Institut für Humangenetik
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Das genetische Modell der hereditären Hämochromatose soll Aufschluss über die ungefähre Größenordnung schlecht untersuchter Parameter geben. Hierzu gehören die Allelfrequenz der zusammengefassten restlichen Mutationen des HFE-Gens, sowie die Penetranzen der verschiedenen Genotypen. Durch die Analyse des Krankenkollektivs und die Berechnung der Häufigkeiten der verschiedenen Genotypen aus den Allelfrequenzen ist es mit Hilfe des genetischen Modells möglich, die Penetranzen der einzelnen Genotypen zu berechnen. Das Modell fasst die restlichen Mutationen des HFE-Gens als RM zusammen. In Europa und Nordamerika zusammengefasst ist so eine Allelfrequenz von 0,0153 mit einer Penetranz von 0,373 für RM-RM anzunehmen. In Italien allein betrachtet, ist die Allelfrequenz von RM etwa 0,098 mit einer Penetranz von 0,491 für RM-RM. Für Mitteleuropa errechnet sich eine Allelfrequenz von 0,0155 mit einer Penetranz von 0,482 für RM-RM, für Südeuropa ist es 0,0119 bzw. 0,482. Vergleiche von zusammengefassten Daten aus Mittel- und Südeuropa ergaben Unterschiede in der Verteilung der Genotypen, sowie der Penetranzen. So scheinen besonders in Südeuropa neben den Hauptmutationen im HFE-Gen, C282Y und H63D, andere Mutationen, RM, eine größere Rolle der Krankheitsmanifestation zu spielen als in Mitteleuropa. Das genetische Modell der Hämochromatose ermöglicht eine Risikoabschätzung bei Ratsuchenden mit an HH erkrankten Angehörigen. Auch bei Personen, die heterozygot für C282Y oder H63D sind, lässt sich nun ein Erkrankungsrisiko abschätzen. Das Erkrankungsrisiko variiert je nach Herkunftsland. Die Erhebung verschiedener Daten und die weitere Untersuchung anderer Mutationen im HFE-Gen sind abzuwarten, um das Modell komplettieren zu können. Bis dahin stellt es jedoch einen guten Anhaltspunkt für eben diese schlecht untersuchten Größen dar, und bietet daher die Möglichkeit, die Krankheit in ihrer Heterogenität und Komplexität vereinfacht darzustellen, und so Wahrscheinlichkeiten abschätzen zu können.
Die Hämophilie A ist mit einer Inzidenz von 1:5000-1:10000 bei männlichen Neugeborenen die häufigste genetisch bedingte Form einer schweren Blutungsneigung. In Deutschland leben zur Zeit ca. 6000 Hämophilie-A-Patienten. Das klinische Erscheinungsbild, die verschiedenen Phänotypen dieser Erkrankung werden durch ein defektes oder ein gar nicht vorhandenes FVIII-Protein, kodiert durch das FVIII-Gen, festgelegt. Zielsetzung der Arbeit war ein Mutationsprofil für schwere und nicht schwere Hämophilie zu erstellen. Die ermittelten Daten sollten der internationalen Datenbank HAMSTeRS und der kürzlich erschienenen Arbeit von Dr. J. Schröder gegenübergestellt werden. Zudem sollten wissenschaftlich interessante Zusammenhänge wie Verteilung der Mutation im FVIII-Gen und Mutationshotspots untersucht werden. Kennt man die Ursache der Mutation, kann man sich aufgrund bisheriger Erkenntnisse eine Vorhersage über den Krankheitsverlauf, wie Schweregrade und Hemmkörperentwicklung erlauben. Die Daten wurden mittels Microsoft Access verarbeitet. Diese Studie umfasste 1492 Hämophilie-A-Patienten. Bei 1422 (95,3%) konnte die krankheitsauslösende Mutation gefunden werden. Die häufigste Mutation bezogen auf alle Patienten war die Missensemutation mit 38,4% gefolgt von der Intron-22-Inversion mit 20,7%. Bezüglich der Schweregrade war die Intron-22-Inversion die häufigste Ursache (47,1%) einer schweren Verlaufsform der Hämophilie und die Missensemutation die häufigste Ursache (93%) der leichten Form der Hämophilie. 18,1% der Patienten mit schwerer Hämophilie entwickelten einen Hemmkörper. Es wurden 3 Hotspots gefunden, von denen die Intron-22-Inversion mit 29,7% den grössten Anteil ausmacht, gefolgt von den Mutationen an den CpG-Diknukleotiden mit 16,8% und kleinen Deletionen/Insertionen an Adenin Folgen mit 3,5%. Verglichen mit HAMSTeRS entsprachen unsere Ergebnisse, bis auf die Stopmutationen, relativ gleichmässig denen der internationalen Datenbank. Auch die Korrelation Genotyp-Phänotyp stimmte fast immer zu ca. 90% oder mehr als 90% überein. Wie zu erwarten entsprach unser Mutationsprofil auch dem der Arbeit von Dr. Schröder. Einzig die Intron-1-Inversion trat in unserer Studie häufiger auf, was an der Einführung der Intron-1-PCR als neue Screeningmethode liegt. Die Verteilung der Schweregrade korrelierte auch mit Dr. Schröders Arbeit. Das Aufstellen von Mutationsprofilen hat zum besseren Verständnis der Ätiologie und zum Krankheitsverlauf der Hämophilie A beigetragen. Die systematische Erfassung aller Krankendaten erleichtert dem Gesundheitswesen eine bessere Planung für die Bereitstellung von Mitteln für die Hämophilie. Im Einzelnen betrifft dies: Beratungstermine für schon betroffene Überträgerinnen, wie auch pränatale Diagnostik, allgemeine Konduktorinnendiagnostik, sowie psychische Beratung und Unterstützung. Für die Hämophiliepatienten bedeutet dies eine Verbesserung der Therapie und eine bessere Vorhersage bezüglich der Hemmkörperentwicklung.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden sechs FA-Patienten und eine Patientin, bei der eine Fanconi Anämie ausgeschlossen wurde, auf das Vorhandensein eines Mosaizismus untersucht. Dabei wurde bei allen Patienten eine zytogenetische Chromosomenbruchanalyse durchgeführt und die Ergebnisse mit den Daten der durchflusszytometrischen Zellzyklusanalyse verglichen. Bei einer FA-Patientin konnte weder in der Chromosomenbruchanalyse noch in der Zellzyklusanalyse das Vorhandensein eines Mosaizismus nachgewiesen werden. Bei drei FA-Patienten gab es in der Auswertung der Metaphasen auf Chromosomenbrüchigkeit den Hinweis auf das Vorliegen einer Mosaik-Konstellation, wobei dies in einem Fall (Proband 5) besonders ausgeprägt war. Die Zellzyklusanalyse konnte das Vorhandensein eines Mosaizismus jedoch in allen drei Fällen nicht bestätigen. Bei einer FAPatientin zeigten sich die Chromosomen in der Chromosomenbruchanalyse nahezu unauffällig. Die erfolgreiche und komplette Selbstkorrektur spiegelte sich auch eindeutig in der Zellzyklusanalyse wider. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die zytogenetische Chromosomenbruchanalyse zum Nachweis eines Mosaizismus besser geeignet ist als die Zellzyklusanalyse, da sie eine höhere Sensitivität zu haben scheint. Um eine definitive Aussage sowohl über die Sensitivität, als auch die Spezifität beider Untersuchungen machen zu können, ist es nötig FAPatienten im Verlauf mehrmals zu untersuchen. Dabei müsste sowohl eine Chromosomenbruchanalyse als auch eine Durchflusszytometrie durchgeführt werden und die Ergebnisse dann mit dem klinischen Befinden bzw. den Blutwerten (Hämatokrit/Hämoglobinwert, Leukozyten-und Thrombozytenzahl) verglichen werden. Da das Vorhandensein eines Mosaizismus Konsequenzen für die Diagnose und eventuell Therapiefestlegung hat, erscheinen weitere Untersuchungen diesbezüglich sinnvoll.
Kathepsin B und L sind lysosomale Cysteinproteasen, die mit einer Reihe von pathologischen Prozessen, wie z. B. Cancerogenese, Tumorangiogenese und Neurodegeneration in Verbindung gebracht werden. Dennoch sind bis jetzt nur wenige Proteinsubstrate beschrieben. Ausserdem sind die Mechanismen der Regulation von Zellproliferation, -invasion und -apoptose durch Kathepsin B und L weitgehend unverstanden. Ein kombinierter Mangel beider Kathepsine führt zu einer frühzeitigen Neurodegeneration in Mäusen, die an neuronale Lipofuszinosen beim Menschen erinnert. In der vorliegenden Studie wurden Unterschiede in der Proteinzusammensetzung von wildtypischen und doppelt-defizienten Gehirnlysosomen quantifiziert. Eine Kombination von subzellulärer Fraktionierung und LC-MS/MS unter Verwendung einer isobarischen Markierung (iTraqTM) erlaubte uns die gleichzeitige Untersuchung von zerebralen Lysosomen aus Wildtyp und Kathepsin B-/-L-/- Mäusen. Ingesamt waren 19 Proteine signifikant erhöht in Kathepsin B-/-L-/- Lysosomen. Die meisten erhöhten Proteine wurden der neuronalen Biosynthese, regenerierenden bzw. endozytotischen oder lysosomalen Kompartimenten zugeordnet. Der Anstieg von Calcyon, dem Delta/Notch- verwandten epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (DNER), Neurochondrin, Phospholipase D3, Rab14, Cathepsin D und Apolipoprotein E lässt eine potentielle Rolle von Kathepsin B und L im Axonwachstum und der Synapsenbildung während der postnatalen Entwicklung des Zentralnervensystems vermuten.
Caretaker-Gen-Syndrome
(2001)
Ataxia telangiectasia: Identifizierung und Charakterisierung nicht-konservativer Spleißmutationen und deren Auswirkungen im ATM-Gen. Ein hoher Anteil der bisher im ATM-Gen identifizierten Mutationen (>350, www.vmresearch.org/atm.htm) stellt Deletionen oder Insertionen direkt an den Exongrenzen dar; viele dieser Aberrationen wurden allerdings nur auf cDNA-Ebene detektiert. Sollte es sich hierbei in den meisten Fällen um Mutationen an den Spleiß-Konsensussequenzen handeln, läge der Anteil der Spleißmutationen im ATM-Gen beträchtlich höher (~35 Prozent) als in anderen betroffenen Genen (~15 Prozent). Um der Frage nachzugehen, ob im ATM-Primärtranskript aufgrund einer erhöhten Labilität gegenüber Spleißmutationen auch Veränderungen weniger konservierter Positionen innerhalb der Donor- oder Akzeptor-Spleißstellen zu aberrantem Spleißen führen, wurden 20 AT-Zellinien mittels „Protein Truncation Test“ nach Deletionen oder Insertionen an den Exongrenzen durchsucht. Die 7 neu identifizierten Spleißmutationen wurden anschließend unter Verwendung eines „Splice Scoring“- Systems näher charakterisiert, die Penetranz der jeweiligen Mutation durch semiquantitative PCR evaluiert und die Auswirkungen auf Proteinebene durch Western Blotting überprüft. Obwohl nur eine der 7 neu identifizierten Spleißmutationen eine schwächer konservierte Position der Spleißsequenzen betraf, konnten im Rahmen einer Kooperation mit der Medizinischen Hochschule Hannover (Arbeitsgruppe Dr. T. Dörk) weitere Spleißmutationen an den Intronpositionen +3, +5 und -6 identifiziert werden, die ebenfalls in völlig aberrantem Spleißen resultieren. Daten weiterer Arbeitsgruppen lassen vermuten, daß tatsächlich ~ 50 Prozent aller Spleißaberrationen im ATM-Gen auf Mutationen außerhalb der konservierten Dinukleotidbereiche (gt und ag) zurückführen sind. Nijmegen Breakage Syndrom (NBS): Suche nach Genen, die einen NBS-ähnlichen Phänotyp auslösen. Über 90 Prozent aller NBS-Patienten tragen Mutationen im NBS1-Gen, dessen Translationsprodukt im Komplex mit MRE11 und RAD50 eine zentrale Rolle in DNA-DSB-Reparatur und Zellzykluskontrolle spielt. Weitere Mutationen bei Patienten mit NBS-ähnlichem Phänotyp wurden im Gen der DNA-Ligase IV identifiziert, die zusammen mit weiteren Angehörigen des NHEJ-Reparaturweges (XRCC4, DNA-PKcs, Ku70, Ku80) ebenfalls in DNA-DSB-Reparatur involviert ist. Zellen von Patienten mit NBS-ähnlichem Phänotyp wurden daher durch direkte Sequenzierung und/oder Western Blotting auf Defekte in den oben genannten Genen/Proteinen untersucht. In einem parallel durchgeführten unabhängigen Mutationsscreening (Medizinische Hochschule Hannover, Arbeitsgruppe Dr. T. Dörk) wurden in Fibroblasten einer Patientin mit NBS-ähnlichem Phänotyp Mutationen im RAD50-Gen identifiziert. Die Auswirkungen der RAD50-Defizienz auf die zelluläre Lokalisation der beiden Komplexpartner NBS1 und MRE11 sowie deren Fähigkeit zur Focibildung nach DNA-Schädigung wurde im Rahmen dieser Arbeit durch Immunfluoreszenzstudien untersucht: während NBS1 vorwiegend nukleäre Lokalisation aufwies, war MRE11 zu etwa gleichen Anteilen zwischen Nukleus und Zytoplasma verteilt; beide Proteine waren nach Bestrahlung der Zellen nicht mehr zur Focibildung fähig. Da in MRE11-defizienten Zellen keine nukleäre NBS1-Lokalisation beobachtet wird, scheint der Kerntransport des NBS1 von funktionellem MRE11, nicht aber von RAD50 abhängig zu sein. Fanconi Anämie (FA): Untersuchung einer möglichen Verbindung zwischen den FA-Proteinen und der RAD51-Familie. FA-Zellen aller bisher bekannter Komplementationsgruppen zeichnen sich durch Hypersensitivität gegenüber DNA-„interstrand crosslinks“ (ICLs) aus, zu deren Behebung u.a. die homologe Rekombinationsreparatur (HRR) eingesetzt wird, bei der das RAD51(A)-Protein eine zentrale Rolle spielt. Aufgrund schwacher Homologien werden 5 weitere Proteine (RAD51B, C, D, XRCC2 und 3) der RAD51-Familie zugeordnet. Da Knockout-Zellinien aller RAD51-Familienmitglieder ebenfalls hohe Sensitivität gegenüber ICLs aufweisen, wurde eine mögliche Verbindung zwischen den FA-Proteinen FANCA, C, G und der RAD51-Familie getestet. Unter Verwendung des "Yeast Two Hybrid" (Y2H)-Systems konnten zunächst mehrere Interaktionen zwischen FA- und RAD51-Proteinen detektiert werden. Zur Bestätigung einer funktionellen Verbindung wurden die FA- und RAD51-Proteine in humanen 293-Zellen überexprimiert. Aufgrund der focibildenden Eigenschaften des RAD51-Proteins wurden die FA-Proteine und die RAD51-Familie auf Focibildung nach DNA-Schädigung sowie etwaige Kolokalisationen getestet; mögliche physikalische Interaktionen wurden durch Koimmunpräzipitationsstudien überprüft. Die RAD51-Familie zeigten keinerlei Focibildung nach DNA-Schädigung während die FA-Proteine in einigen Experimenten eine Lokalisation in nukleäre Foci zeigten, die sich jedoch in Größe und Homogenität deutlich von denen klassischer DNA-Reparaturfoci unterschieden und nicht mit RAD51 kolokalisierten. Die häufige Beschränkung der FA-Foci auf Bereiche besonders dicht gepackten Chromatins kann möglicherweise als weiterer Hinweis auf die postulierte Rolle der FA-Proteine bei Chromatin Remodelling Mechanismen interpretiert werden. Bei Überexpression in HEK293-Zellen konnte keine der im Y2H-System identifizierten Interaktionen zwischen FA- und RAD51-Proteinen durch Koimmunpräzipitationen detektiert werden. Dennoch erscheinen seit der Identifizierung des FANCD2, das durch den FA-Komplex aktiviert wird und mit dem RAD51-Interaktor BRCA1 in nukleäre Foci kolokalisiert, weitere Untersuchungen einer Verknüpfung der FA-Proteine mit den Angehörigen des HRR-Weges durchaus sinnvoll.
Muskeldystrophie Duchenne (DMD) (Xp21.2) und gehört mit 1:3500 männlichen Geburten zu den häufigsten genetisch-determinierten Erkrankungen. DMD ist bis heute nicht heilbar. Die genetische Beratung ist Teil der Betreuung dieser Patienten und bezieht auch die heterozygotenwahrscheinlichkeit weiblicher Angehöriger
mit ein. Für die Risikoberechnung zum Überträgerstatus weiblicher Angehöriger von DMD-Patienten sind neben Stammbauminformationen und Enzymwerten Verhältnisse der Mutationsraten ( k -Werte) essentiell, welche die
unterschiedliche Entstehungswahrscheinlichkeit der einzelnen Mutationstypen (Deletion, Duplikation, Punktmutation) in Spermatogenese oder Oogenese
beschreiben.Die Bestimmung des Verhältnisses k der Mutationsraten zeigte, dass einerseits Deletionen im Dystrophin-Gen viel häufiger großmütterlichen
Ursprungs (k Deletion ≈ 0,26) und andererseits Punktmutationen im Dystrophin-Gen meist großväterlichen Ursprungs (k Punktmutation ≈ 2,8) sind.
Fanconi anemia (FA) is an autosomal recessive or X-chromosomal inherited disorder, which is not only phenotypically but also genotypically very heterogeneous. While its hallmark feature is progressive bone marrow failure, many yet not all patients suffer additionally from typical congenital malformations like radial ray defects and growth retardation. In young adulthood the cumulative risk for developing hematological or other malignancies is compared to the general population several hundred-fold increased. The underlying molecular defect is the deficiency of DNA interstrand crosslink (ICL) repair. ICLs are deleterious lesions, which interfere with crucial cellular processes like transcription and replication and thereby can lead to malignant transformation, premature senescence or cell death. To overcome this threat evolution developed a highly complex network of interacting DNA repair pathways, which is conserved completely only in vertebrates. The so called FA/BRCA DNA damage response pathway is able to recognize ICLs on stalled replication forks and promotes their repair through homologous recombination (HR). Today we know 15 FA genes (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O and -P) whose products are involved in this pathway. Although more than 80% of FA patients carry biallelic mutations in either FANCA, FANCC or FANCG, there are still some who cannot be assigned to any of the known complementation groups. This work aimed to indentify the di¬sease causing mutations in a cohort of those unassigned patients. Initial screens of the candidate genes FAN1, MHF1 and MHF2 did not reveal any pathogenic alterations. Moreover, FAN1 could be excluded as FA candidate gene because patients carrying a homozygous microdeletion including the FAN1 locus did not show a phenotype comparable to FA patients. In the case of MHF1 and MHF2 the reason for the negative screening result is not clear. Mutation carriers might be rare or, regarding the diverse and also FA pathway independent protein functions, phenotypically not comparable to FA patients. Nevertheless, this study contri¬buted to the identification and characterization of the most recent members of the FA pathway - RAD51C (FANCO), SLX4 (FANCP) and XPF (FANCQ). FANCO is one of the RAD51 paralogs and is involved in crucial steps of HR. But since the only reported FA-O patient has so far not developed any hematological anomalies, FANCO is tentatively designated as gene underlying an FA-like disorder. In contrast, patients carrying biallelic mutations in FANCP do not only show hematological anomalies, but as well congenital malformations typical for FA. The distinct role of FANCP in the FA pathway could not be determined, but it is most likely the coordination of structure-specific nucleases during ICL excision. One of these nucleases is the heterodimer XPF/ERCC1. XPF is probably disease causing in the complementation group FA-Q and is the first FA gene, which was identified by Next Generation Sequencing (NGS). Extraordinarily is that mutations in this gene had previously been reported to cause two other disorders, xeroderma pigmentosum and segmental progeria. Despite some overlaps, it was shown that the divergent phenotypes could clearly be distinguished and are caused by distinct functional defects of XPF. Additionally, this work aimed to improve and accelerate the genotyping process of FA patients in general. Therefore, classical approaches should be complemented or fully replaced by approa¬ches using NGS. Massively parallel sequencing of the whole exome proved to be most appro¬priate and the establishment of an FA-specific analysis pipeline facilitated improved molecular diagnostics by combining complementation group assignment and mutation analysis in one step. Consequently two NGS studies revealed the pathogenic defect in several previously unassigned FA patients and thereby added another patient to one of the most recent subtypes, FA-P. In summary, this work contributed not only to further completion of the FA/BRCA DNA repair network by adding three novel genes, it also showed that classical molecular approaches for re¬search as well as for diagnostics could be replaced by NGS.
The human retina is a multilayered neuroectodermal tissue specialized in the transformation of light energy into electric impulses which can be transmitted to the brain where they are perceived as vision. Since the retina is easily accessible and functional aspects are directly recordable, the study of this tissue has been at the forefront of neuroscience research for over a century. Studies have revealed that the distinct functions of the retina require a large degree of differentiation which is achieved by the coordinated function of approximately 55 different cell types. The highly structured anatomy and the functional differentiation of the retina is a result of its distinctive transcriptome and proteome. Due to the complexity of the retina it has been difficult to estimate the number of genes actively transcribed in this tissue. Great efforts in the elucidation of retinal disease genes have led to the identification of 139 retina disease loci with 90 of the corresponding genes cloned thus far . In contrast to the success in the hereditary disorders, efforts to identify the genetic factors conferring manifestations known as age-related macular degeneration (AMD) have revealed sparse results. AMD is a retinal disease affecting a significant percentage of the older population. This disorder is likely due to exogenic as well as genetic factors. To further our understanding of retinal physiology and facilitate the identification of genes underlying retinal degenerations, particularly AMD, our efforts concentrated on the systematic analysis of the retinal transcriptome. Since approximately half of all retinal degeneration-associated genes identified to date are preferentially expressed in retina, it is plausible that the investigation of gene expression profiles and the identification of retina-expressed transcripts could be an important starting point for characterizing candidate genes for the retinal diseases. The expressed sequence tags approach included the assessment of all retinal expressed sequence tags (EST) clusters indexed in the UniGene database and of 1080 single-pass ESTs derived from an in-house generated human retina suppression subtracted hybridization (SSH) cDNA library. In total, 6603 EST clusters were evaluated during this thesis and detailed in-silico analysis was performed on 750 EST clusters. The expression of the genes was evaluated using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), followed by confirmation using quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (qRT-PCR), as well as conventional and virtual Northern blot analysis. The expression profiling of 337 selected EST clusters led to the identification of 111 transcripts, of which 60 are specific or abundant to the retina, 3 are expressed at high levels in the retinal pigment epithelium (RPE), and 48 are expressed in brain as well as in retina. The EST approach used to select candidate transcripts allowed us to assess the effectiveness of the two available resources, the UniGene database and the retinal SSH (retSSH) cDNA library. From the results obtained, it is evident that the generation of suppression subtracted libraries to identify cell-specific transcripts constitutes the most straight-forward and efficient strategy. In addition to the high percentage of candidate genes that are identified from an SSH cDNA library, it has the added benefit that genes expressed at low levels can be identified. Furthermore, comparison of our retina-enriched gene set with previously published studies demonstrated only limited overlap of the identified genes further confirming the valuable source of retinal genes from our retinal SSH cDNA library. The effort of our and other groups has resulted in the establishment of the full-length coding sequence of 55 of the 111 genes uniquely or preferentially expressed in the retina. Using various methods such as bioinformatical analysis, EST assembly, cDNA library screening, and rapid amplification of cDNA ends (RACE) a number of genes were cloned in the scope of this thesis including C1orf32, C4orf11, C7orf9, C12orf7, C14orf29, DAPL1, and GRM7. Bioinformatic analyses and cDNA library screening were used to isolate the full-length cDNA sequence and determine the genomic organization of C7orf9, also identified as RFRP. This 1190 bp retina-specific transcript from chromosome 7p15.3 encodes a precursor protein for at least two small neuropeptides, referred to as RFRP-1 and RFRP-3. Since C7orf9 is localized in the critical region for dominant cystoid macular dystrophy (CYMD) its role in the pathology was investigated. Southern blot analysis and sequencing of samples from two affected individuals of the original pedigree used to localize the disease gene excluded the gene from involvement in this disease. Multiple isoforms of the C12orf7 gene were assembled from a number of clones identified from library screenings, PCR amplifications, and RACE experiments. The gene variants, transcribed from chromosome 12q13.13, have been found to be expressed exclusively in retina. Because of the multiple alternative splicing of the gene, we can only speculate about the nature of the protein it encodes. The longest transcript, which includes all six exons plus the last intervening sequence, encodes a 471 aa protein which contains a nuclear localization signal and five ankyrin repeats. The existence of many isoforms is also observed in mouse suggesting that they may have a relevant role in cellular physiology. Five novel splice variants of the glutamate metabotropic receptor 7 (GRM7) resulting from the use of alternative 3’-end exons were identified and characterized. One of the novel variants, GRM7_v3, encodes a 924 aa protein and is therefore the longest putative GRM7 protein reported to date. Even though they are not retina-specific, the isoforms are preferentially expressed in the nervous system. Although the functional properties of the specific carboxyl-termini are still unclear, it is known that axon targeting of GRM7_v1 is mediated by the last 60 aa of the protein. Hence the novel isoforms may direct the protein to specific subcellular localizations. The C1orf32 gene, preferentially expressed in retina, is organized in 10 exons and is transcribed from chromosome 1q24.1. Bioinformatic analyses of the 639 aa putative protein not only identified the mouse and rat orthologous genes but also the LISCH7 gene as a potential member of the same family. Since the LISCH7 protein has been shown to function as a low density lipoprotein receptor, the C1orf32 protein may be involved in retinal lipid homeostasis. Disturbances in lipid metabolism have been proposed as one of the pathways involved in AMD etiology. Thus, the role of C1orf32 in this complex disease should be investigated. Expression analyses of the death-associated protein-like 1 (DAPL1) gene revealed that it is expressed in both the retina and the RPE at high levels. The 552 bp transcript encodes a 107 aa putative protein and is transcribed from chromosome 2q24.1. In-silico analyses identified an additional 12 related proteins from various species which share high similarity constituting a novel protein family. The similarity to the death-associated-protein (DAP) is particularly interesting since this protein has been found to be indispensable for programmed cell death. Therefore, DAPL1 is an excellent candidate for retinal disease as apoptosis is generally the ultimate cause in retinal degeneration. The retina-specific C4orf11 and C14orf29 genes localized on chromosome 4q21.22 and 14q22.1, respectively, are both transcribed in more than one isoform. The encoded proteins do not contain any known domains but because of their retina-specific expression they may be important for proper retinal physiology. As part of the long-term goals of the project, several of the cloned genes are being genotyped to construct single nucleotide polymorphism (SNP) maps. Projects to investigate haplotype frequencies of candidate genes in large cohorts of controls and AMD patients are ongoing. Thus, by establishing a collection of 111 genes expressed exclusively or preferentially in the retina, the present work has laid the foundation for future research in retinal diseases.
Untersuchungen zur Informationsweitergabe in Familien mit erblichem Brust- und Eierstockkrebs
(2021)
Für die hier beschriebene Studie wurde ein Fragebogen erstellt, welcher von 80 Trägerinnen und Trägern einer pathogenen Mutation in den Genen BRCA1 oder BRCA2 ausgefüllt wurde. Die Befragung sollte untersuchen, ob den Befragten das Risiko ihrer Verwandten, ebenso Mutationsträger zu sein, bewusst war. Weiterhin sollte ermittelt werden, ob sie die jeweiligen Risikopersonen darüber informierten. Es zeigte sich, dass den meisten Befragten dieses Risiko bekannt war. Einigen Personen schienen jedoch nicht genau zu wissen, welche Verwandten als „Risikopersonen“ zählen. Insbesondere war nicht allen Befragten die Möglichkeit bewusst, dass auch Männer die Mutation tragen und an ihre Kinder weitergeben sowie selbst an Brustkrebs erkranken können. Weiterhin gaben mehr als ein Viertel der Befragten an, dass sie mindestens ein Familienmitglied, obwohl es ihnen als Risikoperson bekannt war, nicht informierten. Als häufigste Grund hierfür wurde mangelnder Kontakt genannt. Vor dem Hintergrund der Angaben der Befragten sowie der aktuellen Forschungslage werden in der vorliegenden Arbeit Möglichkeiten diskutiert, wie die Anzahl der informierten Angehörigen verbessert werden könnte.
Plasma- und Serumproben waren in früheren epidemiologischen Studien häufig das einzige biologische Material, das gesammelt und untersucht wurde. Diese Studien besitzen gerade durch ihren sehr langen Untersuchungszeitraum einen riesigen Informationsgehalt und wären ein unbezahlbarer Schatz für genetische Analysen. Oft ist aufgrund damals mangelnder Akquirierung jedoch keine genomische DNA verfügbar. Um die in Plasmaproben in geringer Menge vorkommende DNA verwenden zu können, extrahierten wir die DNA mit Hilfe von magnetischen Partikeln und setzten sie in eine Whole Genome Amplification (WGA) mittels Φ29-DNA-Polymerase ein. Wir stellten 88 Probenpärchen, bestehend aus einer WGA-Plasma-DNA und der korrespondierenden Vollblut-DNA derselben Person, zusammen und genotypisierten bei diesen neun hochpolymorphe Short Tandem Repeats (STR) und 25 SNPs. Die durchschnittliche innerhalb der Probenpaare auftretende Diskordanzrate betrug 3,8% für SNPs sowie 15,9% für STRs. Basierend auf den Ergebnissen der Hälfte der Probenpaare entwickelten wir einen Ausschlussalgorithmus und validierten diesen in der anderen Hälfte der Probenpaare. Mit diesem ist es möglich, zum Einen diejenigen Proben mit einer guten DNA-Qualität herauszufiltern, um Genotypisierungsfehler zu vermeiden, und zum Anderen jene Proben mit insuffizienter DNA-Qualität auszuschließen. Nachdem Proben, die fünf oder mehr homozygote Loci in dem 9-STR-Markerset aufwiesen, ausgeschlossen wurden, resultierte dies in einer Ausschlussrate von 22,7% und senkte die durchschnittliche Diskordanzrate auf 3,92% für STRs bzw. 0,63% für SNPs. Bei SNPs entspricht dieser Wert ungefähr der Fehlerquote, wie er auch bei Genotypisierungen mit Vollblut-DNA in vielen Laboratorien auftritt. Unsere Methode und das Ausschlusskriterium bieten damit neue Möglichkeiten, um zuverlässige DNA aus archivierten Plasmaproben wiederzugewinnen. Dieser Algorithmus ist auch besser geeignet, als nur die eingesetzte DNA-Menge in die WGA-Reaktion als Kriterium zu benützen.