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Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Interaktion von ANP und Ang II im Bereich der blutdruckbestimmenden Widerstandsgefäße zu untersuchen. Ein besonderer Augenmerk wurde hierbei auch auf die Bedeutung von RGS2 gerichtet. Durch das Zusammenspiel der beiden funktionellen Antagonisten ANP und Ang II wird der Blutdruck reguliert. ANP und Ang II üben hierbei jeweils gegenteilige Effekte aus. Ang II hat vasokonstriktorische Effekte auf die Blutgefäße, vermindert die Natriurese und Diurese und erhöht den Sympathikustonus. ANP hingegen besitzt blutdruckmindernde Effekte, hervorgerufen durch Vasodilatation, gesteigerte Diurese, die Erhöhung der endothelialen Durchlässigkeit und der Hemmung des Sympathikustonus. Da nichts über die Interaktion dieser beiden Hormone in der Mikrozirkulation bekannt ist, wurden im Rahmen der Dissertation intravitalmikroskopische Studien der Mikrozirkulation des Musculus cremaster der Maus, in Anlehnung an der von Baez (1973) publizierten Methode, durchgeführt. Darüber hinaus wurden auch die Effekte von Ang II und ANP auf den Blutdruck durch invasive Blutdruckmessung untersucht. Der Durchmesser von präkapillären Arteriolen des M. cremaster wurde vor und während lokaler Superfusion von Ang II oder ANP gemessen. Ang II löste eine konzentrationsabhängige stabile Konstriktion aus. Bei der ausschließlichen Superfusion von ANP in verschiedenen Konzentrationen hingegen, zeigte sich kein Effekt auf den basalen Vasotonus. ANP war jedoch in der Lage, an Ang II vorkontrahierten Arteriolen, den konstriktorischen Effekt von Ang II aufzuheben und sogar darüber hinaus eine ausgeprägte Vasodilatation zu bewirken. Dieser Effekt konnte auch bei der invasiven Messung des mittleren arteriellen Blutdrucks nachgewiesen werden. Der durch Ang II ausgelöste Blutdruckanstieg wurde durch die zusätzliche Infusion von ANP gemindert. Ang II aktiviert die Kontraktion von glatten Gefäßmuskelzellen durch den Gαq-gekoppelten AT1-Rezeptor. RGS2 hingegen ist ein negativer Regulator von Gαq. Da von RGS2 bekannt ist, dass er von cGKI phosphoryliert und stimuliert wird (Osei-Owusu et al., 2007), stellte sich die Frage, ob ANP über RGS2 dem vasokonstriktiven Effekt von Ang II entgegenwirkt. Bei den Versuchen an RGS2-KO Mäusen zeigt sich hierbei, dass ANP nicht mehr in der Lage ist, den vasokonstriktiven Effekt von Ang II aufzuheben. Daraus ist nun der Schluss zu ziehen, dass RGS2 eine bedeutende Rolle für die Wechselwirkung zwischen ANP und Ang II in der Mikrozirkulation spielt und somit eine wichtige Aufgabe bei der Regulation des peripheren Widerstands und des Blutdrucks hat.
Die Stickstoffmonoxid (NO)-cGMP-Signalkaskade spielt eine entscheidende Rolle in der Kontrolle des glatten Muskeltonus. NO ist einer der wichtigsten vaskulären Faktoren für die Relaxation der Blutgefäße sowie für die Regulation des Blutdruckes und fungiert ebenfalls als wichtigster inhibitorischer Neurotransmitter im gastrointestinalen Trakt. Es wirkt hauptsächlich über die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen führt zu einem vollständigen NO-GC-Knockout (GCKO). GCKO-Mäuse zeigen keine NO-induzierte Relaxation der vaskulären und gastrointestinalen glatten Muskulatur. Die Mäuse zeigen eine arterielle Hypertonie und eine verlängerte Magen-Darm-Transportzeit, die in eine gastrointestinale Dysfunktion mündet. Allerdings erlaubt eine vollständige Deletion der NO-GC in den Mäusen keine Identifikation des Zell- bzw. Gewebe-Typs, der für den erhöhten Blutdruck und die gastrointestinale Dysfunktion verantwortlich ist. Um die relative Beteiligung der glatten Muskelzellen an der Hypertonie und der gestörten Darm-Motilität zu bestimmen, wurden Glattmuskel-spezifische Knockout-Mäuse für die ß1-Untereinheit der NO-GC (SM-GCKO) generiert. Die SM-GCKO-Mäuse entwickelten im Verlauf der Deletion eine arterielle Hypertonie in Kombination mit einem Verlust der NO-induzierten Glattmuskelrelaxation. Diese Daten zeigen, dass die Deletion der NO-GC in den glatten Muskelzellen völlig ausreichend ist, eine Hypertonie zu erzeugen. Überraschenderweise ist die Darm-Motilität der SM-GCKO-Mäuse im Vergleich zu den WT-Mäusen unverändert. In gastrointestinaler Muskulatur exprimieren neben den glatten Muskelzellen auch die interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) die NO-GC. Mithilfe einer Cre-spezifischen Maus für ICC wurde eine Mauslinie generiert, der die NO-GC in beiden Zelltypen fehlt. Der gastrointestinale Phänotyp dieser Doppel-Knockouts ähnelt dem der totalen GCKO-Tiere: Die nitrerge Relaxation fehlt und die Magen-Darm-Transportzeit ist verlängert. Zusammenfassend führt eine Deletion der NO-GC in glatten Muskelzellen und gleichzeitig in den ICC zu einer vollständigen Unterbrechung der nitrergen Relaxation in GI Trakt.
Das atriale natriuretische Peptid (ANP) beeinflusst den arteriellen Blutdruck und das intravasale Volumen durch Stimulation der intrazellulären Produktion von cGMP über den membranständigen Guanylyl Cyclase-A (GC-A)-Rezeptor. ANP stimuliert außerdem die Angiogenese und ist am Wachstum der Kardio-myozyten beteiligt. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die dynamische Interaktion zwischen den rezeptoraktivierten Kationenkanälen Transient Receptor Potential Canonical Type 3 und Type 6 (TRPC3/C6) und dem GC-A-Rezeptor untersucht. Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass ANP über GC-A den TRPC-vermittelten Ca2+-Einstrom in Kardiomyozyten auf cGMP-unabhängige Weise stimuliert. Um eine mögliche direkte Interaktion von TRPC3/C6 und GC-A zu zeigen, wurde TRPC3 oder C6 mit Flag-GC-A in HEK293-Zellen koexprimiert. Die Membranfraktion der Zellen wurde nach Immunpräzipitation mit einem anti-Flag-Antikörper im Western Blot untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass TRPC3/C6 unabhängig von ANP mit GC-A ko-immunpräzipitieren. Die Interaktion erfolgte auch mit einem modifizierten GC-A-Rezeptor, dem die Cyclase-Domäne fehlt. Um die Interaktion in Kardiomyozyten zu untersuchen, wurde ein transgenes Mausmodell mit einer Überproduktion von HA-GC-A in Kardiomyozyten verwendet. Auch bei diesem Modell konnte mittels anti-HA- Antikörper die Koimmunpräzipitation von GC-A und TRPC3/C6 nachgewiesen werden. Schließlich wurden FRET-basierte Untersuchungen durchgeführt, um die lokale Nähe von GC-A und TRPC3 zu beweisen und eine mögliche ANP-induzierte Konformationsänderung zu untersuchen. Die Koexpression von GC-A-CFP und TRPC3-YFP in HEK293 Zellen führte zu einem FRET-Signal, welches durch ANP konzentrationsabhängig (1-100 nM) gesenkt wurde. Die Gabe des membranpermeablen cGMP-Analagons 8-Br-cGMP führte dagegen zu keiner Veränderung des FRET-Signals. Die Ergebnisse bestätigen das Vorhandensein eines stabilen Proteinkomplexes von GC-A und TRPC3, der für den neuen cGMP-unabhängigen Signalweg von GC-A ausschlaggebend ist. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschreibt die Rolle von ANP/GC-A für die Insulinausschüttung der pankreatischen β-Zellen. Es ist bereits bekannt, dass GC-A in den β-Zellen exprimiert wird und dass ANP an isolierten Langerhans’schen Inseln das β-Zell-Wachstum und die Insulinsekretion moduliert. Um langfristig die Bedeutung von ANP für die systemische Glukose-Homöostase zu ergründen, wurde ein Mausmodell mit einer β-Zell-spezifischen GC-A-Deletion generiert. Der Nachweis des konditionellen GC-A knock out (KO) erfolgte mittels genomischer PCR und Immunhistochemie. Eine Detektion von GC-A in den Langerhans’schen Inseln auf Proteinebene war leider nicht möglich. Aber es konnte gezeigt werden, dass der β-Zell-spezifische KO zu keiner Expressionsänderung von GC-A in anderen Geweben führte. Auch der Blutdruck und das Herzgewicht der KO Mäuse blieb unauffällig. Zur Untersuchung der Bedeutung von ANP für die Insulinausschüttung unter pathologischen Bedingungen wurden KO- und Kontrolltiere für 12 Wochen einer fettreichen Ernährung (60% Fett) ausgesetzt um einen Prädiabetes auszulösen. Zu verschiedenen Zeitpunkten der Studie wurden orale Glukose-Toleranz-Tests (oGTT), Blutdruckmessungen und Gewichtsbestimmungen durchgeführt. Bereits vor der Studie wurde beobachtet, dass der Nüchternglukosewert in den weiblichen KO-Mäusen leicht erhöht ist. Daher wurden die oGTT‘s in der Studie geschlechtsspezifisch ausgewertet. Am Ende der Studie zeigten alle Mäuse eine vergleichbare insuffiziente Blutzuckerregulierung. Der Blutdruck war sowohl in KO- als auch in Kontrolltieren um ca. 60% erhöht. Einigen Tieren wurde das Pankreas entnommen und für immunhistologische Zwecke präpariert. Die morphometrische Auswertung der Pankreas-Schnitte ergab eine signifikant vergrößerte durchschnittliche Inselfläche und eine erhöhte durchschnittliche β-Zellfläche der KO-Tiere im Vergleich zu den Kontrollen. Die β-Zellen der KO-Tieren waren im Vergleich zu den Kontrollen hypertroph. Die Studie zeigt also, dass die Deletion von GC-A in den β-Zellen unter pathologischen Bedingungen zu einer Hypertrophie der β-Zellen führt und zu einem geringeren Schutz gegen die Ausbildung eines Prädiabetes beiträgt. Eine mögliche verstärkte periphere Insulinresistenz in den KO-Tieren ist auch nicht auszuschließen. Weitere Studien an dem neuen Mausmodell könnten die Bedeutung des ANP/GC-A-Systems für die Insulinausschüttung näher ergründen und dadurch eventuell neue Therapieansätze für Diabetes mellitus Typ 2 bringen.
Ziel dieser Arbeit war es, strukturelle Veränderungen präsynaptischer Aktiver Zonen als mögliches Korrelat synaptischer Plastizität zu detektieren. Damit soll die Hypothese getestet werden, dass strukturelle Plastizität Aktiver Zonen eine zentrale Rolle bei der Informationsverarbeitung im Gehirn und bei Lern- und Gedächtnisprozessen spielt. Dazu war es notwendig Methoden zu etablieren, die die strukturelle Analyse Aktiver Zonen und deren Veränderung in vitalem Gewebe ermöglichen. Um die Untersuchungen in einem Gewebe mit plastischen Eigenschaften durchzuführen, wurden Methoden zur Herstellung organotypischer hippocampaler Hirnschnittkulturen etabliert, da hippokampale Moosfasersynapsen ausgeprägte präsynaptische Plastizität aufweisen (Bliss und Collingridge, 1993). Durch Einzelzellelektroporation wurde es möglich, individuelle Neurone mit Transgenen zur Markierung der gesamten Zelle (DsRed) und synaptischer Substrukturen wie Aktive Zonen (z.B.: GFP-CAST, einem Fluorophor-markierten AZ-Protein) zu transfizieren. Mit konfokaler Bildgebung transfizierter Zellen konnten strukturierte Anreicherungen von GFP-CAST in Moosfaserboutons dargestellt werden. Konfokale Bildgebung von Doppelimmunfluoreszenzfärbungen zur detaillierten Analyse der Proteinlokalisation zeigte ein diffraktionsbedingtes Auflösungsdefizit, das auch durch die Anwendung von STED-Mikroskopie nicht zufriedenstellend gelöst werden konnte. Um eine präzise Karte synaptischer Proteine zu erstellen, wurde hochauflösende Mikroskopie (dSTORM) mit einer lateralen räumlichen Auflösung von 20 nm etabliert. Dabei erwiesen sich die ausgeprägte Plastizität, die hohe Dichte an Aktiven Zonen und die variable Gestalt der Boutons im hippokampalen Präparat als problematisch. Aus diesem Grund wurde die elektronenmikroskopisch gut charakterisierte neuromuskuläre Endplatte mit ihrer symmetrischen molekularen Struktur als Präparat für dSTORM verwendet. An der Endplatte konnte die molekulare Organisation der Aktiven-Zonen-Proteine Piccolo und Bassoon dargestellt werden. Zudem konnten erstmals die Mündungen postsynaptischer Falten lichtmikroskopisch aufgelöst werden. So gelang es Werkzeuge zu etablieren, die mit lichtmikroskopischen Methoden die Darstellung der Architektur Aktiver Zonen mit molekularer Auflösung ermöglichen. Die Herausforderung wird es sein, diese neue Dimension in funktionellem Kontext zu nutzen. Die experimentellen Grundlagen dazu wurden durch eine spezielle Badkammer und die Etablierung von Rollertubekulturen bereits gelegt. Dabei ermöglicht dSTORM die Adressierung quantitativer Fragestellungen bis hin zur Bestimmung der Molekülanzahl.
Recent studies show that combinations of defined key developmental transcription factors (TFs) can reprogram somatic cells to pluripotency or induce cell conversion of one somatic cell type to another. However, it is not clear if single genes can define a cells identity and if the cell fate defining potential of TFs is also operative in pluripotent stem cells in vitro. Here, we show that ectopic expression of the neural TF Neurogenin2 (Ngn2) is sufficient to induce rapid and efficient differentiation of embryonic stem cells (ESCs) into mature glutamatergic neurons. Ngn2-induced neuronal differentiation did not require any additional external or internal factors and occurred even under pluripotency-promoting conditions. Differentiated cells displayed neuron-specific morphology, protein expression, and functional features, most importantly the generation of action potentials and contacts with hippocampal neurons. Gene expression analyses revealed that Ngn2-induced in vitro differentiation partially resembled neurogenesis in vivo, as it included specific activation of Ngn2 target genes and interaction partners. These findings demonstrate that a single gene is sufficient to determine cell fate decisions of uncommitted stem cells thus giving insights into the role of key developmental genes during lineage commitment. Furthermore, we present a promising tool to improve directed differentiation strategies for applications in both stem cell research and regenerative medicine.
The voltage –gated calcium channel, Cav1.2, and the plasma membrane calcium ATPase, PMCA4b, play important roles in excitable and non-excitable cells. The central function of Cav1.2 is to regulate the calcium entry into cells upon depolarization, while PMCA4b is responsible for calcium extrusion and has an influence on cellular calcium homeostasis. Both proteins control fundamental functions in the heart and brain, but the specific functions and the precise mechanisms are still investigated. In order to identify new interaction partners that may regulate the activities of the Cav1.2 and the PMCA4b, we used three independent assays and co-localization studies. The assays, which were used are PDZ domain arrays (testing 124 different PDZ domains), GST pull-downs, and conventional immunoprecipitation assays. In the PDZ arrays, strongest interactions with Cav1.2 and PMCA4b were found for the PDZ domains of MAST-205, MAGI-1, MAGI-2, MAGI-3, and ZO-1. Additionally, we established interactions between Cav1.2 and the PDZ domains of NHERF1/2, Mint-2, and CASK. PMCA4b was observed to interact with Mint-2, and its interactions with Chapsyn-110 and CASK were confirmed. Furthermore, we validated interaction of Cav1.2 and PMCA4b with NHERF1, CASK, MAST-205 and MAGI-3 via immunoprecipitation. We also demonstrated direct interaction of the C-terminus of Cav1.2 and the PDZ domain of nNOS. We assumed that nNOS overexpression would reduce Ca2+ influx through Cav1.2. To address this question, we measured Ca2+ currents in stably transfected HEK 293 cells expressing the Cav1.2 (α1b and β2a subunit of the smooth muscle L-type calcium channel) and nNOS. It has been shown that NO modulates ion channel activity by nitrosylation of sulfhydryl groups on the channel protein. So we propose that the interaction between the C-terminus of Cav1.2 and the PDZ domain of nNOS inhibits the currents by an S-nitrosylation of the channel protein. All these interactions connect both proteins to signaling networks involved in signal transmission, cell adhesion, and apoptosis, which may help provide new hints about the physiological functions of Cav1.2 and PMCA4b in intra- and intercellular signaling.
The nicotinic acetylcholine receptor of skeletal muscle is one of the best-investigated synaptic proteins and often serves as model for the entire family of pentameric ligand gated ion channels (pLGICs). Receptors of this superfamily share a common architecture. After binding the agonist the characteristic C-loop structure closes around the ligand-binding site and triggers a wave of conformational changes that spread through the protein and finally result in the opening of the channel gate. As shown before, high-resolution single channel data can hardly be described by simple kinetic mechanisms (Parzefall et al., 1998, Hallermann et al., 2005). Recent advances in the field of kinetic modelling on receptor currents demonstrate that the introduction of additional short lived shut states in kinetic schemes enhances the quality of estimates of reaction rates. The additional shut states that immediately follow ligand bound states in the mechanism are suggested to resemble the closing movement of the C-loop (Lape et al., 2008; Mukhtasimova et al., 2009). It has not been described yet whether and how the structural differences of the 2 binding sites of the receptor influence the opening behaviour. To address this question, high-resolution single channel recordings, in combination with agonists that are known to exhibit different binding site selectivity, were performed. Thereby, a detailed description of the binding site dependent generation of channel currents is possible. At the embryonic mouse-muscle receptor used in this study the ligand binding sites are located at the α-γ and α-δ subunit interfaces. By allocation of opening characteristics to the α-δ and α-γ sites it is possible to show the binding site dependent activation of distinct kinetic states. Furthermore, it will be shown that the recently introduced short-lived shut states are sufficient to describe high-resolution single channel data. Finally an enhanced kinetic mechanism based on the ‘primed states’ model, published in 2009 by Mukhtasimova et al., will be presented. In this model the structurally diverse α-δ and α-γ binding sites elicit different kinetic channel characteristics. Thus the complex high-resolution kinetic characteristics of the embryonic receptor can be described coherently.
Characterisation of Mena Promoter Activity and Protein Expression in Wild-type and Gene-trapped Mice
(2011)
Proteins of the Ena/VASP protein family are important regulators of actin and participate in cell-cell and cell-matrix adhesions. To date, the physiological importance of Ena/VASP proteins for integrity of the cardiovascular system has remained unclear. To study cardiovascular functions of Mena and VASP, we used an established VASP knockout mouse in combination with a novel gene-trap-based model to ablate Mena function. In the mutated Mena mouse, the endogenous Mena gene is disrupted by the insertion of a β-galactosidase construct and β-galactosidase expression is under the control of the endogenous Mena promoter. X-gal staining of mouse organs revealed Mena promoter activity in smooth muscle layers of vessels, intestines and bronchioles, but also in cells of the brain, in cardiomyocytes and in the respiratory epithelium of bronchioles. In wild-type mice, Western blotting revealed differing protein expression patterns of VASP and Mena. Mena expression was observed in almost every tissue, predominantly in heart, lung, stomach, large intestine, testis, brain and eye. Additionally, the neuronalspecific Mena isoform was expressed in brain, eye, and slightly in heart and stomach. VASP protein, in contrast, was predominantly detected in spleen and thrombocytes. In gene-trapped mice, Mena expression was largely reduced in heart, lung and stomach but only slightly decreased in brain and testis. Immunofluorescence microscopy revealed colocalisation of Mena and F-actin at intercalated discs of cardiomyocytes and strong colocalisation of Mena and α- smooth-muscle-actin in vessels and bronchioles. Functional analysis of Mena/VASP-mutated and wild-type mice using electrocardiography suggested that the depletion of either Mena or VASP does not interfere with normal heart function. However, in double-deficient mice, the resting heart rate was significantly increased, probably reflecting a mechanism to compensate defects in ventricle contraction and to maintain a normal cardiac output. In agreement, cardiac catheter investigations suggested dilated cardiomyopathy in doubledeficient mice. Thus, although Western blot analysis showed differing protein expression patterns of Mena and VASP, these findings suggest that Mena and VASP mutually compensate for each other. Concerning Mena, we propose an important role of the protein in vessel walls, cardiomyocytes and bronchioles.
In diesem Projektteil charakterisierten wir mittels vergleichenden Analysen an Mäusen mit konditioneller, herzspezifischer Deletion der GC-A (CM GC-A KO; (Holtwick et al., 2003; Kilic et al., 2005 und 2007)) und Kontrolltieren die zellulären Mechanismen, welche bei Dysfunktion des ANP/GC-A-Systems die Entwicklung von Herzhypertrophie begünstigen. Wir untersuchten, ob/wie ANP die kardialen Effekte von -adrenerger versus Ang II/AT1 (Gs versus Gq-mediierter) Stimulation beeinflusst. Zunächst kombinierten wir an isolierten adulten murinen Kardiomyozyten elektrophysiologische Messungen der L-Typ Ca2+ Ströme (LTCS, mittels voltage-clamp Messungen in Kooperation mit Herrn Dr. M. Kruse und Herrn Prof. O. Pongs am Zentrum für Molekulare Neurobiologie, Universität Hamburg), fluorometrische Messungen der intrazellulären Calcium-Transienten (mittels Indo-1 AM) und Messungen der Kontraktilität (Zellverkürzung, mittels edge detection). Diese ex vivo Untersuchungen zeigten, dass Isoproterenol (ISO) und Ang II die LTCS, [Ca2+]i und Kontraktilität isolierter adulter Myozyten stimulieren. Interessanterweise hemmt ANP/GC-A die Effekte von Ang II, nicht aber die Effekte von ISO. Um der Bedeutung dieser Interaktion zwischen ANP und Ang II für die Entwicklung einer pathologischen Herzhypertrophie ...
The study of animal development is one of the oldest disciplines in the field of biology and the collected data from countless investigations on numerous species have formed a general understanding of the animal life-cycle. Almost one century ago, one consequence of these intense investigations was the discovery of specific morphological changes that occur during the cleavage phase, a period that follows fertilization and egg activation at the very beginning of animal embryogenesis. These observations resulted into the formulation of the concept of a midblastula transition (MBT). So far, the mechanism of the nucleo-cytoplasmic ratio model is the only one that explains MBT regulation in a satisfying way. It suggests that the MBT is controlled by several maternal repressive factors in the egg, which are titrated out by every cell division until they lose their repressing potential. Although this regulatory mechanism was proven for several species and in different approaches, it is still only a rudimentary model for MBT control and leaves numerous questions unanswered. On this conceptual background, this thesis has shown that embryos from the medaka fish (Oryzias latipes) lose their cell cycle synchrony already after the fourth or fifth round of cell divisions, and replace it by a metasynchronous divisions pattern, in which cell division occurs in clear waves beginning in the embryo's center. The reason for this change in division mode is still unknown, although several hypotheses were put forward, most notable a difference in yolk-access between cells. However, this theory was weakened by division waves that progressed from one embryonic pole to the opposing one, which were occasionally observed in deformed embryos, leaving the mechanism for this phenomenon furthermore unclear. Those deformed embryos were most likely the result of asymmetric cell divisions at very early stages, a phenomenon which occurred in a significant percentage of medaka embryos and which directly influenced the equal distribution of cytoplasmic material. It could not beuncovered what kind of effects this unequal distribution of cytoplasm exerted on the progression of embryonic development, but it can be argued that relevant differences in cell volumes could result in cell clusters that will enter MBT at different time points. Comparable observations were already made in other species and it was hypothesized that they were the direct results of early unequal cell cleavages. Finally, it was demonstrated that zygotic transcription in medaka embryos is activated prior to the hitherto assumed time of the first transcriptional initiation. Moreover, indications were found that strongly speak for a transcriptional activation that occurs in two steps; a first step at the 16-cell stage when first cells were identified positive for RNAPII phosphorylation, and a second step at the 64-cell stage, when the number of p-RNAPII positive cells significantly increased. A stepwise activation of zygotic transcription was already observed in other species, but only for the overall increasing amount of mRNAs and irrespective of the actual number of transcriptionally active cells within the embryos. .. Overall, these data confirm and expand the basic knowledge of pre-MBT embryos and about the MBT itself. Furthermore, they also suggest that many early processes in pre-MBT embryos are only rudimentarily understood or still totally unknown.