Pathologisches Institut
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- Center for Interdisciplinary Clinical Research, Würzburg University, Würzburg, Germany (1)
- Department of Paediatric Radiology, Institute of Diagnostic and Interventional Radiology, Josef-Schneider-Straße 2, Wuerzburg 97080, Germany (1)
- IZKF Nachwuchsgruppe Geweberegeneration für muskuloskelettale Erkrankungen (1)
- Lehrstuhl für Regeneration Muskuloskelettaler Gewebe (1)
- Muskuloskelettales Centrum Würzburg (MCW) (1)
In this thesis we have investigated the effect of NFAT (Nuclear Factor of Activated T Cell) transcription factors on the expression of Rag-(Recombination Activating Genes) genes in murine thymus. The protein products of Rag genes, RAG1 and RAG2, are critical for the recombination and generation of the TCR (T Cell Receptor) repertoire during thymocyte development, and their expression can be suppressed by the activity of NFAT factors. In thymus, the expression of Rag1 and Rag2 genes is induced at the double-negative (DN, CD4-8-) 3 stage, down-regulated at the DN4 stage, re-induced at the double-positive (DP, CD4+8+) stage, and suppressed again at the single-positive (SP, CD4+8- or CD4-8+) stage. Although it is known that TCR signaling suppresses the expression of Rag1 and Rag2 at the SP stage, the signals that mediate the Rag gene down-reulation remain elusive. Here we report that both the calcineurin-NFAT-signaling and MAPKinase signaling pathways, which are activated by TCR signaling during positive selection, mediate the Rag gene down-regulation in DP thymocytes. The calcineurin-NFAT pathway suppresses both the Rag1 and the Rag2 gene expression. This pathway has a stronger suppressive effect on the Rag1 than the Rag2 gene. A synergistic activity between the two NFAT factors NFATc2 and NFATc3 is essential for calcineurin-NFAT signaling to efficiently suppress the Rag gene expression in DP thymocytes. It is likely that the calcineurin-NFAT signaling down-regulates Rag gene expression by suppressing both the Rag anti-silencer element (ASE) activity and the Rag promoter activity. Similarly, MEK-ERK signaling of MAPK signaling pathway mediates the Rag gene suppression in DP thymocytes although the mechanism through which MEK-ERK mediates the Rag gene down-regulation has to be elucidated. In DN thymocytes, it appears that neither the calcineurin-NFAT signaling nor MAPK signaling is involved in the Rag gene down-regulation. However, a role for these two signaling pathways in the Rag gene up-regulation in DN thymocytes is not excluded. In DN thymocytes, pre-TCR signaling stimulates the expression both Nfatc1 and Nfatc2 genes but has no effect on Nfatc3 gene expression. In DN thymocytes, pre-TCR signaling activates Nfatc1α expression but not Nfatc1ß expression, i.e. the two promoters controling Nfatc1 gene xpression are differently controled by pre-TCR signals. Nfatc1α gene expression in DN thymocytes is mainly regulated by the MAPK signaling pathway because activation of Nfatc1α is mediated by MEK-ERK signaling but opposed by JNK signaling. Calcineuirn-NFAT and p38 signaling pathways are not involved in Nfatc1α promoter regulation in DN thymocytes. In DP thymocytes, TCR signaling up-regulates Nfatc1 and Nfatc2 expression but down-regulates Nfatc3 expression. In DP thymocytes, TCR signaling activates Nfatc1α expression. The activation of Nfatc1α in DP thymocytes is mediated by NFATc1, but not or to a less degree by NFATc2 and NFATc3. MEK-ERK, JNK, and p38 signaling pathways are involved in Nfatc1α gene activation in DP thymocytes, probably by activating NFAT trans-activation activity. All these findings illustrate that in thymocytes the expression of NFAT transcription factors – which are essential for thymic development - is controled at multiple levels.
Die Rolle von NFAT-Transkriptionsfaktoren bei der Regulation der Apoptose peripherer T-Zellen
(2006)
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der NFAT-Transkriptionsfaktoren NFATc2 und NFATc3 beim AICD (Activation induced cell death) von peripheren T-Lymphozyten untersucht. Dazu wurde die Auslösbarkeit der Apoptose mittels Anti-CD3-Antikörper bei Wildtyp- bzw. Knock-out-Mäusen mit folgender NFAT-Ausstattung verglichen: NFAT c2+/+c3-/-, c2-/-c3+/+, c2-/-c3-/+, c2-/-c3-/-. Mittels FACS-Analyse von T-Helfer-Zellen aus den Lymphknoten dieser Mäuse zeigte sich, dass die CD3-vermittelte Apoptose - im Gegensatz zur Fas-vermittelten - mit dem Gesamtgehalt der Zellen an NFATc2 und NFAT c3 korreliert und diesbezüglich eine direkte Proportionalität angenommen werden kann.
Bei T-Zell-Lymphomen sind im Gegensatz zu B-Zell-Lymphomen wenige spezifische genetische Aberrationen bekannt. In dieser Arbeit wurden 39 periphere T-Zell-Lymphome (30 PTCL NOS und 9 EATCL) mit der Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung untersucht. Es wurde ein Screening auf Aberrationen vorgenommen, die zu einem Teil bei B-Zell-Lymphomen eine Rolle spielen, zum anderen bereits für T-Zell-Lymphome beschrieben wurden. Alle untersuchten EATCL wiesen Zugewinne in 9q34 auf. Diese waren signifikant häufiger bei EATCL als bei PTCL NOS. Diese Ergebnisse decken sich mit den CGH-Untersuchungen von Zettl et al.(2002,2004). Ein Vergleich mit Daten aus der Literatur zeigt, daß diese Zugewinne unter peripheren T-Zell-Lymphomen gegenwärtig als spezifisch für EATCL anzusehen sind. Dies ist die erste beschriebene spezifische Aberration bei EATCL. Das Philadelphiachromosom mit der Translokation t(9;22)(q34;q11), das bei der chronisch myeloischen Leukämie gefunden wird, wurde bei EATCL nicht nachgewiesen. Welches das relevante Gen in der Region 9q34 ist, ist noch nicht geklärt. Inwiefern Amplifikationen des NOTCH1-Gen für die Pathogenese der EATCL eine Rolle spielen, müssen weitere Untersuchungen zeigen. Bei PTCL NOS fand sich in 30% der Fälle eine Deletion im langen Arm von Chromosom 5. Dabei war in jedem Fall die Bande 5q21/22 betroffen. Es zeigte sich eine Tendenz zu häufigeren Deletionen von 81c5 als vom proximal gelegenen APC-Gen und in 5q31. Bei den diploiden Fällen war dieser Unterschied statistisch signifikant. Es ist somit anzunehmen, daß der Genlocus distal des APC-Gens und proximal von 5q31 in der Nähe von 81c5 liegt. Verluste in 5q21/22 sind bislang bei T-Zell-Lymphomen nur im Rahmen einer CGH-Studie für PTCL NOS beschrieben worden. Nach unseren Daten scheinen sie bei EATCL keine Rolle zu spielen. Deletionen in 6q21 und von TP53 spielen als sekundäre Aberrationen sowohl bei PTCL NOS als auch bei EATCL eine Rolle. Bei PTCL NOS waren sie signifikant häufiger bei den tetraploiden Fällen zu finden. So waren Deletionen von TP53 bei allen tetraploiden Fällen nachzuweisen. Ein Zusammenhang mit der Progression der Tumoren kann vermuten werden. Dieser Unterschied zwischen diploiden und tetraploiden Fällen fand sich bei EATCL nicht. Aberrationen von ATM, die bei B-Zell-Lymphomen beschrieben wurden, haben bei PTCL NOS und EATCL nach den vorliegenden Daten keine Bedeutung. Bezüglich Deletionen von ATM unterscheiden sich PTCL NOS und EATCL signifikant von T-PLL, bei denen Deletionen von ATM beschrieben wurden. Deletionen von D13S25 wurden zwar sowohl bei PTCL NOS als auch bei EATCL gefunden. Allerdings zeigt ein Vergleich mit der Literatur, dass die minimale überlappende Region der Deletionen eher distal in Bande 13q21 zu suchen ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals mit der Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung spezifische Aberrationen bei PTCL NOS und EATCL beschrieben werden. Zudem konnten weitere Aberrationen nachgewiesen werden, die bei diesen Entitäten eine Rolle in der Pathogenese zu spielen scheinen. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um ihre Bedeutung in der Diagnostik und Therapie der Malignome zu klären.
Eine primäre Aberration wurde bei den extranodalen diffusen großzelligen B-Zell-Lymphomen bisher nicht definiert. Das in dieser Arbeit untersuchte Chromosom 1 birgt dennoch eine Vielzahl an genomischen Veränderungen, die möglicherweise als sekundäre Aberrationen an der Pathogenese der extranodalen DLBCL beteiligt sein könnten. Durch die in der vorliegenden Untersuchung angewandten Mikrosatellitenanalyse war es möglich, diese genomischen Aberrationen aufzudecken. Als Hotspot unserer Untersuchung gilt die Chromosomenbande 1p36.32, die den Locus für das Gen TP73 enthält. Deletionen in diesem Bereich wurden in 34,8% der informativen Fälle nachgewiesen. Die am zweithäufigsten von Deletionen betroffene Region (20% der Patienten) war 1q32.3-41. Die Bereiche 1p22 und 1q21-23 waren nicht auffällig verändert. Wir vermuten, dass Aberrationen dieser Bereiche in der Pathogenese der gastralen DLBCL von untergeordneter Bedeutung sind. Lediglich 1,44% aller Genotypen zeigten Mikrosatelliteninstabilität, high frequency MSI konnte dabei in keinem der Fälle nachgewiesen werden. Bei Betrachtung des Alters der Patienten, die MSI aufwiesen, fällt ein signifikanter Zusammenhang zwischen höherem Alter und steigender MSI-Inzidenz auf. Eine Korrelation zwischen Tumorstadium und MSI-Inzidenz konnte nicht festgestellt werden. Der für die Mikrosatelliteninstabilität stehende Mutator Pathway scheint keine bedeutende Rolle in der Pathogenese der DLBCL einzunehmen. Die Ergebnisse unserer Untersuchung veranlassen uns jedoch dazu, dem Tumorsuppressor Pathway eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der extranodalen DLBCL zuzuschreiben.
Die vorliegende Arbeit hatte zur Aufgabe, die EBV-infizierte Zelle bei infektiöser Mononukleose, Hodgkin Lymphom, Post-Transplantations-Lymphoproliferation(PTLD) und seniler Lymphoproliferation zu beschreiben. Da die Einordnung der senilen Lymphoproliferation als eigenständige Entität unbefriedigend ist, sollte der Bezug zu PTLD oder Hodgkin Lymphom untersucht werden.Sowohl bezüglich des Latenztyps des EBV, der Oberflächenantigen- und Transkriptionsfaktorenexpression als auch der fehlenden Immunglobulinsekretion entsprachen sich Hodgkin Lymphom und senile Lymphoproliferation. Zwischen seniler Lymphoproliferation und PTLD dagegen fanden sich diesbezüglich große Unterschiede. Daher sind die senilen Lymphoproliferationen im Ergebnis dieser Doktorarbeit als Hodgkin Lymphome des höheren Alters anzusehen. Als Nebenbeobachtung stellten sich die hier untersuchten Hodgkin Zellen als CD27 negativ dar, die im Unterschied stehen, zur CD27 und CD30 positiven Memoryzelle, welche als korrespondierende Normalzelle postuliert wurde. Der Vergleich EBV-negativer und EBV-positiver Hodgkin Lymphome erbrachte in dieser Hinsicht jedoch keine Unterschiede. Die CD27-Negativität der Hodgkin Zelle ist somit nicht als EBV-spezifisches Phänomen zu verstehen und bedarf weiterer Klärung.
Das Somatostatin-Analogon Octreotid ist ein in der Diagnose von Thymomen und Thymuskarzinomen wertvolles Hilfsmittel, da praktisch 100 % der Fälle eine kräftige Anreicherung in der Octreotid-Szintigraphie aufweisen, während entzündlich veränderte und nicht-neoplastische Thymi meist nicht anreichern. Auch therapeutisch zeigten 5 der 8 hier untersuchten Thymome eine ausgeprägte, objektivierbare Tumorregression unter einer Kombinationstherapie von Octreotid und Prednison, allerdings zählte die Mehrzahl der Fälle mit gutem Ansprechen zu der Gruppe der klinisch gutartigen Typ A und AB Thymome, während alle Fälle ohne Ansprechen ungünstige Typ B3 Thymome und Thymuskarzinome waren. Das unterschiedliche Anreicherungsverhalten von Normalthymi und Thymomen war nicht durch Unterschiede im immunhistochemischen Expressionmuster von SSTR-Isoformen erklärbar. Die für die Bindung von Octreotid hauptverantwortlichen Somatostatinrezeptor (SSTR) Subtypen 2A, 3 und 5 zeigten in Normalthymi und nahezu allen untersuchten Thymomen und Thymuskarzinomen eine kräftige zytoplasmatische Expression, während membranständige SSTR in Normalthymi nicht, in Thymomen und Thymuskarzinomen nur in etwa 5 % der Fälle beobachtet wurden. Auch das unterschiedliche Ansprechen der einzelnen Thymome bzw. Thymuskarzinome korrelierte nicht mit einem erkennbar unterschiedlichen Expressionsprofil der einzelnen SSTR. Die Befunde sind in erster Linie durch unterschiedliche Kinetiken bei der Internalisierung der SSTR, möglicherweise auch durch Heterokomplexbildung mit anderen Rezeptortypen erklärbar. Eine weitere Erklärungsmöglichkeit wäre eine unterschiedliche Kompetition von Octreotid mit intrinsischem Somatostatin. Unsere Ergebnisse sprechen gegen eine gängige Auffassung, nach der ausschließlich membranständige SSTR durch eine Octreotid-Therapie „attackiert“ werden können. Die Aussagekraft der in der Bildgebung objektivierten Tumorregression und der histologischen Befunde vor und nach Octreotidtherapie ist allerdings mit Vorbehalt zu bewerten, da in allen Fällen eine Kombinationstherapie mit Steroiden durchgeführt wurde und mittlerweile bekannt ist, dass auch Steroide allein bei einem Teil der Fälle zu einer Tumorremission führen können.
Follikuläre Lymphome (FL) machen etwa 25-40% der Non-Hodgkin-Lymphome aus und sind in der Regel bereits bei Diagnosestellung nicht mehr auf den Lymphknoten beschränkt, sondern systemische Erkrankungen. In jüngeren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die selten diagnostizierten limitierten Stadien (Ann Arbor I und II) der Erkrankung häufig einen nur partiellen Befall der betroffenen Lymphknoten durch das Lymphom zeigen. In diesen frühen Stadien kolonisieren follikuläre Lymphome präexistente Follikel (in situ- Lymphom) und breiten sich dann offenbar auf die übrigen Follikel des Lymphknotens aus, bevor ein systemischer Befall des gesamten Organismus feststellbar ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zunächst zu untersuchen, auf welchem Weg die Zellen eines Tumorklons im follikulären Lymphom die Keimzentren eines Lymphknotens kolonisieren. Dazu wurde die genetische Verwandtschaft der einzelnen Tumorsubklone untereinander anhand ihrer individuellen Mutationsmuster bestimmt. Mit Hilfe von daraus berechneten phylogenetischen Stammbäumen konnte die Ausbreitung der Subklone auf die vorbestehenden Keimzentren nachvollzogen werden. Zweitens sollte in dieser Studie der Frage nachgegangen werden, ob die Tumorsubklone auch unter dem Einfluss der Keimzentrumsumgebung stehen, die in der physiologischen B-Zell-Reifung für die enorme Vielfalt der Antikörperspezifität sorgt (Hypermutation). Anhaltende Mutationen (ongoing mutations) innerhalb eines Tumorklons würden auf einen solchen erhaltenen Einfluss der Hypermutationsmaschinerie hinweisen. Schließlich sollte untersucht werden, ob es auch in follikulären Lymphomen eine antigenabhängige B-Zell-Reifung gibt, wie sie bei der physiologischen „Optimierung“ von Antikörpern auf die korrespondierenden Antigene zu finden ist. Material und Methode: Sieben Fälle von follikulären Lymphomen von vier Patienten (davon einer mit einem und einer mit zwei Rezidiven ihrer Lymphomerkrankung) wurden morphologisch und immunhistochemisch reevaluiert. Pro Fall wurden bis zu zehn Follikel mikrodisseziert und pro Follikel die VH-Gene von bis zu zehn Subklonen sequenziert. Computerunterstützt wurden sowohl die genetische Verwandtschaft der Tumorsubklone untereinander und ihre Verteilung auf die einzelnen Follikel, als auch das Verhältnis von R- zu S- Mutationen in den verschiedenen Abschnitten des BCR-Gens und damit ein möglicher Antigen-Einfluss auf die Hypermutation analysiert. Ergebnisse: Ein FL Grad I zeigte ein deutliches Clustering von genetisch miteinander verwandten Tumorsubklonen im selben Follikel. Dennoch fand sich ein moderater interfollikulärer Austausch der Subklone. Bei morphologisch höhergradigen FL (Grad II und IIIa) nahm das Clustering deutlich ab und der interfollikuläre Austausch zu, bis im zweiten Rezidiv eines Patienten ein weitgehend diffuses Wachstum resultierte. Als Ausdruck des erhaltenen Einflusses des Keimzentrums zeigten alle Primärtumoren (FL Grad I und II) noch ongoing mutations, während bei FL in Progression keine ongoing mutations mehr feststellbar waren. Eine Häufung von R-Mutationen in den antigenbindenden Domänen des B-Zell-Rezeptors (CDR) und S-Mutationen in den strukturellen Domänen (FR) als Hinweis auf eine antigen-gesteuerte Hypermutation in den Tumorsubklonen fand sich nur in einem FL Grad I. Aus den genetischen Analysen ergaben sich aber Hinweise auf eine erhaltene Funktionalität des B-Zell-Rezeptors in allen sieben Fällen.
Die t(11; 18)-negativen gastralen Marginalzonen B-Zell Lymphome (MZBCL) vom MALT-Typ (Mukosa-assoziiertes lymphatisches Gewebe) können zu hoch-malignen gastralen diffusen großzelligen B-Zell Lymphome (DLBCL) transformieren. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war die noch offene Frage, ob und in welchem Ausmaß die DLBCL als blastäre Transformation gastraler MZBCL vom MALT-Typ zu verstehen sind, zu beantworten. So konnten wir zeigen, dass eine direkte Progression möglich ist: 44,4% der sequenzierten Fälle haben eine klonale Identität der simultanen Tumorkomponenten aufgewiesen. Wir konnten aber auch feststellen, dass manche sekundäre gastrale DLBCL keine klonale Verwandtschaft zu dem simultanen MZBCL vom MALT-Typ aufweisen und somit als „de novo“ entstandene Tumoren zu betrachten sind. Das Ausmaß und die Bedeutung molekulargenetischer Veränderungen in der Pathogenese und Tumorprogression der gastralen MZBCL vom MALT-Typ sind derzeit ebenfalls noch nicht geklärt. Mittels Mikrosatellitenanalyse konnten wir zeigen, dass 3q Amplifikationen (21,05% der Fälle) und 6q Deletionen (36,84%) häufig vorkommen und somit eine Rolle in der Tumorprogression spielen können. Diese Aberrationen schließen sich in den von uns untersuchten Fällen gegenseitig aus, d.h. Fälle mit 3q Aberrationen weisen keine 6q Deletionen auf und umgekehrt. Die klonal identischen Tumoren weisen auch die gleichen Aberrationen auf, im Gegensatz zu den nicht klonal verwandten Tumoren. Als Ergänzung zu den Aussagen vorangegangener Studien weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass eine direkte Progression nicht nur über 3q Amplifikationen sondern auch über 6q Deletionen möglich ist und dass unterschiedliche Aberrationen mit klonal unteschiedlichen Tumoren korrelieren. Der „mutator pathway“ mit dem Kennzeichen der Mikrosatelliteninstabilität spielt nach unseren Erkenntnissen keine bedeutende Rolle in der Entstehung und Progression der gastralen MZBCL vom MALT-Typ, vielmehr ist die chromosomale Instabilität in Form von Amplifikationen und Deletionen von Bedeutung. Die Tumorprogression der gastralen MZBCL ist ein komplexer Prozess der auch mit zusätzlichen hier nicht untersuchten genetischen Aberrationen verbunden ist.
Zielsetzung dieser Arbeit war die Untersuchung von Gehirngewebe in der asymptomatischen Phase der SIV-Infektion zur Erfassung immunologischer Vorgänge bei der Entstehung einer SIV-Enzephalitis am Beispiel der gewebeständigen Lymphozyten und Makrophagen. Wir benutzten das etablierte SIV-AIDS Modell mit Makakenaffen. Untersucht wurden 24 Versuchstiere im Zeitraum von bis zu 20 Wochen, die zuvor mit einem der beiden Virusstämme (SIVmac251/ 32H oder SIVmac251/ MPBMC) infiziert worden waren, vier der Versuchstiere entwickelten eine SIV-Enzephalitis, eines dieser Tiere war mit Selegilin behandelt worden. Fünf weitere infektfreie Makaken dienten als Kontrollen. Nach definierten Zeiträumen wurden die Versuchstiere getötet, die Gehirne präpariert und mittels Immunhistochemie Lymphozyten und Makrophagen angefärbt. Im weiteren führten wir eine lichtmikroskopische Morphometrie, getrennt nach einzelnen Kompartimenten des Gehirns, wie Cortex, subcorticalem weißem Mark und perivaskulärem Raum, durch. Die Ergebnisse unserer Arbeit — die infizierte, asymptomatische Tiere mit den Kontrolltieren vergleicht — zeigen eine ausgeprägte lymphozytäre Reaktion speziell im Cortex, zum Teil auch im subcorticalen Mark. Die Makrophagen zeigen eine Zunahme der Zelldichte perivaskulär und im Cortex, welche quantitativ deutlich unter der der Lymphoyzten bleibt. Die Tiere mit Enzephalitis zeigen allesamt eine corticale, wie auch subcorticale Zunahme der lymphozytären Zelldichte, bei den Makrophagen zeigt sich eine überwiegend generelle Stimulierung in allen drei Kompartimenten. Die Ergebnisse unserer Arbeit — die sich durch die Untersuchung asymptomatischer Versuchstiere sehr gut an die Verhältnisse bei der HIV-Infektion annähert — lassen vermuten, daß es dem Immunsystem mit Hilfe der gewebeständigen Lymphozyten im Cortex und subcorticalen Mark für eine ganze Weile gelingt, den Ausbruch einer Enzephalitis und damit der AIDS Erkrankung zu verzögern.
Clonality analysis in B-Cell Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL) associated with Richter's syndrome
(2006)
B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) comprises 90% of chronic lymphoid leukemias in Western countries and patients with B-CLL have a heterogeneous clinical course. Approximately 3-5% of B-CLL patients encounter transformation to an aggressive lymphoma, mainly diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) or Hodgkin’s lymphoma (HL) which has been defined as Richter’s syndrome and is associated with a poor clinical outcome. The mutational status of the immunoglobulin heavy chain variable region (IgVH) gene not only implies the developmental stage at which the neoplastic transformation occurs in a given B-cell lymphoma, but also constitutes an important prognostic factor in B-CLL, since B-CLL patients with unmutated IgVH genes usually have a poor clinical outcome. Sparse molecular analyses performed in Richter’s syndrome so far suggest that it can occur in B-CLL patients carrying mutated or unmutated IgVH genes, and tumor cells in DLBCL or HL can be clonally identical to the B-CLL clone or arise as an independent, secondary lymphoma. To determine the clonal relationship between DLBCL or Hodgkin/Reed-Sternberg (HRS) cells and pre-existing B-CLL cells in a larger series, to identify the IgVH gene usage and the mutational status and to explore possible prognostic factors in B-CLL undergoing Richter’s transformation, we utilized a PCR-based GeneScan approach with subsequent sequencing of the IgVH genes. In cases with HRS/HRS-like cells laser capture microdissection (LCM) was employed to isolate these cells. In addition, a thorough morphological and immunohistochemical analysis was performed. In total, specimens from 48 patients were investigated including 40 cases of Richter’s syndrome and additional 8 cases of B-CLL cases with the presence of CD30-positive HRS-like cells. Among 40 cases of Richter’s syndrome, 34 B-CLL cases showed transformation to DLBCL and 6 cases transformed from B-CLL to HL. Sequencing was performed in 23 paired B-CLL and DLBCL cases. In 18 cases, B-CLL and DLBCL were clonally identical, whereas DLBCL developed as a clonally independent neoplasm in 5 patients. Among the clonally related pairs, 11 out of 15 cases carried unmutated IgVH genes in both the B-CLL and DLBCL component, whereas 5 of 6 B-CLL cases that showed transformation to HL carried mutated IgVH genes. HRS cells in two samples and HRS-like cells in one sample were clonally distinct from the B-CLL clone and infected by EBV, whereas one sample of HRS-like cells was related to the clone from the surrounding B-CLL cells and did not express latent membrane protein-1 (LMP1). The VH genes VH3-23, VH3-74, VH1-2 and VH3-9 were overused in B-CLL cases that transformed to DLBCL, whereas VH4-34 and VH3-48 were used in over half of the B-CLL cases with transformation to HL. Immunohistochemical staining of ZAP70 was significantly associated with unmutated IgVH genes in B-CLL cases undergoing Richter’s transformation. Clinical follow-up data could be obtained from 24 patients. The median survival times of B-CLL patients with transformation to DLBCL or HL were 7 and 21 months, respectively. No significantly different survival times were found between clonally related or unrelated cases, or between IgVH-mutated or -unmutated cases. We conclude that in Richter’s transformation, DLBCL can evolve by clonal transformation of the pre-existing B-CLL clone or occur as an independent, clonally unrelated neoplasm. In the majority of cases (78% in our series), B-CLL and DLBCL are clonally identical. In a subset of patients, however, DLBCL develops as an independent secondary neoplasm that is not clonally related to the B-CLL. Clonal transformation into DLBCL predominantly occurs in B-CLL patients with unmutated IgVH genes, whereas most B-CLL patients that show transformation to HL or CD30-positive HRS-like cells carry mutated IgVH genes. The tendency that IgVH-unmutated B-CLL transforms to DLBCL and IgVH-mutated B-CLL transforms to HL implies different transformation pathways in the two subtypes of Richter’s syndrome. In addition, important pathogenetic differences are likely to exist between DLBCL cases derived from a pre-existing B-CLL as compared to de novo DLBCL cases, since de novo DLBCL is usually characterized by mutated IgVH genes. The biased usage of IgVH genes in the two subtypes of Richter’s syndrome suggests a possible role for antigen involvement in tumorigenesis also in B-CLL cases that undergo Richter’s transformation. Finally, EBV-association in the HL variant of Richter’s syndrome occurs more frequently in clonally unrelated secondary malignancies.
Diffuse großzellige B-Zell Non-Hodgkin Lymphome (DLBCL) stellen eine heterogene Kategorie maligner Lymphome dar. In der vorliegenden Arbeit sollte die Frage beantwortet werden, ob sich die morphologische Variante der multilobulierten centroblastischen Lymphome (CB multilobuliert) von anderen in der Kiel-Klassifikation definierten morphologischen Untergruppen großzelliger B-Zell Lymphome hinsichtlich ihres Immunphänotyps und des klinischen Verlaufs unterscheiden. Insbesondere ergab sich die Frage nach einem möglichen Keimzentrumsursprung der Tumoren. Insgesamt wurden 72 Fälle aus dem Referenzzentrum für Lymphknotenpathologie untersucht. 46 Lymphome zeigten ein rein diffuses Wachstumsmuster und 26 CB multilobuliert wiesen ein partiell follikuläres Wachstumsmuster auf. Bemerkenswert war die Tatsache, dass häufig nur partielles Infiltrationsmuster vorlag, oft in Form eines subkapsulären Randsaums. Dieser Befund legt nahe, dass im Rahmen der Tumorausbreitung reaktive Follikel kolonisiert werden, die in der Weiterentwicklung des Tumors konfluieren. Die Auswertung der in der Technik der „Tissue Microarray“ -Stanzen (TMA) hergestellten Schnittpräparate zeigte, dass CB multilobuliert weitaus häufiger als andere Entitäten von DLBCL den (prognostisch günstigeren) Keimzentrums-ähnlichen (GC-like) Lymphomen zugeordnet werden können. Klinische Daten konnten von insgesamt 46 Patienten mit CB multilobuliert erhoben werden. Sie wurden mit einer Kontrollgruppe von 54 nodalen DLBCL, 14 FL 3B und 47 FL 1-3A korreliert. Die Analysen der Überlebensdaten der Patienten zeigten ein signifikant besseres Gesamtüberleben der Patienten mit CB multilobuliert im Vergleich zu nodalen DLBCL anderer Differenzierung. Bemerkenswert war auch das signifikant bessere Überleben der Patienten mit CB ohne Immunoblasten (CB multilobuliert/monomorph) vs. DLBCL mit Immunoblasten (CB polymorph und IB/PB). In der Zusammenschau der Daten legen diese Befunde nahe, dass CB multilobuliert eine dem Keimzentrum nahe stehende Differenzierungsstufe großzelliger B-Zell Lymphome repräsentieren. Die relativ gesehen bessere Prognose dieser Tumoren gegenüber insbesondere den centroblastischen Lymphomen vom polymorphen Subtyp ist offenbar in ihrer sehr häufigen Keimzentrums-ähnlichen Differenzierung begründet. 75% der in der vorliegenden Serie untersuchten Tumoren ließen ein „GCB-like“ Proteinexpressionsmuster nachweisen. Aus Genexpressionsuntersuchungen größerer Serien von DLBCL ist die „Keimzentrums-Signatur“ in der Regel mit einer besseren Prognose assoziiert.
Die Ursachen des Rotatorenmanschettensyndroms sind vielfältig, ausgehend von der Hypothese, dass die vorbestehenden Muskelatrophie die postoperative Refunktionalisierung beeinflusst, wurde in der vorliegenden Arbeit eine semiquantitative Bestimmung der Expression des fetalen Acetylcholinrezeptottyps untersucht. bei neurogenen Schädigung der Skelettmuskulatur kommt es zu einer Überexpression des fetalen Acetylcholinrezeptors. Ein RT-PCR-basiertes Verfahren zur Bestimmung der Expression des fetalen Acetylcholinrezeptors war methodischer Ausgangspunkt dieser Arbeit. Es konnte in 74% der untersuchten Patienten eine Überexpression des fetalen Rezeptortyps bei Rotatorenmanschettensyndrom nachgewiesen werden.
BLIMP1 ist ein Transkriptionsfaktor und Schlüsselregulator in der Plasmazell-Differenzierung. Um die Rolle des BLIMP1 in der Lymphomentstehung zu untersuchen, wurde die BLIMP1 Expression im normalen humanen lymphatischen Gewebe und in 78 diffusen großzelligen B-Zell Lymphomen untersucht. BLIMP1 wurde in Plasmazellen und GC B-Zellen sowie in einer Population extrafollikulärer B-Zellen exprimiert. Die reifen Plasmazellen vom Marschalko-Typ waren CD138+CD20-MUM1+Ki67-BCL6-PAX5-BLIMP1+. Außerdem zeigten die Keimzentrums-B-Zellen keine Ki67-Expression. Im Gegensatz hierzu waren die BLIMP1+ EGBZ Ki67+p27-. BLIMP1 wurde in 19% (15/78) der DLBCL Fälle, darunter ABC- (7/15) und GCB- (8/15) Typ, exprimiert. BLIMP1+ DLBCL konnten entsprechend dem BLIMP1, BCL6 und PAX5 Expressionsprofil in drei pathogenetisch unterschiedliche Typen unterteilt werden. In den Typ A-Fällen waren die BLIMP1+ Tumor- zellen ständig BCL6-/PAX5- und waren alle vom ABC-Typ (CD10-/BCL6-/MUM1+). Im Typ B-DLBCL waren die meisten Tumorzellen ständig BLIMP1-/BCL6+/PAX5+ und BLIMP1 war nur in relativ kleinen Arealen herdförmig exprimiert. Die BLIMP1+ Zellen zeigten keine BCL6 und PAX5 Expression, und alle Typ B-Fälle zeigten ein GCB-Profil (CD10+ oder BCL6+ und MUM1-). Die Typ C-Fälle waren durch eine gleichzeitige BLIMP1 und BCL6 und/oder PAX5 Expression gekennzeichnet, was einem abärranten und nicht in normalen B-Zellen auftretenden Immunphänotyp entspricht. Weiterhin wurden in 7 Fällen mit Allelverluste auf der Genomregion 6q21, der das BLIMP1 Gen enthält, keine BLIMP1 Mutationen gefunden. Hinsichtlich einer BLIMP1 Expression im normalen lymphatischen Gewebe konnte festgestellt werden, dass das BLIMP1 nicht nur während der Plasmazellentwicklung aus den Keimzentrums-B-Zellen eine bedeutende Rolle spielt, sondern auch mit der Plasmazell-Differenzierung außerhalb des Keimzentrums assoziiert ist. Eine BLIMP1 Expression in DLBCL kennzeichnet die Fälle mit einer Plasmazell-Differenzierung. BLIMP1 ist in den Lymphomen größtenteils wie in normalen B-Zellen reguliert und besitzt die Kapazität, die Plasmazell-Entwicklung in die Tumorzellen zu induzieren. Jedoch reicht die BLIMP1 Expression weder aus, den Zellzyklus aufzuhalten, noch eine komplette terminale Plasmazell-Reifung in den DLBCL zu leiten. Allerdings scheint BLIMP1 nicht von den bekannten TSG Inaktivierungsmechanismen in den DLBCL betroffen zu sein, wobei es sehr unwahrscheinlich ist, dass das BLIMP1 ein TSG darstellt, dessen Verlust bei der Lymphomentwicklung eine wesentliche Rolle spielt.
Der humane monoklonale IgM-Antikörper PAM-1 induziert in seiner monomeren Form sowohl in vivo als auch in vitro Apoptose an Magenkarzinomzellen. Er bindet hierbei an den post-transskriptionell modifizierten Rezeptor CFR-1, der auf nahezu allen epithelialen Karzinomzellen und deren Vorläuferläsionen exprimiert wird. In dieser Arbeit werden die intrazellulären Mechanismen nach PAM-1/CFR-1-Bin- dung anhand von Protein(de)phosphorylierungen und deren selektiver Hemmung näher charakterisiert. Die hierbei detektierten Protein(de)phosphorylierungen sind somit möglicherweise essentielle Bestandteile der durch PAM-1 ausgelösten Apoptose.
Marginalzonen-B-Zell-Lymphome vom MALT-Typ stellen die häufigste Form primär extranodaler Non-Hodgkin-Lymphome dar. Sie entstehen auf dem Boden einer chronischen infektiösen oder autoimmunen Entzündung in hierdurch sekundär erworbenem lymphatischen Gewebe. Eine charakteristische und die häufigste bei diesen Tumoren beobachtete Translokation ist die t(11;18)(q21;q21). Hierbei fusioniert API 2, ein Apoptoseinhibitor-Gen auf 11q21 mit MALT 1 auf 18q21, einer humanen Paracaspase. Mit dem Ziel, letztlich die Funktion und Rolle des durch die Translokation trunkierten MALT 1-Gens untersuchen zu können, wurde bei dieser Arbeit ein Vektorsystem konstruiert, mit dem das MALT 1-Bruchstück stabil und nachweislich in humane B-Zelllinien transfiziert werden kann. An und mit diesen Transfektanten können nun vielfältige Analysen durchgeführt werden, um weitere Einsichten in die Lymphompathogenese zu gewinnen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden noch Untersuchungen zum Wachstumsverhalten und Zellzyklus von das trunkierte MALT 1-Gen überexprimierenden Zellen durchgeführt. Es zeigte sich, dass diese Zellen im Vergleich zu das intakte Gen exprimierenden Zellen stärker und konstanter proliferierten. Dies legte den Schluss nahe, dass in der Genstruktur vor dem Bruchpunkt proliferationshemmende und regulatorische Domänen liegen könnten, welche schließlich durch die Translokation eliminiert werden. Hierdurch könnte der verbleibende Anteil des Gens unreguliert zur Tumorgenese beitragen.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Thema "Die Rolle des Signalmoleküls Ca2+ in der Signaltransduktion der SC-1-induzierten Apoptose" anhand von immunhisto-chemischen, proteinbiochemischen und fluoreszenzmikroskopischen Methoden erarbeitet. Die SC-1-induzierte Apoptose stellt einen neuen intrinsischen, „death domain“-unabhängigen Signalweg in der Vermittlung des programmierten Zelltodes dar, der über die Bindung dieses Antikörpers an CD55SC-1 ausgelöst wird. Dem Signalmolekül Ca2+ galt besonderes Interesse bei der Charakterisierung der durch SC-1 ausgelösten Signaltransduktion. Nach Aktivierung von CD55SC-1 durch SC-1 steigt das intrazelluläre Ca2+ um Faktor 2,7 an, stabilisiert sich danach auf dem 1,5fachen Ausgangsniveau. Dies hat keinerlei Einfluss auf die Ausführung des Apoptoseprogramms, ist aber maßgeblich in das Expressionsverhalten involviert. Der Ca2+ - Einstrom ist somit nicht direkt in die Ausführung der Apoptose beteiligt, durch die Hochregulation der Expression des Apoptoserezeptors verstärkt es jedoch die Wahrscheinlichkeit der Tumorzelle, den programmierten Zelltod zu vollziehen, da durch die verstärkte Expression dieses Apoptose-induzierenden Rezeptors auch die Wahrscheinlichkeit steigt, dass mehrere SC-1-Antikörper binden können. Da die Quervernetzung mehrerer Rezeptoren mittels des SC-1-Antikörpers in der Apoptoseinduktion von Nöten ist, stellt diese durch Ca2+ getriggerte Überexpression von CD55SC-1 einen essentiellen Bestandteil in der Exekution dieses Selbstmordprogrammes dar. Dieses Ergebnis gibt einen interessanten Einblick in den Signalweg der durch SC-1 induzierten Apoptose. Weiterführende Experimente sind notwendig, um genauere Erkenntnisse dieser einzigartigen Form einer gewebespezifischen Apoptose zu erlangen.
Untersuchungen zur Expression der Rezeptortyrosinkinase c-kit in Thymuskarzinomen und Thymomen
(2005)
Thymome und Thymuskarzinome sind seltene mediastinale Neoplasien. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression und der Aktivierungsstatus der Rezeptortyrosinkinase c-kit in Thymustumoren untersucht und deren diagnostische und klinische Relevanz aufgezeigt. Das c-kit-Gen wurde auf Mutationen untersucht sowie der Aktivierungsstatus im c-kit-Transduktionspfad nachgeschalteter Proteine festgestellt.
Der Thymus unterliegt einer altersabhängigen Involution. Dieses Phämomen soll in dieser Arbeit mit morphometrischen Mitteln untersucht werden. Mit Hilfe der Farbdifferenzanalyse wird der Anteil von Thymusgewebe im mediastinalen Fettgewebe festgestellt. Weiterhin wird die Veränderung des Thymus bei der Autoimmunkrankheit Myasthenia gravis untersucht.