Institut für Humangenetik
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Institute
- Institut für Humangenetik (234)
- Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften (48)
- Deutsches Zentrum für Herzinsuffizienz (DZHI) (6)
- Kinderklinik und Poliklinik (6)
- Fakultät für Biologie (5)
- Klinik und Poliklinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie (5)
- Medizinische Klinik und Poliklinik I (5)
- Neurologische Klinik und Poliklinik (5)
- Lehrstuhl für Orthopädie (3)
- Institut für Anatomie und Zellbiologie (2)
Sonstige beteiligte Institutionen
- Comprehensive Hearing Center, Department of ORL, Plastic, Aesthetic and Reconstructive Head and Neck Surgery, Würzburg, Germany (1)
- DNA Analytics Core Facility, Biocenter, University of Würzburg, Würzburg, Germany (1)
- Department of Animal Ecology and Tropical Biology, University of Würzburg, Würzburg, Germany (1)
- Maastricht University, Maastricht, the Netherlands (1)
There is substantial interest in the identification of genes underlying susceptibility to complex human diseases because of the potential utility of such genes in disease prediction and therapy. The complex age-related macular degeneration (AMD) is a prevalent cause of legal blindness in industrialized countries and predominantly affects the elderly population over 75 years of age. Although vision loss in AMD results from photoreceptor cell death in the central retina, the initial pathogenesis likely involves processes in the retinal pigment epithelium (RPE) (Liang and Godley, 2003). The goal of the current study was to identify and characterize genes specifically or abundantly expressed in the RPE in order to determine more comprehensively the transcriptome of the RPE. In addition, our aim was to assess the role of these genes in AMD pathogenesis. Towards this end, a bovine cDNA library enriched for RPE transcripts was constructed in-house using a PCR-based suppression subtractive hybridization (SSH) technique (Diatchenko et al., 1996, 1999), which normalizes for sequence abundance and achieves high enrichment for differentially expressed genes. CAP3 (Huang and Madan, 1999) was used to assemble the high quality sequences of all the 2379 ESTs into clusters or singletons. 1.2% of the 2379 RPE-ESTs contains vector sequences and was excluded from further analysis. 5% of the RPE-ESTs showed homology to multipe chromosomes and were not included in further assembly process. The rest of the ESTs (2245) were assembled into 175 contigs and 509 singletons, which revealed approximately 684 unique genes in the dataset. Out of the 684, 343 bovine RPE transcripts did not align to their human orthologues. A large fraction of clones were shown to include a considerable 3´untranslated regions of the gene that are not conserved between bovine and human. It is the coding regions that can be conserved between bovine and human and not the 3’ UTR (Sharma et al., 2002). Therefore, more sequencing from the cDNA library with reclustering of those 343 ESTs together with continuous blasting might reveal their human orthologoues. To handle the large volume of data that the RPE cDNA library project has generated a highly efficient and user-friendly RDBMS was designed. Using RDBMS data storage can be managed efficiently and flexibly. The RDBMS allows displaying the results in query-based form and report format with additional annotations, links and search functions. Out of the 341 known and predicted genes identified in this study, 2 were further analyzed. The RPE or/and retina specificity of these two clones were further confirmed by RT-PCR analysis in adult human tissues. Construction of a single nucleotide polymphism (SNP) map was initiated as a first step in future case/control association studies. SNP genotyping was carried out for one of these two clones (RPE01-D2, now known as RDH12). 12 SNPs were identified from direct sequencing of the 23.4-kb region, of which 5 are of high frequency. In a next step, comparison of allele frequencies between AMD patients and healthy controls is required. Completion of the expression analysis for other predicted genes identified during this study is in progress using real time RT-PCR and will provide additional candidate genes for further analyses. This study is expected to contribute to our understanding of the genetic basis of RPE function and to clarify the role of the RPE-expressed genes in the predisposition to AMD. It may also help reveal the mechanisms and pathways that are involved in the development of AMD or other retinal dystrophies.
Fanconi anemia (FA) is a genetically and phenotypically heterogenous autoso- mal recessive disease associated with chromosomal instability, progressive bone marrow failure, typical birth defects and predisposition to neoplasia. The clinical phenotype is similar in all known complementation groups (FA-A, FA-B, FA-C,FA-D1, FA-D2, FA-E, FA-F and FA-G). The cellular phenotype is characterized by hypersensitivity to DNA crosslinking agents (MMC,DEB), which is exploited as a diagnostic tool. Alltogether, the FA proteins constitute a multiprotein pathway whose precise biochemical function(s) remain unknown. FANCA, FANCC, FANCE, FANCF and FANCG interact in a nuclear complex upstream of FANCD2. Complementation group FA-D1 was recently shown to be due to biallelic mutations in the human breast cancer gene 2 (BRCA2). After DNA damage, the nuclear complex regulates monoubiquitylation of FANCD2, result- ing in targeting of this protein into nuclear foci together with BRCA1 and other DNA damage response proteins. The close connection resp. identity of the FA genes and known players of the DSB repair pathways (BRCA1, BRCA2, Rad51) firmly establishs an important role of the FA gene family in the maintenance of genome integrity. The chapter 1 provides a general introduction to the thesis describing the current knowledge and unsolved problems of Fanconi anemia. The following chapters represent papers submitted or published in scientific literature. They are succeeded by a short general discussion (chapter 7). Mutation analysis in the Fanconi anemia genes revealed gene specific mutation spectra as well as different distributions throughout the genes. These results are described in chapter 1 and chapter 2 with main attention to the first genes identified, namely FANCC, FANCA and FANCG. In chapter 2 we provide general background on mutation analysis and we report all mutations published for FANCA, FANCC and FANCG as well as our own unpublished mutations until the year 2000. In chapter 3 we report a shift of the mutation spectrum previously reported for FANCC after examining ten FA-patients belonging to complementation group C. Seven of those patients carried at least one previously unknown mutation, whereas the other three patients carried five alleles with the Dutch founder mu- tation 65delG and one allele with the Ashkenazi founder mutation IVS4+4A>T, albeit without any known Ashkenazi ancestry. We also describe the first large deletion in FANCC. The newly detected alterations include two missense mu- tations (L423P and T529P) in the 3´-area of the FANCC gene. Since the only previously described missense mutation L554P is also located in this area, a case can be made for the existence of functional domain(s) in that region of the gene. In chapter 4 we report the spectrum of mutations found in the FANCG gene com- piled by several laboratories working on FA. As with other FA genes, most muta- tions have been found only once, however, the truncating mutation, E105X, was identified as a German founder mutation after haplotype analysis. Direct compar- ison of the murine and the human protein sequences revealed two leucine zipper motifs. In one of these the only identified missense mutation was located at a conserved residue, suggesting the leucine zipper providing an essential protein-protein interaction required for FANCG function. With regard to genotype-phenotype correlations, two patients carrying a homozygous E105X mutation were seen to have an early onset of the hematological disorder, whereas the missense mutation seems to lead to a disease with later onset and milder clinical course. In chapter 5 we explore the phenomenon of revertant mosaicism which emerges quite frequently in peripheral blood cells of patients suffering from FA. We de- scribe the types of reversion found in five mosaic FA-patients belonging to com- plementation groups FA-A and FA-C. For our single FA-C-patient intragenic crossover could be proven as the mechanism of self-correction. In the remaining four patients (all of them being compound heterozygous in FANCA), either the paternal or maternal allele has reverted back to WT sequence. We also describe a first example of in vitro phenotypic reversion via the emergence of a compensat- ing missense mutation 15 amino acids downstream of the constitutional mutation explaining the MMC-resistance of the lymphoblastoid cell line of this patient. In chapter 6 we report two FA-A mosaic patients where it could be shown that the spontaneous reversion had taken place in a single hematopoietic stem cell. This has been done by separating blood cells from both patients and searching for the reverted mutation in their granulocytes, monocytes, T- and B-lymphocytes as well as in skin fibroblasts. In both patients, all hematopoietic lineages, but not the fibroblasts, carried the reversion, and comparison to their increase in erythrocyte and platelet counts over time demonstrated that reversion must have taken place in a single hematopoietic stem cell. This corrected stem cell then has been able to undergo self-renewal and also to create a corrected progeny, which over time repopulated all hematopoietic lineages. The pancytopenia of these patients has been cured due to the strong selective growth advantage of the corrected cells in vivo and the increased apoptosis of the mutant hematopoietic cells.
Best disease (OMIM 153700) is an early-onset, autosomal dominant maculopathy characterized by egg yolk-like lesions in the central retina. The disease gene, the vitelliform macular dystrophy gene type 2 (VMD2), encodes a 585-aa VMD2 transmembrane protein, termed bestrophin. The protein is predominantly expressed on the basolateral side of the retinal pigment epithelium (RPE) and is thought to be involved in the transport of chloride ions. Bestrophin as well as three closely related VMD2-like proteins (VMD2L1-L3) contain multiple putative transmembrane (TM) domains and an invariant tripeptide (RFP) motif in the N-terminal half of the protein. This and the tissue-restricted expression to polarized epithelial cells are typical features of the VMD2 RFP-TM family. Best disease is predominantly caused by missense mutations, clustering in four distinct „hotspots“ in the evolutionary highly conserved N-terminal region of the protein. To further augment the spectrum of mutations and to gain novel insights into the underlying molecular mechanisms, we screened VMD2 in a large cohort of affected patients. In total, nine novel VMD2 mutations were identified, raising the total number of known Best disease-related mutations from 83 to 92. Eight out of nine novel mutations are hotspot-specific missense mutations, underscoring their functional/structural significance and corroborating the dominant-negative nature of the mutations. Of special interest is a one-basepair deletion (Pro260fsX288) encoding a truncated protein with a deletion of an important functional domain (TM domain four) as well as the entire C-terminal half of bestrophin. For the first time, a nonsense mutation leading to a 50 % non-functional protein has been identified suggesting that on rare occassions Best disease may be caused by haploinsufficiency. Molecular diagnostics strongly requires a reliable classification of VMD2 sequence changes into pathogenic and non-pathogenic types. Since the molecular pathomechanism is unclear at present, the pathogenicity of novel sequence changes of VMD2 are currently assessed in light of known mutations. We therefore initiated a publicly accessible VMD2 mutation database (http://www.uni-wuerzburg.de/humangenetics/vmd2.html) and are collecting and administrating the growing number of mutations, rare sequence variants and common polymorphisms. Missense mutations may disrupt the function of proteins in numerous ways. To evaluate the functional consequences of VMD2 mutations in respect to intracellular mislocalization and/or protein elimination, a set of molecular tools were generated. These included the establishment of an in vitro COS7 heterologous expression assay, the generation of numerous VMD2 mutations by site-directed mutagenesis as well as the development of bestrophin-specific antibodies. Surprisingly, membrane fractionation/Western blot experiments revealed no significant quantitative differences between intact and mutant bestrophin. Irrelevant of the type or location of mutation, incorporation of mutant bestrophin to the membraneous fraction was observed. Thus, impaired membrane integration may be ruled out as causative pathomechanism of Best disease consistent with a dominant-negative effect of the mutations. In a different approach, efforts were directed towards identifying and characterizing the VMD2 RFP-TM protein family in mouse. While clarification of the genomic organization of murine Vmd2 was required as basis to generate Vmd2-targeted animals (see below), the study of closely related proteins (Vmd2L1, Vmd2L2 and Vmd2L3) may provide further clues as to the function of bestrophin. For this, biocomputational as well as RT PCR analyses were performed. Moreover, the novel genes were analyzed by real time quantitative RT PCR, displaying predominant expression in testis, colon and skeletal muscle of Vmd2, Vmd2L1 and Vmd2L3 transcripts, respectively as well as in eye tissue. Interestingly, neither an ORF was determined for murine Vmd2L2 nor was the transcript present in a panel of 12 mouse tissues, suggesting that murine Vmd2L2 may represent a functionally inactive pseudogene. The murine Vmd2L3 gene, as its human counterpart, is a highly differentially spliced transcript. Finally, generating mouse models of Best disease will provide essential tools to investigate the pathophysiology of bestrophin in vivo. We have initiated the generation of two different mouse lineages, one deficient of Vmd2 (knock-out) and the other carrying a human disease-related mutation (Tyr227Asn) in the orthologous murine gene (knock-in). Genetic engineering of both constructs has been achieved and presently, four ES clones harboring the homologous recombination event (Vmd2+/-) have been isolated and are ready for the subsequent steps to generate chimeric animals. The resulting mouse lineages will represent two key models to elucidate the functional role of bestrophin in Best disease, in RPE development and physiology.
Im Karpfenfisch Alburnus alburnus wurden die bisher größten überzähligen Chromosomen bei Wirbeltieren entdeckt. Dies ermöglichte eine umfangreiche zytogenetische und molekulare Studie dieser außergewöhnlichen Genomelemente. Aus Populationsstudien, die mehrere Fundorte in Deutschland einschlossen, konnten Informationen über die Verteilung der B Chromosomen in Fischen verschiedener Herkunftsorte ermittelt werden. Eine derartige Studie könnte zukünftig auch auf andere Länder ausgedehnt werden. Eine detaillierte, zytogenetische Analyse mit allen konventionellen Hellfeld- und Fluoreszenzbänderungen sowie Fluoreszenz in situ Hybridisierungen mit den ribosomalen 5S, 18S/28S rDNA-Proben und der Telomerprobe (TTAGGG)n, zeigte, dass die außergewöhnlich großen B Chromosomen von A. alburnus heterochromatisch, GC-reich und spät replizierend sind. Es wurden bei Alburnus alburnus keinerlei Hinweise auf heteromorphe Geschlechtschromosomen gefunden. Die molekularen Untersuchungen basierten hauptsächlich auf AFLP-Analysen, mit denen eine B Chromosomen-spezifische Bande entdeckt und isoliert werden konnte. Nach Klonierung und Sequenzierung sowie dem Durchsuchen einer Fischspezifischen Datenbank konnte eine retrotransposable Sequenz (Gypsy/Ty3 LTRRetrotranpson) gefunden werden. Ferner konnte eine deutliche Homologie zu dem Nterminalen Teil der reversen Transkriptase von Medaka, Oryzias latipes, dokumentiert werden. Die Southern blot-Untersuchungen und der PCR-Test zeigten, dass es sich bei der entdeckten 203 bp-Sequenz um eine B Chromosomen- und Alburnus alburnus-spezifische Sequenz handelt, welche hochrepetitiv über die beiden Arme der überzähligen Chromosomen verteilt ist. Der Ursprung und die Funktion der massiven überzähligen Chromosomen blieb offen. Da es aber nach wie vor wenig Information über B Chromosomensequenzen und DNA-Organisation im Allgemeinen und besonders bei Fischen gibt (Mestriner et al., 2000), sind die Ergebnisse dieser Studie für die Aufdeckung des Ursprungs und der Evolution überzähliger Chromosomen von allgemeiner Bedeutung, da sie wohl den Hauptanteil der DNA-Zusammensetzung des größten, bisher unter den Wirbeltieren entdeckten überzähligen Chromosoms darstellen. Die Analyse meiotischer Chromosomen zeigte, dass das B Chromosom in der Diakinese als selbstpaarendes Ringchromosom vorliegt. Zusammenfassung und Ausblick 101 Mittels durchflußzytophotometrischer DNA-Messungen konnte der Beitrag des außerordentlich großen B Chromosoms zum Gesamt-DNA-Gehalt von A. alburnus bestimmt werden und Fische auf das Vorhandensein des überzähligen Chromosoms, allerdings unter Tötung, analysiert werden. Dies kann in Zukunft durch Ausnutzung von Sequenzinformation über das B Chromosom und der damit einhergehenden Konstruktion spezifischer PCR-Primer („minimal-invasiver Flossentest“) vermieden werden. Fische aus unterschiedlichen Populationen, eventuell auch europaweit, können so schnell und zuverlässig auf das Vorhandensein des überzähligen Chromosoms hin untersucht werden, mit dem Zweck, durch künftige Verpaarung der Tiere mit 0, 1 oder 2 B Chromosomen den Vererbungs- bzw. Weitergabemechanismus der überzähligen Chromosomen auf die nächste Generation zu studieren.
Caretaker-Gen-Syndrome
(2001)
Ataxia telangiectasia: Identifizierung und Charakterisierung nicht-konservativer Spleißmutationen und deren Auswirkungen im ATM-Gen. Ein hoher Anteil der bisher im ATM-Gen identifizierten Mutationen (>350, www.vmresearch.org/atm.htm) stellt Deletionen oder Insertionen direkt an den Exongrenzen dar; viele dieser Aberrationen wurden allerdings nur auf cDNA-Ebene detektiert. Sollte es sich hierbei in den meisten Fällen um Mutationen an den Spleiß-Konsensussequenzen handeln, läge der Anteil der Spleißmutationen im ATM-Gen beträchtlich höher (~35 Prozent) als in anderen betroffenen Genen (~15 Prozent). Um der Frage nachzugehen, ob im ATM-Primärtranskript aufgrund einer erhöhten Labilität gegenüber Spleißmutationen auch Veränderungen weniger konservierter Positionen innerhalb der Donor- oder Akzeptor-Spleißstellen zu aberrantem Spleißen führen, wurden 20 AT-Zellinien mittels „Protein Truncation Test“ nach Deletionen oder Insertionen an den Exongrenzen durchsucht. Die 7 neu identifizierten Spleißmutationen wurden anschließend unter Verwendung eines „Splice Scoring“- Systems näher charakterisiert, die Penetranz der jeweiligen Mutation durch semiquantitative PCR evaluiert und die Auswirkungen auf Proteinebene durch Western Blotting überprüft. Obwohl nur eine der 7 neu identifizierten Spleißmutationen eine schwächer konservierte Position der Spleißsequenzen betraf, konnten im Rahmen einer Kooperation mit der Medizinischen Hochschule Hannover (Arbeitsgruppe Dr. T. Dörk) weitere Spleißmutationen an den Intronpositionen +3, +5 und -6 identifiziert werden, die ebenfalls in völlig aberrantem Spleißen resultieren. Daten weiterer Arbeitsgruppen lassen vermuten, daß tatsächlich ~ 50 Prozent aller Spleißaberrationen im ATM-Gen auf Mutationen außerhalb der konservierten Dinukleotidbereiche (gt und ag) zurückführen sind. Nijmegen Breakage Syndrom (NBS): Suche nach Genen, die einen NBS-ähnlichen Phänotyp auslösen. Über 90 Prozent aller NBS-Patienten tragen Mutationen im NBS1-Gen, dessen Translationsprodukt im Komplex mit MRE11 und RAD50 eine zentrale Rolle in DNA-DSB-Reparatur und Zellzykluskontrolle spielt. Weitere Mutationen bei Patienten mit NBS-ähnlichem Phänotyp wurden im Gen der DNA-Ligase IV identifiziert, die zusammen mit weiteren Angehörigen des NHEJ-Reparaturweges (XRCC4, DNA-PKcs, Ku70, Ku80) ebenfalls in DNA-DSB-Reparatur involviert ist. Zellen von Patienten mit NBS-ähnlichem Phänotyp wurden daher durch direkte Sequenzierung und/oder Western Blotting auf Defekte in den oben genannten Genen/Proteinen untersucht. In einem parallel durchgeführten unabhängigen Mutationsscreening (Medizinische Hochschule Hannover, Arbeitsgruppe Dr. T. Dörk) wurden in Fibroblasten einer Patientin mit NBS-ähnlichem Phänotyp Mutationen im RAD50-Gen identifiziert. Die Auswirkungen der RAD50-Defizienz auf die zelluläre Lokalisation der beiden Komplexpartner NBS1 und MRE11 sowie deren Fähigkeit zur Focibildung nach DNA-Schädigung wurde im Rahmen dieser Arbeit durch Immunfluoreszenzstudien untersucht: während NBS1 vorwiegend nukleäre Lokalisation aufwies, war MRE11 zu etwa gleichen Anteilen zwischen Nukleus und Zytoplasma verteilt; beide Proteine waren nach Bestrahlung der Zellen nicht mehr zur Focibildung fähig. Da in MRE11-defizienten Zellen keine nukleäre NBS1-Lokalisation beobachtet wird, scheint der Kerntransport des NBS1 von funktionellem MRE11, nicht aber von RAD50 abhängig zu sein. Fanconi Anämie (FA): Untersuchung einer möglichen Verbindung zwischen den FA-Proteinen und der RAD51-Familie. FA-Zellen aller bisher bekannter Komplementationsgruppen zeichnen sich durch Hypersensitivität gegenüber DNA-„interstrand crosslinks“ (ICLs) aus, zu deren Behebung u.a. die homologe Rekombinationsreparatur (HRR) eingesetzt wird, bei der das RAD51(A)-Protein eine zentrale Rolle spielt. Aufgrund schwacher Homologien werden 5 weitere Proteine (RAD51B, C, D, XRCC2 und 3) der RAD51-Familie zugeordnet. Da Knockout-Zellinien aller RAD51-Familienmitglieder ebenfalls hohe Sensitivität gegenüber ICLs aufweisen, wurde eine mögliche Verbindung zwischen den FA-Proteinen FANCA, C, G und der RAD51-Familie getestet. Unter Verwendung des "Yeast Two Hybrid" (Y2H)-Systems konnten zunächst mehrere Interaktionen zwischen FA- und RAD51-Proteinen detektiert werden. Zur Bestätigung einer funktionellen Verbindung wurden die FA- und RAD51-Proteine in humanen 293-Zellen überexprimiert. Aufgrund der focibildenden Eigenschaften des RAD51-Proteins wurden die FA-Proteine und die RAD51-Familie auf Focibildung nach DNA-Schädigung sowie etwaige Kolokalisationen getestet; mögliche physikalische Interaktionen wurden durch Koimmunpräzipitationsstudien überprüft. Die RAD51-Familie zeigten keinerlei Focibildung nach DNA-Schädigung während die FA-Proteine in einigen Experimenten eine Lokalisation in nukleäre Foci zeigten, die sich jedoch in Größe und Homogenität deutlich von denen klassischer DNA-Reparaturfoci unterschieden und nicht mit RAD51 kolokalisierten. Die häufige Beschränkung der FA-Foci auf Bereiche besonders dicht gepackten Chromatins kann möglicherweise als weiterer Hinweis auf die postulierte Rolle der FA-Proteine bei Chromatin Remodelling Mechanismen interpretiert werden. Bei Überexpression in HEK293-Zellen konnte keine der im Y2H-System identifizierten Interaktionen zwischen FA- und RAD51-Proteinen durch Koimmunpräzipitationen detektiert werden. Dennoch erscheinen seit der Identifizierung des FANCD2, das durch den FA-Komplex aktiviert wird und mit dem RAD51-Interaktor BRCA1 in nukleäre Foci kolokalisiert, weitere Untersuchungen einer Verknüpfung der FA-Proteine mit den Angehörigen des HRR-Weges durchaus sinnvoll.
Central Core Disease (CCD) ist eine neuromuskuläre Erkrankung aus dem Formenkreis der kongenitalen Myopathien. Die Symptomatik umfaßt eine verzögerte motorische Entwicklung, eine nicht bis schwach progrediente Schwäche der Extremitätenmuskulatur mit Betonung der distalen, unteren Gliedmaßen sowie Defekte des Skelettapparates wie Kyphoskoliosen, Kontrakturen und Fußanomalien. Die Zentralfibrillen-Myopathie, wie man die Erkrankung im Deutschen nennt, imponiert durch eine mehr oder minder regelmäßige Assoziation mit der Veranlagung zur Malignen Hyperthermie (MHS), die wiederum von Mutationen im Ryanodinrezeptorgen (RYR1), einem sarkoplasmatischen Calciumkanal, verursacht wird. In genetischen Familienanalysen wurde die CCD ebenfalls zum RYR1-Gen auf dem Humanchromosom 19q13.1 kartiert, womit dieses Gen zum Kandidatengen für CCD avancierte. Es wurden in einigen wenigen Familien Mutationen im RYR1-Gen gefunden, die man für ursächlich für die Ausprägung der CCD hält. Mittlerweile häuften sich aber Hinweise, daß die CCD, ebenso wie die MHS heterogene Ursachen haben kann und damit die Rolle des RYR1-Gens als Kandidat für das CCD-Gen zunehmend in Frage gestellt wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die Feinkartierung von CCD-Familien vorangetrieben, indem neue Familien gesammelt wurden und ein neuer, zusammengesetzter Mini-/ Mikrosatelliten-Marker charakterisiert wurde, der für die Feinkartierung an CCD-Familien eingesetzt werden konnte. Des weiteren wurden neuere Mikrosatelliten-Marker des Genethon-Konsortiums angewendet und die Koppelung der CCD-Familien zu Chromosom 19q13.1 konnte bestätigt werden, allerdings mit einigen Ausnahmen, so daß bei CCD ebenfalls heterogene Ursachen angenommen werden können. Ein weiteres Kandidatengen wurde mit dem MYH7-Gen für die beta-Kette des schweren Myosins auf Chromosom 14 vorgeschlagen, dies konnte aber weder bestätigt noch ausgeschlossen werden. Um die Rolle des RYR1-Gens für die CCD zu eruieren wurden die häufigsten bisher bei MHS-Familien gefundenen RYR1-Mutationen an CCD-Patienten untersucht. Lediglich in einer CCD/MHS-Familie konnte eine bereits bekannte Mutation bestätigt werden, das RYR1-Gen konnte nicht als verursachendes Gen der CCD bestätigt werden, allerdings konnte nicht das komplette Gen untersucht werden, aufgrund der großen Anzahl von Exons und der Größe des Gens. Ein zweiter Teil der Arbeit bestand in der Suche nach neuen Transkripten aus Muskelgewebe in der genomischen Region 19q13.1 mit dem Endziel der Erstellung einer Transkriptionskarte dieser Region. Hier kam die cDNA-Selektion zur Anwendung mit einer PCR-amplifizierten cDNA-Bibliothek aus Muskelgewebe sowie ein gut charakterisiertes Cosmid-Contig aus dem Bereich des RYR1-Gens. Es konnte lediglich ein kurzes Transkript isoliert werden, das auf den genomischen Ursprung zurückkartiert, aber es konnte nicht näher charakterisiert werden. Der dritte Teil der Arbeit stand im Zeichen der Kandidatengensuche im betreffenden Abschnitt q13.1 des Chromosoms 19. Anhand von genetischen Karten und Gendatenbanken sollten Gene gesucht werden, die in diesen Bereich kartieren und eine Expression im Skelettmuskel aufweisen und damit als Kandidat für die CCD in Frage kommen. Es wurden zwei Gene für nukleär codierte Untereinheiten der mitochondrialen Cytochrom c Oxidase untersucht. Von dem Gen, das die muskelspezifische Isoform von COX VIIa codiert, konnte die genomische Sequenz und die Exon-Intron Struktur ermittelt werden sowie eine Promotor-Analyse anhand einer Datenbanksuche durchgeführt werden. Der Vergleich mit der Sequenz des homologen Gen des Rindes ergab, daß es sich um ein evolutionär konserviertes Gen handelt mit dem typischen Eigenschaften eines Haushaltsgens. Ein weiteres Kandidatengen stellt das Gen für die kleine Untereinheit des Calpains dar, das möglicherweise direkt in die elektromechanische Koppelung zwischen Nerv und Muskel involviert ist und mit dem Ryanodinrezeptor interagiert. CCD-Patienten wurden mit der SSCP-Methode (Single-stranded conformation polymorphism) auf Mutationen in den Exons sowohl des COX7A1-Gens als auch des CANPS-Gens untersucht. In beiden Fällen konnten keine Mutationen gefunden werden. Die Suche nach dem CCD-Gen ist also nach wie vor offen.
Die Positionsklonierung hat sich als erfolgreiche Strategie zur Identifizierung und Isolierung von Genen erwiesen. Da ihre Anwendung im Allgemeinen keine Informationen über den zugrundeliegenden Pathomechanismus einer Erkrankung voraussetzt, eignen sich die Methoden der Positionsklonierung in besonderem Maße für die Erforschung hereditärer Netzhauterkrankungen. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurden sie zur Untersuchung ausgewählter retinaler Degenerationen eingesetzt. Dabei konnten wichtige Beiträge für die Aufklärung der genetische Ursachen dieser Erkrankungen geleistet werden. Die autosomal dominante North Carolina Makuladystrophie (NCMD) oder die zentral areoläre Pigmentepitheldystrophie (CAPED) sind allelische Erkrankungen mit allenfalls gering progredientem Verlauf. Ihr Genlokus liegt in einem etwa 7,2 cM großen Bereich auf 6q14-q16.2 zwischen den DNA-Markern D6S424 und D6S1671. Mit Hilfe von 21 polymorphen DNA-Markern welche den NCMD-Lokus (MCDR1) flankieren, wurden Kopplungsanalysen in drei deutschen NCMD-Familien durchgeführt. Die Analyse der krankheitsassoziierten Haplotypen erbrachte Hinweise auf einen gemeinsamen Vorfahren aller drei Familien. Darüber hinaus konnte der MCDR1-Lokus auf 3,2 cM eingeengt werden und wird von den Markern D6S249 und D6S475 flankiert. Dies bedeutet einen wichtigen Schritt auf dem Weg zur Klonierung des zugrundeliegenden Krankheitsgens. Eine häufige Ursache für den frühzeitigen Verlust der zentralen Sehschärfe bei Jungen ist die X-gebundene juvenile Retinoschisis (RS). Ihr Genlokus wurde in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert, wo er von den DNA-Markern DXS418 und DXS999/DXS7161 flankiert wird. Die Analyse von EST-Sequenzen aus dieser Region ermöglichte die Isolierung eines neuen retinaspezifischen Transkriptes, welches als RS1 bezeichnet wurde. Das RS1-Gen besteht aus sechs Exonen und codiert ein Protein, welches eine in der Evolution hoch konservierte Discoidin-Domäne enthält. Diese Domäne ist in anderen Proteinen u.a. an der Ausbildung von Zell-Zell-Interaktionen beteiligt. Mutationsanalysen in betroffenen Personen aus neun nicht-verwandten RS-Familien ergaben neun verschiedene Sequenzveränderungen die mit dem Krankheitsbild der jeweiligen Familie segregierten. Einen ersten Einblick in die zeitliche und räumliche Expression ergab die Untersuchung des murinen Orthologs Rs1h mit Hilfe von Northern Blot, RT-PCR und RNA in situ-Hybridisierungen. Rs1h wird in der Maus hauptsächlich in den Photorezeptoren exprimiert. Die Expression beginnt erst postnatal und ist mit der Entwicklung der Photorezeptoren korreliert. Das Auftreten zahlreicher weißlich-gelber Flecken, sogenannter Drusen, in radiärer Anordung am hinteren Augenpol ist das charakteristische Merkmal einer Gruppe von Netzhauterkrankungen mit gemeinsamer Ätiologie, die unter dem Begriffen Doynsche Honigwaben Dystrophie (DHRD), Malattia Leventinese (MLVT) oder radiäre Drusen zusammengefasst werden. Der Genlokus dieser Erkrankung wurde auf den kurzen Arm von Chromosom 2 in den Bereich 2p16 kartiert. Die Durchsuchung von EST-Datenbanken führte zur Identifizierung des neuronal exprimerten Gens pNEU60. Dieses besteht aus zwei Exonen, wobei der vollständige codierende Bereich im zweiten Exon liegt. Die Analyse des pNEU60-Proteins ergab eine Struktur aus sieben Transmembrandomänen, dem gemeinsamen Merkmal G-Protein gekoppelter Rezeptoren, wie z.B. Rhodopsin. Patienten mit radiären Drusen zeigten keinerlei Sequenzveränderungen in pNEU60. Die Untersuchung von fast 200 Patienten mit der phänotypisch sehr ähnlichen altersbedingten Makuladegeneration (AMD), führte zur Identifizierung von drei potentiellen Mutationen, darunter eine nonsense-Mutation, sowie zwei polymorphen Veränderungen. Die Assoziation einer einzigen missense-Mutation (R345W) im ubiquitär exprimierten Gen EFEMP1 (EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1) mit der DHRD und MLVT wurde von einer amerikanischen Arbeitsgruppe nachgewiesen. Die R345W Mutation in diesem proximal zu pNEU60 liegenden Gen wurde in den zur Verfügung stehenden zwei MLVT-Familien sowie einer DHRD-Familie nachgewiesen. Bei der Analyse von 14 Patienten mit sporadischen radiären Drusen konnte weder die R345W Mutation, noch irgendeine andere krankheitsassoziierte Mutation nachgewiesen werden. Es wurden jedoch drei polymorphe Sequenzvarianten, sowie zwei polymorphe Di- bzw. Trinukleotidsequenzen identifiziert. Die Klonierung des orthologen EFEMP1-Gens des Rinds diente als Voraussetzung zur Untersuchung der Interaktionsfähigkeit von EFEMP1 mit anderen Proteinen. Mit der Anwendung des Hefe Zwei-Hybrid Systems konnte gezeigt werden, dass die EGF-Domänen von EFEMP1 eine Interaktion mit sich selbst ermöglichen. Die Einführung der R345W Mutation hatte dabei keinen Einfluss auf diese Wechselwirkungen. Die beschriebene Interaktion mit dem zur Familie der Ubiquiline gehörenden Protein DA41 konnte nicht reproduziert werden. Das Gen welches mit der inkompletten Form der X-gebundenen kongenitalen stationären Nachtblindheit (CSNB2) assoziiert ist, codiert die a1-Untereinheit des retinaspezifischen spannungsabhängigen L-Typ Kalziumkanals (CACNA1F). Mit Hilfe von RT-PCR Analysen und RNA in situ-Hybridisierungen wurde die räumliche Expression dieses Gens in der Netzhaut untersucht. Dabei wurde das CACNA1F-Transkript in der äußeren und inneren Körnerschicht, sowie in der Ganglienzellschicht nachgewiesen.
Die vorliegende Arbeit untersucht, ob mit zunehmendem Alter während der Mitose häufiger Geschlechtschromsomen verlorengehen. Die Beobachtungen erfolgten an Lymphozytenkulturen gesunder weiblicher und männlicher Probanden aus drei verschiedenen Altersgruppen. Unter Zugabe von 5-Azadeoxycytidin, einem Nukleosidanalogon, ergab sich in den höheren Altersgruppen ein verstärktes Auftreten von Mikronuklei. Mikronuklei enthalten Chromosomen oder -bruchstücke, die während der Mitose nicht in die Tochterzellkerne integriert wurden. Mittels in situ Hybridisierung konnte in den Mikronuklei der Frauen zu 5,5 Prozent ein X-Chromosom, bei den Männern mit 10,7 Prozent überzufällig häufig ein Y-Chromosom nachgewiesen werden. Zwischen den einzelnen Altersstufen änderte sich dieser Anteil nicht wesentlich. 5-Azadeoxycytidin wird als Nukleosidanalogon während der Replikation in die DNA eingebaut und verhindert die Methylierung des Tochterstrangs, da ein Kohlenstoffatom im Pyrimidinrings durch ein Stickstoffatom substituiert ist. Wahrscheinlich resultiert aus der Hyomethylierung eine falsche "Verpackung" des Gonosoms während der Mitose, dadurch erfolgt eine fehlerhafte Aufteilung des Chromosoms mit Bildung eines Mikronukleus.
Vor 2 Jahren wurden erstmals die wahrscheinlich wichtigsten Tight Junction Proteine, Claudin-1 und -2 in der Maus beschrieben. An Hand von Sequenzhomologien konnten bis heute dieser 4 Transmembrandomänen Proteinfamilie 18 Mitglieder mit unterschiedlichen Gewebeverteilungen zugeordnet werden. Parallel zum murinen Claudin-1 wurde von (Swisshelm et al. 1999) das humane Claudin-1 mit einer 91 prozentigen Sequenzhomologie zum murinen Protein isoliert und molekulargenetisch beschrieben. In der überwiegenden Mehrzahl von Brusttumorzellinien ist die Expression von hu-CLDN1 verloren gegangen. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb die biologische Funktion des humanen Claudin-1 (hu-CLDN1) und dessen Relevanz während der Tumorgenese untersucht werden. Für diese Aufgabenstellung mußten monoklonale Antikörper mittels DNA Vakzinierung und hu-CLDN1 Retroviren zur effektiven Transduktion von Tumorzellen entwickelt werden. Die Antikörper wurden in ELISA, kompetitiven hu-CLDN1 Peptid ELISA und Western Blot auf ihre hu-CLDN1 Spezifität und Epitoperkennungsstelle überprüft. Für biologische Untersuchungen wurden für die neuen Antikörper optimale immunzytochemische und immunhistochemische Methoden etabliert. Mit Hilfe der monoklonalen Antikörper wurde die zelluläre Proteinexpression und die Lokalisation, als auch die Expression von hu-CLDN1 in Gewebeschnitten von Tumoren- und Normalgewebe untersucht. Vor 2 Jahren wurden erstmals die wahrscheinlich wichtigsten Tight Junction Proteine, Claudin-1 und -2 in der Maus beschrieben. An Hand von Sequenzhomologien konnten bis heute dieser 4 Transmembrandomänen Proteinfamilie 18 Mitglieder mit unterschiedlichen Gewebeverteilungen zugeordnet werden. Parallel zum murinen Claudin-1 wurde von (Swisshelm et al. 1999) das humane Claudin-1 mit einer 91 prozentigen Sequenzhomologie zum murinen Protein isoliert und molekulargenetisch beschrieben. In der überwiegenden Mehrzahl von Brusttumorzellinien ist die Expression von hu-CLDN1 verloren gegangen. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb die biologische Funktion des humanen Claudin-1 (hu-CLDN1) und dessen Relevanz während der Tumorgenese untersucht werden. Für diese Aufgabenstellung mußten monoklonale Antikörper mittels DNA Vakzinierung und hu-CLDN1 Retroviren zur effektiven Transduktion von Tumorzellen entwickelt werden. Die Antikörper wurden in ELISA, kompetitiven hu-CLDN1 Peptid ELISA und Western Blot auf ihre hu-CLDN1 Spezifität und Epitoperkennungsstelle überprüft. Für biologische Untersuchungen wurden für die neuen Antikörper optimale immunzytochemische und immunhistochemische Methoden etabliert. Mit Hilfe der monoklonalen Antikörper wurde die zelluläre Proteinexpression und die Lokalisation, als auch die Expression von hu-CLDN1 in Gewebeschnitten von Tumoren- und Normalgewebe untersucht. Für die Reexpression von hu-CLDN1 in Brusttumorzellen wurden retrovirale Genshuttlesysteme hergestellt. Die retroviralen Genshuttlesysteme basieren auf dem MoMuLV Grundgerüst und als Besonderheit wurde der l-NGFR Rezeptor zur schnellen und sicheren Identifkation transduzierter Zellen einkloniert. Hergestellt wurde ein Mock Kontrollvektor (nur l-NGFR) und der hu-CLDN1 Vektor mit l-NGFR. Die hu-CLDN1 retroviralen Überstände wurden verwendet, um verschiedene Brusttumorzellinien zu transduzieren. Die Expression von hu-CLDN1 wurde mittels eigens entwickelter quantitativer gekoppelter Reverser Transkription Polymerase Ketten Reaktion (qRT PCR) in verschiedenen Brusttumorzellinien untersucht. Wie aus der vorliegenden Arbeit ersichtlich, konnten erstmalig monoklonale Antikörper gegen hu-CLDN1 entwickelt werden. Diese sind spezifisch und haben eine hohe Sensitivität gegenüber hu-CLDN1. Desweiteren gelang es erstmals Antikörper gegen alle 4 extra- und intrazellulären Domänen zu gewinnen. Mit diesen Antikörpern gelang es nachzuweisen, daß es sich bei hu-CLDN1 um ein ausschließlich membranständiges Protein handelt. Die Expression des Proteins findet sich nur in konfluenten Zellkulturen von natürlicherweise hu-CLDN1 exprimierenden Brusttumorzellen (T47D, MCF7), wobei die Lokalisation ausschließlich auf die Zell-Zell Kontaktstelle beschränkt ist. Bei der hu-CLDN1 Transduktion in hu-CLDN1 negativen Brusttumorzellinen zeigte sich eine konstitutive mRNA Expression in subkonfluenten und konfluenten Zellkulturen. Allerdings ist fluoreszenzmikroskopisch hu-CLDN1 Protein nur in konfluenten Zellkulturen nachweisbar, wobei diese Tumorzellen das Protein korrekt nur an der Zell-Zell Kontaktstelle einbauen. Offensichtlich haben die hu-CLDN1 negativen Brusttumorzellen noch den intakten Signalweg zur korrekten Expression mit einer noch unbekannten posttranskriptionellen Kontrolle. Bemerkenswert ist in diesem Zusammenhang, daß in Brusttumorzellen, die weder Occludin noch ZO-1 exprimieren (MDA-MB-435) die physiologisch korrekte Expression von hu-CLDN1 existiert. Offensichtlich ist die Lokalisation von hu-CLDN1 von beiden Proteinen unabhängig. Die Analyse von unterschiedlichen hu-CLDN1 positiven und negativen Brusttumorzellen zeigte, daß der Verlust der hu-CLDN1 Expression besser zur in vitro Invasivität von Brusttumorzellen korreliert als der Expressionsverlust von Occludin und ZO-1. Die klinische Relevanz des Verlustes von hu-CLDN1 während der Tumorgenese wurde bei den Expressionsanalysen auf normalen Brust- und Darmgewebe gegenüber transformierten Brust- und Darmgewebe untersucht. Bei der Analyse von normalem Brustgewebe konnte festgestellt werden, daß hu-CLDN1 ein rein epthelial/endotheliales Protein mit eindeutiger Membranlokalisation darstellt. In den untersuchten transformierten Geweben zeigte keines der transformierten Gewebe mehr die membranständige Färbung, sondern nur noch zytoplasmatische Färbung. Desweiteren war eine signifikant reduzierte oder nicht vorhandene hu-CLDN1 Färbung in einer größeren Anzahl von Tumoren zu beobachten. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Verlust der Expression zumindest bei der Brust- und Darmtumorentwicklung offensichtlich mit der in vivo Tumorprogression korreliert. Um die Bedeutung der hu-CLDN1 Relokalisation bzw. verringerten Expression während der Tumorgenese zellphysiologisch zu verstehen, wurden in vitro Zellkulturstudien mit hu-CLDN1 negativen Zellinien und ihren hu-CLDN1 transduzierten Tochterpopulationen durchgeführt. In den adhärenten Zellkulturen hat die hu-CLDN1 Expression keinen Einfluß auf Zellwachstum und Apoptose. Allerdings zeigte sich in drei dimensional wachsenden Tumorzellaggregaten, daß die Reexpression von hu-CLDN1 zu einer drastischen Erhöhung der Apoptose führt. Die parazellulären Fluxstudien ergaben, daß bei der Reexpression von hu-CLDN1 in Brusttumorzellen der parazelluläre Flux zwischen den Zellen deutlich zurückgeht. Somit könnte die reduzierte Wachstumskapazität bzw. erhöhte Apoptose in 3 D Kulturen mit einer reduzierten Zugänglichkeit von Nährstoffen und Wachstumsfaktoren in hu-CLDN1 transduzierten Zellen verursacht sein. Dies würde auch erklären, warum bei den untersuchten transformierten noch hu-CLDN1 positiven Brust- und Darmtumorgeweben sich ausschließlich eine zytoplasmatische Lokalisation in den Tumorzellen findet. Während in Organen und Drüsengeweben Epithelien einschichtig vorkommen und die Versorgung der Zellen mit Wachstumsfaktoren basolateral oder apikal durch Diffusion und Mikro-/Makropinozytose erfolgen kann, wachsen Tumorepithelzellen mehrschichtig. Wären die Tight Junctions im Tumor noch intakt, so könnte es zu einer Mangelversorgung und somit zur Apoptose kommen. Für das in vivo Wachstum eines Tumors ist es also notwendig, Membranproteine, die den parazellulären Flux inhibieren, zu verringern. Wie die zellphysiologischen in vitro Studien der vorliegenden Arbeit zeigen, ist es aber möglich, einen tumorinhibierenden Effekt allein durch die Reexpression von hu-CLDN1 unabhängig von Occludin und ZO-1 zu erreichen. In diesem Sinne kann zumindest zellphysiologisch hu-CLDN1 als Tumorsuppressorprotein betrachtet werden.
Ziel dieser Arbeit war aufgrund eines sehr gut dokumentierten Krankheitsverlaufes einer jetzt 20-jaehrigen Patientin die Darstellung der Interaktion zwischen therapeutischen Massnahmen und dem tatsaechlichen Verlauf und der Entwicklung der Erkrankung, sowie aufgrund persoenlicher Gespraeche mit der betroffenen Patientin und ihrer Familie die Dokumentation einer Beeinflussung der Lebensweise und -qualitaet. Die Ergebnisse brachten bezueglich der Blutwerte im Verlaufe der Jahre 1985-1996 ein zwar stetes Absinken des Haemoglobins, allerdings mit Stabilisierung auf niedrige Durchschnittswerte unter maximaler Therapie. Gleiches zeigte sich bei den Thrombozyten, bei den Leukozytenzahlen war sogar ein leichter Anstieg zu verzeichnen. Grundlage hierfuer ist ein ausgekluegeltes Therapieschema, das zum Teil von den in Eigeninitiative zu Experten herangereiften Eltern mit initiiert und aufrecht erhalten wird. Auffaellig war die lange Zeit bis zur Diagnosestellung. Besonders im Hinblick auf die noch nicht abgeschlossene Familienplanung bei einer so jungen Familie und den bestehenden Behandlungsmoeglichkeiten der Krankheit, im weiteren Sinne auch die Prognose betreffend, waere heutzutage eine rasche Diagnosestellung ueberaus wichtig und wuenschens-wert. Fuer beide Parteien, Eltern und medizinisches Personal, sollte im Mittelpunkt des Interesses die optimale Behandlung und Therapie des Patienten stehen. Um dieses zu erreichen, ist eine Zusammenarbeit auf allen Ebenen erforderlich.
Die Fanconi-Anämie ist eine autosomal-rezessiv vererbte Krankheit, die mit progredientem Knochenmarksversagen, Fehlbildungen und Tumoren einhergeht. Diagnostiziert wird diese Krankheit durch eine vermehrte Chromosomenbrüchigkeit nach Behandlung mit Diepoxybutan oder Mitomycin C oder durch einen erhöhten Anteil von Zellen in der G2-Phase in der Durchflußzytometrie. Bei einigen Patienten wurden Verläufe mit stabilen Blutbildern beschrieben. Als Erklärung wurde das Vorhandensein einer Mosaikkonstellation bei diesen Patienten diskutiert. Hier wird ein FA-Patient der Komplementationsgruppe A beschrieben, bei dem es im Alter von 2 Jahren zu einer Thrombozytopenie kam und ein dysplastisches Knochenmark vorlag. Zusätzlich liegt bei dem Patienten noch ein Wachstumshormonmangel bei dysplastischer Hypophyse vor. Im Alter von 3 ½ Jahren kam es zu einer deutlichen Stabilisierung des Blutbildes; auch fand sich bei wiederholten Knochenmarkspunktionen ein normozelluläres Mark. Nachdem zuvor die Diagnose FA mittels Chromosomenbruchanalyse und Durchflußzytometrie gestellt und später durch Untersuchung von Fibroblasten bestätigt worden war, stellte sich jetzt die Frage eines Mosaiks. Weitere Zellzyklusanalysen ergaben annähernd normale Befunde. Bei einer weiteren, im Alter von 6 Jahren durchgeführten Chromosomenbruchanalyse zeigte sich eine bimodale Verteilung der MMC-Sensitivität. Auf Grund dieser Bimodalität, also der Koexistenz von defekten und intakten Zellen, kann von der Existenz einer Mosaikkonstellation ausgegangen werden, die für das Auftreten intakter Zellen verantwortlich ist und dadurch zu einer Stabilisierung des Blutbildes geführt hat. Die erste Mutation des Patienten wurde auf Exon 10 gefunden, wo anstelle von Glutaminsäure ein Stopcodon gebildet wird. Ob die Mosaikkonstellation im vorliegenden Fall durch intragenes Crossover oder Genkonversion entstanden ist, kann erst nach der Identifizierung der Mutation auf dem zweiten Allel des Patienten abgeklärt werden.
Die Dissertation beschreibt die Positionsklonierung von VMD2, einem Krankheitsgen des Menschen, dass der dominant vererbten vitelliformen Makuladystrophie Typ 2 (VMD2) zugrundeliegt. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein etwa 1.4 Mbp großer Klon-'Contig' aus artifiziellen Phagenchromosomen ('phage artificial chromosomes', PAC) erstellt, der die VMD2-Kandidatengenregion auf Chromosom 11q12-q13.1 physikalisch repräsentiert. Durch die Identifizierung polymorpher (CA)n-Dinukleotidmarker aus dem kritschen Intervall und anschließender Kopplungsanalyse gelang es, die Kandidatengenregion auf ca. 500 kbp zu reduzieren. In der öffentlichen Datenbank (GenBank) bereitgestellte Nukleinsäuresequenzen zweier genomischer Klone aus dem Kern des relevanten chromosomalen Bereichs von zusammen etwa 290 kbp wurden dazu genutzt, über eine Kombination aus computergestützter Vorhersagen kodierender Sequenzen, Kartierung von EST-Klonen ('expressed sequence tags'), RT-PCR-Analysen und, wenn erforderlich, 5'-RACE-Experimenten, acht neue Gene des Menschen zu isolieren. Von den charakterisierten Genen erwiesen sich mehrere als potentielle Kandidaten für VMD2. Ein Gen, provisorisch als Transkriptionseinheit TU15B bezeichnet, konnte durch eine Mutationsanalyse schließlich eindeutig mit der Erkrankung assoziiert werden und wurde 1998 als VMD2 publiziert. Drei Gene aus der untersuchten Region kodieren Mitglieder einer Familie von Fettsäuredesaturasen (FADS1, FADS2 und FADS3), während ein anderes Gen ('Rabin3 interacting protein-like 1'; RAB3IL1) signifikante Sequenzidentität zu einem Transkript der Ratte besitzt, welches das GTPase-interagierende Protein Rabin3 kodiert. Den putativen Translationsprodukten drei weiterer Gene (C11orf9, C11orf10 und C11orf11) konnte bislang keine präzise Funktion zugeschrieben werden. Mit FTH1 ('ferritin heavy chain 1') und FEN1 ('flap endonuclease 1') liegen zudem zwei bekannte Gene im analysierten Intervall, deren cDNA-Sequenzen bereits 1984 bzw. 1995 von anderen Forschungsgruppen isoliert und publiziert wurden. Zweifellos kann die Region als sehr genreicher Abschnitt des menschlichen Genoms bezeichnet werden. Neben der Erstellung des PAC-'Contigs', der Einengung der VMD2-Kandidatenregion und der Klonierung von VMD2 war die vollständige genetische Charakterisierung der genannten Fettsäuredesaturase-Gene ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit. Unabhängig von der Klonierung und Charakterisierung des VMD2-Gens sowie der chromosomal eng benachbarten Gene, richtete sich mein Interesse schließlich noch auf drei Gene des Menschen, provisorisch als TU51, TU52 und TU53 bezeichnet, die gemeinsam mit VMD2 eine Genfamilie bilden und auf den Chromosomen 19p13.2-p13.12 (TU51), 12q14.2-q15 (TU52) und 1p32.3-p33 (TU53) lokalisiert werden konnten. Durch die Aufklärung der kodierenden Nukleinsäuresequenzen der Gene wurden konservierte Sequenzabschnitte innerhalb der Genfamilie erkennbar, die auf wichtige funktionelle Abschnitte der Translationsprodukte schließen lassen.
Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) hat in viele Gebiete der modernen Medizin und Biologie Einzug gehalten. Ein wichtiges Anwendungsfeld hat sie in der pränatalen Diagnostik gefunden. An kultivierten Interphasekernen sowie Metaphasechromosomen eingesetzt kann sie zusätzliche Informationen zur zytogenetischen Analyse liefern. Chromosomenspezifische Sonden können auch auf native Fruchtwasserzellen, Chrorionzottenzellen und fetale Blutzellen hybridisiert werden. Seit einigen Jahren wird FISH an unkultivierten Amniozyten bei bestimmten Indikationen ergänzend zur herkömmlichen Chromosomenanalyse durchgeführt. Nach der Hybridisierung werden die Prozentsätze der Kerne mit disomem (2 Signale) und aberrantem (z.B. 3 Signale bei Trisomie) Signalmuster analysiert. Für eine zuverlässige Information müssen mindestens 50 Kerne pro Sonde ausgewertet werden. Bei weniger als 10 Prozent aneuploiden Kernen wird das Ergebnis als unauffällig gewertet, bei mehr als 60 Prozent aberranten Kernen als auffällig und dazwischen als uneindeutig bzw. kontrollbedürftig. Die konventionelle Chromosomenanalyse erfordert in der Regel ein 2-3wöchige Zellkultur. Das Ergebnis der FISH-Analyse ist dagegen nach 1-3 Tagen erhältlich, verkürzt so die für die werdende Mutter oft quälende Wartezeit beträchtlich und ist damit besonders für Hochrisikogruppen geeignet. Mit FISH für die Chromosomen 13, 18, 21 und XY können können bis zu 90 Prozent der im 2. Trimenon erwarteten Chromosomenanomalien diagnostiziert werden. 10-15 Prozent der Anomalien, z.B. strukturelle Aberrationen können mit dieser Methode grundsätzlich nicht erfasst werden. Technische Probleme, wie z.B. Versagen der Hybridisierung, eine zu geringe Anzahl auswertbarer Kerne oder eine Kontamination der nativen Fruchtwasserprobe mit Zellen mütterlichen Ursprungs können die Aussagekraft des Tests beträchtlich herabsetzen. In der vorliegenden Arbeit werden die ersten 129 FISH-Untersuchungen an unkultivierten Fruchtwasserproben, die am Institut für Humangenetik in Würzburg in der klinischen Diagnostik durchgeführt wurden, retrospektiv aufbereitet. Die einzelnen Fälle werden nach den oberngenannten Kriterien in Gruppen mit unauffälligen, auffälligen und problematischen FISH-Befunden aufgeteilt. Der Anteil der letztgenannten Gruppe ist recht groß: In lediglich 20 Prozent (n=26) der Fälle konnten 50 Zellkerne pro Sonde ausgewertet werden, in 22 Prozent (n=28) der Fälle war das Ergebnis mit 10-60 Prozent aberranten Kernen uneindeutig und in 26 Prozent (n=33) der Fälle schlug die Hybridisierung für mindestens eine Sonde fehl. Dennoch konnten 79 Prozent (15/19) der erkennbaren Anomalien korrekt identifiziert werden: 5 Trisomie 21-Fälle, darunter eine Robertson-Translokation, 3 Trisomie 18-Fälle, 4 Fälle mit Triploidie, 2 Fälle mit Monosomie X und eine Fall mit dem Chromosomensatz 48, XXY, +21. Nicht diagnostiziert wurden aufgrund von fehlgeschlagener Hybridisierung 2 Fälle mit Trisomie 21 und ein Fall mit Trisomie 13. ein Fall von Trisomie 18 zeigte ein unauffälliges Signalmuster. Es traten keine falsch positiven Befunde auf. Fünf Fälle mit strukturellen Aberrationen entgingen der FISH-Analyse. In der folgenden Arbeit werden die Anzahl auswertbarer Kerne, die Signalverteilung in den verschiedenen Gruppen, Probleme bei Hybridisierung oder Auswertung und beeinflussende Faktoren wie Indikation, Gestationsalter, Farbe und Menge des Fruchtwassers beschrieben. In der Diskussion wird auf grundsätzliche technische Besonderheiten der FISH-Analyse eingegangen, wie z.B. Sondenqualität, Gestationsalter und Zellzahl. Das Problem der Kontamination der Fruchtwasserproben mit mütterlichen Zellen wird erläutert. Anschließend wird nochmals auf die pathologischen, problematischen und diskrepanten FISH-Befunde eingegangen. Daten und Erfahrungen verschiedener Arbeitsgruppen aus der Literatur werden jeweils berücksichtigt und mit den eigenen Daten in Beziehung gesetzt. Sensitivität und Spezifität der Methode werden diskutiert. FISH kann eine wertvolle Ergänzung zum Goldstandard der pränatalen Diagnostik und insbesondere der psychischen Entlastung der Patientin dienen. Einen vollständigen Ersatz der konventionellen Technik kann sie wegen der oben erwähnten Limitationen nicht bieten. Die Entscheidung über die Anwendung der FISH-Diagnostik, wie auch der Pränataldiagnostik überhaupt, sollte der betroffenen Frau überlassen werden und erst nach ausführlicher Information über Vor- und Nachteile sowie mögliche Konsequenzen, im Idealfall im Rahmen einer Genetischen Beratung, erfolgen.