetylcholinrezeptors war methodischer Ausgangspunkt dieser Arbeit. Es konnte in 74% der untersuchten Patienten eine Überexpression des fetalen Rezeptortyps bei Rotatorenmanschettensyndrom nachgewiesen werden.
BLIMP1 ist ein Transkriptionsfaktor und Schlüsselregulator in der Plasmazell-Differenzierung. Um die Rolle des BLIMP1 in der Lymphomentstehung zu untersuchen, wurde die BLIMP1 Expression im normalen humanen lymphatischen Gewebe und in 78 diffusen großzelligen B-Zell Lymphomen untersucht. BLIMP1 wurde in Plasmazellen und GC B-Zellen sowie in einer Population extrafollikulärer B-Zellen exprimiert. Die reifen Plasmazellen vom Marschalko-Typ waren CD138+CD20-MUM1+Ki67-BCL6-PAX5-BLIMP1+. Außerdem zeigten die Keimzentrums-B-Zellen keine Ki67-Expression. Im Gegensatz hierzu waren die BLIMP1+ EGBZ Ki67+p27-. BLIMP1 wurde in 19% (15/78) der DLBCL Fälle, darunter ABC- (7/15) und GCB- (8/15) Typ, exprimiert. BLIMP1+ DLBCL konnten entsprechend dem BLIMP1, BCL6 und PAX5 Expressionsprofil in drei pathogenetisch unterschiedliche Typen unterteilt werden. In den Typ A-Fällen waren die BLIMP1+ Tumor- zellen ständig BCL6-/PAX5- und waren alle vom ABC-Typ (CD10-/BCL6-/MUM1+). Im Typ B-DLBCL waren die meisten Tumorzellen ständig BLIMP1-/BCL6+/PAX5+ und BLIMP1 war nur in relativ kleinen Arealen herdförmig exprimiert. Die BLIMP1+ Zellen zeigten keine BCL6 und PAX5 Expression, und alle Typ B-Fälle zeigten ein GCB-Profil (CD10+ oder BCL6+ und MUM1-). Die Typ C-Fälle waren durch eine gleichzeitige BLIMP1 und BCL6 und/oder PAX5 Expression gekennzeichnet, was einem abärranten und nicht in normalen B-Zellen auftretenden Immunphänotyp entspricht. Weiterhin wurden in 7 Fällen mit Allelverluste auf der Genomregion 6q21, der das BLIMP1 Gen enthält, keine BLIMP1 Mutationen gefunden. Hinsichtlich einer BLIMP1 Expression im normalen lymphatischen Gewebe konnte festgestellt werden, dass das BLIMP1 nicht nur während der Plasmazellentwicklung aus den Keimzentrums-B-Zellen eine bedeutende Rolle spielt, sondern auch mit der Plasmazell-Differenzierung außerhalb des Keimzentrums assoziiert ist. Eine BLIMP1 Expression in DLBCL kennzeichnet die Fälle mit einer Plasmazell-Differenzierung. BLIMP1 ist in den Lymphomen größtenteils wie in normalen B-Zellen reguliert und besitzt die Kapazität, die Plasmazell-Entwicklung in die Tumorzellen zu induzieren. Jedoch reicht die BLIMP1 Expression weder aus, den Zellzyklus aufzuhalten, noch eine komplette terminale Plasmazell-Reifung in den DLBCL zu leiten. Allerdings scheint BLIMP1 nicht von den bekannten TSG Inaktivierungsmechanismen in den DLBCL betroffen zu sein, wobei es sehr unwahrscheinlich ist, dass das BLIMP1 ein TSG darstellt, dessen Verlust bei der Lymphomentwicklung eine wesentliche Rolle spielt.
Der humane monoklonale IgM-Antikörper PAM-1 induziert in seiner monomeren Form sowohl in vivo als auch in vitro Apoptose an Magenkarzinomzellen. Er bindet hierbei an den post-transskriptionell modifizierten Rezeptor CFR-1, der auf nahezu allen epithelialen Karzinomzellen und deren Vorläuferläsionen exprimiert wird. In dieser Arbeit werden die intrazellulären Mechanismen nach PAM-1/CFR-1-Bin- dung anhand von Protein(de)phosphorylierungen und deren selektiver Hemmung näher charakterisiert. Die hierbei detektierten Protein(de)phosphorylierungen sind somit möglicherweise essentielle Bestandteile der durch PAM-1 ausgelösten Apoptose.
Marginalzonen-B-Zell-Lymphome vom MALT-Typ stellen die häufigste Form primär extranodaler Non-Hodgkin-Lymphome dar. Sie entstehen auf dem Boden einer chronischen infektiösen oder autoimmunen Entzündung in hierdurch sekundär erworbenem lymphatischen Gewebe. Eine charakteristische und die häufigste bei diesen Tumoren beobachtete Translokation ist die t(11;18)(q21;q21). Hierbei fusioniert API 2, ein Apoptoseinhibitor-Gen auf 11q21 mit MALT 1 auf 18q21, einer humanen Paracaspase. Mit dem Ziel, letztlich die Funktion und Rolle des durch die Translokation trunkierten MALT 1-Gens untersuchen zu können, wurde bei dieser Arbeit ein Vektorsystem konstruiert, mit dem das MALT 1-Bruchstück stabil und nachweislich in humane B-Zelllinien transfiziert werden kann. An und mit diesen Transfektanten können nun vielfältige Analysen durchgeführt werden, um weitere Einsichten in die Lymphompathogenese zu gewinnen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden noch Untersuchungen zum Wachstumsverhalten und Zellzyklus von das trunkierte MALT 1-Gen überexprimierenden Zellen durchgeführt. Es zeigte sich, dass diese Zellen im Vergleich zu das intakte Gen exprimierenden Zellen stärker und konstanter proliferierten. Dies legte den Schluss nahe, dass in der Genstruktur vor dem Bruchpunkt proliferationshemmende und regulatorische Domänen liegen könnten, welche schließlich durch die Translokation eliminiert werden. Hierdurch könnte der verbleibende Anteil des Gens unreguliert zur Tumorgenese beitragen.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Thema "Die Rolle des Signalmoleküls Ca2+ in der Signaltransduktion der SC-1-induzierten Apoptose" anhand von immunhisto-chemischen, proteinbiochemischen und fluoreszenzmikroskopischen Methoden erarbeitet. Die SC-1-induzierte Apoptose stellt einen neuen intrinsischen, „death domain“-unabhängigen Signalweg in der Vermittlung des programmierten Zelltodes dar, der über die Bindung dieses Antikörpers an CD55SC-1 ausgelöst wird. Dem Signalmolekül Ca2+ galt besonderes Interesse bei der Charakterisierung der durch SC-1 ausgelösten Signaltransduktion. Nach Aktivierung von CD55SC-1 durch SC-1 steigt das intrazelluläre Ca2+ um Faktor 2,7 an, stabilisiert sich danach auf dem 1,5fachen Ausgangsniveau. Dies hat keinerlei Einfluss auf die Ausführung des Apoptoseprogramms, ist aber maßgeblich in das Expressionsverhalten involviert. Der Ca2+ - Einstrom ist somit nicht direkt in die Ausführung der Apoptose beteiligt, durch die Hochregulation der Expression des Apoptoserezeptors verstärkt es jedoch die Wahrscheinlichkeit der Tumorzelle, den programmierten Zelltod zu vollziehen, da durch die verstärkte Expression dieses Apoptose-induzierenden Rezeptors auch die Wahrscheinlichkeit steigt, dass mehrere SC-1-Antikörper binden können. Da die Quervernetzung mehrerer Rezeptoren mittels des SC-1-Antikörpers in der Apoptoseinduktion von Nöten ist, stellt diese durch Ca2+ getriggerte Überexpression von CD55SC-1 einen essentiellen Bestandteil in der Exekution dieses Selbstmordprogrammes dar. Dieses Ergebnis gibt einen interessanten Einblick in den Signalweg der durch SC-1 induzierten Apoptose. Weiterführende Experimente sind notwendig, um genauere Erkenntnisse dieser einzigartigen Form einer gewebespezifischen Apoptose zu erlangen.
Untersuchungen zur Expression der Rezeptortyrosinkinase c-kit in Thymuskarzinomen und Thymomen
(2005)
Thymome und Thymuskarzinome sind seltene mediastinale Neoplasien. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression und der Aktivierungsstatus der Rezeptortyrosinkinase c-kit in Thymustumoren untersucht und deren diagnostische und klinische Relevanz aufgezeigt. Das c-kit-Gen wurde auf Mutationen untersucht sowie der Aktivierungsstatus im c-kit-Transduktionspfad nachgeschalteter Proteine festgestellt.
Der Thymus unterliegt einer altersabhängigen Involution. Dieses Phämomen soll in dieser Arbeit mit morphometrischen Mitteln untersucht werden. Mit Hilfe der Farbdifferenzanalyse wird der Anteil von Thymusgewebe im mediastinalen Fettgewebe festgestellt. Weiterhin wird die Veränderung des Thymus bei der Autoimmunkrankheit Myasthenia gravis untersucht.
Zusammenfassung Die Langzeitresultate von aortocoronaren Venenbypässen unter Verwendung von Vena saphena magna Interponaten hängen neben vielen anderen Faktoren maßgeblich von der Integrität des Gefäßendothels ab. Ein intaktes Endothel spielt für die Offenheit des Grafts eine entscheidende Rolle, da Endothelverletzungen die Entwicklung vorzeitiger thrombotischer Graftverschlüsse triggern und auch an den späten Graftverschlüssen durch Intimahyperplasie und Einsprossung glatter Muskelzellen beteiligt sind. So spielt die Vermeidung intraoperativer Endothelschädigungen der Venengrafts durch die Lagerungsmedien eine entscheidende Rolle. Diese Arbeit hatte zum Ziel, das Endothel von Venengrafts nach Inkubation mit verschiedenen Lagerungslösungen mit direkten Nachweismethoden wie Rasterelektronen- und Transelektronenmikroskopie zu untersuchen. Untersucht wurden sieben cm lange Venensegmente von sechs Patienten, die sich einer ACVB-Operation unterzogen. Die Präparation der Venen fand unter standardisierten Bedingungen statt. Anschließend erfolgte die Inkubation jeweils eines Drittels der entnommenen Segmente für 45 Minuten in einer der folgenden Lagerungsmedien, physiologische Kochsalzlösung, Medium 199 + 20mM HEPES + 5% bovines Serumalbumin und Medium 199 + 20mM HEPES + 20% humanes Serumalbumin. Die Auswertung des Endothelzellschadens erfolgte mittels raster- und transelektronenmikroskopischer Untersuchungen sowie histopathologischer Aufarbeitung. Venensegmente nach Lagerung in physiologischer Kochsalzlösung zeigen signifikante Schädigungen der Endothelzelloberfläche. Bereits nach 45-minütiger Lagerung findet sich in den rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen eine 56,5%ige Ablösung der Endothelzellschicht, transelektronenmikroskopisch kann man Zellschädigungen im Sinne von Zellhydrops und Karyolyse nachweisen. Dagegen findet man nach Lagerung in Medium 199 mit 20%igem Albuminanteil bei Betrachtung mit dem Rasterelektronenmikroskop deutlich geringere Zellschädigungen. Das Endothel von Venen nach Inkubation mit Nährmedium mit 5%igem Albuminanteil stellt sich nahezu intakt, ohne wesentliche Zerstörungen der Zelloberfläche dar. Unsere Arbeit konnte belegen, dass die Lagerungsmethode einen deutlichen Einfluss auf das Gefäßendothel ausübt. Um möglichst große Anteile intakten Endothels zu gewährleisten, bedarf es einer Modifizierung der bisherigen Handhabung der Venenlagerung während einer aortocoronaren Venenbypass-Operation. Eine Möglichkeit dazu könnte in der Lagerung in Zellkulturmedium mit einem 5%igen Albuminanteil gesehen werden.
Die Rolle der DNA-Methylierung in der Kontrolle des MHC-II-spezifischen Typ-IV-Promotors in Thymomen
(2004)
Die Moleküle des „major histocompatibility complex“ (MHC) spielen in der thymischen T-Zell-Reifung eine zentrale Rolle. Durch Interaktion des T-Zell-Rezeptors auf der unreifen T-Zelle und den Co-Rezeptoren CD4 und CD8 mit dem MHC auf dem Thymusepithel werden die zwei wichtigsten Reifungs- und Selektionsprozesse, positive und negative Selektion, vermittelt. Störungen dieser Selektionsmechanismen können zu Immundefekten oder Autoimmunphänomenen führen. Die Regulierung der MHC IIExpression erfolgt hauptsächlich transkriptionell und wird vor allem durch den sogenannten Class II Transaktivator (CIITA) bestimmt. Die Transkription von CIITA wird über vier alternative, gewebsspezifische Promotoren durch alternatives splicing reguliert. Unter diesen Splicevarianten ist der CIITA Typ IV Promotor für die konstitutive MHC II-Expression in Thymusepithelzellen und für die IFN-g induzierte Expression in anderen Geweben verantwortlich. Thymome sind menschliche Tumoren des Thymusepithels, welche häufig mit einer paraneoplastischen Myasthenia gravis (MG) assoziiert sind. Die paraneoplastische MG zeigt eine starke positive Korrelation mit der Fähigkeit eines Thymoms, reife CD4+ T-Zellen zu produzieren und in das periphere Blut zu exportieren. Thymome weisen aus bislang ungeklärten Gründen häufig eine starke Reduktion der epithelialen MHC II- Expression auf. Ziel dieser Arbeit war die Beantwortung der Frage, ob eine DNA-Methylierung der Promotorregion des MHC-Klasse II Transaktivators (CIITA) Typ IV daran beteiligt ist. Hierzu wurden 27 Thymome mit sowohl hoher und als auch niedriger MHC II-Expression und 9 Normalthymi aus unterschiedlichen Altersgruppen untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass der CIITA Typ IV Promotor in kindlichen Kontrollthymi vollständig unmethyliert ist, während die Thymi erwachsener Kontrollpersonen eine vermehrte Methylierung aufweisen. Im Gegensatz dazu war der CIITA Typ IV in nahezu allen Thymomen stark hypermethyliert. Da aber kein signifikanter Unterschied in der Methylierung zwischen Thymomen mit hoher und solchen mit niedriger MHC II-Expression festgestellt werden konnte, lassen diese Ergebnisse vermuten, dass eine Hypermethylierung des CIITA Typ IV Promotors sehr wahrscheinlich nicht der alleinige Grund für die verminderte MHC II-Expression in Thymomen ist, sondern das auch andere Regulationsmechanismen wie zum Beispiel Histon-Acetylierung beteiligt sein könnten beteiligt sein könnten.
Das murine Blimp1 (B lymphocyte-induced maturation protein) und sein humanes Homolog PRDI-BF1 (positive regulatory domain I binding factor 1) sind als terminale Differenzierungsfaktoren der myeloischen Reihe und der B-Lymphozyten (BCs) beschrieben worden. Über direkte sequenzspezifische Promotorbindung und epigenetische Modifikationen greifen sie größtenteils reprimierend in die Expression einer Vielzahl von Genen ein und werden dabei funktionell mit einer niedrigen Proliferationsrate und einem hohen Grad an Zelldifferenzierung und Apoptose in Zusammenhang gebracht. Im Zuge dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Blimp1 auch in der zweiten lymphatischen Zellreihe, also in den T-Lymphozyten (TCs) und hier insbesondere in den Subtypen der T-Helfer-2-Zellen (CD4+ TH2), der CD4+ T-Gedächtniszellen (CD4+ TMem) und der regulatorischen TCs (CD4+ CD25+ TReg) exprimiert wird. Die gefundene Blimp1-Expression ist nicht konstitutiv. Vielmehr wird das Blimp1-Gen über T-Zellrezeptorsignale – über die Proteinkinase C (PKC) und den Anstieg freier intrazellulärer Ca2+-Konzentrationen – verstärkend über den Interleukin-6-Rezeptor-pathway, und über die Aktivität des Transkriptionsfaktors C/EBPβ (CCAAT/enhancer-binding protein) allein induziert. Die Transaktivierung des TATA-boxlosen Blimp1-Promotors (ca. 1 kb) durch C/EBPβ wird stärker über dessen proximale Hälfte vermittelt, an der jedoch keine direkte Bindung des Transkriptionsfaktors nachzuweisen ist, und scheint somit indirekt zu sein. Im Gegensatz dazu bindet das C/EBPβ-Protein im schwächer transaktivierenden distalen Blimp1-Promotorbereich direkt an eine kombinierte, der P1/Pu-bB-des IL-4-Promotors ähnliche NFAT/C/EBP-Bindungssequenz. Die C/EBP-Bindungsstelle liegt hierbei in direkter Nachbarschaft zum NFAT-(nuclear factor of activated T cells) Bindungsmotiv. Auch NFATc1 bindet direkt, entwickelt aber kein transaktivierendes Potential sondern reprimiert vielmehr die durch C/EBPβ-vermittelte Transaktivierung.
Die humane Hybridomatechnologie ist ein guter Ansatz um tumorspezifische humane monoklonale Antikörper zu gewinnen. Der humane monoklonale IgM-Antikörper PAM-1 wurde aus einem Patienten mit Magenkarzinom mit Hilfe der humanen Hybridomatechnik isoliert und bindet an eine neue, post-transkriptionell modifizierte Variante des CFR-1 Rezeptors. Dieser Rezeptor ist auf fast allen Karzinomen unabhängig von Lokalisation und Art exprimiert, aber nicht auf gesundem Gewebe. CFR-1/ PAM-1 ist auch auf Präkanzerosen nachgewiesen worden: Helicobacter pylori-assoziierte Gastritis, Dysplasie des Magens, Colitis ulcerosa assozierte Dysplasie und Kolonadenome, Barrettmetaplasie, -dysplasie des Ösophagus, Plattenepitheldysplasie der Lunge und cervicale intraepitheliale Neoplasie I-III. Das auf präkanzerös veränderte und maligne entartetet Zellen beschränkte Expressionsmuster des CFR-1/PAM-1 Rezeptors bietet interessante Angriffspunkte für weitere Forschungen.
Ziel dieser Arbeit war es, zum einen Unterschiede in der NF-kappaB-Zusammensetzung zwischen HD- und LCAL-Zelllinien und zum anderen anhand der NF-kappaB-Verteilung das in der Literatur beschriebene Verhalten der jeweiligen Zellen bezüglich Proliferation und Apoptose zu analysieren. In beiden untersuchten Zelllinien wurden die NF-kappaB-Faktoren p50 und p65 konstitutiv nukleär exprimiert. In den HD-Zelllinien fand sich zusätzlich konstitutives c-Rel, in den LCAL-Zelllinien dagegen konstitutives RelB. Diese vier Faktoren zeigten auch in den jeweiligen Zellen konstitutive Bindungsaktivität. Die NF-kappaB-Faktoren können als Marker für verschiedene Entwicklungsstufen hämatopoetischer Zellen dienen. Die konstitutiven nukleären NF-kappaB-Faktoren p50 und c-Rel in HD-Zellen wiesen auf B-Zell-typische Eigenschaften hin. Allerdings spricht das in der HD-Zelle HDLM-2 überwiegend im Zytoplasma lokalisierte c-Rel für T-Zell-typische Eigenschaften. In LCAL-Zellen dagegen lassen die konstitutiven nukleären NF-kappaB-Faktoren p50 und RelB einen T-Lymphozyten als Ursprungszelle erkennen. Die konstitutive NF-kappaB-Aktivität in HD-Zelllinien konnte im Vergleich mit den Ergebnissen anderer Forschergruppen bestätigt werden. Im Gegensatz zu den Arbeiten in der Literatur konnten bei den LCAL-Zellen konstitutiv aktive p65/p50-Heterodimere als auch RelB/p50-Heterodimere nachgewiesen werden. Obwohl p65 in den meisten menschlichen Zellen induziert wird, wurde p65 in beiden Zelllinien konstitutiv nukleär exprimiert. Dies könnte ein Indiz für ein dereguliertes NF-kappaB-System in beiden Zelllinien sein und damit möglicherweise die entkoppelte Funktion bezüglich Apoptose und Proliferation erklären. Nach Stimulation des Oberflächenrezeptors CD30 mit dem agonistischen monoklonalen Antikörper M44 konnte in der vorliegenden Arbeit keine NF-kappaB-Induktion festgestellt werden. Nach PMA-Ionomycin-Stimulation fiel in LCAL-Zellen die Aktivität des p65/p50-Komplexes nach vier Stunden ab, in HDLM-2-Zellen nahm sie nach vier Stunden und in KMH-2-Zellen nach einer Stunde zu. Die Komplexe mit den Faktoren RelB in LCAL-Zellen und c-Rel in HD-Zellen hatten eine unveränderte Bindungsaktivität. Die CD30-Stimulation führte in HD-Zellen zur Proliferation. Für KMH-2 sind die Aussagen in der Literatur allerdings widersprüchlich: teilweise zeigte sie keine Auswirkung, teilweise kam es zur Proliferation. Wird die konstitutive NF-kappaB-Aktivität in HD-Zellen gehemmt, reagieren die Zellen mit Apoptose. Der p65-Faktor ist bekannt für seine Apoptose-hemmende Eigenschaft. Die zunehmende p65/p50-Aktivität in HD-Zellen könnte die Zellen zur Proliferation anregen. Außerdem kam es ausschließlich in HD-Zellen zur Expression von c-Rel. Dieser Faktor ist in einigen Zellen ebenfalls für das Überleben notwendig. In LCAL-Zellen folgt der CD30- Aktivierung die Apoptose. In diesen Zellen nimmt die p65-Bindungsaktivität ab, was darauf hinweist, dass sie der Apoptose ausgesetzt sind. RelB wird nur in LCAL-Zellen exprimiert. RelB besitzt eine Doppelrolle: als Komplex mit p50 oder p52 ist er ein positiver Transaktivator, als Komplex mit p65 beeinflusst er die KappaB-abhängige Genexpression negativ. Die starke Konzentration von RelB im Zytoplasma und im Zellkern und die trotz steigender p65-Expression abnehmende p65-Aktivität könnte ein Hinweis auf das inaktivierte p65 und damit eine weitere Erklärung für die Apoptose der LCAL-Zellen sein.
We examined the regulation of NFATc1 in different lymphomas and observed an inversed correlation between the methylation status and expression of NFATc1. Our data demonstrate that aberrant DNA methylation associated with chromatin remodeling within nfatc1 locus is a major mechanism for the repression of NFATc1 expression, suggesting that the DNA methylation-mediated transcriptional silencing of NFATc1 may be a critical event in the tumorogenesis of ALCLs and cHLs. Furthermore, the DNA methylation of human nfatc1 promoter region could be used as a novel biomarker of tumor progression. Our results indicate a close link between the loss of immunoreceptor signaling and NFATc1 expression in human lymphomas. For both ALCLs and cHLs, defects in immunoreceptor signaling have been described which result in a loss of receptor-mediated gene expression programs (Schwering et al., 2003; Bonzheim et al., 2004; Marafioti et al., 2004). In T cells, one indicator gene of these programs appears to be the nfatc1 gene whose expression is controlled by TCR signals (Chuvpilo et al., 2002a). In contrast, in T cells NFATc1 expression is unaffected by TCR signals, and NFATc2 was found to be expressed at normal levels in ALCLs and cHLs (L.K., unpubl. data). Moreover, the activity of NF-kappaB factors which can bind to certain NFAT binding sites and share a distantly-related DNA binding domain with NFATs is strongly elevated in cHL cells (Bargou et al., 1997; Hinz et al., 2001; Hinz et al., 2002) suggesting that NFATs and NF-kappaBs exert very different effects on generation and maintenance of Hodgkin’s lymhomas. However, it should be mentioned that in Burkitt’s and further B cell lymphomas in which NFATc1 proteins are strongly expressed and controlled by receptor signals (Kondo et al., 2003), they could exert a promoting function in tumor development. The genes of p53 family members p63 and p73 are prominent examples for mammalian genes whose products can act both as oncoproteins and tumor suppressor genes (Hibi et al., 2000; Stiewe and Putzer, 2002), and it is likely that more genes exist which encode both tumor suppressors and oncoproteins. It remains to be shown whether the nfatc1 gene is one of them.
Durch einen auffällig hohen Anteil an Patienten mit Autoimmungastritis, die gleichzeitig Antikörper gegen Helicobacter pylori aufweisen, wurde eine enge pathogenetische Korrellation der beiden Krankheitsbilder vermutet. So macht eine Entstehungstheorie der Autoimmungastritis eine Supermutation der B-Zellen nach Antigenkontakt mit dem H.pylori für eine autoimmune Entgleisung dieser verantwortlich. Die molekulargenetischen Untersuchungen der antikörperkodierenden Gene und deren Mutationen zeigen jedoch, daß das Mutationsniveau in der Autoimmungastritis niedriger ist als dies in der H. pylori Gastritis. Die Theorie der durch Supermutationen entstehenden autoimmungastritis aus der H.pylori Gastritis konnte in dieser Arbeit nicht bestätigt werden. Auch wurde durch des Aufstellen genealogischer B-Zellklon Stammbäume eine Kompartimentierung der inflammatorischen Zellen nach anatomischen Regionen, wie es das histopathologisches Bild der beschriebenen Gastritiden vermuten ließen nicht darstellen.
Um das Risikoprofil beim Mantelzell-Lymphom (MCL) zu identifizieren, wurden morphologische und immunhistochemische Daten von 225 Patienten verglichen. Klinische Daten konnten von 139 Patienten gesammelt werden. Cytogenetische Daten standen von 83 Patienten zur Verfügung. Das wichtigste Ergebnis war die Höhe des Proliferationsindex für die individuelle Überlebensdauer. Vergleichbar mit den Ergebnissen von Rosenwald et al. (Cancer cell, 2/2003, Vol. 3, Seiten 185-197) konnten wir zeigen, daß der Proliferationsindex auch dann mit der Überlebensdauer korreliert ist, wenn man vier Gruppen mit ansteigendem Proliferationsindex (PI) bildet. Dies beweist die Bedeutung des PI bei Mantelzell-Lymphomen. Zusätzlich war eine blastische Zytomorphologie mit einem hohen Mitoseindex, erhöhten Ki-67 Werten und einer Überexpression von p53 korreliert. Die Analyse der zytogenetischen Daten ergab folgende häufige Bruchpunkte: 11q13, 14q32, 1p22, 1p32, 6q21 und 1p11. Die häufigsten (partiellen) Trisomien waren: +3, +3q, +3p, +5/5q, +7, +11q, +12q und +X/Xp/Xq, während die häufigsten Deletionen in –1p, -6/6q, -8p, -9/9p, -11/11p, -13/13p, 14/14q und –17/17p zu finden waren. Der Bruchpunkt 1q32 war mit blastischer Zytomorphologie assoziiert und Patienten mit Deletionen in 1p, 9/9p und 1q zeigten einen signifikant höheren Proliferationsindex als die Kontrollgruppe. Wir konnten zeigen, das Tetraploidie und die Anzahl numerischer Abberationen auf der einen Seite mit blastischer Zytomorphologie und einem hohem Ki-67 Index auf der anderen Seite assoziiert waren. Im Gegensatz dazu gab es keinen Zusammenhang zwischen Ploidie, dem Mitoseindex und einer Überexpression von p53. Die folgenden Faktoren waren Indikatoren einer ungünstigen Überlebensprognose: Ein Karnofsky Index <80, disseminierter Befall (Ann Arbor III-IV), ein IPI>1, ein Hämoglobin >12,5mg/dl, ein Befall von Leber oder Knochenmark, Leukozytenwerte >10.000, keine Remission oder Progression unter Therapie. Die folgenden Parameter waren mit kürzeren Überlebensdauern assoziiert: >3 Bruchpunkte, >2 strukturelle Abberationen, hohe Mitose- und Ki-67 Indices und eine p53 Überexpression. Ein Verlust des Y Chromosoms bei Männern war mit einem längeren Überleben assoziiert. In der Gruppe mit Langzeitüberlebern (>7 Jahre) zeigte sich ein geringerer Befall extranodaler Lokalisationen, von Milz und Knochenmark, weniger B-Symptomatik, niedrigere LDH-Werte und weniger disseminierter Befall. Ein niedriger Proliferationsindex war ebenfalls ein wichtiges Kriterium in dieser Gruppe, kein einziger Fall wies eine PI>30% auf.
Drei verschiedene mit Hilfe der humanen Hybridomatechnologie aus einem Rektumkarzinompatienten isolierte humane monoklonale Antikörper wurden immunhistochemisch und mit Hilfe zellbiologischer Tests untersucht. Die Ergebnisse der Immunperoxidasefärbung geben erste Hinweise auf die Art und Verteilung der von den Antikörpern erkannten Antigene. HH 98/81-33-154 und HH 99/71-81-149 färben nur wenige kolorektale Karzinome sowie einige Tumoren verschiedenen histologischen Ursprungs an und zeigen keine Reaktion mit normalen adulten oder fetalen Geweben. HH 101/99-14 reagiert dagegen außer mit zahlreichen Dickdarmkarzinomen auch mit einigen fetalen Geweben, was auf die Expression des spezifischen Antigens während der Fetalperiode schließen läßt. Neben den Kreuzreaktionen mit verschiedenen zentralnervösen Strukturen adulter Normalgewebe, die im Hinblick auf paraneoplastische neurologische Krankheitsbilder von Interesse sind, zeigt der Antikörper weiterhin eine Affinität zu drüsig differenzierten Tumoren. Im MTT-Assay auf Zellen der Kolonkarzinomzellinie CACO-2 bewirkte unverdünnter Zellkulturüberstand der Antikörper HH 98/81-33-154 und HH 101/99-14 eine starke Proliferationshemmung. Dieser Effekt konnte sowohl nach 24- als auch nach 48stündiger Inkubation, nicht jedoch mit verdünntem Überstand nachgewiesen werden. Mit Überstand von HH 99/71-81-149 war hingegen nur eine schwache Hemmung mitochondrialer Dehydrogenasen zu verzeichnen. Zellen der Linien HT-29, COLO 206F sowie COLO 320 zeigten sich hingegen resistent gegen die antikörpervermittelte Wachstumshemmung. Mit Hilfe des Cell Death Detection ELISAPLUSÒ konnte weiterhin belegt werden, daß HH 98/81-33-154 und HH 101/99-14 nicht nur das Wachstum von Tumorzellen hemmen, sondern überdies auf der Zellinie CACO-2 Apoptose induzieren. In beiden funktionellen Tests überstieg die gemessene Aktivität des niedriger konzentrierten HH 98/81-33-154 die von HH 101/99-14. Die relativ geringe Anzahl von Kreuzreaktionen mit gesundem Gewebe sowie die apoptoseinduzierende Aktivität von HH 98/81-33-154 und HH 101/99-14 unterstreichen die Eignung der Antikörper als potentielle Immuntherapeutika für die adjuvante Behandlung des kolorektalen Karzinoms, einer weltweit zu den häufigsten Krebsarten zählenden Tumorerkrankung.
Prognostische und therapeutische Aspekte von Thymomen : eine retrospektive Studie von 582 Fällen
(2004)
Thymome sind seltene epitheliale Thymustumoren, die in der überwiegenden Zahl der Fälle die Fähigkeit zur Reifung und zum Export von T-Zellen behalten haben. Diese Fähigkeit ist als Ursache für die häufige Asoziation dieser Tumoren mit Autoimmunphänomenen (z.B Myasthenia gravis)anzunehmen. Die vorgelegte Studie zeigt die prognostische Relevanz der derzeit gültigen histologischen WHO-Klassifizierung von Thymomen. Das biologische Verhalten der einzelnen Thymomtypen korreliert dabei mit dem Ausmaß zytogenetischer Veränderungen. Wenige klinische und histologische Parameter wie der histologische Subtyp, Tumorstadium nach Masaoka sowie der Resektionsstatus reichen aus, um den Verlauf eines bestimmten Thymoms mit genügender Zuverlässigkeit prognostizieren zu können. Dies konnte in Übereinstimmung mit früheren Arbeiten in unserer Studie gezeigt werden. Somit müssen vor allem diese drei Parameter berücksichtigt werden, um eine adäquate Therapie einleiten zu können. Angaben zu Alters- und Geschlechtsverteilung können diese Befunde ergänzen, haben jedoch keine prognostische Signifikanz für die Wahl der Therapie. Die erhobenen Befunde der vorgelegten Follow-up Studie können als Grundlage prospektiver klinischer Therapiestudien dienen. Im Zentrum der Bemühungen sollte hierbei nach unseren Ergebnissen die Therapie von „high-risk“ Thymomen des Typ B und C stehen, bei denen eine primäre vollständige Resektion nicht möglich ist, oder bei denen zum Zeitpunkt der Operation bereits Metastasen bestehen. Therapieoptionen mit multimodalen Therapiestrategien müssen dafür noch weiter modifiziert und über längere Zeiträume erprobt werden. Zudem sollten klinische Studien mit Somatostatin-Analoga als neue Therapiemöglichkeit gefördert werden. Aufgrund der äußerst niedrigen Inzidenz von Thymomen und der niedrigen Frequenz von Patienten mit diesen ungünstigen Thymomverläufen werden diese Versuche nationale oder internationale Bemühungen erfordern.
Interleukin-5 ist ein Th2-Cytokin, das eosinophile Granulozyten aktiviert und B-Zellen zur Produktion von IgE stimuliert. Bei der Entstehung von allergischen (wie z.B. Asthma) und atopischen Reaktionen spielt die erhöhte Ausschüttung von IL-5 eine wichtige Rolle. Der Interleukin-5-Promoter weist unter anderem Bindestellen für NF-AT-Faktoren und GATA-3 auf. NF-ATc ist ein Mitglied der NF-AT („Nuclear Factor of Activated T-cells“)-Transkriptionsfaktoren, die an den verschiedensten immunologischen Funktionen beteiligt sind, vor allem aber an der Steuerung der Cytokingene. GATA-3 ist ein wichtiger Th2-spezifischer Zinkfinger-Transkriptionsfaktor aus der Familie der GATA-Faktoren, die an eine gemeinsame WGATAR-Sequenz der DNA binden. Molkentin et al. zeigten 1998, daß NF-AT3 und GATA-4 in Herzmuskelzellen physikalisch interagieren und daß ihre funktionelle Kooperation bei der Aktivierung verschiedener Promotoren letztendlich zur Entwicklung einer Herzhypertrophie beiträgt. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine ähnliche physikalische Interaktion zwischen NF-ATc und GATA-3 in T-Zellen stattfindet. Zu diesem Zweck wurden im ersten Teil der Arbeit Coimmunopräzipitationen durchgeführt. Dabei konnte in mit NF-ATc und GATA-3 cotransfizierten 293T Zellen eine spezifische in vivo Interaktion der beiden Transkriptionsfaktoren nachgewiesen werden. Im zweiten Teil der Arbeit sollten mittels GST-„pulldown“-Experimenten die für die Interaktion wichtigen Proteindomänen von NF-ATc und GATA-3 bestimmt werden. Im ersten Schritt wurden die dafür benötigten Plasmide konstruiert. Im zweiten Schritt erfolgte die bakterielle Expression und nachfolgende Aufreinigung der GST-Fusionsproteine. Mit GST wurde jeweils eine N- und C-terminale Hälfte von NF-ATc und GATA-3 fusioniert. Mit diesen rekombinanten Proteinen wurden die „pulldown“-Experimente durchgeführt. Dabei konnte eine Interaktion des C-terminalen Anteils (enthält den zweiten Zinkfinger) von GATA-3 mit NF-ATc detektiert werden. Nachfolgende Ergebnisse deuteten auf eine Interaktion des C-terminalen Anteils (enthält die „Rel-Similarity-Domain“) von NF-ATc mit GATA-3 hin. Analog zeigten Molkentin et al., daß die RSD von NF-AT3 mit dem C-terminalen Zinkfinger von GATA-4 in Herzmuskelzellen interagiert. Die Interaktion von NF-ATc und GATA-3 scheint nicht nur physikalisch zu existieren, sondern auch funktionell von Bedeutung zu sein. In Luciferase-Reporteressays, die in unserem Labor durchgeführt wurden, zeigte sich bei Cotransfektion von NF-ATc und GATA-3 im Vergleich zu Einzeltranfektionen eine drastische Aktivitätssteigerung des IL-5 Promoters. Diese Ergebnisse weisen – wiederum analog zu den Vorgänge im Herzen - auf eine funktionelle Kooperation der beiden Transkriptionsfaktoren bei der Steuerung des IL-5 Promoters hin.
Zur Charakterisierung der genetischen Aberrationen, welche für die Pathogenese von Enteropathie-Typ T-Zell-Lymphomen eine Rolle spielen, wurden 26 Tumoren mit 47 Mikrosatellitenmarkern untersucht. Dabei stellte sich die Amplifikation im Bereich 9q34, dem Genlokus für c-abl und Notch-1, als die häufigste Aberration heraus, welche sich bei 40% der informativen Genotypen nachweisen ließ. Weitere häufige Aberrationen fanden sich in 5q33-34, 7q31, 6p24, 7p21 und 17q23-25. Bei der Analyse des Verteilungsmuster der Aberrationen ließen sich die ETLs in 2 Untergruppen einteilen.
In der vorliegenden Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation des proximalen Promotors der lymphozytenspezifischen Proteintyrosinkinase lck untersucht. Das Hauptaugenmerk richtete sich auf die Beteiligung der Familie der NF-AT-Transkriptionsfaktoren an der Kontrolle der Promotoraktivität. Es konnte zunächst gezeigt werden, dass NF-ATs aus Zellkulturzellen sowie aus frisch isolierten Thymozyten spezifisch an Sequenzmotive in der regulatorischen Region des lck-Typ-I-Promotors binden. Die NF-AT-Bindungsstellen mit der höchsten Affinität wurden in Pos. –480/–476 (NF-AT-I lck) und in Pos. –216/–212 (NF-AT-II lck) identifiziert. Eine Mutation in den Bindungsmotiven verhinderte dementsprechend die Ausbildung von NF-AT-Komplexen mit der DNA. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass NF-AT-Faktoren den proximalen lck-Promotor allein und zusammen mit Faktoren der Ets-Familie bzw. c-Myb aktivieren können. Die Untersuchung der Interaktion von NF-AT und c-Myb ergab, dass die beiden Transkriptionsfaktoren unmittelbar benachbart an die DNA binden. Unter Berücksichtigung dieses Bindungsverhaltens und der Kooperation in der Transaktivierung des Promotors konnten wir somit eine neue Form eines NF-AT-"composite elements" beschreiben. Bei der Untersuchung von NF-AT-"knock out"-Mäusen auf Anzeichen einer lck-Bildungsstörung zeigte sich eine deutliche Reduktion der lck-Typ-I-Transkripte in NF-AT1/NF-AT4 doppelt defizienten Tieren. Dies belegt die Relevanz der NF-AT-Faktoren für die Aktivität des proximalen lck-Promotors in vivo.
Der Gewebe Mikroarray ist eine sehr effektive Methode eine große Anzahl von Lymphomen in kurzer Zeit und unter gleichen Färbebedinungen zu untersuchen. Es wurde eine hohe Übereinstimmung bei den homogen exprimierten Markern erzielt. Schwierigkeiten ergeben sich nur in der Erfassung von regional begrenzten Überexpressionen, hier am Beispiel der Maximalexpression des Proliferationsmarkers Ki67 untersucht. Ferner wurden ein Vergleich von verschiedenen Markern zwischen Frischmaterial und formalinfixiertem Paraffinmaterial erstellt, sowie ein Immunphänotyp für ausgewählte NHL Enitäten.
Das Ausmaß und die Bedeutung molekulargenetischer Veränderungen in der Pathogenese gastraler Marginalzonen B-Zell Lymphome (MZBCL) vom MALT-Typ ist derzeit noch unklar. Ein unbekannter Teil dieser niedrig-malignen Lymphome transformiert zu hoch-malignen gastralen „diffusen großzelligen B-Zell Lymphomen“ (DLBCL), jedoch besitzen diese DLBCL nicht die Translokation t(11;18)(q21;q21), die sich dagegen in den gastralen MZBCL vom MALT-Typ als die häufigste Translokation mit noch unklarer Konsequenz etablierte. Um die Pathogenese dieser Tumoren genauer zu analysieren, wurden in dieser Studie 24 gastrale MZBCL vom MALT-Typ mit 39 Mikrosatellitenmarkern auf genomische Aberrationen untersucht. Die gastralen MZBCL vom MALT-Typ können nach unseren Ergebnissen in zwei Gruppen eingeteilt werden, die in ihrer Pathogenese zwei unterschiedliche Wege gehen. Die erste Gruppe beinhaltet die Translokation t(11;18)(q21;q21)–positiven MZBCL vom MALT-Typ. Diese erwerben signifikant weniger genomische Aberrationen als die Translokation t(11;18)(q21;q21)–negativen und transformieren nicht zu DLBCL. Die zweite Gruppe bilden die Translokation t(11;18)(q21;q21)–negativen MZBCL vom MALT-Typ. Diese erlangen im Verlauf ihrer Entwicklung signifikant mehr genomische Aberrationen als die Translokation t(11;18)(q21;q21)–positiven und scheinen ein potenzieller Ursprung für sekundäre hoch-maligne DLBCL zu sein. Der „mutator-pathway“ mit dem Kennzeichen der Mikrosatelliteninstabilität (MSI) spielt nach unseren Erkenntnissen bei den gastralen MZBCL vom MALT-Typ nur eine untergeordnete Rolle, vielmehr ist die chromosomale Instabilität in Form von Deletionen (loss of heterozygosity, LOH) oder Amplifikationen von Bedeutung. Die mit 20,8% der untersuchten Fälle am häufigsten gefundene Aberration war die Amplifikation der Region 3q26.2-27, welche den BCL-6- bzw. den PIK3CA-Genlocus beinhaltet. Auch wurden Amplifikationen des MLL-Genlocus auf 11q23-24 und der Region 18q21 und LOH der Regionen 6q23.3-25.3 und 7q31 gefunden. Beim Vergleich mit den DLBCL stellte sich außerdem heraus, dass Allelverluste auf 6q und 7q frühe Ereignisse in der Progression zu DLBCL zu sein scheinen.
Genetische Veränderungen von Thymomen, insbesondere rekurrente Aberrationen, sind bislang unbekannt. In dieser Dissertation wurden 13 WHO Typ A Thymome, 23 WHO Typ B3 Thymome sowie 12 primäre Plattenepithelkarzinome (WHO Typ C Thymome) sowie einige seltene Primärtumoren des Thymus mittels Komparativer genomischer Hybridisierung untersucht. Mit Ausnahme eines einzigen Falles zeigten WHO Typ A Thymome keine chromosomalen Gewinne oder Verluste. Im Gegensatz dazu fanden sich bei allen Thymomen des Typs B3 genetische Aberrationen. Der Gewinn von 1q trat in 15 (65%), Gewinne von Chromosom 16 und Xq traten in jeweils 3 (13%) Fällen auf. Verluste fanden sich auf Chromosom 6 in 10 Fällen (43%) und an 13q in 6 Fällen (23%). Die häufigsten Gewinne bei primären Plattenepithelkarzinomen fanden sich auf 1q in 7 Fällen (58%), auf 17q in 4 Fällen (33%) und auf Chromosom 5 und 18 in jeweils 3 Fällen (25%). Rekurrente Verluste traten bei dieser Entität auf Chromosom 16q in 8 Fällen (67%), auf Chromosom 6 in 6 Fällen (50%), auf Chromosom 3 in 4 Fällen (33%) und auf den Chromosomen 13q sowie 17p in jeweils 3 Fällen (25%) auf. Die Dissertation zeigt, daß histologisch unterschiedliche Thymome mit unterschiedlichen, rekurrenten Aberrationen assoziiert sind. WHO Typ A Thymome weisen nur vereinzelt genetische Aberrationen auf. Thymome vom WHO Typ A und Typ B3 weisen verschiedene genetische Phänotypen auf, während Thymome vom Typ B3 sowie die primären Plattenepithelkarzinome des Thymus gemeinsame genetische Aberrationen zeigen. Neben den pathogenetischen Aspekten weist der beobachtete Verlust von Chromosom 6, auf dem sich die Genloci der HLA-Moleküle befinden, bei WHO Typ B3 Thymomen auch auf eine Rolle bei der Entstehung paraneoplastischer Autoimmunphänomene wie der Myasthenia Gravis hin.