Institut für Molekulare Infektionsbiologie
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- Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin (5)
- Physikalisches Institut (5)
Sonstige beteiligte Institutionen
- Universitätsklinikum Münster (2)
- Genelux Corporation, San Diego Science Center, 3030 Bunker Hill Street, Suite 310, San Diego, California 92109, USA (1)
- Helmholtz Center for RNA-based Infection Research (1)
- Institut für Molekulare Infektionsbiologie (MIB) der Universität Würzburg (1)
- MRB Forschungszentrum für Magnet-Resonanz-Bayern e.V., Am Hubland, D-97074 Würzburg (1)
- Research Center for Infectious Diseases (ZINF), University of Wuerzburg, Wuerzburg, Germany, (1)
- Research Center of Infectious Diseases (ZINF) of the University of Wurzburg, Germany (1)
- Zentrum für Infektionsforschung (ZINF): Nachwuchsgruppe 2 (1)
Shigellosis, or bacillary dysentery, is a rectocolitis caused by the gram-negative, enteroinvasive bacteria of the genus Shigella. Shigellosis still remains a major public health burden with an estimated 80 million cases of bloody diarrhoea and 700.000 deaths per year, primarily in children under the age of 5. Shigella disrupts, invades, and causes inflammatory destruction of the colonic epithelium in humans through virulence effectors secreted by the type III secretion apparatus (TTSA). In contrast to the Shigella-induced manipulation of the host innate immune response, the impact of Shigella on the adaptive immunity has been poorly studied thus far. In order to understand why the naturally induced protective humoral response requires several infections to be primed and is of short duration, the work presented here investigates if Shigella is able to directly interact with T cells. Indeed, it has been shown that Shigella was able to invade and proliferate inside T cells. Furthermore, Shigella was able to inhibit T cell migration through a TTSA effector. Moreover, the Shigella effector IpgD, a phosphoinositide 4-phosphatase that specifically dephosphorylates phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate (PIP2) into phosphatidylinositol-(5)-monophosphate (PI(5)P), was identified as the effector responsible for the observed inhibition. It could be demonstrated that IpgD was responsible for a reduction of intracellular PIP2 levels in T cells. Further experiments showed a reduced level of phosphorylated ezrin, radixin and moesin (ERM) proteins in infected, as well as with IpgD transfected, T cells. The ERM protein family plays an imported role in signal transduction and motility and their activity is closely related to the binding of PIP2. Therefore, the low level of PIP2 leads to a dephosphorylation of the ERM proteins which inhibits T cells response to chemokine stimulation. Indeed, IpgD transfected T cells show a reduced ability to re-localise the ERM proteins upon chemokine stimulation. Targeting T cell motility, via TTSA effectors, could explain the low level of specific T cell priming during Shigella infection. This is the first report of Shigella induced manipulation of T cell function and on the inhibition of T cell migration by a bacterial effector.
In dieser Arbeit werden die Ergebnisse der molekular-epidemiologischen Analyse von Virulenzgenen im Genom von insgesamt 222 Escherichia coli (E. coli)-Isolaten dargestellt, die von Mastitis-Fällen bei Rindern isoliert wurden. Mit Hilfe der Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion wurde die Verbreitung von 42 potentiellen Virulenzfaktor-Genen extraintestinal pathogener E. coli (ExPEC) analysiert. Neben der quantitativen Bestimmung des Vorkommens jedes Einzelgens wurde in dieser Arbeit eine differenzierte Auswertung von Genkombinationen bei E. coli Mastitis-Isolaten vorgenommen. Diese ermittelten genetischen Muster werden zur 1. Prävalenz der in der Gesamtheit der Isolate, 2. Prävalenz in den phylogenetischen ECOR-Gruppen, 3. akut klinischen und chronischen Mastitis-Episoden und 4. dem Vorkommen spezifisch tierpathogener Adhäsine korreliert. Die Mastitis-Isolate konnten aufgrund der Virulenzmarkerverteilung und Phylogenie keinem bestimmten charakteristischen Pathotyp zugeordnet werden. Die überwiegende Mehrzahl der Mastitis-Isolate zeigte aufgrund einer geringen Prävalenz Virulenz-assoziierter Gene sowie der Zugehörigkeit zu den phylogenetischen Entwicklungslinien A und B1 ein geringes Virulenzpotential extraintestinal pathogener E. coli. Die Mehrzahl der Stämme enthielt eine singuläre Virulenzdeterminante (83 Stämme; 37,4 %), eine Zweierkombination (69 Stämme; 31,1 %) oder eine Dreierkombination von Virulenzgenen (34 Stämme; 15,3 %). Vier Gene für Virulenzfaktoren in Kombination zeigten sich lediglich in sieben Stämmen (3,1 %). Insbesondere die Anwesenheit von 5 bis 18 differenten Virulenzgenen pro Genom traten nur mit einer geringen Frequenz in zusammen 16 Isolaten (7,2 %) auf. Das absolut häufigste Virulenz-assoziierte Gen, das nachgewiesen wurde, war fimH, das für die mannosespezifische Adhäsinuntereinheit der Typ1-Fimbrien kodiert. Insgesamt gaben 88,7 % aller 222 untersuchten Stämme ein positives Signal in der Multiplex-PCR, und zwar 89,9 % der 199 klinischen Isolate sowie 85,7 % der Isolate chronischer Mastitiden. In etwa der Hälfte aller untersuchten Stämme trat auch das Gen traT auf, das Serumresistenz vermittelt (43,7 %). Die Genkombination fimH-traT wurde in wechselnden Konstellationen in insgesamt 83 Stämmen (37,3 %) gefunden. Sie ist damit die häufigste Virulenzgenkombination in den untersuchten E. coli-Genomen mit multiplen Virulenzdeterminanten. Da bei Rinder-Mastitis besonders in den schweren Fällen systemische Verläufe fördernde Faktoren wie Serumresistenz eine bedeutende Rolle spielen, könnte hier eine Selektion auf genetische Kopplung von traT mit fimH vorliegen. Deutlich geringere Prävalenzen wiesen die Virulenzgene für α-Hämolysin (hlyA, 10,8 %), den Yersiniabactinrezeptor (fyuA, 12,2 %) sowie das ebenfalls an der Serumresistenz beteiligte Gen iss (8,5 %) auf. Nur 13 (5,8 %) der 222 E. coli-Isolate besaßen keines der untersuchten Virulenzgene. Das Fehlen bekannter Virulenzgene in diesen Stämmen deutet darauf hin, dass weitere unberücksichtigte Faktoren eine Rolle bei der Virulenz von Mastitisisolaten spielen könnten oder der Status des Wirtsorganismus in diesen Fällen ausschlaggebend für eine erfolgreiche Infektion des Euters sein könnte. Offensichtlich sind die meisten der untersuchten E. coli- Virulenzfaktoren für die Pathogenese der Rindermastitis von untergeordneter Bedeutung. Von den 222 Isolaten zählten insgesamt 137 Stämme zur phylogenetischen Linie (ECOR-Gruppe) A, 62 zur ECOR-Gruppe B1, 20 zur ECOR-Gruppe B2 und 14 zur Gruppe D. Die Stämme, die zu den phylogenetischen Entwicklungslinien A, B1 und D gehören, unterschieden sich hinsichtlich der Prävalenz der Virulenzfaktormuster nicht vom Gesamtbild. Lediglich Isolate der ECOR-Gruppe B2 wiesen eine für sie typische Häufung von Virulenzgenclustern auf. Das relativ geringe Vorkommen bzw. weitgehende Fehlen (5 von 8) von Adhäsingenen spezifisch tierpathogener E. coli lässt darauf schließen, dass bislang beschriebenen Rinder-pathogenen E. coli keine Bedeutung als Verursacher einer Rindermastitis zukommt. Für die Analyse der chronischen Verlaufsform der Mastitis standen nur 21 Isolate zur Verfügung, die keinen hinreichend gesicherten Vergleich zu den Fällen mit akuter klinischer Mastitis (199 Stämme insgesamt) erlauben. Die auffällige Zunahme des Hämolysingens hlyA (23,8 %) gegenüber 9,5 % in den klinischen Isolaten (und 10,8 % in allen Stämmen) müsste in künftigen Untersuchungen invasiven Verhaltens der ExPEC beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass eine bovine Mastitis durch verschiedene E. coli-Varianten hervorgerufen werden kann und ein großes Potential extraintestinaler Virulenzfaktoren dazu nicht erforderlich ist. Entscheidend ist eine durch das fimH-Gen vermittelte Adhäsion, in der Hälfte der untersuchten Fälle unterstützt durch das Serumresistenz vermittelnde Gen traT.
Malaria stellt mit einer Mortalität von über einer Million Menschen pro Jahr die bedeutsamste Tropenkrankheit für den Menschen dar. Wachsende Resistenzen der Malariaerreger gegenüber den verfügbaren Medikamenten erhöhen mehr denn je den Druck, neue Therapiemöglichkeiten sowie einen Impfstoff gegen diese Krankheit zu entwickeln. Eine Unterbrechung des sexuellen Fortpflanzungszyklus im Laufe der Transmission von Mensch zu Stechmücke würde zu einem Verbreitungsstopp des Erregers führen. Sowohl die Identifizierung von molekularen Wechselwirkungen als auch die Erforschung von an Fertilisationsereignissen beteiligten Prozessen sind wichtige Schritte, um die Sexualphase des Erregers aufzuklären und neue Angriffspunkte für Medikamente oder Vakzine zu entwickeln. Dem Genom von P. falciparum konnten 92 putative Proteasen zugeordnet werden, von denen nur ein geringer Bruchteil charakterisiert worden ist. Unter Anwendung von Protease-Inhibitoren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Exflagellation der männlichen Gameten die Beteiligung von Proteasen verschiedener Kategorien benötigt. Die Ergebnisse belegten, dass die Aktivität von zwei oder mehr Serinproteasen, von Falcipain-ähnlichen Cysteinproteasen, von nicht-Thermolysin-ähnlichen Zink-Metalloproteasen und von Aspartatproteasen für den erfolgreichen Abschluss der männlichen Gametogenese eine wichtige Voraussetzung ist. Die Lokalisation des Cysteinproteasen- und Falcipain-hemmenden Inhibitors bADA konnte erstmals im Zytosol von Sexualstadien nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurden zusätzlich die Proteasen Calpain, DPAP2, GPI8, Metacaspase 2, Plasmepsin 6 und PfSub3 näher untersucht. RT-PCR-Analysen konnten die Transkription der sechs ausgesuchten Proteasen in gemischten asexuellen Parasiten sowie zum Großteil in Gametozyten, Gameten und Zygoten belegen. Die Transformation von asexuellen Parasiten mit entsprechenden knockout-Konstrukten deckte für Metacaspase 2 und PfSub3 auf, dass sie im asexuellen Vermehrungszyklus nicht essentiell und die entsprechenden Genloci für Rekombinationsereignisse zugänglich sind. Die Ergebnisse der übrigen Transformationen deuteten darauf hin, dass Calpain essentiell im asexuellen Vermehrungszyklus und dass der Genlocus von Plasmepsin 6 für Rekombinationsereignisse unzugänglich ist. Proteinexpressionsstudien anhand von Western-Blot-Analysen und Immunfluoreszenzstudien für PfSub3 konnten Hinweise darauf liefern, dass diese Serinprotease in asexuellen Parasiten, nicht-aktivierten sowie aktivierten Sexualstadien exprimiert wird. Aufgrund der in dieser Arbeit generierten Ergebnisse konnten im Laufe der Gametogenese auftretende Gametenfilamente morphologisch beschrieben sowie Hinweise auf ihre mögliche Funktion erlangt werden. Durch die Anwendung von Immunfluoreszenzstudien, rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen sowie die Analyse lebender Gameten konnte gezeigt werden, dass die bis zu 180 µm langen Filamente am Ende geschlossen sind und einen Durchmesser von ca. 200 nm aufweisen. Die tubulären Zellausläufer konnten weiterhin als verzweigte sowie nicht-verzweigte Ausläufer der parasitären Plasmamembran dargestellt werden, die mit Zytoplasma gefüllt sind. Es konnte belegt werden, dass die Aktin-assoziierten Filamente in periodischen Abständen von beulenartigen Auswölbungen unterbrochen werden und dass sie in rasterelektronenmikroskopischen Analysen ein perlschnurartiges Erscheinungsbild aufweisen. Weiterhin wurde dokumentiert, dass die Zellausläufer mit typischen sexualstadienspezifischen Proteinen wie Pfs25, Pfs230, Pfs48/45 und PfCCp4 assoziiert vorliegen, wobei das Fehlen einzelner dieser Proteine jedoch nicht das Ausbilden der Gametenfilamente verhinderte. Als typisches Charakteristikum der Filamente konnte ihre Eigenschaft beschrieben werden, mehrere Makrogameten und zum Teil Gametozyten in einem Zellkluster miteinander netzartig zu verbinden, wobei bis zu neun Filamente von einem Makrogameten ausgehend beobachtet werden konnten. Die Gametenfilamente zeigten ebenfalls die Fähigkeit, an umliegende nicht-infizierte Erythrozyten sowie mit asexuellen Parasiten infizierte Erythrozyten zu adhärieren. Die Filamente waren bereits fünf Minuten nach der Aktivierung der Gametozyten und im Laufe der Gametogenese bei 33 bis 73 % der Zellen nachweisbar. Die Gametenfilamente blieben bis zu 12 Stunden nach Aktivierung der Gametozyten mit der Zelloberfläche verbunden. Der aktive Einzug eines Zellfilaments sowie die Bildung der Gametenfilamente im Mitteldarm der Stechmücke konnte ebenfalls demonstriert werden. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse lieferten unter anderem den Grundbaustein einer formulierten Funktionshypothese für diese Gametenfilamente. Es wird angenommen, dass die Filamente aufgrund ihrer adhäsiven Eigenschaften im Laufe der Befruchtung von Plasmodium im Mitteldarm der Stechmücke auftreten. Möglicherweise bedienen sich vitale Gameten dieser Strukturen, um andere Sexualstadien zu finden und sie zu verbinden.
Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) represent a subset of the so-called extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) pathotype that can cause various extraintestinal infections in humans and animals. APEC are the causative agent of localized colibacillosis or systemic infection in poultry. In this latter case, the syndrome starts as an infection of the upper respiratory tract and develops into a systemic infection. Generally, ExPEC are characterized by a broad variety of virulence-associated factors that may contribute to pathogenesis. Major virulence factors, however, that clearly define this pathotype, have not been identified. Instead, virulence-associated genes of ExPEC and thus also of APEC could be used in a mix-and-match-fashion. Both pathotypes could not be clearly distinguished by molecular epidemiology, and this suggested a hypothetical zoonotic risk caused by APEC. Accordingly, the main scientific question of this study was to characterize common traits as well as differences of APEC and human ExPEC variants that could either support the possible zoonotic risk posed by these pathogenic E. coli strains or indicate factors involved in host specificity. Comparative genomic analysis of selected APEC and human ExPEC isolates of the same serotype indicated that these variants could not be clearly distinguished on the basis of (i) general phenotypes, (ii) phylogeny, (iii) the presence of typical ExPEC virulence genes, and (iv) the presence of pathoadaptive mutations. Allelic variations in genes coding for adhesins such as MatB and CsgA or their regulators MatA and CsgD have been observed, but further studies are required to analyze their impact on pathogenicity. On this background, the second part of this thesis focused on the analysis of differences between human ExPEC and APEC isolates at the gene expression level. The analysis of gene expression of APEC and human ExPEC under growth conditions that mimick their hosts should answer the question whether these bacterial variants may express factors required for their host-specificity. The transcriptomes of APEC strain BEN374 and human ExPEC isolate IHE3034 were compared to decipher whether there was a specific or common behavior of APEC and human ExPEC, in response to the different body temperatures of man (37°C) or poultry (41°C). Only a few genes were induced at 41 °C in each strain relative to growth at 37 °C. The group of down-regulated genes in both strains was markedly bigger and mainly included motility and chemotaxis genes. The results obtained from the transcriptome, genomic as well as phenotypic comparison of human ExPEC and APEC, supports the idea of a potential zoonotic risk of APEC and certain human ExPEC variants. In the third part of the thesis, the focus was set on the characterization of Mat fimbriae, and their potential role during ExPEC infection. Comparison of the mat gene cluster in K-12 strain MG1655 and O18:K1 isolate IHE3034 led to the discovery of differences in (i) DNA sequence, (ii) the presence of transcriptional start and transcription factor binding sites as well as (iii) the structure of the matA upstream region that account for the different regulation of Mat fimbriae expression in these strains. A negative role of the H-NS protein on Mat fimbriae expression was also proven at 20 °C and 37 °C by real-time PCR. A major role of this fimbrial adhesin was demonstrated for biofilm formation, but a significant role of Mat fimbriae for APEC in vivo virulence could not yet be determined. Interestingly, the absence of either a functional matA gene or that of the structural genes matBCDEF independently resulted in upregulation of motility in E. coli strains MG1655 and IHE3034 by a so far unknown mechanism. In conclusion, the results of this thesis indicate a considerable overlap between human and animal ExPEC strains in terms of genome content and phenotypes. It becomes more and more apparent that the presence of a common set of virulence-associated genes among ExPEC strains as well as similar virulence gene expression patterns and phylogenetic backgrounds indicate a significant zoonotic risk of avian-derived E. coli isolates. In addition, new virulence factors identified in human ExPEC may also play a role in the pathogenesis of avian ExPEC.
Syngeneic memory cells can be stimulated to yield a secondary immune response after their transfer into irradiated euthymie recipients as well as into young thymusless nude mice. It is shown that nude mice older than twelve weeks of age are not permissive towards memory cell activation as it is found in non-irradiated euthymie animals. This barrier to isogeneie or congeneic cells seems to be caused by a pool of cyclophosphamide-sensitive cells. Since young nude mice could be rendered as unpermissive as older nude mice by pretreatment with either PNA-agglutinable thymus cells or nylon-wool passed spleen cells, it is suggested that an increased number of precursor T cells in older nude mice might induce this effect. Further experiments with monoclonal antibodies against the Lyt-l, Lyt-2, and L3T4 marker on T cells indicate that T -helper/inducer activity might be required to establish the "isogeneie barrief" in nude mice.
A novel technique for independent and simultaneous labeling of two antigens expressed on individual cells (referred to as mixed labeling) is presented. The staining procedure combined three-step (streptavidin-biotin) immunogold-silver staining with three-step immunoenzymatic labeling. To ensure both high specificity and high sensitivity, particular emphasis was placed on designing a protocol that avoids immunological crossreactivity between the antibody reagents and overlapping of the final color products. Two examples for usage of this mixed labeling technique are described: lymphocyte subpopulations were identified in inflammatory lesions of human skin and infected host cells were characterized in the skin of mice infected with the obligatory intracellular parasite Leishmania major, a cause of human cutaneous leishmaniasis.
Asymptomatische Bakteriurie (ABU) stellt eine bakterielle Infektion der Harnblase über einen langen Zeitraum dar, die häufig von Escherichia coli hervorgerufen wird, ohne dass typische Symptome einer Harnwegsinfektion auftreten. Um die Charakteristika von ABU E. coli Isolaten genauer zu untersuchen, wurden die Geno- und Phänotypen von 11 ABU-Isolaten verglichen. Außerdem wurden in mehreren aufeinanderfolgenden in vivo-Reisolaten des Modell-ABU Stammes 83972 die Veränderungen im Transkriptom, Proteom und Genom während einer langfristigen Persistenz in der menschlichen Blase charakterisiert. Schließlich wurde der Effekt des menschlichen Wirtes auf die bakterielle Adaptation durch einen Vergleich von in vitro- mit in vivo-kultivierten Stämmen abgeschätzt. ABU-Isolate stellt eine heterogene Gruppe von Organismen dar. Diese können den vier phylogenetischen Hauptgruppen von E. coli sowie unterschiedlichen klonalen Gruppen zugeordnet werden. Dementsprechend unterscheiden sie sich erheblich bezüglich der Zusammensetzung des Genomes, der Genomgröße und auch der Ausstattung mit UPEC-typischen Virulenz-assoziierten Genen. Multi-Lokus-Sequenz-Typisierung legt nahe, dass bestimmte ABU Stämme sich durch Genomreduktion aus UPEC Stämmen entwickelt haben, die eine Harnwegsinfektion mit charakteristischen Symptomen auslösen konnten. Folglich erlaubt die hohe Genomplastizität von E. coli keine generalisierte Betrachtung einzelner Isolate eines Klons. Genomreduktion über Punktmutationen, Genom-Reorganisation und Deletionen resultierte in der Inaktivierung einiger Gene, die für einige UPEC Virulenz-Faktoren kodieren. Dies stützt die Vorstellung, dass eine verminderte bakterielle Aktivierung der Entzündung der Wirtsschleimhaut den Lebensstil von ABU (bei diesen E. coli-)Isolaten fördert. Genregulation und genetische Diversität sind Strategien, die es Bakterien ermöglichen unter sich fortlaufend ändernden Bedingungen zu leben bzw. zu überleben. Um die anpassungsbedingten Veränderungen bei einem langfristigen Wachstum in der Blase zu untersuchen, wurden aufeinanderfolgende Reisolate, denen eine langfristige in vivo-Kolonisierung im menschlichen Wirt beziehungsweise eine in vitro-Kultivierung vorausgegangen ist, im Hinblick auf Veränderungen Genexpression und Genomorganisation analysiert. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass E. coli in der Lage ist, seine metabolischen Netzwerke verschiedenen Wachstumsbedingungen anzupassen und individuelle bakterielle Kolonisierungsstrategien entwickeln kann. Transkriptom- und Proteom-Analysen zeigten verschiedene metabolische Strategien zur Nährstoffbeschaffung und Energieproduktion bei untersuchten in vivo-Reisolaten vom Stamm 83972, die es ihnen ermöglichen, den Wirt zu kolonisieren. Das Zurückgreifen auf D-Serin, Deoxy- und Ribonucleoside sowie die bidirektionale Umwandlung zwischen Pentose und Glucuronat waren hoch-regulierte Stoffwechselwege, die die in vivo-Reisolate mit zusätzlicher Energie für ein effizientes Wachstum in der Blase versorgen. Zudem wurden in dieser Studie die Netzwerke für eine Reaktion auf Abwehrmechanismen des Wirtes erforscht: Erstmals wurde hier die Rolle der Klasse-III-Alkoholdehydrogenase AdhC, bekannt durch ihre Bedeutung bei der Entgiftung von Stickstoffmonoxid, bei der Wirtsantwort während einer asymptomatischen Bakteriurie gezeigt. Aufeinanderfolgende in vivo- und in vitro-Reisolate vom Stamm 83972 wurden ebenfalls bezüglich ihrer Genomstruktur analysiert. Einige Veränderungen in der Genomstruktur der aufeinanderfolgenden Reisolate, die von einer humanen Kolonisierungsstudie stammen, implizieren die Bedeutung einer Interaktion der Bakterien mit dem Wirt bei der Mikroevolution der Bakterien. Dagegen war die Genomstruktur von Reisolaten eines langfristigen in vitro-Kultivierungsexperiments, bei dem sich der Stamm 83972 ohne Wirtskontakt vermehrt hat, nicht von Veränderungen betroffen. Das legt nahe, dass die Immunantwort eine Genomplastizität fördert und somit eine treibende Kraft für den ABU Lebensstil und die Evolution im Harnwegstrakt ist.
Cutaneous leishmaniasis is initiated by the bite of an infected sandfly and inoculation of Leishmania major parasites into the mammalian skin. Macrophages are known to playa central role in the course of infection because they are the prime host cells and funetion as antigen-presenting eells (APC) for induetion of the eell-mediated immune response. However, in addition to maerophages in the dermis. the skin eontains epidermal Langerhans eells (LC) which ean present antigen (Ag) to T cells. Therefore, using a murine model of cutaneous leishmaniasis, we analyzed the ability of epidermal cells to induce a T eell response to L.major. The results demonstrated that freshly isolated LC, but not cuItured LC, are highly active in presenting L.major Ag in vitro to T cells from primed mice and to a L.major-specific T cell clone. Furthermore, freshly isolated LC had the ability to retain L.major Ag in immunogenic form for at least 2 days. Their efficiency was much greater than that of irradiated spleen cells, a standard population of APC. LC stimulated both T cell proliferation and production of the Iymphokines interleukin (IL)-2 and IL-4. The response was Ag specific and could be induced by lysate of L. major parasites and by live organisms. The data suggest that epidermal LC are important APC in eutaneous leishmaniasis. They may perform a critical funetion by eapturing L.major Ag in the skin and presenting it either to quiescent T eells circulating through the draining lymph node or locally to T effector cells infiltrating the cutaneous lesion.
Murine epidermal Langerhans cells (LC) have been demonstrated to stimulate a vigorous T cell response to Leishmania major, a cause of human cutaneous leishmaniasis. It was therefore of interest to analyze whether LC can take up viable parasites. Epidermal cells were obtained from mouse ear skin for incubation with L. major and subsequent detection of intracellular parasites by cytochemistry. Freshly isolated LC, but not cultured LC, phagocytosed L. major and the uptake was inhibited by antibodies to the complement receptor type 3. Electron microscopic studies revealed the presence of viable amastigotes within Le. Moreover, with double-Iabeling techniques, L. major-containing LC could also be detected in infected skin. The results demonstrate that LC can internalize L. major. Since the number of organisms per infected LC remained consistently low, the prime task of LC may not be the promotion of parasite spreading but the presentation of L. major antigen to T cells and, thus, the regulation of the cellular immunity during cutaneous leishmaniasis.
Freshly isolated human T lymphocytes were tested for their response to mycobacteria, mycobacteriallysates, 2 dimensional (2D) PAGE separated mycobacteriallysates, leishmania and defined leishmanial antigen preparations. While,o T cells proliferated vigourously in the presence of mycobacteria and mycobacteria derived lysates, a significant stimulation from 2 D gel separated lysates was not detected. In addition '10 T cells failed to respond towards leishmania or leishmanial components. In the ab T cell compartment some donors, presumably according to their state of immunity against mycobacteria, responded to mycobacteria, mycobacterial lysates and 2 D gel separated mycobacterial lysates. Neither freshly isolated '10 T cells nor ab T cells from naive donors did mount a significant immune response against leishmania.
Studien zur Verbreitung und genetischen Struktur des Colibactin-Genclusters in Enterobacteriaceae
(2009)
Horizontaler Gentransfer zwischen Bakterien – sogar zwischen verschiedenen Spezies – ist ein wichtiger Mechanismus für den Austausch genetischer Information. Dies kann dem Rezipienten einen selektiven Vorteil verleihen, z. B. durch die schnelle Aneignung von Genclustern, die für Pathogenitäts- oder Fitnessfaktoren kodieren. Die Variabilität bakterieller Genome durch Aneignung und Inkorporation genetischen Materials in das Genom trägt somit erheblich zur Evolution von Bakterien bei. Bakterielle Genome neigen allerdings dazu, nutzlose genetische Information zu verlieren und daher kann horizontal erworbener DNA häufig eine distinkte biologische Funktion zugeordnet werden. Das Colibactin-Gencluster, welches zuerst in Escherichia coli gefunden wurde, weist mehrere Charakteristika einer horizontal erworbenen genomischen Insel auf. Die Größe dieser genomischen Insel beträgt 54 kb und sie umfasst 20 offene Leseraster (ORFs), von denen acht für putative Polyketidsynthasen (PKS), nichtribosomale Peptidsynthasen (NRPS) und Hybride dieser kodieren. Colibactin übt einen zytopathischen Effekt (CPE) auf eukaryotische Zellen in vitro aus. Nach Kokultivierung Colibactin-Gencluster-positiven Bakterien mit eukaryotischen Zellen kommt es zu DNA Doppelstrang Brüchen, Zellzyklus-Arrest in der G2-Phase, Megalozytose und schließlich zum Zelltod. Diese Effekte sind mit denen des Zyklomodulins „Cytolethal Distending Toxin“ (CDT) vergleichbar, allerdings konnte die biologische Funktion des Colibactins in vivo bisher nicht aufgeklärt werden. Das Colibactin-Gencluster wurde bisher nur in Escherichia coli Stämmen der phylogenetischen Gruppe B2 als individuelle genomische Insel, integriert im tRNA-asnW-Gen, vorgefunden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte das Colibactin-Gencluster auch in E. coli der phylogenetischen Gruppe B1 und in Citrobacter koseri, Enterobacter aerogenes und Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae nachgewiesen werden. In diesen Bakterienstämmen ist das Colibactin-Gencluster Teil eines genetischen Elements, das Ähnlichkeit zu integrativen und konjugativen Elementen (ICE) aus E. coli und K. pneumoniae aufweist. Im Gegensatz zur hochkonservierten Integrationsstelle des Colibactin-Genclusters in tRNA-asnW in E. coli der phylogenetischen Gruppe B2 konnte die Integrationsstelle dieses ICE in E. coli der Gruppe B1 in tRNA-asnU bestimmt werden. In Bakterienstämmen der Spezies K. pneumoniae subsp. pneumoniae wurden vier verschiedene Integrationsstellen in fünf analysierten Stämmen identifiziert. Neben der Studien zur Verbreitung und chromosomalen Integration des Colibactin-Genclusters wurden Kolonisierungsstudien im murinen streptomycinbehandelten Intestinaltrakt mit E. coli Stamm Nissle 1917 durchgeführt, um eine mögliche Funktion des Colibactins im Darmtrakt näher zu untersuchen. Weder in nicht-kompetitiven noch in kompetitiven Versuchsdurchführungen konnte dabei ein Kolonisierungsvorteil durch Colibactin nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass das Colibactin-Gencluster in verschiedenen Spezies der Enterobacteriaceae vorhanden und funktional ist. Das Auftreten dieses sowohl als individuelle genomische Insel als auch als Teil eines ICE veranschaulicht die genetische Plastizität dieses Elements und die Bedeutung des horizontalen Transfers genetischen Materials. Die biologische Funktion des Colibactins in vivo bleibt weiterhin unklar und könnte sowohl die bakterielle Fitness als auch die Virulenz beeinflussen.
Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules (CEACAMs) are exploited by human-specific pathogens to anchor themselves to or invade host cells. Interestingly, human granulocytes express a specific isoform, CEACAM3, that can direct efficient, opsonin-independent phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria, Moraxella and Haemophilus species. As opsonin-independent phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria depends on Src-family protein tyrosine kinase (PTK) phosphorylation of the CEACAM3 cytoplasmic domain, we hypothesized that an SH2-containing protein might be involved in CEACAM3-initiated, phagocytosis-promoting signals. Accordingly, we screened glutathione-S-transferase (GST) fusion proteins containing SH2 domains derived from a panel of signaling and adapter molecules for their ability to associate with CEACAM3. In vitro pull-down assays demonstrated that the SH2 domain of the adapter molecule Nck (GST-Nck SH2), but not other SH2 domains such as the Grb2 SH2 domain, interact with CEACAM3 in a phosphotyrosine-dependent manner. Either deletion of the cytoplasmic tail of CEACAM3, or point-mutation of a critical arginine residue in the SH2 domain of Nck (GST-NckSH2R308K) that disrupts phosphotyrosine binding, both abolished CEACAM3-Nck-SH2 interaction. Upon infection of human cells with CEACAM-binding Neisseria, full-length Nck comprising an SH2 and three SH3 domains co-localized with tyrosine phosphorylated CEACAM3 and associated bacteria as analyzed by immunofluorescence staining and confocal microscopy. In addition, Nck could be detected in CEACAM3 immunoprecipitates confirming the interaction in vivo. Importantly, overexpression of a GFP-fusion protein of the isolated Nck SH2 domain (GFP-Nck-SH2), but not GFP or GFP-Nck SH2 R308K reduced CEACAM3-mediated phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria suggesting that the adaptor molecule Nck plays an important role in CEACAM3-initiated signaling leading to internalization and elimination of human-specific pathogens.
Der Erreger der Malaria tropica, Plasmodium falciparum, ist für eine jährliche Todesrate von über einer Million Menschen verantwortlich. Rasch zunehmende Erregerresistenzen gegen gängige Antimalariamedikamente und das Fehlen eines Impfstoffes machen die Suche nach neuen therapeutischen Ansätzen und Medikamenten unerlässlich. Sexualstadienspezifische Oberflächenproteine des Parasiten sind attraktive Zielstrukturen für die Entwicklung von TBV, welche eine Entwicklung von P. falciparum in der Mücke unterbrechen. Die Suche nach multiplen tier- oder bakterienähnlichen, extrazellulären Adhäsionsdomänen im Genom von P. falciparum führte zur Identifizierung einer Familie von sechs Proteinen mit hochkonservierten Adhäsionsmodulen, die vermutlich an Parasit-Parasit- oder Parasit-Wirtsinteraktionen beteiligt sind, was sie zu potentiellen Kandidaten für Komponenten von TBV macht. Aufgrund ihrer gemeinsamen LCCL-Domäne wurden diese Proteine PfCCp1 bis PfCCp5 sowie PfFNPA benannt. PfFNPA besitzt keine LCCL-Domäne, es ist jedoch ähnlich aufgebaut wie PfCCp5 und wurde daher mit in die PfCCp-Familie integriert. Die in der parasitophoren Vakuole reifer Gametozyten lokalisierenden PfCCp1- bis PfCCp3-Proteine werden während der Gametogenese teilweise freigesetzt und umgeben matrixähnlich entstehende Exflagellationszentren. In PfCCp2- und PfCCp3-defizienten Parasiten ist die Wanderung der Sporozoiten aus den Mitteldarmoozysten in die Speicheldrüsen der Mücke blockiert. Sexualstadien-spezifische Expression und eine wichtige Funktion bei der Entwicklung des Erregers in der Mücke sind die Hauptkriterien für potentielle TBV-Kandidaten. Diese viel versprechenden Daten waren Anlass, in der vorliegenden Arbeit, die bisher nur hypothetischen PfCCp5- und PfFNPA-Proteine genauer zu untersuchen. Expressionsstudien von PfCCp5 und PfFNPA mittels RT-PCR, Western-Blot-, Immunfluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopischen-Analysen zeigten, dass sie sowohl plasmamembranassoziiert in der parasitophoren Vakuole als auch intrazellulär in reifen Gametozyten exprimiert werden. Beide Proteine sind in Gameto-zyten ab dem Stadium II detektierbar und weisen in unreifen Gametozyten ein punktiertes Expressionsmuster auf. In reifen Gametozyten konzentriert sich ihre Expression dagegen v. a. auf die Zellpole. Ferner werden PfCCp5 und PfFNPA auf der Oberfläche von Makrogameten, jedoch nicht in Mikrogameten und Ookineten exprimiert. Zusätzlich wird PfCCp5 in einem Teil reifer Schizonten eines gametozyten-bildenden Parasiten-Stammes exprimiert. Durch Integration eines Komplementations-Konstukts in die 3-untranslatierte Region von PfCCp5 bzw. PfFNPA konnte gezeigt werden, dass beide Gene genetisch manipulierbar sind. Mit PfCCp5- bzw. PfFNPA-KO-Konstrukten transfizierte WT-Parasiten wachsen nach erfolgter positiver Selektion jedoch nicht mehr. Diese Daten lassen vermuten, dass PfCCp5 und PfFNPA eine essentielle Funktion in den Blutstadien bzw. bei Gametozytenbildung haben. Zur weiteren Analyse von PfFNPA wurde ein verkürztes Protein durch Integration eines weiteren PfFNPA-KO-Konstrukts in den Locus von WT-Parasiten generiert. Erste Analysen des PfFNPA-KO-Phänotyps deuten darauf hin, dass durch die Ausschaltung der 3’-Region des Gens das Protein nicht mehr korrekt exprimiert wird, obwohl keine morphologischen Veränderungen der Blutstadien des Parasiten feststellbar sind. Außerdem werden PfCCp5 und PfFNPA ko-abhängig in PfCCp1-, PfCCp2- und PfCCp3-KO-Gametozyten exprimiert. Ko-Immunpräzipitationsstudien zeigten, dass beide Proteine mit den anderen PfCCp-Mitgliedern interagieren. Affinitätschromato-graphiestudien deckten dann direkte Interaktionen einzelner PfCCp-Domänen auf. Hierbei sind v. a. die LCCL-, die SR- und die NEC- Domäne an Proteininteraktionen beteiligt, was die Hypothese einer Komplexbildung der PfCCp-Familie während der Gametogenese des Erregers stützt. Transmissionsblockierungsstudien sollen nun die Eignung ausgewählter PfCCp-Proteine als TBV-Komponenten näher beleuchten. Zunehmende Resistenzen gegen gebräuchliche Malariamedikamente veranlassen zur Suche nach neuen Angriffspunkten zur Behandlung der Erkrankung. Die maßgeblich an der Hämoglobinhydrolyse beteiligten plasmodialen Cysteinproteasen Falcipain-2 und Falcipain-3 sind mögliche Ziele für die Entwicklung neuer Antimalariawirkstoffe. In der vorliegenden Arbeit wurden peptidomimetische 1,4-Benzodiazepin- und nicht-peptidische Etacrynsäurederivate in vitro auf ihre antiplasmodiale Wirkung an P. falciparum-Blutstadien getestet. Ein erstes Screening hatte gezeigt, dass die eine Vinylsulfonkopfgruppe tragenden 1,4 Benzodiazepinderivate rekombinant exprimiertes Falcipain-2 irreversibel hemmen. In vitro konnte dann auch eine antiplasmodiale Aktivität für diese Verbindungen festgestellt werden. Dockingstudien und HPLC-Assays mit den Etacrynsäurederivaten deckten eine Hemmung der Cysteinprotease Papain und der SARS-Mpro-Hauptprotease der Coronaviren auf. Weiterhin konnte in einem Screening an rekombinant exprimiertem Falcipain-2 und Falcipain-3 eine inhibitorische Wirkung für einen Teil dieser Etacrynsäurederivate festgestellt werden. Der In-vitro-Test an P. falciparum-Blutstadien deckte dann eine schwache antiplasmodiale Aktivität von fluorsubstituierten Etacrynsäurederivaten und von Derivaten mit einer modifizierten Etacrynsäurepartialstruktur auf. Der viel versprechendste Inhibitor dieser Studie wurde nun zur Identifizierung potentieller Bindungspartner mittels Affinitätsbindungsstudien biotyniliert. Zusammenfassend besitzen beide getesteten Wirkstoffklassen eine inhibierende Aktivität gegenüber Cysteinproteasen womit sie die Grundlage für die Entwicklung neuer, effektiverer plasmodialer Cysteinproteaseinhibitoren bieten.
While clear evidence exists for the direct involvement of cytolysins in the pathogenesis of Gram-positive bacteria, the significance of Gram-negative haemolysins remains unclear. This paper presents briefly data indicating a role for haemolysin production in infections caused by Escherichia coli and also experiments which have allowed an analysis of the molecular basis of the haemolysis among pathogenic and non-pathogenic strains of this species.
Um Änderungen in seiner Umwelt wahrnehmen zu können, benötigt S. aureus unterschiedliche Signaltransduktionssysteme. In dieser Arbeit wurde erstmals die Eukaryoten-ähnliche Serin/Threonin-Proteinkinase (STPK) PknB umfassend charakterisiert. Die posttranslationale Proteinmodifikation mittels Phosphorylierung spielt sowohl in Eukaryoten als auch in Prokaryoten eine wichtige Rolle. Man glaubte lange, dass die Phosphorylierung von Serin-, Threonin- und Tyrosinresten ein nur auf Eukaryoten beschränkter Regulationsmechanismus ist. Dagegen wurde die Phosphorylierung an Histidin- und Aspartatresten durch die Zweikomponenten-Systeme allein den Prokaryoten zugeordnet. Die Genomanalysen der letzten Jahre identifizierten jedoch STPKs und Serin/Threonin-Proteinphosphatasen (STPP) in nahezu allen prokaryotischen Genomen. Auch S. aureus codiert für eine STPK, die eine hohe Homologie zu den beschriebenen STPKs aufweist. In dieser Arbeit wurden mittels Microarray-Analyse einer ΔpknB-Mutante im Stamm 8325 erste Hinweise zur Funktion von PknB als Regulator der Zellwandsynthese sowie zentraler Stoffwechselwege gewonnen. Es wurden mittels Phosphopreoteom-Analysen in vivo-Substrate identifiziert und weiterhin die Kinase biochemisch charakterisiert.
Streptococcus pneumoniae (pneumococci) are Gram-positive bacteria and commensals of the nasopharyngeal cavity. Besides colonization, pneumococci are responsible for severe local infections such as otitis media, sinusitis and life-threatening invasive diseases, including pneumonia, sepsis and meningitis. The surface of pneumococci is decorated with proteins that are covalently or non-covalently anchored to the cell wall. The most unique group of cell wall associated proteins in pneumococci are the choline-binding proteins (CBPs). PspC, also known as SpsA or CbpA, is a multifunctional choline-binding protein that plays an essential role in pneumococcal pathogenesis by functioning as an adhesin. PspC promotes adherence of pneumococci to mucosal epithelial cells by interacting in a human specific manner with the free secretory component (SC) or to SC as part of the secretory IgA (SIgA) or polymeric immunoglobulin receptor (pIgR). PspC also interacts specifically with the soluble complement Factor H. Apparently, PspC uses two different epitopes for binding the soluble host protein Factor H and SC of pIgR. However, the mechanism by which these independent interactions facilitate pneumococcal infections under physiological and host specific conditions have not yet been completely elucidated. This study aims to explore the impact of the PspC interaction with human pIgR (hpIgR) or complement regulator Factor H on pneumococcal virulence. Here the cellular and molecular basis of PspC-mediated adherence to and invasion of host epithelial and endothelial cells was demonstrated. The genetic approach, specific pharmacological inhibitors and immunoblot analysis demonstrated the complexity of the induced signal transduction pathways during PspC-hpIgR mediated pneumococcal uptake by host cells. Inhibition studies with specific inhibitors of actin cytoskeleton and microtubules demonstrated that the dynamics of host cell cytoskeleton are essential for pneumococcal uptake by mucosal epithelial cells. Moreover, this study reports for the first time that the small GTPase Cdc42 is essential for pneumococcal internalization into epithelial cells via the PspC-hpIgR mechanism. In addition, in infection experiments performed in presence of specific inhibitors of PI3-kinase/Akt and protein tyrosine kinase (PTKs), hpIgR-mediated pneumococcal uptake by host cells was significantly blocked. Amongst PTKs the Src kinase pathway, ERK1/2 and JNK pathways were implicated during pneumococcal ingestion by hpIgR expressing cells. In addition, inhibition experiments performed in the presence of individual inhibitors or with a combination of inhibitors suggested the independent activation of PI3-kinase/Akt and Src kinase pathways during pneumococcal infections of hpIgR expressing cells. By employing specific inhibitors and siRNA in cell culture infection experiments it was further demonstrated that pneumococcal endocytosis by host epithelial cells via the PspC-hpIgR mechanism depends on clathrin and dynamin. PspC recruits also Factor H to the pneumococcal cell surface. Consequently, the impact of pneumococcal cell surface bound Factor H on adherence to host cells and the molecular mechanism facilitating the uptake of Factor H bound pneumococci by epithelial cells was investigated. Flow cytometry and immunoblots revealed that S. pneumoniae has evolved the ability to recruit both purified Factor H as well as Factor H from human plasma or serum. Moreover, it was demonstrated that the recruitment of Factor H is independent of the PspC-subtypes and that capsular polysaccharide (CPS) interferes with its recruitment. Factor H bound to pneumococci significantly increased bacterial attachment to and invasion of host epithelial cells including nasopharyngeal cells (Detroit562), lung epithelial cells (A549), and human brain-derived endothelial cells (HBMEC). Blocking experiments demonstrated that bacteria bound Factor H interacts via the heparin binding sites on Factor H with eukaryotic cell surface glycosaminoglycans and that this interaction promotes pneumococcal adherence to host cells. In addition, inhibition studies with mAbs recognizing specifically different short consensus repeats (SCR) of Factor H suggested that SCR 19-20 of Factor H are essential for the pneumococcal interaction with host epithelial cells via Factor H. In the presence of Factor H, attachment of pneumococci to human polymorphonuclear leukocytes (PMNs) is enhanced. The integrin CD11b/CD18 was identified as the cellular receptor on PMNs. By using pharmacological inhibitors the impact of host cell cytoskeleton and signalling molecules, such as PTKs and PI3-kinase, for Factor H-mediated pneumococcal internalization into eukaryotic cells was shown. Taken together, the results revealed that Factor-H mediated pneumococcal infection requires a concerted role of host epithelial cell surface glycosaminoglycans, integrins and host cell signalling pathways.
During a study of the nutritional requirements of clinical isolates of Escherichia coli, we found that 21 (7.0%) of 301 strains required nicotinamide to grow in minimal medium. The nicotinamide- requiring strains were present in 16 (15.8%) of 101 cultures of urine from young women with acute cystitis, in 5 (5.0%) of 100 stool specimens from healthy adults, and in none of 100 blood samples from adult patients with bacteremia. Most of the strains belonged to serogroup OI8:KI:H7, were hemolytic, possessed type I fimbriae, and exhibited similar patterns of antibiotic susceptibility. Two of the urinary isolates expressed S fimbriae, and all 16 urinary isolates contained the s/aS homologue gene on their chromosomes. One of the stool isolates contained the s/aS gene. The urinary isolates closely resembled a large clone of E. coli that is reportedly associated with neonatal meningitis and sepsis. It may be possible to detect this and related clones by their requirement for nicotinamide and to screen strains for S fimbriae by relatively inexpensive hemagglutination methods, including the use of avian PI antigens to detect mannose- resistant, non-P-fimbriated E. coli; the agglutination of bovine erythrocytes; and the use of bovine mucin to detect sialyl galactosides in S fimbriae.
Over a period of 3 years, Legionella pneumophila serogroup 6 strains were isolated from warm water outlets and dental units in the Dental Faculty and from the Surgery and Internal Medicine Clinics at the University of Dresden, Dresden, Germany. In the bacteriological unit of the above-mentioned facility, L. pneumophila serogroups 3 and 12 were grown frl,)m warm water specimens. The medical facilities are located in separate buildings connected with a ring pipe warm water system. All L. pneumophila serogroup 6 strains isolated from the warm water supply reacted with a serogroup-specific monoclonal antibody, but not with two other monoclonal antibodies which are subgroup specific, reacting with other serogroup 6 strains. The NolI genomic profiles obtained by pulsed-field gel electrophoresis of 25 serogroup 6 strains isolated from the Dental Faculty over a 3-year period, 1 isolate from the Internal Medicine Clinic, and 4 strains from the Surgery Clinic were identical. Furthermore, all these strains hybridized with a 3OO-kb NolI fragment when a legiolysin (lIy)-specific DNA probe was used. The NolI pattern, however, differed from those of six serogroup 6 strains of other origins, one serogroup 12 strain from the bacteriological unit, and another six unrelated strains of serogroups other than serogroup 6. L. pneumophila serogroup 6 strains which can be divided into only two subgroups by the use of monoclonal antibodies are differentiated in at least six Noli cleavage types obtained by pulsed-field electrophoresis.
F 1 C fimbriae allow uropathogenic Escherichia coli to adhere to specific epithelial surfaces. This adhesive property is probably due to the presence of minor fimbrial components in F1C fimbriae. The foe gene cluster encoding F1C fimbriae has been cloned, as described previously. Here we present the nucleotide sequence (2081 bp) coding for the F 1 C minor fimbria I subunits. The structural genes code for polypeptides of 175 (FocF), 166 (FocG), and 300 (FocH) amino acids. The deduced amino acids of the F 1 C minor subunits were compared with the reported sequences of the minor subunits of other types of fimbriae. The data show that the Foc minor subunits are highly homologous to the corresponding Sfa proteins, whereas homology to the minor subunits of type 1 and P fimbriae is much lower.
Die MHK-Werte von Desacetylcefotaxim gegen verschiedene, z. T. ampicillinresistente Stämme von Escherichia coH, die mit Hilfe einer Agardilutionsmethode erhoben wurden, waren höher als die von Cefotaxim und Ceftriaxon, jedoch niedriger als die von Cefoxitin. In einem Modell der systemischen Infektion der Maus mit einem plasmidtragenden, betalactamaseproduzierenden Stamm von E. coli führte die Therapie mit Desacetylcefotaxim zu einer starken Reduktion der Keime pro Leber. Im Vergleich zur Therapie mit Cefotaxim trat die protektive Wirkung aber verlangsamt ein. Desacetylcefotaxim ist also kein unnützes Abbauprodukt von Cefotaxim.
The \(\alpha\)-Sialyl-\(\beta\) 2-3-Galactosyl-specific adhesin (S adhesin) was isolated from cells of a recombinant Escherichia coli K-12 strain expressing the S-flmbrial adhesin complex. A crude cell extract was partiaUy dissociated into fimbriae and an adhesin-enriched fraction by heating to 7O°C. From the latter, adhesin was purified to apparent homogeneity (by fast protein liquid chromatography, immunoblot, and NaDodSO\(_4\)/PAGE) by differential ammonium sulfate precipitation, dissociation in 8 M guanidine hydrochloride, and high-resolution anion-exchange chromatography in 8 M urea. The purified adhesin formed an aggregate of M\(_r\)\(\approx\)10\(^6\) that was made up of one type of 12-kDa polypeptide (fimbrillin is 16.5 kDa). It had pI value of 4.7 (fimbriae has a pI value of 6). Adhesin and fimbrillin had different amino add compositions. The purified adhesins agglutinated human and bovine erythrocytes with the same speclfkity as the whole bacteria; purified fimbriae were not adhesive. Monoclonal anti-adhesin and anti-fimbriae antibodies were obtained. Monoclonal antiadhesin, but none of the anti-fimbriae, antibodies inhibited the agglutination of erythrocytes. The anti-adhesive antibodies were used in immuno-gold electron microscopy to localize adhesin exclusively on the fimbriae, with a possible preference to their tips.
Results of molecular and pathogenic studies of three different bacterial hemolysins (cytolysins) are presented. These exoproteins derive from the two gram-negative bacteria Escherichia coli and Aeromonas hydrophila and from the gram-positive pathogen Listeria monocytogenes. The hemolysin of E. coli is determined by an 8-kilobase (kb) region that includes four clustered genes (hlyC, hlyA, hlyB, and hlyD). This hemolysin determinant is part either of large transmissible plasmids or of the chromosome. The genes located chromosomally are found predominantly in E. coli strains that can cause pyelonephritis and/or other extraintestinal infections. A detailed analysis of the chromosomal hly determinants of one nephropathogenic E. coli strain revealed the existence of specific, large chromosomal insertions 75 kb and lOO kb in size that carry the hly genes but that also influence the expression of other virulence properties, i.e., adhesion and serum resistance. The direct involvement of E. coli hemolysin in virulence could be demonstrated in several model systems. The genetic determinants for hemolysin (cytolysin) formation in , A. hydrophila (aerolysin) and L. monocytogenes (listeriolysin) are less complex. Both cytolysins seem to be encoded by single genes, although two loci (aerB and aerC) that affect the expression and activity of aerolysin have been identified distal and proximal to the structural gene for aerolysin (aerA). Cytolysin-negative mutants of both bacteria were obtained by site-specific deletion and/or transposon mutagenesis. These mutants show a drastic reduction in the virulence of the respective bacteria.
A new mouse model for systemic infection with Escherichia coli is presented. Whereas in other models 107_108 bacteria have to be injected into an animal to induce toxic effects resulting in death within 24 hours, now, only 103_104 bacteria of an appropriate strain are required to produce a genuine infection characterized by an increase in the bacterial load over several days. The quantitative determination of bacterial counts per liver allows a more sensitive measurement than recording death rates. Furthermore, few animals are required for a definite result in contrast to the LDso determination of other models. The salient point regarding this new model is that conditioning of animals has to be achieved by incorporating the inoculum into agar which is injected subcutaneously. The resulting infection is completely dependent on the E. colicondistrain used. Whereas a hemolytic, uropathogenic strain is so virulent that an overwhelming infection develops within 48 hours after the injection of 103 bacterial cells, a non-hemolytic variant of this strain is completely avirulent, being unable to multiply in spite of the potentiating agar. The hemolytic E. coli strain ATCC 25922 is intermediate in virulence. The bacterial counts per liver increase steadily until death occurs five to seven days after the injection of 104 bacteria. This bacterial infection can be therapeutically influenced by daily treatment with various drugs. Ciprofloxacin, ceftriaxone and co-trimoxazole are able to cure the infection, whereas amoxicillin given orally is only moderately active against this ATCC strain, which is relatively resistant to amoxicillin.
Like all other Salmonella typhimurium strains examined, the smooth variants SF1397 (L T2) and 1366 and also their semi-rough and rough derivatives are non-haemolytic. Nevertheless, two haemolysin (Hly) plasmids of E. coli belonging to the inc groups incFllI,lv (pSU316) and incIz (pHly152) were able to be introduced into these strains by conjugation and stably maintained. A considerable percentage of the Hly+ transconjugants obtained had lost parts of their O-side chains, a result of selection for the better recipient capability of « semi-rough» variants rather than the direct influence of the Hly+ plasmids themselves. In contrast to the incF1lI1V plasmid pSU316, which exhibited higher conjugation rates with rough recipients, the incIz plasmid pHly152 was accepted best by smooth strains. Transformation with cloned E. coli haemolysin (hly) determinant was inefficient ( <10-8) for smooth strains, but 102-103 times higher for rough recipients, and was increased by the use of Salmonella-modified DNA. The transform ants and transconjugants were relatively stable and showed the same haemolytic activity as the E. coli donor strains. The virulence of the Hly+ smooth, semi-rough and rough S. typhimurium strains was tested in two mouse models, and neither the mortality rate nor the ability to multiply within the mouse spleen was influenced by the hly determinants.
The 06 serogroup Escherichia coli strain 536 carries two hemolysin (hly) determinants integrated into the chromosome. The two hly determinants are not completely identical, either functionally or structurally, as demonstrated by spontaneous deletion mutants carrying only one of them and by cloning each of the two determinants separately into cosmid vectors. Each hly determinant is independently deleted at a frequency of 10-4 , leading to variants which exhibit similar levels of internal hemolysin but different amounts of secreted hemolysin. The two hly determinants were also identified in the 04 E. coli strain 519. The three E. coli strains 251, 764, and 768, which belong to the serogroup 018, and the 04 strain 367 harbor a single chromosomal hly determinant, as demonstrated by hybridization with hly-gene-specific probes. However, a hybridization probe derived from a sequence adjacent to the hlyC-proximal end of the plasmid pHlyl52-encoded hly determinant hybridizes with several additional chromosomal bands in hemolytic 018 and 06 E. coli strains and even in E. coli K-12. The size ofthe probe causing the multiple hybridization suggests a 1,500- to 1,800-base pair sequence directly flanking hlyC. Spontaneous hemolysin-negative mutants were isolated from strains 764 and 768, which had lost the entire hly determinant but retained all copies of the hlyC-associated sequence. This sequence is not identical to a previously identified (J. Hacker, S. Knapp, and W. Goebel, J. Bacteriol. 154:1145-1154, 1983) somewhat smaller (about 850 base pairs) sequence flanking the other (hlyBb-proximal) end of the plasmid pHlyl52-encoded hly determinant which, as shown here, exists also in multiple copies in these hemolytic E. coli strains and in at least two copies in E. coli K-12. In contrast to the plasmid-encoded hly determinant which is directly flanked at both ends by these two diJJerent sequences, the chromosomal hly determinants are not immediately flanked by such sequences.
The hemolytic Escherichia coli strain 536 (06) propagates spontaneous hemolysin- negative mutants at relatively high rates (10-3 to 10-4 ). One type of mutant (type I) lacks both secreted (external) and periplasmic (internal) hemolysin activity (HlYex - IHlYin -) and in addition shows no mannose-resistant hemagglutination (Mrh -), whereas the other type (type II) is HlYex -IHIYin + and Mrh +. The genetic determinants for hemolysin production (hly) and for mannose-resistant hemagglutination (mrh) of this strain are located on the chromosome. Hybridization experiments with DNA probes specific for various parts of the hly determinant reveal that mutants of type I have lost the total hly determinant, whereas those of type 11 lack only part of the hlyB that is essential for transport of hemolysin across the outer membrane. Using a probe that contains the end sequence of the plasmid pHly152-encoded hly determinant (adjacent to hlyB), we determined that a related sequence flanks also the hlyB-distal end of the chromosomal hly determinant of E. coli 536. In addition several other similar or even identical sequences are found in the vicinity of the hlyC- and the hlyB-distal ends of both the chromosomal and the plasmid hly determinants.
We have cloned the chromosomal hemolysin determinants from Escherichia coli strains belonging to the four O-serotypes 04, 06, 018, and 075, The hemolysin-producing clones were isolated from gene banks of these strains which were constructed by inserting partial Sau3A fragments of chromosomal DNA into the cosmid pJC74. The hemolytic cosmid clones were relatively stable. The inserts were further sub cloned either as Sail fragments in pACYC184 or as BamHI-SaLI fragments in a recombinant plasmid (pANN202) containing cistron C (hlye) of the plasmid-encoded hemolysin determinant. Detailed restriction maps of each of these determinants were constructed, and it was found that, despite sharing overall homology, the determinants exhibited minor specific differences in their structure, These appeared to be restricted to cistron A (hlyA), which is the structural gene for hemolysin. In the gene banks of two of these hemolytic strains, we could also identify clones which carried the genetic determinants for the mannose-resistant hemagglutination antigens Vb and VIc. Both of these fimbrial antigens were expressed in the E. coli K-12 clones to an extent similar to that observed in the wild-type strains. These recombinant cosmids were rather unstable, and, in the absence of selection, segregated at a high frequency.
The role of macrophages in primary and secondary infection of mice with Salmonella typhimurium
(1982)
Elimination of macrophages with high-molecular dextran sulphate (OS) markedly impairs resistance of mice to primary infection with smooth, virulent strains of Salmonella typhimurium, whereas stimulation of this system by killed Bordetella pertussis organisms increases resistance. In infection with rough, avirulent strains of S. iyphimurium the elimination of macro phages was not followed by an essential loss of resistance, and it appears that other non-specific defence mechanisms, for example the complement system, may have compensated for the lack of macrophages. Macrophages, therefore, play an important role in defence during primary infection with virulent strains. In immunity to challenge infection with S. typhimurium, macrophages play an even more significant role. Treatment with OS completely removes immunity, and both humoral and cell-mediated immune mechanisms seem to require the participation of macrophages.
Recent progresses and developments in molecular biology provide a wealth of new but insufficiently characterised data. This fund comprises amongst others biological data of genomic DNA, protein sequences, 3-dimensional protein structures as well as profiles of gene expression. In the present work, this information is used to develop new methods for the characterisation and classification of organisms and whole groups of organisms as well as to enhance the automated gain and transfer of information. The first two presented approaches (chapters 4 und 5) focus on the medically and scientifically important enterobacteria. Its impact in medicine and molecular biology is founded in versatile mechanisms of infection, their fundamental function as a commensal inhabitant of the intestinal tract and their use as model organisms as they are easy to cultivate. Despite many studies on single pathogroups with clinical distinguishable pathologies, the genotypic factors that contribute to their diversity are still partially unknown. The comprehensive genome comparison described in Chapter 4 was conducted with numerous enterobacterial strains, which cover nearly the whole range of clinically relevant diversity. The genome comparison constitutes the basis of a characterisation of the enterobacterial gene pool, of a reconstruction of evolutionary processes and of comprehensive analysis of specific protein families in enterobacterial subgroups. Correspondence analysis, which is applied for the first time in this context, yields qualitative statements to bacterial subgroups and the respective, exclusively present protein families. Specific protein families were identified for the three major subgroups of enterobacteria namely the genera Yersinia and Salmonella as well as to the group of Shigella and E. coli by applying statistical tests. In conclusion, the genome comparison-based methods provide new starting points to infer specific genotypic traits of bacterial groups from the transfer of functional annotation. Due to the high medical importance of enterobacterial isolates their classification according to pathogenicity has been in focus of many studies. The microarray technology offers a fast, reproducible and standardisable means of bacterial typing and has been proved in bacterial diagnostics, risk assessment and surveillance. The design of the diagnostic microarray of enterobacteria described in chapter 5 is based on the availability of numerous enterobacterial genome sequences. A novel probe selection strategy based on the highly efficient algorithm of string search, which considers both coding and non-coding regions of genomic DNA, enhances pathogroup detection. This principle reduces the risk of incorrect typing due to restrictions to virulence-associated capture probes. Additional capture probes extend the spectrum of applications of the microarray to simultaneous diagnostic or surveillance of antimicrobial resistance. Comprehensive test hybridisations largely confirm the reliability of the selected capture probes and its ability to robustly classify enterobacterial strains according to pathogenicity. Moreover, the tests constitute the basis of the training of a regression model for the classification of pathogroups and hybridised amounts of DNA. The regression model features a continuous learning capacity leading to an enhancement of the prediction accuracy in the process of its application. A fraction of the capture probes represents intergenic DNA and hence confirms the relevance of the underlying strategy. Interestingly, a large part of the capture probes represents poorly annotated genes suggesting the existence of yet unconsidered factors with importance to the formation of respective virulence phenotypes. Another major field of microarray applications is gene expression analysis. The size of gene expression databases rapidly increased in recent years. Although they provide a wealth of expression data, it remains challenging to integrate results from different studies. In chapter 6 the methodology of an unsupervised meta-analysis of genome-wide A. thaliana gene expression data sets is presented, which yields novel insights in function and regulation of genes. The application of kernel-based principal component analysis in combination with hierarchical clustering identified three major groups of contrasts each sharing overlapping expression profiles. Genes associated with two groups are known to play important roles in Indol-3 acetic acid (IAA) mediated plant growth and development as well as in pathogen defence. Yet uncharacterised serine-threonine kinases could be assigned to novel functions in pathogen defence by meta-analysis. In general, hidden interrelation between genes regulated under different conditions could be unravelled by the described approach. HMMs are applied to the functional characterisation of proteins or the detection of genes in genome sequences. Although HMMs are technically mature and widely applied in computational biology, I demonstrate the methodical optimisation with respect to the modelling accuracy on biological data with various distributions of sequence lengths. The subunits of these models, the states, are associated with a certain holding time being the link to length distributions of represented sequences. An adaptation of simple HMM topologies to bell-shaped length distributions described in chapter 7 was achieved by serial chain-linking of single states, while residing in the class of conventional HMMs. The impact of an optimisation of HMM topologies was underlined by performance evaluations with differently adjusted HMM topologies. In summary, a general methodology was introduced to improve the modelling behaviour of HMMs by topological optimisation with maximum likelihood and a fast and easily implementable moment estimator. Chapter 8 describes the application of HMMs to the prediction of interaction sites in protein domains. As previously demonstrated, these sites are not trivial to predict because of varying degree in conservation of their location and type within the domain family. The prediction of interaction sites in protein domains is achieved by a newly defined HMM topology, which incorporates both sequence and structure information. Posterior decoding is applied to the prediction of interaction sites providing additional information of the probability of an interaction for all sequence positions. The implementation of interaction profile HMMs (ipHMMs) is based on the well established profile HMMs and inherits its known efficiency and sensitivity. The large-scale prediction of interaction sites by ipHMMs explained protein dysfunctions caused by mutations that are associated to inheritable diseases like different types of cancer or muscular dystrophy. As already demonstrated by profile HMMs, the ipHMMs are suitable for large-scale applications. Overall, the HMM-based method enhances the prediction quality of interaction sites and improves the understanding of the molecular background of inheritable diseases. With respect to current and future requirements I provide large-scale solutions for the characterisation of biological data in this work. All described methods feature a highly portable character, which allows for the transfer to related topics or organisms, respectively. Special emphasis was put on the knowledge transfer facilitated by a steadily increasing wealth of biological information. The applied and developed statistical methods largely provide learning capacities and hence benefit from the gain of knowledge resulting in increased prediction accuracies and reliability.
We have developed a reliable and sensitive immunohistochemical staining technique which allows the simultaneous demonstration of two different antigens expressed in or on the same cell (referred to as mixed labeling), together with the evaluation of the general histopathological appearance of the tissue. The staining procedure combines a three-step (streptavidin-biotin) immunogold-silver staining (IGSS) with a three-step immunoenzymatic labeling. For this purpose, we investigated the compatibility ofIGSS with various substrates of peroxidase or alkaline phosphatase (AP). Highly reliable and discernible mixed labeling was achieved only after iniriallabeling with IGSS followed by AP labeling using the substrates naphthol AS-MX phosphate/Fast Blue or naphthol AS-HI phosphate/New Fuchsin, respectively. To ensure utmost specificity, we applied FlTC-conjugated mouse monoclonal antibodies and rabbit anti-FlTC immunoglobulins visualized by AP-labeled immunoglobulins and the respective substrate in a final step. This novel approach provides an excellent means for demonstration of immunocompetent cells and unequivocal determination of the percentage of specific cell subsets in infiltrated tissue. The advantages of this method, as compared with double immunofluorescence or double immunoenzymatic labeling, were investigated and are discussed. (J Histochem Cytochem 38:307-313, 1990)
Human B cells appropriately activated by a B cell mitogen are rendered susceptible to human Interleukin 2 (IL-2) as demonstrated with recombinant human IL-2 (rec. h IL-2). They show increased proliferation and drastically enhanced immunoglobulin secretion. Susceptibility to IL-2 is accompanied with the expression of the IL-2 receptor (Tac antigen) on B cells. The data suggest that IL-2 is one of the lymphokines directly involved in the activation of B lymphocytes.
In this study the effect of recombinant human interleukin 2 (rec.hIL-2) on the proliferation and maturation of B lymphocytes was investigated. It was found that the presence of rec.hIL 2 results in proliferation of mitogen (LPS)-activated B cell blasts. In addition, it is shown that highly enriched murine B cells can be induced by rec.hIL-2 to proliferate and to develop into antibody-secreting cells (PFC) in the presence of antigen (SRBC). When tested for its effect on B cell preparations enriched for resting (small) or activated (blasted) B lymphocytes, it was found that rec.hIL 2 provides signals for both B cell populations to develop into PFC. In contrast, induction of proliferation by the same lymphokine source was only seen in blasted B cells. The data indicate that IL 2 is involved in the generation of B effector cells by directly acting on their precursors thereby providing differentiation as well as proliferation signals.
H-Y-specific and H-2Db-restricted, Lyt-1 "2+ T-cell clones (CTLL) with graded specific cytotoxic activities on male C57BL/6 (B6) target cells (1E3, +++; 2C5, ++; 2A5, +, 3E6, ±) were tested for their capacity to inhibit the generation of H-Y-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) in vitro. Addition of irradiated lymphocytes of CTLL 1E3 and CTLL 3E6 but not those of CTLL 2A5 or CTLL 2C5 abolished the generation of CTL from in vivo primed H-Y-specific precursor cells (CTLP) when added to fresh mixed-lymphocyte cultures (MLC). Exogenous sources of T-cell growth factors (TCGF) did not overcome suppression. Rather the presence of TCGF resulted in a further enhancement of suppressive activities in CTLL 1E3 and 3E6 and the induction of similar activities in cells from CTLL 2A5 and 2C5, which by themselves were not inhibitory. Moreover when added to similar MLC on Day 1 instead of Day 0, only irradiated cells of CTLL 3E6 but not those of the other three CTLL were suppressive. Induction of suppressive activities in H-Y-specific CTLL was independent of the appropriate male stimulator cells since it was also observed in MLC induced by irrelevant antigens (H-2, trinitrophenol). Furthermore at low cell numbers, irradiated lymphocytes from any of the CTLL consistently enhanced CTL activities generated from H-Y-specific CTLP. This augmenting activity, which was not TCGF, could be transferred by soluble mediators present in antigen-sensitized CTLL cultures. Thus, these data indicate (i) that cytotoxic effector cells can function as suppressor cells in the generation of CTL, (ii) that the cytotoxic activity of cloned CTL does not correlate with their capacity to suppress CTL responses, (iii) that the inhibition of CTL responses by CTLL is not due to simple consumption of T-cell growth factors produced in MLC, and (iv) that different CTL clones may interfere with the generation of CTL at different stages of their maturation. Moreover, the experiments suggest an antigen-independent enhancement of suppression by the interaction of CTL with lymphokines. Together with the augmenting activity evoked by cloned CTL the data provide strong evidence for the expression of multiple immunological functions by one particular subset of T cells and suggest that cytotoxic effector cells can differentially regulate the maturation and/or clonal expression of their precursor cells.
Mouse H-Y-specific and I-Ab restricted T-cell clones have been established and compared for their helper effects in the differentiation ofboth T and B Iymphocytes. The results demonstrate that three individual T -cell clones and one subclone could help in the antigen-driven induction of cytotoxic Iymphocytes (CTL) from their precursor cells (CTL-P), and were able to activate B cells to develop into antibody-secreting cells (PFC) in the presence of SRBC, provided the cloned T cells were restimulated by H-Y antigen on antigen-presenting cells. In addition, antigen or lectin could induce the same H -Y -specific T -cell clones to secrete factor(s) expressing helper activities similar to that ofthe cloned T cells. Furthermore, it is shown that the T cell-derived soluble mediator(s) was distinct from T-cell growth factor (TCGF) and from immune interferon (lFN-y). The data reveal a new type ofT cell with helper potential for the activation ofCTL-P and B Iymphocytes, and suggest the existence of distinct T helper cells which can provide help for both cytotoxic and antibody responses by virtue of different Iymphokine activities.
We have recently demonstrated that the frequency ofT cells expressing granzyme A is significantly higher in skin lesions and spleens of susceptible BALB/c mice compared with resistant C57BL/6 mice infected with Leishmania major, a cause of human cutaneous leishmaniasis. In the present study, we have performed in vitro studies to characterize the subpopulation, the antigen responsiveness and the lymphokine production pattern of granzyme A-expressing T cells in L. major-infected mice. Using a limiting dilution system for functional analysis of selected T cells at the clonallevel, we could show that granzyme A activity in infected BALB/c mice can be assigned to L. major-reactive CD4\(^+\) T cells secreting interleukin-2 (IL-2) and IL-4. Granzyme A production was most pronounced in the early phase of infection. On the other hand, granzyme A expression could not be detected in C57BL/6-derived T cells responding to L. major. The da ta support the suggestion that granzyme A is produced by L. major-responsive CD4\(^+\) T cells facilitating lesion formation and the dissemination of infection.
Schwämme (Phylum Porifera) sind der älteste rezente Tierstamm der Erde. Insbesondere marine Vertreter dieser sessilen Invertebraten sind oftmals mit einem mikrobiellen Konsortium assoziiert, welches hochgradig wirtsspezifisch und phylogenetisch divers ist. Die Biomasse dieser Mikroflora kann dabei rund die Hälfte der Masse eines Schwamms ausmachen. Die Komplexität des Konsortiums sowie der Mangel an kultivierbaren Vertretern der Schwamm-spezifischen Kladen erschwert dabei eine gezielte funktionelle Charakterisierung. Von besonderem Interesse hierbei ist das exklusiv in marinen Schwämmen vorzufindende Candidatus Phylum Poribacteria, für das bislang kein kultivierter Vertreter vorliegt. Die metabolisch aktiven und hochabundanten Poribakterien liegen in der extrazellulären Matrix des Schwammes vor und zeichnen sich durch das Vorhandensein einer Nukleoid-ähnlichen intrazellulären Struktur aus. Ziel dieser Promotionsarbeit war es, neue Einzelzell-basierte Methoden auf das Gebiet der funktionellen Charakterisierung von Bakterien anzuwenden, welche spezifisch mit dem mediterranen Schwamm Aplysina aerophoba assoziiert sind. Dabei wurden sowohl kultivierungs-abhängige, als auch kultivierungs-unabhängige Versuchsansätze verfolgt. Das Hauptaugenmerk dieser Studien lag dabei auf dem Candidatus Phylum Poribacteria. Während auf dem ‚dilution-to-extinction‘-Prinzip beruhende Hochdurchsatz-Kultivierungen nicht zum Erhalt einer Schwammsymbionten-Reinkultur führten, konnten durch eine Kombination aus FACS-Vereinzelung von Schwamm-assoziierten Bakterien und anschließenden Einzel-Genom-Amplifizierungen (‚whole genome amplifications‘) umfassende Einblicke in die metabolischen Kapazitäten von Schwammsymbionten gewonnen werden. Ferner gelang durch die Anwendung dieser neuen kultivierungs-unabhängigen Methode eine spezifische Verknüpfung von Phylogenie und Funktion Schwamm-assoziierter, nicht-kultivierbarer Bakterien. So konnte im Rahmen dieser Dissertation eine neue nicht-ribosomale Peptidsynthetase (NRPS) einem Vertreter einer Schwamm-spezifischen Chloroflexi-Klade zugewiesen werden. Ferner gelang die Zuordnung einer exklusiv in marinen Schwämmen vorgefundenen Polyketidsynthase (Sup-PKS) zu den Poribacteria. Die Klonierung von hochmolekularer, Einzel-Genom-amplifizierter DNA in Cosmide gewährte zudem Einblicke in den genomischen Kontext dieser, mit dem bakteriellen Sekundärmetabolismus assoziierten Gene. Die Pyrosequenzierung eines amplifizierten, von einem einzelnen Poribakterium abstammenden Genoms führte zudem zum Erhalt von rund zwei Megabasen an genetischer Information über diese Schwammsymbionten. Dadurch wurden detaillierte Informationen über den poribakteriellen Primär- und Sekundärstoffwechsel gewonnen. Die Auswertung der automatisch annotierten 454-Daten erlaubte die Rekonstruktion von Stoffwechselwegen, so z.B. der Glykolyse oder des Citratzyklus und bestätigte das Vorhandensein eines Sup-PKS-Gens im poribakteriellen Genom. Ferner konnten Gemeinsamkeiten mit den Schwesterphyla Planctomycetes, Chlamydiae und Verrucomicrobia gefunden werden. Zudem zeigte die vergleichende Analyse mit einem poribakteriellen Referenzklon aus einer bestehenden Metagenombank die genomische Mikroheterogenität innerhalb dieses Phylums. Nicht zuletzt konnte die Auswertung der poribakteriellen 454-Sequenzierung eine Reihe von möglichen Symbiose-Determinanten aufdecken, die beispielsweise am Austausch von Metaboliten zwischen den Interaktionspartnern beteiligt sind. Die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit stellen die Basis für eine gezielte und detaillierte funktionelle Beschreibung einzelner Bakterien innerhalb komplexer mikrobieller Konsortien dar, wie sie in marinen Schwämmen vorzufinden sind. Dieser Studie gewährte erstmalig umfassende Einblicke in das genomische Potential der nicht-kultivierten, Schwamm-assoziierten Poribacteria. Weiterführende Einzelzell-basierte Experimente werden in Zukunft dazu beitragen, das Bild von der Interaktion zwischen Bakterien und eukaryontischen Wirten zu komplettieren.
Multizelluläre Gemeinschaften in Form bakterieller Biofilme stellen aus medizinischer Sicht ein großes klinisches Problem dar. Häufig lassen sich chronische oder rezidivierende Erkrankungen aber auch nosokomiale Infektionen auf die multizelluläre Lebensweise von humanpathogenen Erregern zurückführen. Sowohl fakultativ als auch obligat pathogene Escherichia coli-Stämme besitzen eine Vielzahl unterschiedlicher Faktoren, die die Biofilmbildung beeinflussen. Daran beteiligt sind unter anderem Flagellen, extrazelluläre polymere Substanzen, Adhäsine oder Oberflächen-assoziierte Proteine wie Autotransporter. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die funktionale Charakterisierung des Proteins Antigen 43 (Ag43). Aufgrund seiner Autoaggregation-vermittelnden Eigenschaft trägt Ag43 ebenfalls zur Mikrokoloniebildung und Biofilmreifung bei. Antigen 43 ist ein Autotransporterprotein, welches innerhalb der Bakterienspezies Escherichia coli weit verbreitet ist. Interessanterweise besitzen viele E. coli-Isolate gleich mehrere identische oder ähnliche Kopien von agn43, die in der Regel von variablen Genombereichen (genomische Inseln, Plasmide) kodiert werden. Am Beispiel der Antigen 43-Varianten des uropathogenen Escherichia coli (UPEC)-Stammes 536 (O6:K15:H31), des kommensalen E. coli Isolats Nissle 1917 (O6:K5:H1) sowie des E. coli K-12-Laborstammes MG1655 (OR:H48:K-) ist die Bedeutung des Autotransporterproteins im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht worden. Hierfür wurden die verschiedenen agn43-Allele in ein geeignetes Vektorsystem kloniert und im Adhäsin-freien Escherichia coli K-12-Stamm MG1655 ΔfimΔflu exprimiert. Da Antigen 43 in Wildtypstämmen posttranslational glykosyliert vorliegt, sind die Experimente zusätzlich unter Einfluß der heterologen, AIDA I-spezifischen Heptosyltransferase Aah (‘Autotransporter Adhesin Heptosyltransferase’) durchgeführt worden. Anhand von Bindungsstudien (intermolekulare Autoaggregation, Zelladhäsionstests) wurde gezeigt, daß sich einzelne Ag43-Varianten teilweise in ihren Eigenschaften unterscheiden. Im direkten Vergleich mit AIDA-I (‘Adhesin Involved in Diffuse Adherence’) enteropathogener Escherichia coli (EPEC) konnte für Ag43 nur eine Funktion als schwaches Adhäsin nachgewiesen werden. Die heterologe O-Glykosylierung beeinflußte die Funktionalität des Antigen 43 in unterschiedlichem Ausmaß. Je nach Autotransporter-Variante führte die Heptosylierung entweder zu signifikant reduzierten Affinitäten, oder sie hatte keinen Effekt auf die Bindungskapazität des Ag43. Antigen 43 weist zudem strukturelle Homologien zu vergleichbaren Domänen anderer Autotransporter auf. Für viele dieser Proteine konnte bereits eine adhäsive oder invasive Funktion nachgewiesen werden. Eine mögliche Interaktion von Ag43 mit eukaryontischen Rezeptoren ist hingegen noch nicht bzw. nur unvollständig untersucht worden. In Overlay assays und ELISAs wurde für Antigen 43 hier erstmals die spezifische Bindung an die extrazellulären Matrixkomponenten Kollagen und Laminin gezeigt. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, daß das Escherichia coli spezifische Autotransporterprotein Antigen 43 nicht nur an der bakteriellen Biofilmbildung, sondern auch an der Besiedlung epithelialer Gewebe beteiligt sein kann. Seine Expression verschafft Bakterien einen Kolonisationsvorteil, der mit erhöhter Fitneß einhergeht. Die Aah-vermittelte O-Glykosylierung scheint für die Funktionalität von Ag43 nicht zwingend erforderlich zu sein. Des weiteren ist im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Testsystem entwickelt worden, das auf der Basis von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungen (FISH) die Differenzierung von verschiedenen (uro-)pathogenen Mikroorganismen ermöglicht. Das etablierte Protokoll eignet sich nicht nur für die diagnostische Erregeridentifizierung, sondern auch in Abhängigkeit des Probenmaterials zur Untersuchung von (Multispezies-)Biofilmen.
The bacterial pathogen Legionella pneumophila replicates intracellularly in protozoa, but can also cause severe pneumonia, called Legionnaires' disease. The bacteria invade and proliferate in the alveolar macrophages of the human lung. L. pneumophila bacteria exhibit a biphasic life cycle: replicative bacteria are avirulent; in contrast, transmissive bacteria express virulence traits and flagella. Primarily aim of this thesis was to evaluate the impact of the regulatory proteins FleQ, FleR, and RpoN in flagellar gene regulation. Phenotypic analysis, Western blot and electron microscopy of regulatory mutants in the genes coding for FleQ, RpoN and FleR demonstrated that flagellin expression is strongly repressed and that these mutants are non-flagellated in transmissive phase. Transcriptomic studies of these putative flagellar gene expression regulators demonstrated that fleQ controls the expression of numerous flagellar biosynthetic genes. Together with RpoN, FleQ controls transcription of 14 out of 31 flagellar class II genes, coding for the basal body, hook, and regulatory proteins. Unexpectedly, 7 out of 15 late flagellar genes class III and IV) are expressed dependent on FleQ but independent of RpoN. Thus, in contrast to the commonly accepted view that enhancer binding proteins as FleQ always interact with RpoN to initiate transcription, our results strongly indicate that FleQ of L. pneumophila regulates gene expression RpoN-dependent as well as RpoN-independent. Moreover, transcriptome analysis of a fleR mutant strain elucidated that FleR does not regulate the flagellar class III genes as previously suggested. Instead FleR regulates together with RpoN numerous protein biosynthesis and metabolic genes. Based on these experimental results our modified model for the transcriptional regulation of flagellar genes in L. pneumophila is that flagellar class II genes are controlled by FleQ and RpoN, while flagellar class III and IV genes are controlled in a fleQ-dependent but rpoN-independent manner. Although all L. pneumophila strains share the same complex life style, various pathotypes have evolved. This is reflected by the genomes, which contain e.g. genomic islands. The genomic island Trb-1 of L. pneumophila Corby, carries all genes necessary for a type-IV conjugation system, an integrase gene and a putative oriT site. The second aim of this thesis was to investigate the implication of this genomic island in conjugative DNA transfer. Using conjugation assays we showed that the oriT site located on Trb-1 is functional and contributes to conjugation between different L. pneumophila strains. As this is the first oriT site of L. pneumophila known to be functional our results provide evidence that conjugation is a major mechanism for the evolution of new pathotypes in L. pneumophila.
The major macromolecule on the surface o/Leishmania majorpromastigotes is a lipophosphoglycan (LPG). This glycoconjugate plays a key role in determining infectivity and survival of para-sites in the mammalian host cell. In addition, L. major LPG is able to induce a host-protective immune response. In this article, we summarise the evidence for recognition of highly purified LPG by T cells and we discuss the potential mechanisms of T-cell Stimulation by this non-protein antigen.
Ten monoclonal antibodies (McAbs) raised to Schistosoma japonicum eggs could be assigned using several serological and immunochemical techniques to 3 groups. The McAbs, termed A, B and C-McAbs, apparently recognize carbohydrate epitopes that can be located on the same antigen molecule. The antibodies, generally of IgM isotype, are idiotypically related. They are distinct from another IgM McAb (Group D-McAb) the carbohydrate target epitope of which can also be associated with the epitopes of A. B and C-McAbs. The McAbs produce large vacuolated bleb reactions in the circumoval precipitin test (COPT) and target epitopes have different representations in various life cycle stages such as immature and mature eggs, male and female worms (including S. mansoni). Antigens affinity purified on columns containing A, B, C and D-McAbs stimulate proliferation of T cells from egg-sensitized mice and elicit DTH reactions in such mice. This raises the possibility that the target antigens of these carbohydrate-reactive monoclonal antibodies are immunopathologic and involved in egg-induced granuloma formation.
Leishmanien besitzen eine Vielzahl von Mechanismen, die humorale und zelluläre Immunabwehr effektiv zu unterlaufen. Diese hängen eng mit der Expression von hauptsächlich zwei Glykokonjugaten auf der Parasitenoberfläche zusammen, dem gp63 und dem Lipophosphoglykan. Die Parasiten sind einerseits schlechte Aktivatoren des alternativen Komplementweges und umgehen damit ihre eigene extrazelluläre Lyse. Oberflächengebundene Komplementfaktoren fördern andererseits die Aufnahme der Leishmanien durch Makrophagen. Solange diese nicht durch T-Zellen aktiviert sind, dienen sie den Parasiten als "Refugium". Dies gilt insbesondere, als Leishmanien in der Lage sind, 1. den "oxidative burst" zu hemmen; 2. toxische Sauerstoffmetaboliten zu entgiften; 3. abbauende lysosomale Enzyme zu hemmen und 4. das saure Milieu in den Lysosomen für ihren eigenen Metabolismus auszunutzen. Schließlich unterlaufen Leishmanien die zelluläre Immunabwehr des Wirts, indem sie die Aktivierung von T-Lymphozyten hemmen und die Expansion von T-Zell-Sub-populationen bewirken, die für ihr eigenes Überleben nützlich sind.
Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae sind humanpathogene Vertreter der Gattung Neisseria. Diese Erreger verfügen über eine Reihe von Virulenzfaktoren, um erfolgreich den menschlichen Körper zu besiedeln. Dabei spielen die neisseriellen OpaCEA-Proteine eine wichtige Rolle. Diese Adhäsine binden an bestimmte Rezeptoren der humanen CEACAM-Familie, die auf unterschiedlichen Zelltypen im menschlichen Körper exprimiert werden. Die Interaktion der OpaCEA-Proteine mit der stark konservierten aminoterminalen Domäne von bestimmten CEACAMs führt zu einer Aufnahme der Bakterien in die Zellen. Dort können sie, vor der humoralen Immunantwort geschützt, persistieren oder sich durch Transzytose in tiefer gelegene Gewebe weiter ausbreiten und letztendlich eine disseminierte Krankheit auslösen. Da CEACAMs eine entscheidende Rolle bei der Infektion mit pathogenen Neisserien spielen, wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion dieser zellulären Rezeptoren mit pathogenen Neisserien und die daraus resultierenden molekularen Ereignisse auf bakterieller bzw. zellulärer Seite näher untersucht. Zunächst wurde eine neuartige Methode entwickelt, die im Gegensatz zu herkömmlichen Strategien eine schnelle und quantitative Erfassung von Neisserien-CEACAM-Interaktionen ermöglicht. Bei dieser Methode wurden GFP-fusionierte, lösliche aminoterminale CEACAM-Domänen eingesetzt, die spezifisch an OpaCEA-exprimierende Bakterien binden. Einzelne Bakterien einer Population, die mit den fluoreszierenden Rezeptordomänen assoziierten, konnten aufgrund ihrer erhöhten Fluoreszenz im Durchflußzytometer sehr schnell und quantitativ bestimmt werden. Diese Rezeptordomänen wurden außerdem als molekulares Werkzeug zur Erstellung eines OpaCEA-induzierten Transkriptionsprofils von Opa-positiven Meningokokken verwendet. Transkriptomanalysen mittels Mikroarrays zeigten, dass die Interaktion OpaCEA-exprimierender Meningokokken mit der löslichen, aminoterminalen Domäne von CEACAM1 eine Herrunterregulation von 56 Genen sowie eine Hochregulation von sieben Genen in Neisseria meningitidis MC58 zur Folge hatte. Dabei konnte ein hochreguliertes Gen identifiziert werden, dessen Genprodukt aufgrund seiner Homologie zu einem bakteriellen -Hämolysin möglicherweise virulenz-assoziiert ist. Die Erstellung dieses Transkriptionsprofils beruhte auf der Interaktion zwischen der aminoterminalen Domäne von CEACAM1 und seinen bis heute einzig bekannten neisseriellen Liganden, den OpaCEA-Proteinen. Bemerkenswerterweise konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Opa-negativer Meningokokkenstamm isoliert werden, der ebenfalls an CEACAM1 bindet und von CEACAM1-exprimierenden Zellen internalisiert wird. Da dieser Meningokokkenstamm keine Opa-Proteine exprimierte, muß er über ein weiteres Adhäsin verfügen, das mit CEACAM1 assoziiert. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass für die CEACAM1-vermittelte Aufnahme dieser Opa-negativen Meningokokken mehrere extrazelluläre Domänen des Rezeptors notwendig sind. Im Gegensatz zur Aufnahme OpaCEA-exprimierender Bakterien war die aminoterminale Domäne essentiell, aber nicht ausreichend für diesen phagozytischen Vorgang, der unabhängig vom Aktinzytoskelett erfolgte. Auch bei Bindungsstudien mit löslichen CEACAM1 Konstrukten gab es Differenzen zwischen den opaquen und nicht-opaquen Bakterienstämmen. So zeigte sich, dass im Gegensatz zu OpaCEA-exprimierenden Meningokokken, die mit monomeren Formen des löslichen Rezeptors assoziieren konnten, Opa-negativen Meningokokken nur mit multimerisierten Formen des Rezeptors interagierten. CEACAM1 stellt den einzigen Rezeptor aus der CEACAM-Familie dar, mit dem Opa-negative Meningokokken interagieren können. Demgegenüber assoziieren OpaCEA-exprimierende Neisserien mit mehreren Mitgliedern der CEACAM-Familie, unter anderem mit CEACAM3. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die c-Jun N-terminale Kinase an Signaltransduktionswegen, die durch Interaktion von OpaCEA-exprimierenden Neisserien mit CEACAM3 ausgelöst wurden, beteiligt ist. Erstaunlicherweise konnte durch Inhibition der c-Jun N-terminalen Kinase CEACAM3-vermittelte Aufnahme der opaquen Bakterien in die Zelle reduziert werden. Da die Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase unabhängig von der Phosphorylierung der ITAM-ähnlichen Sequenz erfolgte, scheint dieses Molekül an einem neuartigen Signalweg beteiligt zu sein, der komplementär zu bereits bekannten CEACAM3-vermittelten Signalprozessen abläuft. Die in der vorliegenden Arbeit zusammengefassten Befunde liefern neue Einblicke in die Wechselwirkung zwischen pathogenen Neisserien und ihren Wirtszellen und können als Ausgangspunkt für interessante weiterführende Analysen dienen.
In dieser Arbeit wurde in Legionella pneumophila Corby ein bislang nicht in L. pneumophila beschriebener Bereich im Genom kloniert und sequenziert, der für ein putatives Konjugations- Typ IV Sekretionssystem kodiert. Alle für ein Typ IV Sekretionssystem notwendigen Gene sind vorhanden. Zum einen kodieren diese ein „mating pair formation“ System, also Proteine für die Pilusgenese und energieabhängigen Transport von Substraten aus der Bakterienzelle. Konjugationsexperimente zeigen, dass es sich bei den „DNA transfer and replication“ Genen trb/tra System um einen funktionierenden Mechanismus zur Mobilisierung von DNA handelt.
Die sekretorischen Aspartatproteasen (Saps) des Hefepilzes Candida albicans gelten als wichtiger Virulenzfaktor dieses opportunistischen Krankheitserregers. Die zehn Sap-Isoenzyme werden von einer Genfamilie codiert, deren Vertreter (SAP1-SAP10) in der Vergangenheit bereits intensiv untersucht wurden. SAP-Expressionsanalysen und die Charakterisierung von sap-Deletionmutanten, die in einem auxotrophen Laborstamm hergestellt wurden, führten aber zu teilweise widersprüchlichen Ergebnissen, weshalb die Rolle der einzelnen Proteine bis heute nicht zweifelsfrei aufgeklärt ist. Eine differentielle Expression der SAP-Gene in unterschiedlichen Stadien einer Infektion wurde jedoch in vielen unabhängigen Studien gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die Expression der Gene SAP1-SAP6 in einem etablierten in vitro-Modell einer Candida-Vaginitis untersucht, das auf der Infektion von rekonstituiertem humanem Epithel (RHE) basiert. Dazu wurden Reporterstämme verwendet, die bereits früher für Expressionsanalysen in verschiedenen in vivo-Infektionsmodellen in Mäusen eingesetzt worden waren. Dies erlaubte es einerseits unterschiedliche Nachweismethoden zur SAP-Genexpression in einem standardisierten Modell zu vergleichen und andererseits das Expressionsmuster der SAP-Gene in einem in vitro-Infektionsmodell mit den Ergebnissen von in vivo-Infektionsexperimenten zu korrelieren. Es zeigte sich in Übereinstimmung mit Ergebnissen früherer in vivo-Experimente in Mäusen, dass bei der Infektion des vaginalen Gewebes vor allem das SAP5-Gen induziert wurde. Allerdings weicht dieses Ergebnis deutlich von Ergebnissen anderer Studien ab, die mit Hilfe anderer Methoden ein ungleiches Muster der SAP-Expression detektierten. Um die Rolle der Gene SAP1-SAP6 bei der Infektion genauer zu untersuchen, wurden deshalb Mutanten hergestellt, in denen einzelne oder mehrere SAP-Gene mit Hilfe einer neuartigen Mutagenesestrategie erstmals aus dem Genom eines wildtypischen C. albicans-Stammes deletiert wurden. Überraschenderweise konnte sowohl in Einzelmutanten der Gene SAP1-SAP6 als auch in sap1 sap2 sap3- und sap4 sap5 sap6-Triplemutanten keine verminderte Fähigkeit zur Invasion und Schädigung von humanem Gewebe in RHE festgestellt werden. Eine in früheren Arbeiten beschriebene abgeschwächte Virulenz solcher Mutanten konnte auch in einem murinen Modell für eine disseminierende Infektion nicht beobachtet werden. Die Sekretion von Aspartatproteasen ermöglicht es C. albicans Proteine als alleinige Stickstoffquelle zum Wachstum zu verwenden. Unter diesen Bedingungen wird spezifisch die Expression des SAP2-Gens induziert; jedoch ist über die Mechanismen dieser Regulation noch wenig bekannt. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit Promotor-Deletionsanalysen des SAP2-Gens und des mit diesem co-regulierten Oligopeptidtransportergens OPT1 durchgeführt. Es zeigte sich, dass unterschiedliche Bereiche innerhalb der 3,5 kb großen regulatorischen Region von SAP2 gemeinsam eine Expression dieses Gens unter induzierenden Bedingungen ermöglichen. Für das OPT1-Gen konnte eine regulatorische Region eingegrenzt werden, die für die Expression dieses Gens essentiell ist. In den für die Expression von SAP2 und OPT1 wichtigen Regionen wurden ähnliche Sequenzen gefunden, die als Bindungsstellen für regulatorische Faktoren dienen könnten. In dieser Arbeit wurden neue Erkenntnisse zur Regulation und Bedeutung der sekretierten Aspartatproteasen von C. albicans erhalten. Um eine endgültige Bewertung der Rolle dieser Enzyme in der Virulenz des Erregers zu ermöglichen, sind jedoch noch weitere detaillierte Studien unter Verwendung verschiedenster Infektionsmodelle nötig.
Marine Schwämme (Phylum Porifera) sind sessile Invertebraten, deren Biomasse bis zu 60% aus Mikroorganismen bestehen kann. Während die mikrobielle Diversität in Schwämmen in den letzten Jahren recht gut beschrieben wurde, weiß man noch sehr wenig über mögliche Funktionen und Interaktionen zwischen Schwamm-assoziierten Mikroorganismen mit ihren Wirten. Das Ziel dieser Promotionsarbeit war es, den Prozess der mikrobiellen Nitrifikation im bakterienhaltigen Mittelmeerschwamm Aplysina aerophoba nachzuweisen und im Kontext der Symbiose näher zu untersuchen. Die Nitrifikation beschreibt die zweistufige Oxidation von Ammoniak zu Nitrit und weiter zu Nitrat und wird von bestimmten Mikroorganismen zur Energiegewinnung durchgeführt. Um dieser Fragestellung nachzugehen, wurden physiologische Untersuchungen an lebenden Schwämmen während Freilandexkursionen nach Rovinj (Kroatien) durchgeführt. Frisch gesammelte Schwämme wurden zu unterschiedlichen Jahreszeiten in experimentellen Aquarien jeweils über einen Zeitraum von über 24 Stunden gehältert. Die Konzentrationen von Ammonium, Nitrit und Nitrat wurden in Zeitintervallen mittels photometrischer Nachweise gemessen und die Aufnahme- und Exkretionsraten berechnet. Nitrit wurde in keinem der Experimente messbar ausgeschieden. Ammonium, als natürliches Stoffwechselendprodukt mariner Schwämme, wurde von A. aerophoba in Raten ausgeschieden, die saisonal variabel waren. Im Frühjahr wurde keine Ammonium-ausscheidung beobachtet während die Exkretionsrate zum Sommer hin stetig anstieg. Nitrat, welches natürlicherweise nur durch mikrobielle Nitrifikation entstehen kann, wurde saisonunabhängig konstant ausgeschieden. Ammoniumaufnahme-Experimente zeigten auf, dass Ammonium im Frühjahr rasch aufgenommen wurde und dass Ammonium die Nitratexkretionsrate bis zu vierfach stimulierte, wohingegen im Sommer keine Ammoniumaufnahme und keine Stimulation der Nitratexkretion stattfanden. Durch Zugabe des spezifischen Inhibitors der Nitrifikation, Nitrapyrin, konnte die Nitratexkretion in A. aerophoba vollständig gehemmt werden. Im Gegensatz zu bakterienhaltigen Schwämmen zeigten sogenannte bakterienfreie Schwämme erwartungsgemäß keine Nitratausscheidung. Das 16S rRNA- und das amoA-Gen wurden als molekulare Marker verwendet, um nitrifizierende Mikroorganismen in Schwämmen phylogenetisch zu identifizieren. Es konnten zahlreiche 16S rRNA-Gene aus insgesamt sechs Schwammarten inklusive Aplysina aerophoba amplifiziert und dem marinen Nitrosospira Cluster 1 zugeordnet werden. Aus A. aerophoba konnten auch Nitrosospira amoA-Gensequenzen gewonnen werden. Archaeale 16S rRNA- und amoA-Gensequenzen wurden ebenfalls aus A. aerophoba gewonnen, wobei die 16S rRNA-Gene mit anderen aus Schwämmen stammenden Sequenzen ein Schwamm-spezifisches Cluster innerhalb der Crenarchaea Gruppe I.1A bildeten. Unter Verwendung spezifischer Fluoreszenz-markierter 16S rRNA Sonden konnten den Nitrosospira Cluster 1 und Crenarchaea Gruppe 1 zugehörige Zellen innerhalb des mikrobiellen Konsortiums aus A. aerophoba nachgewiesen werden. Basierend auf der geschätzten Menge nitrifizierender Mikroben in der Schwammmesohylmatrix und den Nitratexkretionsraten wurde eine zellspezifische Ammoniakoxidationsrate von 1,6 fmol Zelle-1 h-1 errechnet. Der Nachweis von 16S rRNA- oder funktionellen Genen des anaeroben mikrobiellen N-Kreislaufs in A. aerophoba verlief negativ. Darüber hinaus wurde eine in vorherigen Arbeiten aus dem mit A. aerophoba assoziierten mikrobiellen Konsortium erstellte Metagenombank auf das Vorhandensein von funktionellen (amoA) Nitrosospira- und Crenarchaea-Genen untersucht. Aus der Sequenzierung des archaealen Metagenomklons 58F6 resultierte die Sequenz des kompletten AMO-Operons eines möglicherweise Schwamm-spezifischen Crenarchaeoten. Diese Ergebnisse liefern erste funktionelle Einblicke in die komplexen Stoffflüsse und Wechselwirkungen zwischen Schwämmen und den mit ihnen assoziierten mikrobiellen Konsortien. Aufgrund dieser Arbeit wurde ein Modell des Stickstoffkreislaufs in A. aerophoba erstellt, welches die Mikroorganismen mit möglichen Stoffwechselfunktionen in dem Wirtsschwamm verknüpft. Diese Arbeit trägt zu dem Informationsstand über die Interaktionen zwischen Schwämmen und Mikroorganismen bei und leistet einen Beitrag zur Aufklärung des Stickstoffkreislaufs in A. aerophoba.
Harnwegsinfektionen (HWI) gehören zu den häufigsten bakteriell bedingten Erkrankungen; vor allem Frauen sind sehr häufig betroffen. Harnwegsinfektionen kommt große medizinische und volkswirtschaftliche Bedeutung zu. Bei akuten unkomplizierten Infekten ist allein Escherichia coli in über 70 % der Fälle die Ursache. Auch bei komplizierten chronischen Infektionen spielt Escherichia coli in über 40 % aller Fälle eine große Rolle. E. coli Stämme, die die Nieren und ableitenden Harnwege inklusive Harnblase infizieren, werden als uropathogene E. coli (UPEC) bezeichnet. Sie unterscheiden sich von anderen, apathogenen E. coli Stämmen dadurch, daß sie bestimmte Virulenzfaktoren (VF) und Fitnessfaktoren besitzen, die ihnen besondere Virulenz verleihen. Solche Virulenzfaktoren sind vor allem Kapseln, Adhäsine, Toxine und Eisenaufnahmesysteme. In dieser Arbeit wurden Stuhl- und Urinproben von acht Patientinnen untersucht, die in der nephrologischen Abteilung der Universitätsklinik Jena betreut wurden und alle an chronisch rezidivierenden Harnwegsinfektionen leiden. Die gewonnenen Isolate wurden mittels Multiplex-PCR auf Virulenzfaktoren getestet, die für UPEC typisch sind. Des Weiteren wurden mit Hilfe der „Repetitive Extragenic Palindromic“ (Rep)-PCR und den Ergebnissen aus der Multiplex-PCR-Analyse Klone definiert. Ausgewählte Isolate wurden mittels Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) untersucht. Die Rep-PCR- und PFGE-Ergebnisse aus vorangegangenen Arbeiten (L. Brauchle, 2002 und M. Maibaum, 2003) wurden in diese Arbeit mit integriert und nomenklatorisch angeglichen. Die 167 Stuhl- und 186 Urinisolate dieser Arbeit konnten 81 Stuhl- und 64 Urinklonen zugeordnet werden. In der vorliegenden Studie scheinen die Häufigkeiten UPEC-typischer Virulenzfaktoren nach längerer chronischer Harnwegsinfektion wieder etwas anzusteigen. Insbesondere aber nahmen die Häufigkeiten der Virulenzfaktoren innerhalb der Stuhlstämme zu und entsprachen oftmals nahezu den Häufigkeiten bei Urinstämmen. Kapselgene, die bei Urinstämmen deutlich häufiger gefunden wurden, scheinen bei Chronizität eine Rolle zu spielen. Auch innerhalb der Urinklone häufiger zu finden waren die für Hämolysin, P-Fimbrien, S- bzw. F1C-Fimbrien codierenden Gencluster. Als Erregerreservoir scheint auch bei chronischen Harnwegsinfektionen der Darm festzustehen. Im Gesamtstudienzeitraum von 38 Monaten (1997-2000) koexistierten 18 Stämme in Stuhl und Urin gleichzeitig. Zehn dieser Koexistenzen wurden nochmals zu anderen Zeitpunkten gefunden (Persistenzen). Über den Vergleich der PFGE-Muster von Stuhl- und Urinklonen konnten bei Probandin Pat. 2 (HF) Klone mit dem PFGE-Muster IV und XV identifiziert werden, deren Bandenmuster sich so ähnlich sind (nur ein einziger Bandenshift), daß hier vermutlich eine DNA-Umlagerung stattgefunden hat. Innerhalb von 51 Untersuchungsterminen konnte lediglich vier Mal eine akute Exazerbation erfaßt werden. Tendenziell läßt sich über den gesamten Studienzeitraum ein Rückgang an erneuten Ausbrüchen bei ähnlicher Verteilung des Virulenzfaktorspektrums in den gefundenen Stuhl- und Urinstämmen beobachten. Eine prophylaktische Gabe von L-Methionin (Acimethin®) verminderte die Häufigkeit der untersuchten Virulenzfaktoren innerhalb der Stuhlstämme, kann aber bei chronischen Harnwegsinfektionen eine Exazerbation nicht sicher verhindern, möglicherweise jedoch deren Anzahl verringern.
Das Gram-negative Bakterium Legionella pneumophila ist der Haupterreger der humanen Legionärskrankheit, einer schweren atypischen Pneumonie. Aufgrund mangelnder Diagnostik bleibt L. pneumophila als Krankheitsverursacher jedoch oft unerkannt. Neuesten Schätzungen des Kompetenznetzwerkes für ambulant erworbene Pneumonien (CAPNETZ) zufolge könnten Legionellen in Deutschland für jährlich ca. 21 000 Pneumonien verantwortlich sein, etwa doppelt so viele Fälle wie bisher angenommen. Die Pathologie der humanen Infektion zeichnet sich durch extrazelluläre Effekte aus, für die in den letzten Jahren vielfältige sekretierte Effektormoleküle (SSPs) verantwortlich gemacht wurden. Darüber hinaus tragen spezielle Sekretionsmaschinen wie das Dot/Icm Typ-IV-Sekretionssystem sowie ersten Hinweisen entsprechend Membranvesikel, die von der äußeren Membran der Bakterien abgeschnürt werden (OMVs), zur intrazellulären Pathogenität von L. pneumophila bei. In der vorliegenden Dissertation bildet die umfassende Charakterisierung des Sekretoms von L. pneumophila den Schwerpunkt. Diese ist untergliedert in (i) Untersuchungen zur OMV-Produktion im Lebenszyklus von L. pneumophila, (ii) Proteomcharakterisierung der Sekretomfraktionen SSP und OMV und (iii) funktionale Analyse der Sekretomfraktionen. Für einen Beitrag von OMVs zur L. pneumophila-Pathogenese ist deren Produktion während extra- und intrazellulären Wachstums essentiell. Mit Hilfe verschiedener Mikroskopie-Techniken wird in dieser Dissertation gezeigt, dass die Abschnürung von OMVs sowohl extrazellulär als auch intrazellulär in Legionella-spezifischen Phagosomen stattfindet und von einer intakten Bakterienmembran erfolgt. Des Weiteren werden OMVs nicht nur während der exponentiellen, sondern auch während der stationären Phase produziert. Diese Beobachtung ist bedeutend, weil sich L. pneumophila während der postexponentiellen Phase in die transmissive Form mit voller Virulenz differenziert und sich der Wechsel in die virulente Form folglich auch in der Zusammensetzung der OMVs widerspiegeln könnte. Der zweite Teil beschäftigt sich mit der Proteomanalyse der Sekretomfraktionen. Die Proteinidentifikation ergab 181 nicht-redundante Proteine im L. pneumophila-Sekretom, von denen 107 für die SSP-Fraktion und 33 für die OMV-Fraktion hochspezifisch sind. In beiden Fraktionen sind insgesamt 22 Typ-II-Sekretionssubstrate enthalten, die verschiedene degradierende Enzymaktivitäten aufweisen. Außerdem wurden 38 bisher putative Typ-II-Substrate, 3 Typ-IV-Substrate und 7 Eukaryoten-ähnliche Proteine detektiert. Die Analyse der Verteilung der Proteine zeigt, dass der prozentuale Anteil der „Virulenz-/Pathogenese“-Proteine in der OMV-Fraktion mit 24% gegenüber 11% in der SSP-Fraktion mehr als doppelt so hoch liegt. Acht Faktoren, u. a. das Mip-Protein, einer der Haupt-Virulenzfaktoren von L. pneumophila, sind nur auf OMVs beschränkt. Dies könnte darauf hindeuten, dass OMVs als spezifische Transportmittel für Virulenz-assoziierte Effektoren dienen. In der funktionalen Analyse der SSP- und OMV-Fraktionen wurden anhand verschiedener Techniken Aspekte untersucht, die während des Infektionsprozesses eine Rolle spielen. Dabei zeigt sich, dass SSPs und OMVs proteo- und lipolytische Enzymaktivitäten besitzen, die zur Zerstörung der Alveolaroberfläche, zur Transmigration der Bakterien durch Lungenepithelbarriere und Basallamina und letztendlich zur Ausbreitung von L. pneumophila im Lungengewebe und zur Milz beitragen könnten. Jedoch konnten für OMVs keine naheliegenden zytotoxischen oder zytolytischen Eigenschaften nachgewiesen werden. In Alveolarepithelzellen können sie ein spezifisches Zytokinsekretionsprofil induzieren, was ihre modulierenden Effekte auf Wirtszellen bestätigt. Die gezeigte Bindung von OMVs an Alveolarepithelzellen bildet die Voraussetzung für eine Interaktion mit den Wirtszellen. Ob dabei eine Fusion mit der Zytoplasmamembran und ein möglicher Transfer von Effektoren in die Wirtszelle stattfinden, bleibt zu klären. Abschließend werden diskutierte Funktionen sekretierter OMVs während der L. pneumophila-Infektion in einem Modell zusammengefasst. Diese neuen Ergebnisse zum Proteom des Sekretoms und zur Funktion von L. pneumophila-OMVs tragen zum besseren Verständnis der Interaktion von L. pneumophila mit seiner Umwelt und der Pathogenese bei. Gleichzeitig liefern sie eine wichtige theoretische Grundlage für zukünftige Forschungsarbeiten über Interaktionsprozesse und beteiligter Effektoren, deren tiefgreifendes Verständnis die Vorraussetzung für die Entwicklung neuer Strategien in der Therapie von Legionella-Infektionen bildet.
Trotz intensiver Forschung und des Global-Eradication-of-Malaria-Programms der WHO in den 1950er Jahren zählt Malaria neben AIDS und Tuberkulose auch heute immer noch zu den bedeutendsten Infektionskrankheiten weltweit. Aufgrund rasch zunehmender Resistenzentwicklung der Erreger gegen gängige Prophylaxe- sowie Therapiepräparate und dem Fehlen eines Impfstoffs sterben jährlich bis zu 3 Mio. Menschen an Malaria. Seit vor etwa 2 Jahrzehnten das wissenschaftliche Interesse an transmissionsblockierenden Vakzinen gegen den Malariaerreger erwachte, rückten sexualstadienspezifische Oberflächenproteine in den Fokus der Impfstoffforschung. Im Zuge der vollständigen Sequenzierung des P.-falciparum-Genoms wurde bei dem Screenen nach Genen, die multiple tier- oder bakterienähnliche, adhäsive, extrazelluläre Domänen kodieren, die PfCCp-Familie identifiziert. Ihre 6 Mitglieder besitzen eine bemerkenswerte Vielfalt an hoch konservierten, adhäsiven Modulen, die eine Beteiligung an Protein-Protein-, -Polysaccharid- oder -Lipid-Interaktionen vermuten lassen. Die Multiadhäsionsdomänenproteine wurden aufgrund des gemeinsamen LCCL-Moduls PfCCp1 bis PfCCp5 benannt. Dem sechsten Mitglied, PfFNPA, fehlt zwar die namensgebende Domäne, doch die ausgeprägte Ähnlichkeit zu PfCCp5 führte zur Integration des Proteins in die PfCCp-Familie. Die Charakterisierung der ersten 3 Mitglieder zeigte, dass PfCCp1, PfCCp2 und PfCCp3 sexualstadienspezifisch exprimiert werden und in der parasitophoren Vakuole reifer Gametozyten lokalisiert sind. Immunfluoreszenzstudien ließen außerdem erkennen, dass die Proteine während der Gametenbildung partiell freigesetzt werden und in einer matrix-ähnlichen Struktur Exflagellationszentren umgeben. In KO-Studien erwiesen sich PfCCp2 und PfCCp3 zusätzlich als essentielle Faktoren für die Migration reifer Sporozoiten aus den Mitteldarmoozysten in die Speicheldrüsen der Mücken. Damit erfüllen sie die 2 grundlegenden Kriterien für Komponenten transmissionsblockierender Vakzine: eine sexual-stadienspezifische Expression und essentielle Funktion während der Parasitenentwicklung in der Mücke. Aufgrund dieser viel versprechenden Daten wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Analyse der PfCCp-Familie durch funktionale Charakterisierung von PfCCp4 sowie Interaktionsstudien an den PfCCp-Proteinen fortgesetzt. Die Expressionsanalysen mittels RT-PCR, Western Blot und Immunfluoreszenzstudien ergaben für PfCCp4 ebenfalls eine sexualstadienspezifische, Plasmamembran-assoziierte Expression innerhalb der parasitophoren Vakuole reifer Gametozyten. Die Expression beginnt bereits in Gametozyten des Stadium I und erfolgt hauptsächlich in Makrogametozyten. Im Gegensatz zu PfCCp1, PfCCp2 und PfCCp3 wird PfCCp4 jedoch homogen verteilt exprimiert. Während der Gametogenese wird PfCCp4 nicht freigesetzt, sondern verbleibt an der Oberfläche von Makrogameten. Es ist zudem das einzige Mitglied der PfCCp-Familie, dessen Expression im Zuge der Ookinetenreifung wieder aufgenommen wird. KO-Studien durch Membranfütterungen von Anopheles-Mücken lassen allerdings darauf schließen, dass PfCCp4 keine essentielle Funktion bei der Parasitenentwicklung ausübt. Der Verlust von PfCCp4 beeinträchtigte weder die Fertilisation noch die Bildung, Reifung oder Migration von Ookineten, Oozysten oder Sporozoiten. PfCCp4 kann somit nicht als Kandidat transmissionsblockierender Vakzine betrachtet werden, obwohl es mit den viel versprechenden Kandidaten Pfs230 und Pfs48/45 interagiert, wie funktionelle Analysen nativer PfCCp-Proteine mittels Ko-Immunpräzipitation ergaben. Weitere Ko-Immunpräzipitationsstudien identifizierten Interaktionen innerhalb der PfCCp-Familie, wie bereits die Ko-Lokalisation und ko-abhängige Expression von PfCCp1, PfCCp2 und PfCCp3, ihre Freisetzung bei der Gametogenese und die matrixähnliche Verteilung um Exflagellationszentren vermuten ließen. In Affinitätschromatographiestudien unter Verwendung rekombinanter PfCCp-Proteine konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um direkte Interaktionen handelt, an denen besonders die LCCL- und die SR-Domäne beteiligt zu sein scheinen. In Zelladhäsionsstudien konnte außerdem eine Bindungsaffinität ausgewählter rekombinanter PfCCp-Proteine an Makrogameten beobachtet werden. Insgesamt bestätigen diese Daten unsere Hypothese, dass PfCCp-Proteine unter Beteiligung weiterer sexualstadienspezifischer Proteine während der Gametozytenreifung und Gametogenese Proteinkomplexe ausbilden. In zukünftigen Studien gilt es einerseits, ausgewählte PfCCp-Proteine durch transmissionsblockierende Experimente in ihrem Potential als Impfstoffkomponenten zu evaluieren. Andererseits nimmt die funktionale Charakterisierung der Proteinkomplexe während der Gamogonie eine zentrale Rolle ein, um ihre Funktion in der Sexualphase von P. falciparum zu klären und die Beteiligung der PfCCp-Proteine an der Regulation dieses komplexen Lebenszyklus zu verstehen.
Cutaneous leishmaniasis is an infectious disease that is endemic especially in tropical and desert regions with an incidence of 1.5 million cases per year and a prevalence of 12 million people infected worldwide. The infection can be caused by the intracellular parasite Leishmania major. The disease has been studied extensively in the murine model. It has become apparent that the induction of a class of interferon (IFN)--producing CD4+ T helper cells (TH1 cells) that activate macrophages to kill the parasites they harbor is desicive for the establishment of immunity. The redirection of the host’s immune response towards a protective TH1 phenotype will also be the key to an effective vaccine. Dendritic cells (DC) loaded with leishmanial antigens ex vivo were lately described as vaccines against L. major infections. One single recombinant Leishmania antigen, LeIF (Leishmania homologue of eukaryotic ribosomal initiation factor 4a), which was identified as a protein that stimulates DC to secrete interleukin (IL)-12 and discussed as a pattern-associated molecular pattern (PAMP), was found to mediate a protective TH1-dependent effect when used for pulsing of DC. The application of recombinant proteins is tied to many disadvantages, which is why other methods of antigen administration have been developed. RNA electroporation of DC has recently emerged from tumor research as a safe and versatile method of antigen delivery, by which a large number of RNA molecules encoding a specific antigen gains access to the cytosol of DC by an electrical impulse. The present study describes, for the first time, transfection of DC with RNA encoding a molecularly defined parasite antigen. Initially, a standardized protocol for RNA transfection was established, using the enhanced green fluorescent protein (EGFP) as reporter antigen. EGFP-RNA was well translatable in an in vitro translation system, and both a DC cell line (fetal skin-derived DC; FSDC) and murine primary bone marrow-derived DC (BMDC) could be transfected efficiently, with a yield of up to 90% and 75%, respectively. In both cell types, maximal transfection efficiency was attained with 20 µg RNA and could not be further increased with larger amounts of RNA. The level of antigen expression, measured as the mean fluorescence intensity (MFI) by flow cytometry, was directly proportional to the amount of RNA used for transfection. In FSDC, transfection efficiency and MFI were generally higher than in BMDC when the same amounts of RNA were used. Furthermore, the kinetics was shown to be sensitive to treatment with lipopolysaccharide (LPS): the expression peak was higher and was reached sooner, followed by a more rapid decline. In transfection experiments with LeIF, two variants of LeIF-RNA were used: LeIF(fl)-RNA, encoding the complete LeIF sequence, and LeIF(226)-RNA, encoding only the aminoterminal half of the LeIF sequence (226 amino acids), the immunogenic part of LeIF. Only LeIF(fl) was detectable by Western Blot in whole cell lysates of BMDC after LeIF(fl)-RNA transfection, whereas LeIF(226) could never be detected in LeIF(226)-transfected BMDC. However, as both constructs were well translatable in a cell-free system, the failure to detect LeIF(226) in BMDC lysates did not represent a failure in RNA translation, but rather a rapid antigen degradation. It was therefore expected that LeIF(226)-transfected BMDC should nevertheless be able to present LeIF(226)-derived antigenic peptides to T cells from BALB/c mice primed with recombinant LeIF (rLeIF). This hypothesis was confirmed by measuring IFN- production in BMDC-T cell co-incubation assays, showing that rLeIF-pulsed, LeIF(226)- and LeIF(fl)-transfected day 7 BMDC did indeed activate T cells from LeIF-immunized mice in an antigen-specific manner. In contrast, IL-4 was not produced, which was consistent with the fact that T cells found in lymph nodes from LeIF-primed mice are primarily of the TH1 type. In the supernatants of LeIF-transfected BMDC cultures, in contrast to rLeIF-pulsed BMDC, the proinflammatory cytokines IL-1β, IL-6, IL-10 and IL-12 were not detected. This effect was not due to the electroporation procedure, as cytokine production by BMDC electroporated with rLeIF was only partially impaired. Also, the expression levels of CD86 were lower upon LeIF transfection than after pulsing with rLeIF. Thus, LeIF transfection did not induce maturation of DC. In conclusion, LeIF-transfected BMDC may have acted as semi-mature antigen-specific tolerance inducers, with regulatory T cells as responders. The effect of LeIF transfection on the immunostimulatory capacity of BMDC was not significantly increased when day 8 or 9 BMDC were used. However, day 8, and even more day 9 BMDC pulsed with rLeIF mounted a vigorous T cell response. Day 9 BMDC were able to activate naïve T cells. In conclusion, before a strong T cell response against LeIF can be induced, DC need to – besides presenting antigen and expressing co-stimulatory molecules – exhibit a susceptibility to the innate signaling molecule LeIF which is linked to their maturation age. This third signal is provided by extracellular rLeIF, but it is not conveyed – or is suppressed – by intracellular LeIF after LeIF-RNA transfection. Furthermore, electroporation of rLeIF abrogated IL-12 production by BMDC completely, the production of IL-1 was reduced with higher antigen doses, and the production of IL-10 was partially increased. The IL-6 production was unaffected. This altered cytokine profile suggests that LeIF as a PAMP might have a bipartite nature: besides exhibiting the capacity to stimulate IL-12 production upon extracellular presence, thereby enhancing host resistance against L. major, LeIF could also contribute to parasitic host evasion mechanisms from intracellular compartments of DC, possibly by interfering with mitogen-activated protein (MAP) kinase signaling pathways. Thus, the adjuvant properties of LeIF depend both on its mode of delivery (transfection with RNA vs. pulsing with the recombinant protein) and the targeted compartment (extra- vs. intracellular). From this work, it can be summarized that BMDC are well transfectable with a parasite antigen. The antigen is processed and presented, but it is not recognized as a PAMP by DC. Hence, transfection with antigen-encoding mRNA by itself does not convey all necessary signals for the elicitation of a potent immune response.
Ziel dieser Arbeit war es, eine Reihe von 17 ausgewählten Kohlehydraten auf deren Fähigkeit zu bewerten, die Adhärenz humanpathogener Enteritis-/Diärrhoe-Erreger zu reduzieren oder gänzlich zu verhindern. Gestestet wurde die Adhärenz an Kryoschnitten humaner Darmbiopsien. Hierbei wurde die bakterielle Adhäsion ohne Zusatz der Kohlehydrate bestimmt und als Vergleichswert gegenüber dem Ansatz mit Zusatz der Kohlehydrate herangezogen. Dabei kamen Stämme folgender Spezies zum Einsatz: entero-aggregative E. coli, entero-hämorrhagische E. coli, entero-pathogene E. coli, entero-toxigene E. coli, Salmonella enterica Serovar Typhimurium und Shigella flexneri. Als Positiv-Kontrolle wurde Citrobacter freundii verwendet.
Der apathogene E. coli Stamm DSM 6601 (E. coli Nissle 1917) kann als Modellorganismus für die Verwendung eines kommensalen Gram-negativen Bakterienstammes als Probiotikum angesehen werden. Dieser E. coli Stamm wurde intensiv erforscht und seine Eigenschaften sind daher gut charakterisiert. Der probiotische Charakter dieses Bakterienstammes ist auf gute Kolonisierungseigenschaften des menschlichen Darms, immunmodulatorische Effekte und antagonistische Wirkungen zurückzuführen. Der E. coli Stamm DSM 6601 wird seit einigen Jahrzehnten zur Behandlung verschiedener gastrointestinaler Erkrankungen eingesetzt und seine therapeutische Wirksamkeit ist wissenschaftlich bewiesen. Daher eignet sich dieser Stamm als Modellstamm für die Entwicklung eines bakteriellen Lebendvektors, der für mukosale Immunisierungen oder die zielgerichtete Lieferung von therapeutischen Molekülen in den Darm eingesetzt werden könnte. Ein Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der kryptischen Plasmide pMUT1 und pMUT2 des probiotischen E. coli Stammes DSM 6601 durch Analyse der DNA-Sequenz. Die Analyse ergab, dass das Plasmid pMUT1 ein Replikationssystem vom ColE1-Typ, ein Mobilisierungssystem sowie eine Stabilitätsregion enthält, während das Plasmid pMUT2 ein ColE2-ähnliches Replikationssystem und ein anderes Mobilisierungssystem besitzt. In beiden Plasmiden konnten keine weiteren offenen Leserahmen mit bekannter Funktion identifiziert werden. Des Weiteren wurde ein spezifisches PCR-Nachweissystem für den E. coli Stamm DSM 6601 etabliert, das auf einer Methode zur direkten DNA-Isolierung aus Stuhlproben und einem optimierten PCR-Protokoll für auf den kryptischen Plasmiden basierende Primerkombinationen beruht. Dadurch konnte eine Sensitivität von 10(3)-10(4) Bakterien/0,1 g Stuhl erreicht werden, die vergleichbar mit den Nachweisgrenzen anderer beschriebener PCR-Nachweissysteme ist. Durch Analysen von Patientenstuhlproben wurde die Spezifität und der diagnostische Nutzen dieses PCR-Nachweissystems bestätigt. Darüber hinaus wurde eine plasmidfreie Variante des E. coli Stammes DSM 6601 hergestellt. Durch funktionelle Untersuchungen dieses Stammes konnten keine Unterschiede im Vergleich zu dem Wildtyp festgestellt werden, wodurch eine mögliche Funktion der beiden kryptischen Plasmide weiterhin unklar bleibt. Diese plasmidfreie Variante kann als Lebendvektor für rekombinante Plasmide auf Basis der Plasmide pMUT1 und pMUT2 verwendet werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von stabilen Klonierungsvektoren für den probiotischen E. coli Stamm DSM 6601. Durch Integration von Antibiotika-Resistenzkassetten in die Plasmide pMUT1 und pMUT2 wurden Klonierungsvektoren konstruiert, die auch nach Insertion weiterer DNA-Fragmente ohne Antibiotika-Selektionsdruck stabil in diesem Stamm beibehalten werden. Zusätzlich wurde durch die stabile Expression von fluoreszierenden Proteinen ein visuelles Nachweissystem etabliert, das bei in vivo Experimenten verwendet werden kann. Dadurch wird die Möglichkeit geboten, Erkenntnisse über Kolonisierungseigenschaften sowie Interaktionen des E. coli Stammes DSM 6601 mit endogenen Mikroorganismen und Zellen des Darmimmunsystems zu erlangen, was zur Aufklärung der Wirkungsweise dieses Stammes beitragen könnte. Im Hinblick auf die Entwicklung eines Lebendvakzins auf der Basis des probiotischen E. coli Stammes DSM 6601 wurden Adhäsine von humanpathogenen enterohämorrhagischen E. coli und von tierpathogenen enterotoxischen E. coli in diesem Stamm exprimiert. Bei ersten Immunisierungsversuchen in Mäusen konnte jedoch keine Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen diese Adhäsine nachgewiesen werden. Weiterhin wurde die inhibitorische Wirkung des E. coli Stammes DSM 6601 auf die Invasivität von Salmonellen in vitro und in vivo untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Typ 1- und F1C-Fimbrien keine Rolle bei dem inhibitorischen Effekt in vitro spielen und dass durch diesen E. coli Stamm in konventionellen Mäusen keine inhibitorischen Wirkungen nachzuweisen sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit bilden durch die Entwicklung von stabilen Klonierungsvektoren und die Etablierung von Nachweissystemen für den probiotischen E. coli Stamm DSM 6601 die Grundlage für den Einsatz dieses Stammes als Lebendvektor und für in vivo Untersuchungen, die zur Aufklärung der Wirkungsmechanismen dieses Stammes beitragen könnten.
Bacteriosponges contain large amounts of morphologically and phylogenetically diverse microorganisms in their mesohyl. The association is permanent, stable and highly specific, however, little is known about the establishment and maintenance of this association. The first aim of this Ph.D. thesis was to examine cospeciation between eight Aplysina species from the Mediterranean and Caribbean and their cyanobacterial associates. Host phylogeny was constructed with 18S rDNA and ITS-2 sequences using an alignment based on the secondary structure of the molecular markers and five different algorithms each. The genus Aplysina appeared as monophyletic. Aplysina sponges could be distinguished into a Caribbean and a Mediterranean cluster and a possible Tethyan origin is suggested. Comparison of the host phylogeny to the 16S rDNA phylogeny of the cyanobacterial strains revealed the lack of a congruent pattern. Therefore it is proposed that Aplysina sponges have not cospeciated with their cyanobacterial phylotypes and probably also not with other sponge specific microbes. The second aim of this Ph.D. thesis was to examine vertical transmission of microorganisms through reproductive stages of sponges. A general transmission electron microscopy (TEM) suvey revealed a clear correlation in that bacteriosponges always contained many microorganisms in their reproductive stages whereas non-bacteriosponges were always devoid of microbes in their reproductive stages. The transmission of the microbial community via sponge reproductive stages is concluded. Based on the previous results Ircinia felix was chosen for a detailed documentation of vertical transmission. I. felix larvae contained large amounts of microorganisms extracellularly in the central region whereas the outer region was almost free of microbes as shown by TEM. In I. felix juveniles microorganisms were located between densely packed sponge cells. The microbial profiles of I. felix adult, larvae, and juveniles were compared using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Similar microbial community patterns were found in adult and the respective larvae indicating that a large subset of the adult microbial community was vertically transmitted. In contrast, microbial communities of larvae pools released by different adult individuals seemed to be more variable. Juvenile banding patterns were a mixture of sponge specific and seawater microbes due to DNA extraction artefacts but demonstrated that at least half of the adult microbial community is present in the next generation. Finally, a comprehensive phylogenetic analysis was conducted by sequencing excised DGGE bands from adult and offspring of the bacteriosponges Agelas wiedenmayeri, I. felix, and Smenospongia aurea and by taking additional 16S rDNA sequences of Ectyoplasia ferox and Xestospongia muta (unpublished data of the laboratory). The identification of 24 vertical transmission clusters in at least 8 eubacterial phyla demonstrates that a complex and uniform microbial community is transferred via sponge reproductive stages. Vertical transmission is specific in that the microorganisms of bacteriosponges, but not those from seawater, are passed on, but unselective in that there appears to be no differentiation between individual sponge-specific lineages. In conclusion, vertical transmission points to a mutualistic and long-term association of bacteriosponges and complex microbial consortia.
Thrombospondin-1 (TSP1) ist ein matrizelluläres, Calcium-bindendes Glykoprotein, das an der Regulation verschiedener zellulärer Prozesse beteiligt ist. TSP1 wird von unterschiedlichen Zelltypen gebildet und ist vor allem in den α-Granula der Thrombozyten zu finden, aus denen es nach deren Aktivierung sekretiert wird. Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) sind Gram-positive humanpathogene Bakterien. Sie besiedeln asymptomatisch den menschlichen Respirationstrakt und können schwerwiegende lokale Infektionen und lebensbedrohliche Erkrankungen, wie z.B. Sepsis, bakterielle Meningitis oder invasive Pneumonien auslösen. Die Anheftung von S. pneumoniae an Wirtsstrukturen ist ein initialer Schritt für die Kolonisierung mukosaler Epitheloberflächen. In dieser Arbeit wird die Bedeutung des humanen TSP1 für die Pathogen-Wirt Interaktion analysiert und der Effekt für die Pathogenese demonstriert. Verschiedene Bindungsstudien und durchflusszytometrische Analysen zeigten eine Assoziation von S. pneumoniae an aktivierte Thrombozyten und an lösliches und immobilisiertes TSP1. In in vitro Infektionsversuchen konnte nachgewiesen werden, dass wirtszellgebundenes TSP1 die Adhärenz an und Invasion in Epithel- bzw. Endothelzellen vermittelt. TSP1 übernimmt die Funktion als Brückenmolekül zwischen S. pneumoniae und eukaryontischen Wirtszellen. Zur Charakterisierung des bakteriellen Adhäsins für TSP1 wurden die Pneumokokken mit dem proteolytischen Enzym Pronase E bzw. mit der Zucker oxidierenden Substanz Natriumperiodat inkubiert. Eine Behandlung mit Natriumperiodat reduzierte die TSP1 vermittelte Adhärenz der Pneumokokken an humane Wirtszellen. Im Gegensatz dazu hatte die Behandlung mit Pronase E keinen Einfluss auf die TSP1 vermittelte Anheftung von S. pneumoniae an eukaryontische Zellen. Diese Ergebnisse deuten an, dass es sich bei dem bakteriellen Adhäsin für TSP1 um eine oberflächenlokalisierte Glykostruktur der Pneumokokken handelt. Die TSP1 vermittelte bakterielle Adhärenz der Pneumokokken an Wirtszellen konnte durch Pneumokokken-spezifisches Phosphorylcholin bzw. durch Lipoteichonsäuren nicht reduziert werden. Im Gegensatz dazu wurde die TSP1 vermittelte Adhärenz von S. pneumoniae an Wirtszellen durch Zugabe von löslichem Peptidoglykan signifikant inhibiert. In verschiedenen Bindungsstudien wurde das Peptidoglykan als Pneumokokken-Adhäsin für TSP1 identifiziert. Weiterhin wurde herausgestellt, dass nicht nur S. pneumoniae, sondern auch andere Gram-positive pathogene Bakterien, wie Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Listeria monocytogenes und verschiedene apathogene Bakterien mit TSP1 interagieren, im Gegensatz zu Gram-negativen Bakterien. Es konnte gezeigt werden, dass TSP1 das Peptidoglykan aller getesteten Gram-positiven Bakterien erkennt. Diese Beobachtung weist auf einen allgemeingültigen Mechanismus der Bakterien-Wirt Interaktion hin, der wahrscheinlich von großer Bedeutung für die Pathogenese Gram-positiver Bakterien ist. Als Rezeptoren für TSP1 auf der Wirtszellseite wurden Proteoglykane auf der Oberfläche von eukaryontischen Zellen identifiziert. Weiterhin konnte herausgestellt werden, dass eine Interaktion der Gram-positiven Bakterien mit TSP1 nicht nur eine Adhärenz an Wirtszellen vermittelt, sondern die Bakterien vor einer Phagozytose durch primäre Granulozyten schützt. Zusammenfassend beweisen diese Ergebnisse eine spezifische Interaktion von Gram-positiven Bakterien mit TSP1, die zur bakteriellen Kolonisierung des Wirtsgewebes beiträgt. Das Peptidoglykan übernimmt die Funktion eines bakteriellen Adhäsins für TSP1, so dass TSP1 als molekulare Brücke die Interaktion von Gram-positiven Bakterien und Wirtszell-Proteoglykanen vermittelt. Diese Untersuchungen tragen in bedeutender Weise zu einem besseren Verständnis der Pathogenese von Infektionen durch S. pneumoniae und anderen Gram-positiven Bakterien bei.
Der human pathogene Erreger Streptococcus pneumoniae besiedelt symptomlos den Nasenrachenraum des Menschen, löst aber auch Infektionen wie Otitis Media und invasive Erkrankungen wie Pneumonie und Meningitis aus. Einen essentiellen Schritt für den Infektionsprozess stellt die Anheftung von S. pneumoniae an die Epithel- und Endothelzellen des Wirtes dar. Im Infektionsverlauf ist auch das nachfolgende Eindringen der pathogenen Mikroorganismen in das humane Gewebe von wichtiger Bedeutung. An dieser Interaktion zwischen Erreger und Wirtszellen sind sowohl bakterielle Virulenzfaktoren als auch Komponenten des Wirtes beteiligt. Der pneumococcal adherence and virulence factor A (PavA) von S. pneumoniae ist ein Fibronektin-bindendes Oberflächenprotein und ist essentiell für die Virulenz in einem Sepsis- und einem Pneumonie-Mausinfektionsmodell (Holmes et al., 2001; Lau et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit konnte PavA zusätzlich in einem experimentellen Maus-Meningitis-Modell als Virulenzfaktor identifiziert werden. In in vitro Infektionsstudien zeigten pavA-defiziente Pneumokokkenmutanten eine signifikant verringerte Adhärenz an und Invasion in alveoläre Epithelzellen A549 von Typ II Pneumozyten, in Larynxkarzinomzellen HEp-2, in humane Hirnendothelzellen HBMEC und in humane Nabelschnurendothelzellen HUVEC. Diese Zelllinien repräsentieren modellhaft typische Gewebezellen, mit denen S. pneumoniae während des Infektionsprozesses in Kontakt treten kann. Die signifikante Reduktion der Adhärenz der pavA-Mutante ist auf die Mutagenese des pavA-Gens zurückzuführen, da die Komplementierung mit einem aktiven pavA-Gen die Adhärenz an die humanen Zellen wiederherstellte. In Inhibitionsstudien blockierte anti-PavA-Antiserum die bakterielle Bindung an immobilisiertes Fibronektin, die über den C-terminalen Bereich des PavA-Proteins vermittelt wird. Im Gegensatz dazu wurde die Adhärenz von S. pneumoniae an die humanen Wirtszellen in Inhibitionsstudien mit anti-PavA-Antiserum oder rekombinantem PavA-Protein nicht blockiert. Zusammenfassend ist PavA ein wichtiger Virulenzfaktor für die Infektion und das Überleben der Erreger in vivo und spielt gleichzeitig auch eine Rolle während der Adhärenz von Pneumokokken an die humanen Wirtszellen in vitro. Allerdings beeinflusst PavA den Anheftungsprozess nicht direkt als Adhäsin, sondern scheint die Funktion anderer, wichtiger, bisher unbekannter Virulenzfaktoren von S. pneumoniae zu regulieren. Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurde die Interaktion von S. pneumoniae mit dem Glykoprotein Fibronektin und deren Bedeutung für die Kolonisierung und den Infektionsmechanismus in vitro untersucht. S. pneumoniae bindet direkt an immobilisiertes Fibronektin (van der Flier et al., 1995). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Pneumokokken Fibronektin sowohl wirtsunabhängig aus dem Plasma rekrutieren als auch reines lösliches Fibronektin binden können. Dabei binden Pneumokokken sowohl die multimere, zelluläre Form des Fibronektins als auch das lösliche, dimere Plasma-Fibronektin. Die Zugabe von Fibronektin verstärkt die Adhärenz von S. pneumoniae an die humanen Nasopharynxepithelzellen Detroit 562, die Larynxzellen HEp-2, die Bronchialepithelzellen A549 und die Hirnendothelzellen HBMEC. Die Fibronektin-vermittelte Anheftung von Pneumokokken an die Nasopharynxzellen Detroit 562 und die Hirnendothelzellen HBMEC erfolgt wahrscheinlich über die Heparin-Bindungsdomäne, da die bakterielle Adhärenz durch die Zugabe von Heparin inhibiert wird. Weitere Inhibitionsstudien zeigten, dass weder die Präinkubation der Erreger mit anti-PavA-Antiserum noch die Zugabe von rekombinantem PavA-Protein die Fibronektin-vermittelte Adhärenz an die Wirtszellen blockierte. Die Interaktion von S. pneumoniae über das Brückenmolekül Fibronektin mit den humanen Wirtszellen findet damit nicht über das Fibronektin-bindende Oberflächenprotein PavA statt. Fibronektin vermittelt nicht nur die Adhärenz von S. pneumoniae an die Wirtszellen, sondern auch deren Internalisierung. In Inhibitionsstudien mit spezifischen Inhibitoren des Aktin-Zytoskeletts und der Mikrotubuli konnte gezeigt werden, dass die Dynamik des Zytoskeletts eine essentielle Rolle für die Fibronektin-vermittelte Internalisierung der Pneumokokken in die Wirtszellen spielt. Außerdem wurde durch die Zugabe von pharmakologischen Inhibitoren der Tyrosin Kinasen, der Familie der Src-Kinasen und der Phosphatidylinositol (PI-3)-Kinase die Fibronektin-vermittelte bakterielle Invasion in humane Zellen signifikant blockiert. Die Invasion von S. pneumoniae in Mausfibroblasten, die defizient für die fokale Adhäsionskinase (FAK) waren, war im Vergleich zu der bakteriellen Invasion in die Wildtyp-Fibroblasten reduziert. Diese Ergebnisse zeigen die Beteiligung der Src-Kinasen, der PI-3-Kinase und der FAK an der Signaltransduktion, die für die Fibronektin-vermittelte Invasion von S. pneumoniae in eukaryotische Zellen notwendig ist.
Eine eindeutige Unterscheidung zwischen extraintestinal pathogenen (ExPEC) und kommensalen E. coli-Stämmen zu treffen, fällt häufig schwer, da Virulenz-assoziierte Faktoren von ExPEC auch in kommensalen Stämmen gefunden werden können. Als naher Verwandter des uropathogenen Isolates E. coli CFT073 weist der apathogene, kommensale Stamm E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1) die Expression einer Vielzahl solcher „ExPEC-Virulenzfaktoren“ auf. Dazu gehören verschiedene Fimbrien, Siderophore und Proteine, die an der Biofilmbildung beteiligt sind. Der Vergleich des Stammes mit ExPEC-Isolaten lässt daher Rückschlüsse auf die Funktion dieser Faktoren im jeweiligen ökologischen Kontext zu. E. coli Nissle 1917 bildet den sog. rdar-Morphotyp aus, eine multizelluläre Struktur, die auf der Koexpression von Zellulose und Curli-Fimbrien beruht. Dieser findet sich bei vielen E. coli und Salmonella-Spezies, tritt aber in der Regel nur bei Temperaturen unterhalb 30 °C auf. E. coli Nissle 1917 hingegen weist diesen Phänotyp auch bei 37 °C auf, was vermutlich die Kolonisierungsfähigkeit gegenüber anderen kommensalen E. coli erhöht. Hier konnte demonstriert werden, dass die Expression des rdar-Morphotyps bei E. coli Nissle 1917 unabhängig von den bisher beschriebenen Regulatoren CsgD und YaiC ist. Mittels Mutagenese mit dem Transposon miniTn5 wurde nach rdar-negativen Klonen gesucht mit dem Ziel, einen möglichen übergeordneten Regulator dieses Phänotyps zu identifizieren. Bei dieser Untersuchung wurden einige Gene ermittelt, die bislang nicht dafür bekannt waren, die Expression von Zellulose oder Curli-Fimbrien zu beeinflussen. Während die Funktion vieler der ermittelten ORFs unbekannt war, hatte vor allem die Inaktivierung von Genen, die an der Biosynthese von Oberflächenstrukturen (Fimbrien, Kapsel, Colansäure, LPS) einen veränderten Phänotyp zur Folge. Allerdings konnte in den wenigsten Fällen ein Zusammenhang zu Curli- oder Zellulosesynthese hergestellt werden. Es zeigte sich, dass die Regulation des rdar-Morphotyps offenbar komplexer und von mehr Faktoren zumindest indirekt abhängig ist, als bislang beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine 55 kb große genomische Insel untersucht, die im asnW-tRNA-Lokus inseriert ist und die Proteine für die Synthese eines hybriden nichtribosomalen Peptid-Polyketids kodiert. Die Insel konnte mittels PCR in extraintestinal pathogenen sowie kommensalen Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 nachgewiesen werden, darunter die Stämme E. coli Nissle 1917, IHE3034, CFT073 und J96. Eine Kokultivierung von HeLa-Zellen mit diesen Bakterien hatte eine Blockierung des Zellzyklus und Megalozytose (zytopathischer Effekt) zur Folge. Die Deletion der asnW-Insel führte zur Aufhebung des zytopathischen Phänotyps, der durch Einbringen des Genclusters auf einem BAC-Vektor wieder hergestellt werden konnte. Der zytopathische Effekt konnte nur nach direktem Kontakt der Bakterien mit HeLa-Zellen beobachtet werden und war weder durch Bakterienlysate, abgetötete Bakterien oder Kulturüberstände zu erzielen. Das PKS/NRPS-Gencluster umfasst 18 ORFs (clbA bis clbR), von denen 17 an der Synthese der aktiven Komponente beteiligt sind. Die Anzahl der Genprodukte und die Abfolge der putativen Domänen unterscheidet sich dabei von allen bislang beschriebenen PKS/NRPSSystemen. Untersuchungen zur Transkription ergaben drei monocistronisch und vier teilweise sehr große (bis 23 kb) polycistronisch transkribierte Einheiten aus bis zu sechs ORFs. Zudem konnte eine konstitutive Transkription aller ORFs festgestellt werden, wenngleich in unterschiedlicher Stärke. Nach Kontakt mit HeLa-Zellen wurde keine erhöhte Transkription oder Promotoraktivität einzelner ORFs festgestellt. Daher scheint die Kontaktabhängigkeit des zytopathischen Effekts nicht auf einer durch HeLa-Zellen hervorgerufenen Induktion der PKS/NRPS-Expression zu beruhen. Die Kontaktabhängigkeit konnte durch die Induktion bzw. Überexpression einer PKS/NRPS (clbB), den putativen Schlüsselenzymen Thioesterase (clbQ) und Phosphopantetheinyl-Transferase (clbA) oder dem möglichen Regulator clbR nicht überwunden werden. Mittels Luziferase-Reportergenfusionen konnte ein Einfluss unterschiedlicher Medien und Kulturbedingungen auf die Promotoraktivität einzelner Gene festgestellt werden. Dies wurde auf den Einfluss des BarA/UvrY- Zweikomponentensystems zurückgeführt, welches über CsrA/CsrBC den Kohlenstoff-Metabolismus von E. coli post-transkriptional reguliert. Die natürliche uvrY-Deletionsmutante UPEC 536 wies trotz des Besitzes des kompletten PKS/NRPS-Genclusters keinen zytopathischen Effekt auf. Dieser konnte jedoch durch Komplementation mit uvrY wieder hergestellt werden. Dies ist der erste Hinweis für einen außerhalb der asnW-Insel liegenden Regulationsmechanismus der PK/NRP-Synthese. Die Funktion des Peptid-Polyketids in vivo bleibt weiterhin unklar und könnte sowohl Fitness als auch Virulenz von E. coli beeinflussen.
Das Gram-positive, Koagulase-negative Bakterium Staphylococcus epidermidis war viele Jahrzehnte als harmloser Kommensale der menschlichen Haut und der Schleimhäute bekannt. Jedoch hat sich S. epidermidis in den letzten zwanzig Jahren zu einem Haupterreger von Nosokomialinfektionen entwickelt. Dabei unterscheidet sich S. epidermidis im Vergleich zu anderen Erregern durch ein sehr begrenztes Spektrum an Pathogenitätsfaktoren, aber auch durch seine Fähigkeit, Biofilme auf künstlichen Oberflächen wie Kathetern und Implantaten formen zu können. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit zwei Hauptaspekten, die in der Pathogenität von S. epidermidis eine wichtige Rolle spielen: (i) dem Quorum-sensing System Agr (accessory gene regulator) und (ii) dem zeitlichen Prozess des Aufbaus, sowie der Regulation der Biofilmbildung von S. epidermidis. Das Quorum-sensing System Agr ist Teil eines komplexen regulatorischen Netzwerks. In der vorliegenden Arbeit wird durch Proteom- und Transkriptomanalysen gezeigt, dass das Agr-System in S._epidermidis den Hauptregulator für die Sekretion von extrazellulären Proteinen darstellt und darüber hinaus einen großen Einfluss auf die Regulation des Zentralmetabolismus und der Biosynthese von Aminosäuren hat. Mittels Mikroarray-Analyse konnte eine wichtige Verknüpfung des Agr-Systems mit dem pleiotrophen Repressor CodY identifiziert werden, der viele stationäre-Phase Gene im S._epidermidis Wildtyp reprimiert, jedoch nicht in der getesteten agr Mutante. Dieses führt zu einem stark veränderten Phänotyp der S. epidermidis agr Mutante, in Hinblick auf Wachstumskapazität, der Biofilmbildung, der Invasivität und dem Langzeitüberleben. Interessanterweise ergaben wissenschaftliche Studien, dass ca. 17 % der klinischen Isolate natürlich vorkommende agr Mutanten sind. Dieses könnte ein Hinweis darauf sein, dass S. epidermidis agr Mutanten aufgrund ihres stark veränderten Phänotyps und ihrer veränderten biochemischen Bedürfnisse und Kapazität in der Lage sind, andere ökologische Nischen im menschlichen Wirt zu besiedeln. Der zweite Teil dieser Arbeit hat die Biofilmbildung von S. epidermidis zum Thema. Durch die Etablierung eines standardisierten Modells der Biofilmbildung, war es möglich, über die Einführung einer Biofilm-Adhäsion-Ratio die Biofilmbildung als zeitlichen dynamischen Prozess darzustellen und verschiedenste Bedingungen und Stämme miteinander zu vergleichen. Dabei zeigte sich, dass die Biofilmbildung in S._epidermidis ein klar zeitlich strukturierter Prozess ist, der von Umweltfaktoren und der Nährstoffsituation abhängig ist, und dass verschiedene Stämme sehr unterschiedlich auf Veränderungen in ihrer Umwelt reagieren. Die zeitliche Analyse der Biofilmbildung mittels konfokaler Lasermikroskopie ergab, dass viele der Bakterien im Biofilm sterben. Dieses macht den Biofilm wesentlich anfälliger für Strömungsscherkräfte, die dann ganze Bakterienverbände ablösen und zu neuen Infektionsherden schwemmen könnten. Somit ermöglicht der Tod einer einzelnen Zelle unter Umständen ein besseres klonales Überleben. Die Mikroarray-Analysen der Genexpression im Biofilm zeigten, dass dieser einen physiologisch klar definierten Prozess durchläuft, der zu einer sehr stark verminderten metabolischen Aktivität und einer erhöhten Antibiotika-Resistenz führt. Darüber hinaus zeigen Bakterien im Biofilm einen weniger aggressiven Charakter, wie die Expression von Proteasen oder anderer Pathogenitätsfaktoren, welches S. epidermidis dabei hilft, dem Immunsystem des Wirts zu entgehen. Diese neuen Ergebnisse zur Regulation der Genexpression im Biofilm und zur Rolle des Quorum-sensing Systems Agr in S. epidermidis tragen wesentlich zum Verständnis der Pathogenität und der Physiologie dieses wichtigen nosokomialen Erregers bei. Sie bilden eine wichtige theroretische Grundlage für weiterführende Studien, mit dem Ziel in Zukunft neue Therapie- und Präventionsansätze gegen S. epidermidis-Infektionen zu entwickeln.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der genetischen Variabilität verschiedener uropathogener E. coli Stämme. Diese wurden mittels phänotypischer Tests, Multiplex-PCR, Pulsfeldgelelektophorese und DNA-DNA Hybridisierung unter Verwendung zweier verschiedener DNA-Makroarrays durchgeführt. Die Stammauswahl umfasste 12 uropathogene und fäkale Isolate von Patientinnen mit chronischen Harnwegsinfektionen. Die Stämme wurden zu unterschiedlichen Zeiten der Infektion abgenommen und schon in Vorgängerarbeiten genauer phänotypisch und genotypisch untersucht. Es wurde in diesem Zusammenhang u. a. vermutet, dass sich die Stämme im fortschreitenden Verlauf der Infektion möglicherweise in ihrer genetischen Ausstattung verändert hatten. Der Gegenstand dieser Arbeit war nun der Ausschluss von Kontaminationen oder Mischkulturen unter diesen 12 Stämmen und die genauere Untersuchung der Genomveränderungen bzw. Genomplastizität im Verlauf der Infektion. Neben diesen Stämmen wurden 18 weitere Stämme ausgewählt. Neun davon waren ahämolytische Mutanten der Stämme 536, 764 und 768. Durch den Vergleich mit dem jeweiligen Wildtyp sollte geklärt werden, ob sich ein identischer Mechanismus hinter dem Verlust der Hämolysefähigkeit (Deletion einer PAI durch site-spezifische Rekombination) finden lässt oder jede dieser Mutanten verschiedene eher zufällige Deletionen aufweist. Des weiteren wurden drei uropathogene Isolate untersucht, die die Fähigkeit zur Bildung von Curli verloren haben sowie zwei UPEC Stämme, bei denen unter Antibiotikaeinfluss die Bildung von L-Formen beobachtet wurde. Durch den Einsatz von DNA-Arrays sollte auf Genomebene nach möglichen Ursachen für die jeweiligen Phänotypen gesucht werden.
Bakterielle Aufnahme, Selektivität und interne Prozessierung bei marinen Schwämmen (Porifera)
(2006)
Marine Schwämme (Porifera) gelten als die evolutionär ältesten Metazoen. Sie sind in allen Meeren verbreitet und tragen einen großen Anteil zur Invertebraten-Fauna bei. Ihrer Lebens-weise als Filtrierer entsprechend pumpen Schwämme bis zu 23.000 l Seewasser Kg-1 Schwamm Tag-1. Das enthaltene Bakterioplankton wird mit hoher Effizienz ausgefiltert und dient als Nahrung. Gleichzeitig enthalten einige Schwammspezies eine sehr hohe Anzahl phylogenetisch diverser Bakterien extrazellulär in der Mesohylmatrix, die bis zu 40% der Gesamtbiomasse ausmachen. Die als Symbionten bezeichnete Bakteriengemeinschaft weist eine hochgradig spezifische phylogenetische Zusammensetzung auf, die bei unterschiedlichen Schwammspezies, jedoch nicht im Seewasser oder Sediment, gefunden wird. Im Rahmen dieser Dissertationsarbeit wurden unterschiedliche Muster der Bakterien-haltigkeit mariner Schwämme durch Elektronenmikroskopie beschrieben. Die Gruppe der bakterienhaltigen Schwämme wies eine hohe Anzahl von Mikroben im Mesohyl auf. Aufgrund der bakteriellen Verteilung wurde zwischen stark und intermediär bakterienhaltigen Spezies unterschieden. Stark bakterienhaltige Schwämme zeigten eine gleichmäßig dichte Verteilung der Mikroben im Mesohyl, die Bakterienkonzentrationen lagen bei 109 - 1010 Zel-len g-1 Schwamm. Intermediär bakterienhaltige Schwämme enthielten lokale Anhäufungen von Mikroben, die in allen Stellen des Tieres gefunden wurden. Die Zellzahlen lagen bei 108 – 109 Bakterien g-1 Schwamm. Die Gruppe der bakterienarmen Schwämme wurde durch ein mikroskopisch bakterienfreies Mesohyl charakterisiert, die Bakterienkonzentrationen betrugen ~106 Zellen g-1 Schwamm und waren damit vergleichbar zu natürlichem Seewasser. In Korrelation zum Bakteriengehalt wurden anatomische Unterschiede des Gewebes beider Schwammgruppen beobachtet. Die bakterielle Aufnahme von Schwämmen wurde an einzelnen Individuen in Filtra-tionsexperimenten untersucht. Es wurde die Aufnahme des „Futterbakteriums“ Vibrio sp. SB177 und des schwammspezifischen Symbiontenkonsortiums gemessen. Die bakterien-haltigen Schwämme Aplysina aerophoba und Chondrosia reniformis wiesen im Vergleich zu „Futterbakterien“ eine sehr stark verminderte Aufnahme gegenüber ihren eigenen Symbionten auf, bei A. aerophoba sank die Filtrationsrate von rn = 2,76 x 106 auf 5,47 x 104 Bakterien g-1 Schwamm h-1. Die bakterienarmen Schwämme Dysidea avara und Tethya aurantium zeigten eine effiziente und undifferenzierte Aufnahme gegenüber allen Mikroben. Das nur bei bak-terienhaltigen Schwämmen gefundene Muster der stark verminderten Aufnahme von Symbi-onten ist statistisch signifikant. Untersuchungen zum Einfluss abdaubarer bakterieller Zell-wandproteine und der bakteriellen Flagelle erbrachten keine Hinweise auf eine Beteiligung dieser Faktoren am bakteriellen Filtrationsprozess der Schwämme. Zur Untersuchung einer möglichen Filtrationsselektivität gegenüber bestimmten bak-teriellen Vertretern des Seewasser- und des Symbiontenkonsortiums wurden Filtrationsexperi-mente durchgeführt. Proben des Inkubationswassers wurde während des Experiments entnom-men und die phylogenetische Zusammensetzung der Konsortien mittels Denaturierender Gradienten Gel Elektrophorese (DGGE) untersucht. Die Banden wurden anhand der Stärke über den zeitlichen Verlauf klassifiziert. Von den anfänglich 40 nachweisbaren Banden des Seewasserkonsortiums wurden nach 300 Minuten experimenteller Dauer eine als konstant, 18 als reduziert und 21 als verschwindend eingeordnet. Für das Symbiontenkonsortium wurden von den initial 65 Banden nach 300 Minuten 30 Banden als konstant, 19 als reduziert und 16 als verschwindend klassifiziert. Während für das Seewasserkonsortium eine Aufnahme fast aller bakterieller Phylotypen überwog, unterlagen nur wenige Phylotypen des Symbionten-konsortiums einer starken Aufnahme. Durch Sequenzierung und phylogenetische Zuordnung repräsentativer Banden wurde gezeigt, dass für die bakterielle Aufnahme keine Selektivität gegenüber einer bestimmten phylogenetischen Abstammungslinie besteht. So wurden z. B. Phylotypen der Chloroflexi als konstant, reduziert, als auch verschwindend beurteilt. Die interne Prozessierung und der Transport aufgenommener Partikel und Bakterien im Mesohyl wurde mikroskopisch untersucht. A. aerophoba transportierte große Aggregate aufgenommener Latex Beads in speziellen Schwammzellgruppen durch das Mesohyl. Es konnte keine Abgabe der Beads in die extrazelluläre Matrix (ECM) beobachtet werden. D. avara transportierte einzelne Beads durch das Mesohyl, nach 300 Minuten wurden zahlreiche Beads in der ECM gefunden. Die bakterielle Aufnahme wurde an dem GFP-exprimierenden „Futterbakterium“ Vibrio sp. MMW1 visualisiert. Die Bakterien wurden mit hoher Effizienz von A. aerophoba aufgenommen, konnten jedoch nicht in tieferen Mesohylbereichen nach-gewiesen werden, was auf eine zügige Lyse der Zellen hindeutete. Fluoreszenzmarkierte Symbiontenzellen wurden nicht von A. aerophoba aber, in Übereinstimung mit den Filtrationsexperimenten, von dem bakterienarmen D. avara aufgenommen. Die Ergebnisse belegen, dass bakerienhaltige Schwämme über einen komplexen Mechanismus der bakteriellen Aufnahme verfügen, durch den zwischen Futterbakterien und Symbionten unterschieden wird. Schwämme stellen deshalb ein interessantes Modellsystem zur Untersuchung von Mechanismen der generellen Phagozytose und der gleichzeitigen Tolerierung von symbiontischen Bakterienzellen im Gewebe dar.
Staphylococcus epidermidis ist ein wichtiger Bestandteil der gesunden Hautflora des Menschen, gleichzeitig aber auch der häufigste Erreger nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Die Forschungsarbeiten haben sich in den vergangenen Jahren besonders auf Faktoren und Mechanismen konzentriert, welche zur Etablierung der Spezies als Pathogen beigetragen haben. Eine typische Eigenschaft klinischer Isolate ist die Fähigkeit, auf künstlichen Oberflächen Biofilme zu bilden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der IS-vermittelten Genomflexibilität und der Vergleich der Genomstruktur nosokomialer und kommensaler Isolate von S. epidermidis. Dazu wurde eine 260 kb große spontane Deletion im Chromosom des Biofilm-bildenden Stammes S. epidermidis 307 sequenziert und annotiert, von der bekannt war, dass sie durch eine homologe Rekombination zweier IS256-Kopien ausgelöst wurde. Auf dem deletierten Fragment fanden sich neben dem ica-Operon zahlreiche potentielle Virulenz-assoziierte Gene. Das überraschende Ergebnis dieser Analyse war jedoch die Identifizierung eines neuartigen SCC-Elementes, das den rechten Rand der Deletion begrenzt. Dies ist die erste Beschreibung eines SSC-Elementes mit einer CcrC-Rekombinase, dem das Methicillin-Resistenzgen mecA fehlt. In der Nähe des Rekombinasegens fand sich S.-haemolyticus-spezifische DNA. Weitere Untersuchungen zeigten, dass das SCC-Element durch die IS256/Tn4001 -vermittelte Deletion in der Mutante verkürzt wurde. Genomvergleiche ica-positiver und ica-negativer Stämme von S. epidermidis mittels Microarrays, sowie in-silico-Analysen zweier vollständiger S.-epidermidis-Genome ergaben, dass sich kommensale und pathogene Stämme in nur wenigen Faktoren unterscheiden. Diese befinden sich jedoch fast alle in einer Region um den oriC, in dessen Nähe auch die Insertionsstelle für die SCCmec-Inseln lokalisiert ist. Das deletierte DNA-Fragment von S. epidermidis 307 konnte ebenfalls dieser Region zugeordnet werden, die offenbar eine Zone hoher genomischer Flexibilität darstellt, in der fremde DNA integriert werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass das ica-Operon diesen variablen Genomabschnitt begrenzt. Die exakte Grenze zwischen ica-positiven und ica-negativen Stämmen bildet eine Thr-tRNA, die in einer 1,4 kb großen intergenischen Region stromabwärts des icaR-Regulatorgens lokalisiert ist. In unmittelbarer Nachbarschaft konnte ein Transkript nachgewiesen werden, welches nur in ica-positiven S. epidermidis vorkommt. Gestützt auf bioinformatische Analysen wurden zunächst die Polarität und Länge des Transkriptes, sowie der korrespondierende Promotor experimentell bestimmt. Demnach handelt es sich um eine 487 nt lange RNA, die entgegengesetzt zur Thr-tRNA orientiert ist und mit dieser teilweise überlappt. Da die Nukelotid-Sequenz weder eine Ribosomen- Bindungsstelle noch einen größeren Leserahmen aufweist, ist es sehr wahrscheinlich, dass es sich um eine nicht-translatierte RNA handelt. Qualitative RT-PCR-Experimente zeigten, dass die IGRica-RNA kostitutiv exprimiert wird. Spontane IS256 –Insertionsmutanten in der Promotorregion der IGRica-RNA wiesen phänotypisch eine deutlich verminderte Biofilmbildung auf. Daher ist zu vermuten, dass die IGRica-RNA in die Regulation dieses wichtigen Virulenzfaktors involviert ist. In der vorliegenden Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass S. epidermidis das in vielen Spezies konservierte Hfq-Protein exprimiert, welches ein Bindungspartner und Chaperon für zahlreiche regulatorische RNAs darstellt. gel-shift-Experimente mit rekombinantem Hfq-Protein aus S. epidermidis ergaben jedoch keine nachweisbare Wechselwirkung der IGRica-RNA mit diesem Faktor in vitro. Insgesamt hat die Studie gezeigt, dass S. epidermidis eine Spezies mit einer außerordentlich hohen Genomflexibilität ist, die sich hauptsächlich in einer bestimmten Genomregion abspielt und für die IS-Elemente von besonderer Bedeutung sind. Die Identifizierung von DNA aus anderen Staphylokokken-Arten in dieser Region zeigt, dass S. epidermidis zu horizontalem Gentransfer über Speziesgrenzen hinweg in der Lage ist. Dies, sowie die Daten zur neuen SCC-Kassette, unterstreichen die Bedeutung von S. epidermidis als Reservoir für die Entwicklung neuartiger Resistenz- und Virulenzdeterminanten, die gerade im Krankenhausmilieu auf Spezies mit höherem Virulenzpotential übertragen werden können und so einen wichtigen Faktor für die anhaltende Problematik nosokomialer Infektionen mit S. aureus darstellen. Die Entdeckung einer RNA mit möglicherweise regulatorischer Funktion ist der erste Faktor dieser Art, der – abgesehen von einigen phylogenetisch hoch konservierten RNAs – bisher in S. epidermidis nachgewiesen wurde. Die funktionale Analyse der IGRica-RNA und die Suche nach weiteren regulatorischen RNAs in Staphylokokken eröffnen ein Forschungsfeld, das zum besseren Verständnis der Lebensweise dieser bedeutenden Erreger beitragen kann.
Die haploide Amöbe Dictyostelium discoideum hat sich als geeinet erwiesen für die Untersuchung der zellulären Aspekte der Legionella Infektion. Nach der Aufnahme befindet sich L. pneumophila innerhalb eines unreifen Phagosoms das weder angesäuert wird noch mit Lysosomen fusioniert. In dieser Studie wurden die Wirtzellfaktoren untersucht, die Legionella eine erfolgreiche Kolonizierung des Wirt ermöglichen. Phagozytoseversuche mit spezifischen zellulären Inhibitoren und die Analyse der Aufnahme in definierten Wirtzell-Mutanten haben gezeigt, daß das zytoplasmatische Kalziumniveau, Zytoskelettproteine und die Kalzium-bindenden Proteine des ERs, Calreticulin und Calnexin, spezifisch die Aufnahme und das intrazelluläre Wachstum von L. pneumophila beeinflussen. Mikroskopisches Untersuchungen mit GFP-markierten Calnexin und Calreticulin haben gezeigt, dass beide Proteine spezifisch in den "phagocytic cups" der L. pneumophila-infizierten Wirtszellen akkumulieren. Beide Proteine umhüllten die replikative Vakuole von L. pneumophila während der gesamten Replikation des Bakteriums. Die kumulativen Effekte intrazellulären Kalziumniveaus, die räumliche Verteilung von Calnexin und Calreticulin und die Defekte Aufnahme und intrazelluläre Vermehrung von L. pneumophila im Calnexin- und Calreticulin-minus der Zellen deuten darauf hin, daß diese Faktoren ein Teil des Regulationssystems sind, der zu der Bildung der spezifische Vakuole von L. pneumophila führt.
The obligate intracellular gram-negative bacterium, Chlamydophila pneumoniae (Cpn), has a significant impact as an acute and chronic disease-causing pathogen. Its potential to undergo persistent infections has been linked to chronic diseases. Several in vitro cell culture models are used to study persistent conditions, mainly IFN_ stimulation, treatment with antibiotics and iron depletion. Little is known about changes in the Cpn transcriptome during the acute and persistent infection. Therefore, the Cpn transcriptome during its acute developmental cycle and iron depletion-mediated persistence was examined in this study. Based on expression profiles, genes with similar expression changes formed 12 clusters using the self-organizing map algorithm. While other studies define genes based on their onset of transcription, here the important feature for clustering was the expression profile. This turned out to be more appropriate for comparing the time specific relevance of a certain cluster of genes to their proposed functions in the cycle. The Cpn clusters were grouped into the 'Early', 'Mid' and 'Late' classes as described for Ctr. Additionally, a new gene expression class containing genes with steadily increasing expression at the end of the developmental cycle was defined and termed 'Tardy' class. Comparison of the Cpn clusters to published proteomics data showed that genes encoding elementary body (EB) proteins peaked in the 'Late' gene cluster. This indicated that genes of the ‘Late’ and ‘Tardy’ class have different roles in RB to EB re-differentiation. Moreover, using lexical comparison the EB mRNA profile was significantly linked to the ‘Tardy’ cluster class. This provided evidence that initial translation in the cycle might be directed from stable transcripts present in the infectious EB form. Based on these criteria the novel ‘Tardy’ class was separated from the ‘Late’ class. The gene ontologies were used to identify specific pathways and physiological functions active during the different phases of development. Additionally, the transcriptome of Cpn in the persistent stage was compared to that of the acute developmental cycle. The Cpn transcriptome was altered in the iron-depletion mediated persistence. Genes upregulated were linked to clusters at the beginning of the developmental cycle, and genes down-regulated were linked to clusters at the end of the developmental cycle. These data provided strong evidence that the Cpn transcriptome during persistence is a gene expression arrest in mid-development. In early acute infection convergently or divergently oriented gene pairs preferentially had an antagonistic expression profile, whereas tandemly oriented gene pairs showed a correlated expression profile. This suggests that the Cpn genome is organized mainly in tandemly arranged operons and in convergently or divergently oriented genes with favored antagonistic profiles. The microarray studies done with the Cpn strain CWL029 also showed expression signals for several genes annotated only for the Cpn strains AR39 and J138. BLAST comparison verified that these genes are also coded in the CWL029 genome. Several of these genes were convergently arranged with their neighboring gene and shared overlapping genome information. Among these were parB, involved in DNA segregation and rpsD, an alternative sigma factor responsible for the transcription at late stages of the developmental cycle. Both genes have been described to have major roles in the chlamydial cycle. These genes had an antagonistic expression profile at the beginning of the acute developmental cycle and in persistence, as described before to be predominant for convergently oriented genes. Real time RT-PCR analysis showed that full-length rpsD mRNA transcripts were down-regulated, whereas short-length rpsD mRNA transcripts were up-regulated during the persistent infection. This demonstrated that the rpsD promoter is activated during the persistent infection and that because of the collision of the RNA polymerases full length transcripts were down-regulated. This sigma factor-independent mechanism is known as ‘Transcriptional Interference’. This is the first description on how the alternative sigma factor rpsD might be down-regulated during persistent infections. Finally, the host cell transcriptome was analyzed in the acute and persistent infection mediated by the depletion of iron. Cpn infection triggered the upregulation of relB, involved in an alternative NF-KB signaling pathway. Several genes coding for cell cycle proteins were triggered, including cyclin G2 and cyclin D1 and inhibitors of CDK4. Taken together, this work provides insights into the modulation of the pathogen and the host transcriptome during the acute infection and the iron mediated persistent infection.
Staphylokokken, insbesondere Staphylococcus aureus sowie der Koagulase-negative Staphylococcus epidermidis, haben sich in den letzten Jahren als dominante Erreger nosokomialer Infektionen etabliert. Diese erstaunliche Anpassung an eine neue ökologische Nische beruht bei S. epidermidis vor allem auf drei Faktoren: (i) der Fähigkeit, Biofilme auf abiotischen Oberflächen auszubilden, (ii) dem Erwerb multipler Antibiotikaresistenzen und (iii) einer hohen genotypischen Variabilität. Ein markantes Beispiel für genotypische Variabilität ist die Phasenvariation der Biofilmbildung durch Insertion und präzise Exzision der Insertionssequenz IS256 aus dem ica-Operon. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der „OFF-ON“ Mechanismus der Phasenvariation, die präzise Exzision von IS256, untersucht. Dabei wurde demonstriert, dass IS256 inklusive der 8 bp target site Duplikation in einem Transposase-unabhängigen Prozess vollständig aus dem Chromosom entfernt wird, ohne chromosomale Umordnungen oder neue Insertionen. Präzise Exzision war hingegen abhängig von der Integrität der target site Duplikationen. Auch nach Insertion von IS256-Derivaten auf einem Plasmidsystem (spc::IS256) konnte präzise Exzision Transposase-unabhängig erfolgen. Die Wahrscheinlichkeit der Exzision für die vollständige IS256-Sequenz betrug in diesem System ca. 1x10-11 pro Generation und Zelle. Ab einer Verkürzung der Mikrohomologien zwischen den 8 bp target site Duplikationen auf 6 bp war präzise Exzision nicht mehr nachweisbar. Bei Verkürzung der IS256-Sequenz auf ca. 160 bp (target site Duplikation und inverted repeats blieben intakt) wurde die Wahrscheinlichkeit der präzisen Exzision ca. dreifach erhöht. Diese Beobachtungen unterstützen die Hypothese, dass diese Form der illegitimen Rekombination durch replicational slippage verursacht wird. Gleichzeitig weisen die Daten darauf hin, dass bei der Phasenvariation durch IS256 Insertions- und Exzisionshäufigkeit im Ungleichgewicht stehen. Während der Durchführung der Experimente zur präzisen Exzision aus icaC wurden nach mehrtägiger Passage häufig Varianten isoliert, die trotz noch vorhandener icaC::IS256 Insertion starke Biofilmbildner waren. Derartige biofilmpositive, PIA-negative Phasenvarianten wiesen im Atomic force Mikroskop einen anderen Phänotyp als der Wildtyp auf. Anstelle von fädiger extrazellulärer Substanz wie beim Wildtyp wurde verstärkt eine polymorphe, aus globulären Untereinheiten bestehende Matrix produziert. Im Gegensatz zum Wildtyp, der in einem vorrangig polysaccharidbasierten Biofilm wuchs, wurde dieser alternative Biofilm durch Proteinkomponenten vermittelt. Die Regulation des proteinogenen Biofilms unterschied sich vom PIA-Biofilm. Zugabe von 4 % NaCl inhibierte den proteinogenen Biofilm vollständig, während es im Wildtyp die Biofilmbildung induzierte. Zusatz von 3 % Ethanol im Medium bewirkte eine wesentlich stärkere Induktion der Biofilmbildung als beim Wildtyp. Die Transkriptmenge des accumulation associated protein, aap, war in der Phasenvariante im Vergleich zum Wildtyp erhöht. Dies spiegelte sich auch auf Proteinebene in einer erhöhten Expression von Aap wider. Die Daten zeigen, dass S. epidermidis über einen alternativen Mechanismus der Biofilmbildung verfügt, der zu einer Modulation der IS256-bedingten Phasenvariation der Biofilmbildung führen kann. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die spezifische DNA-Bindung der IS256 Transposase in vitro näher charakterisiert. Dazu wurde die IS256 Transposase heterolog überexprimiert und mittels eines N-terminalen Calmodulin binding tag CBP)gereinigt. Im Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) band die CBP-Transposase spezifisch an IRL bzw. IRR DNA-Fragmente, zeigte jedoch eine leicht erhöhte Affinität zum IRR. Durch Atomic force Mikroskopie ließ sich die Bindung der CBP-Transposase an die inverted repeats innerhalb eines circle junction DNA-Fragments sowie unspezifische DNA-Endbindung nachweisen. Deletionen innerhalb der DNA-Sequenz des linken und rechten inverted repeats und anschließende EMSA-Experimente demonstrierten, dass die Transposase den inneren Bereich der inverted repeats erkennt und bindet. EMSA-Experimente mit verkürzten Transposasederivaten wiesen darauf hin, dass sich das DNA-Bindungsmotiv in der N-terminalen Domäne der Transposase befindet. Die identifizierte Proteinregion (Aa100-130) umfasste zwei a-Helices, getrennt durch einen kurzen turn, mit typischen Charakteristika eines Helix-turn-helix Motivs. Durch Punktmutationen wurden sechs konservierte Aminosäuren in diesem Bereich ausgetauscht und der Effekt im EMSA überprüft. Austausch von L103 und L127 gegen den Helixbrecher Prolin hatte keinen Effekt auf das Bindungsverhalten. Die Mutationen Y111A, G114W, T117A und R118A hingegen führten zu einer stark abgeschwächten Bindung bzw. zum Verlust des Bindungsvermögens. Damit wurde erstmals die DNA-Bindungsdomäne eines Elements der IS256-Familie näher beschrieben.
Der Hefepilz Candida albicans ist Teil der natürlichen Mikroflora auf den Schleimhäuten des Verdauungs- und Urogenitaltrakts der meisten gesunden Menschen. Allerdings kann C. albicans vor allem in immunsupprimierten Patienten auch schwerwiegende Infektionen verursachen. Diese reichen von oberflächlichen Mykosen bis hin zu lebensbedrohlichen systemischen Infektionen. C. albicans besitzt eine Reihe von Eigenschaften, die es diesem opportunistisch humanpathogenen Pilz ermöglichen unterschiedliche Wirtsgewebe zu kolonisieren und zu infizieren. Ein wichtiger Virulenzfaktor sind sekretorische Aspartylproteasen (SAPs), die von einer großen Genfamilie von zehn SAP-Genen codiert werden. Die SAPs werden während der Infektion differentiell exprimiert und übernehmen unterschiedliche Rollen im Infektionsverlauf. So tragen sie zur Adhärenz bei, können Wirtsbarrieren und Moleküle der Wirtsimmunabwehr zerstören oder liefern Nährstoffe, indem sie Proteine abbauen. Unter den zehn SAP-Genen ist SAP2 für ein Wachstum von C. albicans auf Proteinen als alleiniger Stickstoffquelle verantwortlich. Allerdings ist wenig über die Regulation der SAP2-Expression und über die Aufnahme der proteolytischen Abbauprodukte in die Zelle bekannt. In dieser Arbeit wurde eine Familie von Oligopeptidtransportern von C. albicans funktionell analysiert. Da aus früheren Arbeiten bekannt war, dass SAP2 durch Peptide mit mindestens acht Aminosäuren induziert werden kann, könnten einzelne Mitglieder dieser Familie neben der Transportfunktion auch eine Sensorfunktion für Peptide übernehmen und somit über einen Signalweg SAP2 induzieren. In der Genomsequenz von C. albicans wurden neben dem bereits beschriebenen OPT1-Gen sieben weitere Gene identifiziert, deren Genprodukte signifikante Homologie zu Opt1p aufwiesen und die deshalb als OPT2-OPT8 bezeichnet wurden. Um die Rolle dieser putativen Oligopeptidtransporter bei der SAP2-Induktion und beim Transport der durch Sap2p-Aktivität bereitgestellten proteolytischen Abbauprodukte zu untersuchen, wurden Mutanten hergestellt, in denen die OPT-Gene spezifisch deletiert waren. Zu diesem Zweck wurde eine Methode zur gezielten Geninaktivierung etabliert, die auf einem neuen, recycelbaren dominanten Selektionsmarker (caSAT1) beruht, der Resistenz gegen Nourseothricin verleiht. Die “SAT1-Flipping“-Strategie kann direkt in C. albicans Wildstämmen angewendet werden und umgeht somit alle Probleme, die mit der Verwendung von auxotrophen Ausgangsstämmen verbunden sind. Alle Mutanten, in denen jeweils eines der OPT-Gene inaktiviert war, verhielten sich wie der Wildtyp und zeigten keinen Wachstumsdefekt auf bovinem Serumalbumin (BSA) als alleiniger Stickstoffquelle, während eine sap2-Nullmutante unter diesen Bedingungen nicht wachsen kann. Somit ist kein einzelnes OPT-Gen für C. albicans notwendig, um auf BSA als alleiniger Stickstoffquelle zu wachsen. Dagegen zeigten opt123-Triplemutanten ähnlich wie die sap2-Mutante einen starken Wachstumsdefekt auf BSA als alleiniger Stickstoffquelle, der durch Reintegration einer intakten Kopie von OPT1, OPT2 oder OPT3 wieder aufgehoben werden konnte. Der Wachstumsdefekt der opt123-Triplemutanten war nicht auf eine fehlende Induktion von SAP2 zurückzuführen, sondern auf das Unvermögen dieser Mutanten, die durch den proteolytischen Abbau von BSA entstandenen Peptide zu transportieren. Mit Hilfe von Reportergenen konnte gezeigt werden, dass die einzelnen OPT-Gene differentiell exprimiert werden. Während keines der Gene in einem Vollmedium (YPD) exprimiert wurde, wurde eine starke Induktion von OPT1 und OPT3 in Gegenwart von BSA als alleiniger Stickstoffquelle beobachtet. Nach Expression von OPT4 und OPT5 unter Kontrolle des konstitutiven ADH1-Promotors in den opt123-Triplemutanten konnte deren Wachstumsdefekt auf BSA als alleiniger Stickstoffquelle ebenfalls kompensiert werden, während die zusätzliche Deletion dieser Gene in den dabei entstandenen opt1234-Quadruple- und opt12345-Quintuplemutanten den Wachstumsdefekt noch verstärkte. Diese Ergebnisse bestätigten, dass die Gene OPT1-OPT5 für funktionelle Oligopeptidtransporter codieren. Weitere Experimente zeigten, dass die Oligopeptidtransporter unterschiedliche Substratpräferenzen haben. Während das Tetrapeptid LWMR für Stämme, die spezifisch OPT3, OPT4, oder OPT5 exprimierten, ein besseres Substrat war als das Tetrapeptid LSKL, konnten Stämme, die spezifisch OPT2 exprimierten, das LSKL-Peptid verwerten, nicht aber das LWMR-Peptid. Experimente mit Peptiden definierter Länge und Zusammensetzung wiesen außerdem darauf hin, dass die Oligopeptidtransporter in der Lage sind, auch längere Peptide mit bis zu mindestens acht Aminosäuren zu transportieren. Die Evolution einer Genfamilie, die für Oligopeptidtransporter mit unterschiedlicher Substratpräferenz codieren, hat deshalb vermutlich dazu beigetragen, dass C. albicans Proteine sehr effizient als Stickstoffquelle verwerten und sich an die Nahrungsbedingungen in verschiedenen Wirtsnischen optimal anpassen kann.
Der Hefepilz Candida albicans kommt bei den meisten gesunden Menschen als harmloser Kommensale auf den Schleimhäuten des Verdauungs- und Urogenitaltraktes vor, kann aber insbesondere bei immunsupprimierten Patienten sowohl lokal beschränkte mukokutane als auch lebensbedrohliche systemische Infektionen verursachen. C. albicans zeichnet sich durch eine große morphologische Variabilität aus, die dazu beiträgt, dass der Pilz viele unterschiedliche Wirtsnischen erfolgreich besiedeln und infizieren kann. Neben dem durch Umweltsignale gesteuerten Wechsel zwischen Hefe- und Hyphenform kann C. albicans auch spontan und reversibel von der normalen Hefemorphologie (white) in eine sogenannte opaque-Zellform wechseln. Das white-opaque-Switching tritt nur bei Stämmen auf, die homozygot für den mating-type-Lokus (MTLa oder MTL) geworden sind, und ermöglicht das Mating von opaque-Zellen komplementären Paarungstyps. Da white- und opaque-Zellen unterschiedlich gut an bestimmte Wirtsnischen angepasst sind, scheint das white-opaque-Switching auch eine Bedeutung in der Pathogenität des Pilzes zu haben, und es ist von großem Interesse herauszufinden, wie dieser komplexe Prozess gesteuert wird. Die genetische Analyse von C. albicans ist durch das Fehlen einer haploiden Phase und durch eine Abweichung vom universalen Codon-Gebrauch in diesem Pilz erschwert. In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden zur gezielten Geninaktivierung und andere Werkzeuge für die funktionelle Genanalyse in C. albicans entwickelt. Die Möglichkeiten zur kontrollierten Genexpression sind jedoch noch begrenzt. In dieser Arbeit wurde deshalb ein System etabliert, das eine Tetrazyklin-induzierbare Expression von Genen in den verschiedenen morphologischen Formen von C. albicans und unabhängig von den Wachstumsbedingungen erlaubt. Zu diesem Zweck wurde eine Kassette konstruiert, die einen an C. albicans adaptierten, reversen Tetrazyklin-abhängigen Transaktivator (rtTA) enthält und in die Zielgene unter Kontrolle eines rtTA-abhängigen Promotors inseriert werden können. Nach Integration der Kassette ins C. albicans-Genom wird der Transaktivator konstitutiv exprimiert und ermöglicht die Induktion des Zielgens durch Zugabe von Doxyzyklin. Mit Hilfe des GFP-Reportergens wurde bestätigt, dass dieses Tet-On-System eine effiziente, Doxyzyklin-induzierbare Genexpression in Hefe-, Hyphen- und opaque-Zellen von C. albicans erlaubt. Die Tetrazyklin-induzierte Expression eines dominant-negativen CDC42-Allels blockierte in Hefezellen die Ausbildung von Knospen und resultierte in vergrößerten, mehrkernigen Zellen, während die Expression des NRG1-Repressors das filamentöse Wachstum unter allen getesteten Hypheninduktionsbedingungen effizient inhibierte. Eine Expression des MTLa1-Gens unter Kontrolle des Tet-abhängigen Promotors in opaque-Zellen eines MTL-Stammes führte zum Switching der Zellen in die white-Phase, was darauf hinwies, dass der nach dem Mating von a- und -opaque-Zellen gebildete a1/2-Repressorkomplex das Switching in die white-Phase bewirkt. Dagegen induzierte die Expression des MTLa2-Transkriptionsfaktors in -opaque-Zellen das Shmooing, das normalerweise durch das Pheromon des Matingpartners ausgelöst wird. Die Expression der site-spezifischen FLP-Rekombinase unter Kontrolle des Tet-abhängigen Promotors ermöglichte eine Tetrazyklin-induzierbare Deletion von essentiellen Genen und damit die Herstellung von konditional letalen Mutanten. In Kombination mit dem dominanten caSAT1-Selektionsmarker konnte das Tet-On-System auch in C. albicans-Wildtypstämmen eingesetzt werden und stellt daher eine vielseitig verwendbare Methode zur funktionellen Genanalyse und zur Manipulation des zellulären Verhaltens von C. albicans dar. In weiteren Experimenten wurde die Rolle des globalen Transkriptionsrepressors Tup1, der in heterozygoten MTLa/-C. albicans-Stämmen das filamentöse Wachstum inhibiert, und der phasenspezifischen Gene WH11 und OP4 beim white-opaque-Switching untersucht. Die Deletion des TUP1-Gens im MTL-Stamm WO-1 bewirkte, dass die Mutanten keine white- oder opaque-Zellen mehr bilden konnten. Stattdessen produzierten sie vier unterschiedliche Zell- und Koloniephänotypen, die ein verändertes Expressionsmuster von white- und opaque-spezifischen Genen zeigten und zwischen denen sie spontan und reversibel wechseln konnten. Interessanterweise waren drei der vier Varianten zum Mating mit MTLa-opaque-Zellen fähig und bildeten rekombinante Nachkommen. Diese Ergebnisse zeigten, dass Tup1 zwar auch in MTL-Zellen für die Aufrechterhaltung der normalen Zellmorphologie und Genexpression wichtig ist, jedoch nicht für das Switching an sich. Die Deletion des white-spezifischen Gens WH11 im Stamm WO-1 hatte keinen erkennbaren Effekt auf die Zell- und Koloniemorphologie von white- und opaque-Zellen, die phasenspezifische Genexpression oder die Frequenz des Switchings. Ein ähnliches Ergebnis wurde nach Inaktivierung des opaque-spezifischen OP4-Gens erhalten, und die Deletion von OP4-Gen hatte auch keinen Effekt auf das Mating der opaque-Zellen. Allerdings zeigten opaque-Zellen der op4-Mutanten ein im Vergleich zum Wildtyp verlangsamtes Wachstum bei niedrigen Temperaturen und bildeten spontan einen weiteren Koloniephänotyp aus. Die phasenspezifischen Gene WH11 und OP4 sind daher nicht notwendig für das white-opaque-Switching und haben vermutlich spezifischere Funktionen in der Ausprägung des phasenspezifischen Phänotyps.
Staphylokokken sind in erster Linie Saprophyten, welche die Haut und Schleimhäute des Menschen besiedeln und dort eine wichtige Rolle für das Gleichgewicht der gesunden Mikroflora spielen. Gleichzeitig haben sie sich aber auch zu den häufigsten Verursachern nosokomialer Infektionen entwickelt. Vor allem S. aureus und S. epidermidis verursachen Erkrankungen, die von leichten Haut- und Wundinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Pneumonien, Sepsis oder Endokarditis reichen. Infektionen durch S. epidermidis treten dabei meist in Verbindung mit Fremdkörpern wie Kathetersystemen, künstlichen Gelenken und Herzklappen auf. In diesem Zusammenhang scheint vor allem die Fähigkeit, einen Biofilm auf diesen Fremdkörpern bilden zu können eine große Rolle für die Pathogenese zu spielen. Die Therapie von Staphylokokken-Infektionen wird zunehmend durch die ausgeprägte Antibiotikaresistenz dieser Erreger erschwert, die sich mittlerweile auch auf Reserveantibiotika wie Daptomycin, Synercid® (Quinupristin/Dalfopristin) oder Linezolid erstreckt. In der Vergangenheit wurde gezeigt, dass subinhibitorische Konzentrationen des Streptogramin-Antibiotikums Synercid® die Biofilmbildung in S. epidermidis induzieren. Darüber hinaus mehren sich die Hinweise auch bei anderen Bakterien, dass geringe Antibiotika-Konzentrationen, wie sie in natürlichen Habitaten wie zum Beispiel im Boden vorkommen, wichtige Signale bei der Kommunikation von Bakterien untereinander darstellen und möglicherweise eine Funktion bei der Modulation des Metabolismus im Kampf um Nährstoffe ausüben. In dieser Promotionsarbeit sollte daher exemplarisch, mit Hilfe der erst seit kurzem zur Verfügung stehenden DNA-Mikroarray-Technik, der Effekt von subinhibitorischen Synercid®-Konzentrationen auf die globale Genexpression von S. epidermidis und S. aureus analysiert werden. Dabei stand vor allem die Wirkung auf die Biofilmbildung und die Identifikation neuer, an der Biofilmbildung beteiligter Komponenten im Mittelpunkt. Die Ergebnisse zeigen, dass subinhibitorische Synercid®-Konzentrationen bei S. aureus, im Gegensatz zu S. epidermidis, zu einer reduzierten Biofilmbildung führen. Bei beiden Arten ist jedoch die unterschiedliche Biofilmbildung durch eine ausgeprägte Veränderung der allgemeinen Genexpression begleitet. Vor allem war eine starke Induktion von Genen zu beobachten, die für Proteine des Translationsapparates kodieren. Außerdem waren Gene des Nukleotid-Stoffwechsels, der Aminosäure-Synthese und des Kohlenstoff-Metabolismus unterschiedlich reguliert. Des Weiteren konnte mit Hilfe von HPLC-Analysen sowohl bei S. epidermidis als auch bei S. aureus eine reduzierte Konzentration des Signalmoleküls Guanosin-3-5-bisphosphat (ppGpp) festgestellt werden. ppGpp spielt vor allem bei der Kontrolle und Anpassung des Stoffwechsels an Wachstumsbedingungen, wie zum Beispiel das Nährstoffangebot, eine wichtige Rolle. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Inaktivierung der ribosomalen Proteine durch Synercid® die reduzierte ppGpp-Konzentration bedingt, was zum einen zur verstärkten Bildung ribosomaler Proteine führt und zum anderen den Zellstoffwechsel in einer Weise beeinflusst, der eine vermehrte extrazelluläre Polysaccharid-Synthese und damit Biofilmbildung ermöglicht. Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Daten, dass die unterschiedliche Beeinflussung der Biofilmbildung bei S. epidermidis und S. aureus sehr wahrscheinlich durch verschiedene Regulationswege des ica-Operons und/oder unterschiedliche katabolische Fähigkeiten bedingt werden. Die Ergebnisse belegen weiterhin, dass die Wirkung von Antibiotika weit über deren bekannte inhibitorische Effekte hinausgeht und vor allem den Stoffwechsel der Bakterien dramatisch beeinflußt. Die Konsequenzen dieser Befunde sowohl für das Verständinis von mikrobiologischen Konsortien in Ökosystemen als auch für die Anwendung von Antibiotika in der Medizin sind noch nicht abzusehen, bieten jedoch eine interessante Grundlage für weitere experimentelle Arbeiten.
Marine Schwämme (Porifera) stellen eine reichhaltige Quelle für bioaktive Substanzen dar. Oft kommen diese jedoch nur in sehr geringen Mengen im Ausgangsmaterial vor, sodass eine nachhaltige Nutzung für z. B. medizinische Anwendungen nur selten möglich ist. Viele Schwämme sind darüber hinaus mit einer ernormen Biomasse hochgradig Schwamm-spezifischer Mikroorganismen assoziiert, die extrazellulär in der Mesohylmatrix vorliegen. In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden ausgewählte Schwamm-assoziierte Mikroorganismen taxonomisch charakterisiert und auf die Produktion von bioaktiven Sekundärmetaboliten sowie ihr weiteres biotechnologisches Potential hin überprüft. Im Verlauf der vorliegenden Arbeit gelang die Isolierung und taxonomische Charakterisierung eines neuen, obligat marinen Bakteriums des Phylums Verrucomicrobia. Das Isolat Pol012 repräsentiert aufgrund der niedrigen 16S-rRNA Sequenzhomologie von <83% zu kultivierten Verrucomicrobia den ersten Vertreter einer neuen Gattung dieses Phylums. Die Wachstumsbedingungen sowie zelluläre und biochemische Merkmale des Stammes wurden charakterisiert. Es zeigte sich, dass das Isolat Pol012 wahrscheinlich zur Bildung von Prodigiosinen befähigt ist. Prodigiosine sind als cytotoxische Sekundärmetabolite bereits aus anderen Bakterienarten bekannt. Pol012 wurde unter dem Namen „Rubritalea marina“ als neues Bakterium beschrieben. Durch Anreicherung auf gezielten Agarmedien wurde eine Isolierung von Streptomyceten aus verschiedenen marinen Schwämmen erzielt. Die Bakterien wurden auf die Produktion antimikrobiell wirksamer Substanzen hin untersucht. Es konnten vor allem Wirksamkeiten gegen Gram-positive Bakterien, wie S. aureus, nachgewiesen werden. Die antimikrobiellen Aktivitäten des Stammes Aer003 wurden auf die gesättigten Fettsäuren Palmitinsäure und Docosansäure zurückgeführt (T. Gulder AG Bringmann, Universität Würzburg). Die Auswertung des Sekundärmetabolitspektrums des Stammes Pol001 steht noch aus. Isolat Pol001 ist durch eine niedrige Sequenzhomologie des 16S-rRNA Gens von 97,6% zu bereits beschriebenen Vertretern der Gattung Streptomyces charakterisiert und stellt daher vermutlich eine neue Streptomycetenart dar. Die Erstellung und Durchmusterung einer Genbank aus Pol001 auf Sekundärmetabolitoperons führte zur Beschreibung eines neuen Glycopeptidbiosyntheseclusters. Seine Sequenzierung und in silico Analyse weist auf ein strukturell neues Glycopeptid hin, welches Ähnlichkeiten zum Vancomycin besitzt. Weiterhin wurde der Enzymtyp der FADH2-abhängigen Halogenasen in mikrobiellen Konsortien verschiedener mariner Schwämme nachgewiesen. FADH2-abhängige Halogenasen spielen bei der Biosynthese halogenierter Sekundärmetaboliten aus Bakterien eine große Rolle. Unter Nutzung von degenerierten PCR Primern wurden 34 Halogenasegenfragmente in verschiedenen Schwämmen identifiziert. Ein phylogenetischer Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit homologen Bereichen bereits bekannter Enzyme ergab, dass die Mehrzahl der aus Schwämmen gewonnenen Gene ein Schwamm-spezifisches Halogenasecluster bildeten, dessen Funktion jedoch noch unbekannt ist. Bei der Durchmusterung einer aus dem mikrobiellen Konsortium des Mittelmeerschwammes Aplysina aerophoba erstellten Metagenombank konnten vier Fosmide identifiziert werden, die unterschiedliche Halogenasegene trugen. Das Insert eines der betreffenden Fosmide wurde komplett sequenziert. Zusätzlich wurden jeweils 7 kb um die Halogenasegene der drei anderen Fosmide analysiert. In den abgeleiteten kompletten Aminosäuresequenzen der vier Enzyme konnten die für FADH2-abhängige Halogenasen typischen Sequenzmotive GxGxxG und WxWxI nachgewiesen werden. Eine phylogenetische Analyse ergab eine eigene Abstammungslinie für drei der Proteine. Die heterologe Expression einer der vier Halogenasen in E. coli war möglich. Die beschriebenen Halogenasen und die sie umgebenden genomischen Bereiche geben erste Einblicke in das halogenierende Potential mikrobieller Konsortien mariner Schwämme. Weiterführende Analysen können hier zu einer biotechnologisch wertvollen Anwendung führen. Weiterhin ist es möglich, dass verschiedene bakterielle Stamme, die während der vorliegenden Arbeit kultiviert werden konnten, in naher Zukunft als Quelle neuartiger Sekundärmetabolite erkannt werden. Dies trifft sowohl auf das Phylum der Verrucomicrobia, als auch auf das Phylum der Actinobacteria zu. Darüber hinaus stellt die Beschreibung von Rubritalea marina einen Ansatzpunkt für die weitere Analyse von marinen Verrucomicrobien dar.
Zusammenfassung: Staphylococcus aureus ist einer der häufigsten Erreger von nosokomialen Infektionen. Die grampositiven in Haufen angeordneten kokkoiden Bakterien verursachen neben harmlosen lokal-oberflächlichen Hautinfektionen auch gefürchtete lebensbedrohliche Systeminfektionen. Ein großes Problem in der Therapie von S. aureus-Infektionen stellen die zunehmenden Multiresistenzen dieses Erregers dar. Die Entwicklung neuer Antibiotika reicht hierbei auf Dauer oft nicht aus, da immer wieder neue Resistenzen der Bakterien zu erwarten sind. Es besteht daher dringender Bedarf an der Entwicklung alternativer Therapieformen im Kampf gegen multiresistente Problemkeime wie S. aureus. Eine Möglichkeit besteht in der Immuntherapie, zum Beispiel durch Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen geeignete Targetstrukturen von S. aureus. In den beiden immundominanten Antigenen IsaA und IsaB scheinen solche geeigneten Angriffsstrukturen gefunden zu sein. In dieser Arbeit wurde eine IsaB-Mutante hergestellt und nachfolgend phänotypisch charakterisiert. Diese Arbeiten bilden die Grundlage für die Aufklärung der Funktion von IsaB. Weiterhin sollte ein humaner monoklonaler Antikörper gegen IsaA generiert werden. Zur Testung der Antigenspezifität war es notwendig einen anti-IsaA-spezifischen ELISA zu entwickeln. Durch die Fusion der Hybridomzelllinie HAB mit B-Lymphozyten aus lymphatischem Gewebe septikämischer Patienten sollten Fusionszellen gewonnen werden, die spezifische anti-IsaA-Antikörper produzieren. Durch den Einsatz einer humanen Hybridomzelllinie sollten Kreuzspezies-Reaktionen, wie sie bei murinen therapeutischen Antikörpern beobachtet wurden, ausgeschaltet werden. Es wurden mehrere Fusionen mit lymphatischem Material (Lymphknoten, Blut-B-Lymphozyten) durchgeführt. Eine spezifische Antikörperproduktion blieb hierbei jedoch aus. Ein anti-IsaA-spezifischer ELISA konnte auf der Grundlage polyklonaler anti-IsaA-Antikörper aus immunisierten Kaninchen erfolgreich etabliert werden. Der ELISA zeigte die höchste Spezifität bei einer Antigenbeschichtung von 2 µg/ml IsaA und einer optimalen Primärantikörperkonzentration von 1 : 25600. In einem weiteren Teil der Arbeit sollte die Spezifität des polyklonalen Antikörpers und das Vorkommen von IsaA bei verschiedenen Staphylococcus aureus-Stämmen und anderen Bakterienspezies getestet werden. Dazu wurde mittels Western-Blot die Expression von IsaA untersucht. Ergebnis dieser Untersuchung war, dass IsaA unabhängig von der Herkunft, vom Infektionstyp oder Resistenzeigenschaften von allen S. aureus-Isolaten exprimiert wird. Von den anderen untersuchten Bakteriespezies zeigte der IsaA-spezifische polyklonale Antikörper auch eine Reaktion gegen S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. warnerii und S. cohnii. Ob diese Staphylokokkenarten ein IsaA-homologes Protein mit konservierten Domänen exprimieren, das mit dem Antiserum kreuzreagiert, müssen zukünftige Untersuchungen zeigen. Die Herstellung der IsaB-Mutante erfolgte durch Konstruktion eines Inaktivierungsplasmides (pTG1), in dem eine Erythromycinkassette zwischen ein „upstream“- und „downstream“-Fragment kloniert wurde. Als Grundlage diente der temperatursensitive „shuttle“-Vektor pBT2, der bei erhöhter Temperatur in S. aureus nicht weiter replizieren kann und dadurch homologe Fragmente auf dem Vektor mit genomischen Abschnitten rekombinieren. Die erfolgreicher Herstellung der isaB-Mutante wurde im Southern-Blot überprüft. Die Mutante wurde verschiedenen vergleichenden Experimenten mit dem Wildtyp unterzogen, um Informationen über die mögliche Funktion des Targetproteins IsaB im Hinblick auf Wachstum und Virulenz für S. aureus zu gewinnen. Die Wachstumsexperimente ergaben einen deutlichen Unterschied im Wachstumsverhalten der Mutante im Vergleich zum Wildtyp. Da die Mutante deutlich schneller wuchs als der Wildtyp scheint IsaB wichtig für das Wachstum von S. aureus zu sein. In vitro-Experimente zur Testung von möglichen in vivo-Umwelteinflüssen bzw. Stressfaktoren auf das Wachsum der Stämme erfolgten mittels Zusetzung von Glucose und NaCl. Hier zeigte sich ein deutlicher Wachstumsvorteil des Wildtyps gegenüber der isaB-Mutante, so dass unter extremen Umweltbedingungen IsaB S. aureus ein besseres Wachsen ermöglicht. In weiteren Experimenten wurden das Hämolyse- und Proteolyseverhalten der Mutante im Vergleich zum Wildtyp untersucht. IsaB scheint Einfluss auf die Expression von Hämolysinen und Proteasen zu haben, die wichtige Virulenzfaktoren von S. aureus sind. Die Untersuchungen zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Wildtyp und Mutante ergaben ebenfalls Unterschiede für verschiedene Antibiotika, so dass IsaB Einfluss auf die Antibiotikaempfindlichkeit zu nehmen scheint. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse verdeutlichen die prinzipielle Eignung von IsaB als Targetprotein für eine Antikörpertherapie bei lebensbedrohlichen S. aureus-Infektionen.
Die ATP-abhängige Serinprotease ClpXP ist für die Kontrolle und Verfügbarkeit einer großen Anzahl von Enzymen und regulatorischer Proteine sowie für den Abbau fehlge-falteter Proteine verantwortlich. Sie besteht aus zwei Komponenten, der Protease ClpP und der ATPase ClpX, welche für die Substratspezifität verantwortlich ist und zusätzlich als Chaperon wirken kann. Durch den gezielten Abbau globaler Regulatoren wie dem alternativen Sigmafaktor RpoS kommt die regulatorische Funktion der Protease auf post-translationaler Ebene zum Tragen. Um den Einfluss der Protease ClpXP auf die Virulenz-eigenschaften uropathogener Escherichia coli zu studieren, wurde der uropathogene E. coli Stamm 536 als Modellorganismus verwendet. Uropathogene E. coli Stämme werden als häufigste Erreger von Harnwegsinfektionen des Menschen beschrieben. Der E. coli Stamm 536 (O6:K15:H31) unterscheidet sich von apathogenen Stämmen durch die Anwesenheit von bislang sechs charakterisierten Pathogenitätsinseln (PAIs), die für eine Reihe verschiedener Virulenzfaktoren wie Prf- und S-Fimbrien, alpha-Hämolysin, dem Kapselantigen K15 und Eisenaufnahmesystemen kodieren. Zudem exprimiert der Stamm Curli-Fimbrien, eine Flagelle vom Serotyp H31 und ist aufgrund seines glatten Lipopolysaccharid Phänotyps (O6 Antigen) serumresistent. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der Protease ClpXP auf die Regulation und Expression Virulenz-assoziierter Gene des E. coli Stammes 536 sowohl auf Protein-, als auch auf Transkriptebene näher zu charakterisieren. Um den Einfluss der clpX- und clpP-Deletion auf die Proteinexpression des E. coli Stammes 536 zu untersuchen, wurde die Methode der zweidimensionalen (2-D) Gelelektrophorese angewendet. Es wurden zytoplasmatische und extrazelluläre Proteine der logarithmischen und stationären Wachstumsphase untersucht und in diesem Zusammenhang jeweils ein internes Mastergel aller 93 identifizierten zytoplasmatischen und aller 127 identifizierten Proteinen des extrazellulären Proteoms angefertigt. In der zytoplasmatischen Fraktion konnte für 13 Proteine aus der logarithmischen und für 25 Proteine aus der stationären Wachstums-phase eine unterschiedliche Expression festgestellt werden. Die 2-D Analyse der Proteine aus dem Kulturüberstand ergab ein erhöhtes Sekretionsvermögen der clpX- und clpP-negativen Stämme sowohl in der logarithmischen als auch in der stationären Wachstums-phase. Darüber hinaus konnte eine reduzierte Expression von Hauptstrukturuntereinheiten der Prf-, S-, CS12-ähnlichen und Typ 1-Fimbrien sowie des Autotransporters Ag43 in den clpX- und clpP-Mutanten nachgewiesen werden. Zusätzlich wiesen diese Stämme eine verstärkte Expression des Flagellins FliC auf. Durch Western Blot-Analysen und weitere phänotypische Tests konnten die Ergebnisse aus den Proteomstudien für Prf-, S- und Typ 1-Fimbrien sowie für die Flagellenexpression bestätigt werden. Zudem war eine stark verlangsamte Expression von Curli und Cellulose bei Temperaturen unter 37 °C, eine erhöhte Motilität und ein „hyperflagellierter“ Phänotyp der clpX- und clpP-negativen Stämme zu beobachten. Demgegenüber hatte ClpXP keinen Einfluss auf die alpha-Hämolysinproduktion, die Expression des Lipopolysaccharides, die Serumresistenz und in vivo-Virulenz dieses Stammes. Bei anschließenden Transkriptionsanalysen (semiquantitative Real-Time Reverse Transkrip-tion (RT)-PCR) der Gene, welche für die Hauptstrukturuntereinheiten von Fimbrien kodieren, konnte eine reduzierte Transkription der Determinanten für Prf-, S-, und Curli-Fimbrien, aber eine erhöhte Transkription für Gencluster der Typ 1- und CS12-ähnlichen Fimbrien und keine Änderung der Transkriptmengen für Gene des Pix-Fimbrienoperons in den Mutantenstämmen nachgewiesen werden. Die Transkription der beiden Antigen 43 Varianten ORF52III und ORF47V war durch die Deletion von clpX und clpP gleichermaßen betroffen und deutlich reduziert. ClpXP hatte aber keinen Einfluss auf die Transkription des „Masterregulatorgens“ flhC der Flagellen-Regulationskaskade, beeinflusst jedoch die in der Hierarchie weiter unten liegender Operons positiv, da eine deutlich erhöhte Expression von fliA und fliC nachgewiesen werden konnte. Demzufolge hat ClpXP einen negativen regulatorischen Effekt auf die Flagellenexpression, der aber erst auf posttranskriptionaler oder posttranslationaler Ebene auftritt. Viele der beobachteten Einflüsse, v.a. auf die Flagellen- und Fimbrienexpression, konnten auf die fehlende regulatorische Wirkung von RpoS zurückgeführt werden, welches ausschließlich durch ClpXP degradiert wird. Zudem lassen die Ergebnisse vermuten, dass der globale Regulator Lrp, welcher eine wichtige Rolle bei der Regulation der Fimbrienexpression spielt, direkt oder indirekt durch ClpXP beeinflusst wird, wodurch die regulatorischen Netzwerke zusätzlich gestört werden.
In this study, the role of histone-like proteins in gene regulation in uropathogenic Escherichia coli isolate 536 was monitored. The histone-like nucleoid structuring protein H-NS is a global regulator in Escherichia coli that has been intensively studied in non-pathogenic strains. No comprehensive study on the role of H-NS and it’s homolog StpA on gene expression in a pathogenic E. coli strain has been carried out so far. Moreover, we identified a third, so far uncharacterized member of the H-NS-like protein family in uropathogenic E. coli isolate 536, which was designated Hlp (H-NS-like protein). Hlp is a 134-amino acid protein, which shares 58 % sequence identity with H-NS. The gene coding for the Hlp protein, hlp, is found in several uropathogenic E. coli variants, but not in non-pathogenic E. coli K-12. In UPEC strains 536 and CFT073, Hlp is encoded on a possibly horizontally acquired 23-kb genomic region inserted into the serU locus. Studies on hlp transcription revealed, that the gene is transcribed monocistronically from a single promoter and that expression is repressed by H-NS. Purified Hlp protein was binding to its own and to the hns promoter, thereby mediating negative auto- and crossregulation. Furthermore, Hlp and H-NS were directly interacting, resulting in the formation of stable heteromers. Complementation studies with hns mutant strains in a K-12 background revealed that the Hlp protein had in vivo activity, being able to complement the lack of H-NS in terms of motility, growth, and repression of the proU, bgl, and clyA genes. When analyzing the role of the histone-like proteins in expression of virulence-associated genes by using DNA arrays and classical phenotypic assays, most of the observed effects were mediated by the H-NS protein alone. Expression profiling revealed that transcript level of more than 500 genes was affected by an hns mutation, resulting in increased expression of alpha-hemolysin, fimbriae and iron-uptake systems, as well as genes involved in stress adaptation. Furthermore, several other putative virulence factors were found to be part of the H-NS regulon. On the other hand, no effect of StpA alone was observed. An hns stpA double mutant, however, exhibited a distinct gene expression pattern that differed in great parts from that of the hns single mutant. This suggests a direct interaction between the two homologs and the existence of distinct regulons of H-NS and an H-NS/StpA heteromeric complex. Although the H-NS protein has – either as homomer or in complex with StpA – a marked impact on gene expression in pathogenic E. coli strains, its effect on urovirulence is ambiguous. At a high infection dose, hns mutants accelerate lethality in murine UTI and sepsis models relative to the wild type, probably due to increased production of alpha-hemolysin. At lower infectious dose, however, mutants lacking H-NS are attenuated through their impaired growth rate, which can only partially be compensated by the higher expression of numerous virulence factors. As seen with StpA, an hlp single mutant did not exhibit a notable phenotype under standard growth conditions. A severe growth defect of hns hlp double mutants at low temperatures, however, suggests a biological relevance of H-NS/Hlp heteromers under certain circumstances. Furthermore, these mutants expressed more capsular polysaccharide and curli fimbriae, thereby indicating a distinct role of H-NS and Hlp in regulation of these surface structures. The H-NS paralogs Hlp and StpA also modulated H-NS-mediated regulation of fimbrial adhesins, and are oppositely required for normal growth at low or high temperatures, respectively. Finally, expression levels of the three histone-like proteins H-NS, StpA and Hlp itself varied with different temperatures, thereby suggesting a flexible composition of the nucleoid-associated protein pool. Hence, we propose that the biological role of Hlp and StpA does not rely on a distinct function of the single protein, but rather on their interaction with the global regulator H-NS.
Das Kerngenom pathogener Escherichia coli Isolate wird von zahlreichen variablen Regionen unterbrochen, die meist durch horizontalen Gentransfer erworben wurden und über das ganze Chromosom verteilt sind. Diese variablen Bereiche tragen häufig Gene für Virulenz- und Fitnessfaktoren und sind oftmals nur instabil in das Chromosom integriert. Um die Verbreitung variabler Bereiche, die insbesondere Virulenzfaktoren kodieren, innerhalb verschiedener klinischer Isolate näher untersuchen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein spezieller DNA-Array entwickelt. Dieser enthielt zahlreiche Sonden für Gene, die für die Virulenz von verschiedenen Erregern der Gattung E. coli als auch der Untergruppe Shigella charakteristisch sind. Mit diesem "Pathoarray" wurde die Verbreitung von Virulenzgenen in unterschiedlichen E. coli Isolaten untersucht. Zusätzlich wurden Unterschiede im Kerngenom mit Hilfe eines kommerziell erwerbbaren DNA-Arrays bestimmt. Ein Vergleich des Kerngenoms von uropathogenen Stämmen mit Derivaten, bei denen Pathogenitätsinseln deletiert sind, bestätigte die Auffassung, dass der Deletion von Pathogenitätsinseln ein spezieller Mechanismus zu Grunde liegt, von dem das Kerngenom nicht betroffen ist. Das Kerngenom der untersuchten Stämme war prinzipiell sehr konserviert und unterschied sich lediglich durch wenige Gene aus Bakteriophagen. Die größten Unterschiede wurden bei Genen beobachtet, die zum variablen Teil des Genoms gehören und charakteristisch für das jeweilige Isolat waren. Mit Hilfe der DNA-Array Technologie lassen sich auch Änderungen von Expressionsprofilen studieren, die von Mutationen oder durch Umwelteinflüsse bedingt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde durch Transkriptomanalysen das RfaH-abhängige Regulon untersucht, insbesondere im Hinblick auf solche Gene, die die Biofilmbildung beeinflussen. Beim Vergleich der Transkriptome von E. coli 536rfaH mit dem Wildtyp wurde eine signifikant erhöhte Expression von Antigen 43 festgestellt. Im E. coli K-12 Stammhintergrund konnte dieses Oberflächenprotein als Hauptfaktor für die RfaH-abhängige Biofilmbildung identifiziert werden. Das verkürzte LPS-Kernoligosaccharid im Stamm MG1655rfaH hatte ebenfalls einen großen Einfluss auf die verstärkte Biofilmbildung. Vermutlich verstärkte die verbesserte Präsentation von Agn43 durch ein verkürztes LPS die Biofilmbildung signifikant. Andere Oberflächenstrukturen, wie die Colansäure-Kapsel, zeigten keinen Effekt auf die Biofilmbildung von E. coli MG1655rfaH. Neben den Expressionsprofilen der Stämme 536 und 536rfaH bei 37 Grad C wurden auch die Expressionsprofile bei 30 Grad C sowie von Biofilmen analysiert. Prinzipiell konnten bei allen untersuchten Wachstumsbedingungen nur geringe Unterschiede zwischen 536 und 536rfaH festgestellt werden. Beim Vergleich der unterschiedlichen Wachstumsbedingungen (Temperatureffekt und planktonische Zellen vs. Biofilm) wurden jedoch deutliche Unterschiede beobachtet. Sowohl Gene des Kerngenoms als auch Gene von Pathogenitätsinseln waren temperaturabhängig reguliert. Bei E. coli Isolaten lassen sich neben genomischen Unterschieden auch phänotypische Unterschiede beobachten. Es wurde festgestellt, dass die Biofilmbildung von E. coli Isolaten abhängig von verschiedenen Faktoren und molekularen Mechanismen ist. Zudem konnte dargelegt werden, wie Unterschiede in der Zusammensetzung der äußeren Membran durch eine veränderte LPS-Struktur und die Expression von Adhäsinen die Biofilmbildung beeinflussen können.
The massive remodeling of the heart tissue, as observed in response to pressure overload or myocardial infarction, is considered to play a causative role in the development of heart failure. Alterations in the heart architecture clearly affect the mechanical properties of the heart muscle, but they are rooted in changes at the cellular level including modulation of gene expression. Together with integrins, the transmembrane receptors linking the extracellular environment to the cytoskeleton, extracellular matrix (ECM) proteins and matricellular proteins are key components of the remodeling process in the heart. Therefore, this thesis was aimed at analysing the role of integrins in the regulation of gene expression and heart muscle performance during cardiac wound repair induced by pressure overload or myocardial infarction (MI). To investigate the contribution of integrin Beta 1, we characterised the response of mice with a conditional, cardiac-specific deletion of the integrin Beta 1 gene in an experimental model of pressure overload by aortic banding (AB). In particular, we measured physiological alterations and gene expression events in the stressed heart in the presence or absence of integrin Beta 1. Interestingly, mice containing a knock-out allele and the ventricular myocyte-specific conditional allele of the integrin Beta 1 gene were born and grew up to adulthood. Though these animals still exhibited minor amounts of integrin Beta1 in the heart (expressed by non-myocytes), these mice displayed abnormal cardiac function and were highly sensitive to AB. Whereas a compensatory hypertrophic response to pressure overload was observed in wildtype mice, the integrin Beta 1-deficient mice were not able to undergo heart tissue remodeling. Furthermore, ECM gene expression was altered and, in particular, the increased expression of the matricellular protein SPARC after AB was abolished in integrin Beta 1–deficient mice. Interestingly, we also found a transient upregulation of SPARC mRNA during heart remodeling after MI using cDNA macroarrays. Indeed, increased SPARC protein levels were observed starting at day 2 (2.55±0.21fold, p<0.01), day 7 (3.72±0.28 fold, p<0.01) and 1 month (1.9±0.16 fold, p<0.01) after MI, which could be abolished by using an integrin alpha v inhibitor in vivo. Immunofluorescence analysis of heart tissue demonstrated that the increased SPARC expression was confined to the infarcted area and occurred together with the influx of fibroblasts into the heart. In vitro, either TGF-Beta 1 or PDGF-BB stimulated SPARC expression by fibroblasts. Inhibition of integrin alpha v did not interfere with TGF-Beta1 or PDGF induced SPARC secretion as determined by ELISA assays or Western blot. However, secretion of TGF-Beta1 and PDGF-BB by cardiomyocytes was induced by vitronectin, a ligand of integrin alpha v, and this response was blocked by the integrin alpga v inhibitor. Functionally, SPARC modulated the migratory response of fibroblasts towards ECM proteins suggesting that the local deposition of SPARC following MI contributes to scar formation. Taken together, our combined in vivo and in vitro data demonstrate that several integrin subunits play critical roles during tissue remodeling in the injured heart. Integrin-dependent gene expression events such as the upregulation of SPARC following MI are critical to orchestrate the healing response. These processes appear to involve complex cross-talk between different cell types such as cardiomyocytes and fibroblasts to allow for locally confined scar formation. The elucidation of the sophisticated interplay between integrins, matricellular proteins such as SPARC, and growth factors will undoubtedly provide us with a better and clinically useful understanding of the molecular mechanisms governing heart remodeling.
The prevention of restenosis after percutaneous coronary intervention is a major task for researchers and clinicians in cardiovascular pharmacology. Nearly 1.5 million PTCA are performed every year worldwide and, due to the implantation of stents, most of the cases can be treated successfully. 60% of those patients develop restenosis within 6 months. SMC migration and ECM deposition are known to be responsible for neointima formation. Among many processes, integrin initiated signalling events play a central role in SMC migration. Many integrins recognize a specific RGD sequence which is present in several ECM proteins and cell surface immunoglobulin super family molecules. Until now, there are various integrin antagonists such as antibodies, cyclic peptides, peptidomimetics, and non-peptides have been shown to interfere with such pathological situations indicating the importance of integrin initiated signalling pathways in SMC migration. Therefore, in this study SMC migration induced by ECM proteins was inhibited either using pharmacological inhibitor or by overexpressing the endogenous inhibitor of FAK by AAV vector system. In the first part of the thesis, the effect of integrin-ligand stimulation on hCASMCs was studied. The tyrosine phosphorylation of many cellular proteins was observed from serum starved hCASMCs replated on VN but not on PL coated plates. The major tyrosine phosphorylated protein was identified as FAK by immunoprecipitation and also phosphorylation was found at Tyr 397, the autophosphorylation site of FAK. Further, VN induced the dose dependent migration of hCASMCs in haptotaxis assay. The integrin v inhibitor was used to block those ECM stimulated integrin signalling pathways and cell migration. It inhibited the ECM stimulated tyrosine phosphorylation in a dose dependent manner. Interestingly, specific potent antagonism of integrin v abrogated both ECM induced haptotaxis and growth factor induced chemotaxis. The inhibition of migration is consistent with the replating assay results that show interference with integrin induced signalling pathways particularly the FAK tyrosine phosphorylation. The integrin v inhibitor also is able to interfere with hCASMC invasion through matrigel by reducing MMP-2 secretion. Importantly, integrin v inhibitor did not induce the apoptosis in hCASMCs. FAK is a key player in many cellular events and its involvement in cell migration was extensively studied in various cell types. The present study explored the function of FAK in hCASMC migration by overexpression of FRNK, the C-terminal domain of FAK. Overexpression of FRNK inhibited the in vitro SMC migration as well as the neointima formation in a porcine restenosis model in vivo. The last part of this thesis focused on the identification of putative binding partners for the N-terminal domain of FAK by bacterial two-hybrid screen. One of the interesting binding partners was a putative protein of 17.9 kDa. Its human homolog is AGS4, which acts as a GTPase activator. The preliminary results revealed that it is able to interact with N-FAK domain and its expression is high in haematopoietic cells. Taken together the above results suggest that integrin v and FAK are promising targets for inhibition of SMC migration. Disruption of FAK-mediated signalling pathways by a pharmacological inhibitor or by overexpression of FRNK, which acts as dominant-negative regulator, resulted in decreased migration of SMCs and thus can lead to reduction of neointima formation.
Eine Infektion durch das ausschließlich human-spezifische Pathogen Neisseria gonorrhoeae manifestiert sich bei einer symptomatischen Kolonisierung in der sog. Gonorrhö, einer venerischen Erkrankung, die durch akute Inflammation des befallenen Gewebes und durch die massive Infiltration von Granulozyten charakterisiert ist. Die Gonokokken können im Verlauf einer symptomatischen Infektion über ihre OpaCEA-Adhäsine mit CEACAM Proteinen unterschiedlicher Wirtszellen interagieren. In der vorliegenden Doktorarbeit sollten anhand verschiedener zellbiologischer, biochemischer und genetischer Methoden die molekularen Vorgänge während der OpaCEA-Gonokokken-Phagozyten-Interaktion untersucht werden. Der Kontakt von OpaCEA-Gonokokken mit primären Granulozyten induziert die Formation von Lamellipodien-ähnlichen Membranausstülpungen und führt zur CEACAM-abhängigen Phagozytose der OpaCEA Gonokokken. Schon in früheren in vitro Versuchen konnte die Reorganisation des Zytoskeletts und die Opsonin-unabhängige, CEACAM-vermittelte Aufnahme OpaCEA-exprimierender Gonokokken in differenzierte promyelomonzytären Zellen und Granulozyten mit der Stimulation von Kinasen der Src-Familie und der GTPase Rac in Verbindung gebracht werden. Erste in vitro Infektionsversuche mit CEACAM-exprimierenden 293 Zellen, in denen pharmakologische oder genetische Inhibitoren gegen Kinasen der Src-Familie eingesetzt wurden, deuteten darauf hin, dass ausschließlich die CEACAM3-vermittelte Internalisierung der Gonokokken die katalytische Aktivität von Kinasen der Src-Familie benötigt. Dies konnte auch in CEACAM3-exprimierenden, Src-Kinase defizienten Maus-Fibroblasten bestätigt werden, da nur c-Src rekonstituierte Zellen OpaCEA Gonokokken internalisieren. Die Adhäsion der OpaCEA Gonokokken an CEACAM3 induziert eine Src-abhängige Tyrosinphosphorylierung der zytoplasmatischen CEACAM3-Domäne und die Kinase selbst kann über ihre SH2-Domäne direkt an das phosphorylierte CEACAM3 binden. Auch die Stimulation der GTPase Rac verläuft über das CEACAM3 Protein, da die Expression einer dominant negativen Version der Rho GTPase ausschließlich mit der CEACAM3-, aber nicht mit der CEACAM6-abhängigen Internalisierung der OpaCEA Gonokokken interferiert. Zudem induziert nur die CEACAM3-vermittelte Aufnahme die Rekrutierung und GTP-Beladung des endogenen Rac. Eine zentrale Rolle dabei spielt die Integrität der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3. Die Mutation beider Tyrosinreste innerhalb der ITAM-ähnlichen Sequenz oder die komplette Deletion der zytoplasmatischen Domäne inhibieren die CEACAM3-vermittelte Rac-Stimulation und blockieren die Internalisierung der OpaCEA Gonokokken. Aber nicht nur OpaCEA Gonokokken interagieren mit CEACAM3, sondern auch die CEACAM-bindenden Adhäsine von Moraxella catarrhalis und Haemophilus influenzae führen zur Rac-Stimulation und damit zur Internalisierung der Pathogene. Im letzten Teil der Arbeit konnte das molekulare Bindeglied zwischen der CEACAM3-induzierten Signalkaskade und der Stimulation der kleinen GTPase Rac identifiziert werden. Das Vav Protein fungiert dabei als GEF für die kleine GTPase Rac. Eine dominant negative Version von Vav oder eine spezifische Vav-siRNA inhibieren die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von OpaCEA-Gonokokken bzw. die GTP-Beladung von Rac. Interessanterweise bindet das Vav Protein über seine SH2 Domäne direkt an CEACAM3 und zwar nach Phosphorylierung durch aktive Src Kinasen an den Tyrosinrest 230 der ITAM-ähnlichen Sequenz. Die distinkte CEACAM3-induzierte Signalkaskade erlaubt es, die Bedeutung von CEACAM3 für die Phagozytose CEACAM-bindender Pathogene auch in primären Granulozyten zu untersuchen. Interessanterweise inhibiert PP2 die Aufnahme der Gonokokken dosisabhängig, wohingegen die Blockade der CEACAM1- bzw. CEACAM6-vermittelten Internalisierung der Gonokokken durch Nystatin keine Auswirkungen zeigt. Auch die Proteintransduktion der dominant-negativen Version von Vav (TAT-Vav-dn) bzw. Rac (TAT-Rac-dn) in primäre Granulozyten interferierte effektiv mit der Phagozytose der OpaCEA Gonokokken. Dementsprechend verhindert ausschließlich die Blockade der CEACAM3-vermittelten Phagozytose, aber nicht der CEACAM1- bzw.CEACAM6-vermittelten Aufnahme durch monoklonale Antikörper die Internalisierung bzw. die Elimination von CEACAM-bindenden Pathogenen. Diese Arbeiten beschreiben das exklusiv auf Granulozyten exprimierte CEACAM3 Protein als einen neuen gegen CEACAM-bindende Erreger gerichteten phagozytischen Rezeptor der angeborenen Immunantwort.
Der uropathogene Escherichia coli Stamm 536 (O6:K15:H31) stammt aus einem Patienten mit akuter Pyelonephritis und ist heute einer der Hauptmodellorganismen für Studien zum Vorkommen und zur Funktionalität von Pathogenitätsinseln (PAIs). Sein Genom enthält sechs genetische Elemente (PAI I(536) bis PAI VI(536)), die an unterschiedlichen Stellen des Chromosoms integriert sind und die Hauptkriterien für PAIs erfüllen. Sie kodieren für viele Virulenzfaktoren des Stammes, sind am 3' Ende von tRNA Genen integriert, enthalten teils kryptische Fragmente mobiler genetischer Elemente wie Integrase- oder Transposasegene und werden meist von IS Elementen oder 'direct repeats' (DRs) flankiert. Darüber hinaus haben sie die Tendenz, instabil zu sein und aus dem Chromosom zu deletieren. Mit Ausnahme von PAI IV(536) sind alle PAIs von E. coli 536 mit intakten Integrasegenen assoziiert, die zu int Genen des Coliphagen P4 bzw. des Shigella flexneri Phagen SfX ähnlich sind. Neuere Untersuchungen zeigen, daß diese Gene exprimiert werden und für funktionelle Enzyme kodieren. Zusätzlich werden die PAIs ebenfalls mit Ausnahme von PAI IV(536) von DRs unterschiedlicher Größe flankiert, die den Randbereichen von Prophagen im prokaryontischen Chromosom entsprechen. Es ist daher wahrscheinlich, daß PAI-Deletionen vergleichbar zum Insertions-/Exzisionsmechanismus von Bakteriophagen durch die jeweilige PAI-assoziierte Integrase vermittelt werden und durch ortsspezifische Rekombination zwischen den flankierenden DRs erfolgen. Die Instabilität von PAI I(536) und PAI II(536) ist schon früh belegt worden. Jede Insel kodiert für eine Hämolysindeterminante und ihre Kodeletion führt zu einem ahämolytischen Phänotyp, der mit einer Häufigkeit von 3×10(-5) in vivo und bis 1x10(-3) in vitro auftritt. Die Exzision erfolgt durch ortsspezifische Rekombination zwischen den 16 bp bzw. 18 bp großen flankierenden DRs der PAIs. Da den übrigen E. coli 536-spezifischen PAIs entsprechende phänotypische Marker fehlen, wurde in der hier vorliegenden Arbeit das 'Island Probing'-Verfahren angewendet, um die Instabilität von PAI I(536) bis PAI V(536) im Detail zu untersuchen. Dazu wurde der negative Selektionsmarker sacB separat in die PAIs integriert. Zellen, die diesen Marker tragen, sind saccharosesensitiv und können nur in Gegenwart hoher Saccharosekonzentrationen wachsen, nachdem die sacB-markierte PAI aus dem Chromosom deletiert wurde. Auf diese Weise konnten von sacB-markierten Derivaten des Stammes E. coli 536 gezielt PAI-negative Zellen isoliert werden, um die Grunddeletionsraten der PAIs zu bestimmen und ihre Randbereiche zu analysieren. Zusätzlich wurde der Einfluß verschiedener Umwelteinflüsse wie niedrige/hohe Temperatur, osmotischer Streß, Nährstoffmangel, subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen oder die Gegenwart konjugativer Plasmide auf die Exzisionsrate untersucht. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen, daß PAIs von E. coli 536 mit unterschiedlicher Häufigkeit deletieren. Während PAI II(536) und PAI III(536) mit Deletionsraten von 2×10(-5) bzw. 5x10(-5) am instabilsten sind, liegen die Exzisionsraten von PAI I(536) und PAI V(536) mit 2x10(-6) bzw. 1×10(-6) niedriger und deuten auf eine fortschreitende Stabilisierung dieser PAIs hin. Im Gegensatz dazu ist PAI IV(536) bereits vollständig stabil in das Chromosom eingebettet. Während die Exzision von PAI I(536), PAI II(536) und PAI V(536) RecA-unabhängig ist und auf ortsspezifischer Rekombination zwischen ihren flankierenden DRs beruht, treten bei PAI III(536) zwei alternative Deletionsmechanismen auf. Die Exzision dieser PAI erfolgt entweder vollständig durch ortsspezifische Rekombination zwischen den flankierenden DRs oder partiell durch homologe Rekombination zwischen zwei IS100 Elementen innerhalb der PAI. Unabhängig vom Rekombinationsmechanismus führt die Deletion aber in allen Fällen zur Bildung zirkulärer Intermediate (CIs), die vermutlich aufgrund fehlender Replikationsstartpunkte bei nachfolgenden Zellteilungen verlorengehen. Obwohl CIs von PAI II(536) und PAI III(536) mit Hilfe spezifischer PCR-Reaktionen identifiziert werden konnten, war ein PCR-Nachweis PAI I(536)- und PAI V(536)-spezifischer CIs bedingt durch die niedrigen Deletionsraten dieser Inseln nicht möglich. Interessanterweise konnte in dieser Arbeit erstmalig gezeigt werden, daß die Deletion von PAI II(536) und PAI III(536) bei niedriger Wachstumstemperatur, hoher Zelldichte und Nährstoffmangel in vitro induzierbar ist, d. h. unter Bedingungen, die auch in natürlichen Biofilmen auftreten können. Andere Bedingungen wie osmotischer Streß, subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen oder die Anwesenheit konjugativer Plasmide haben keinen Einfluß auf die Deletionsrate der PAIs. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, daß die Instabilität von PAIs bei E. coli 536 in vivo eine wichtige Rolle spielt indem sie zur Genomflexibilität und Evolution sowie zur Modulation der Virulenzgenexpression der Bakterien beiträgt.
Saposin-ähnliche Proteine (SAPLIPs) sind membraninteragierende Proteine, die sich durch die konservierte Position von drei Disulfidbrücken, einer typischen alpha-helikalen Proteinfaltung und der Fähigkeit mit Lipiden zu interagieren, auszeichnen. Ihre zellulären Funktionen sind äußerst vielfältig. Bis zum Beginn des Genomsequenzierungsprojektes waren die Amoebapores die einzigen bekannten und charakterisierten SAPLIPs von Entamoeba histolytica, dem Erreger der humanen Amöbenruhr. Aufgrund ihrer antimikrobiellen Aktivität stellen sie für diesen parasitischen Einzeller, der sich von phagozytierten Bakterien ernährt, wichtige Effektormoleküle dar. Sie können aber auch cytolytisch auf Wirtszellen wirken und werden deshalb als bedeutender Pathogenitätsfaktor angesehen. Die theoretische computergestützte Datenbankanalyse nach Abschluss der Genomsequenzierung ergab, dass es 16 weitere Gene kodierend für SAPLIPs zusätzlich zu den drei Amoebapore-Genen gibt. Die Sequenzen der neuen SAPLIPs sind abgesehen von dem Cysteinmotiv divers und auch die Größe der Proteine ist sehr unterschiedlich (77 - 1009 Aminosäuren). Alle besitzen sie jedoch eine einzige, C-terminal gelegene SAPLIP Domäne. Außer der SAPLIP-Domäne konnten keine weiteren bekannten funktionellen oder strukturellen Domänen in den relevanten Datenbanken identifiziert werden, die auf mögliche Funktionen hätten hinweisen können. Alle SAPLIP-Gene werden gleichzeitig in axenisch kultivierten Trophozoiten transkribiert wie durch reverse Transkriptions-PCR gezeigt wurde. Die vergleichende transkriptionelle Analyse im Mikroarray ergab, dass nach Kontakt mit menschlichen Kolonzellen keine Hochregulierung dieser Gene mit Ausnahme des Amoebapore A Gens stattfindet. Für die parallele Klonierung der verschiedenen SAPLIP-Domänen wurde ein ”Expressionsscreening” in E.coli mit dem grün fluoreszierenden Protein als Reporterprotein etabliert, das die erfolgreiche Klonierung und Expression eines Fragments aufgrund der Fluoreszenz der Bakterienkolonie bereits auf der Ebene der Transformation anzeigt. Die rekombinant exprimierte und bis zur Homogenität gereinigte SAPLIP-Domäne von SAPLIP 12 wies Amoebapore-ähnliche Aktivitäten auf. Unter Verwendung von Liposomen konnte porenbildende Aktivität nachgewiesen werden, wobei diese Aktivität stark an einen sauren pH-Wert gebunden ist. Die SAPLIP-Domäne 12 ist aber auch antibakteriell und dieses sogar mit vergleichbarer Selektivität wie Amoebapore A, nämlich Zelllyse von gram-positiven B. megaterium war nachweisbar, jedoch nicht von gram-negativen E. coli. Strukturell unterscheiden sich die SAPLIP-Domäne 12 und Amoebapore A bezüglich der Exposition positiver Ladungsansammlungen auf der Proteinoberfläche und des Fehlens des für den Mechanismus der Amoebapores essentiellen Histidinrestes an entsprechender Position in der Sequenz. Darüber hinaus übt die SAPLIP-Domäne 12 eine im Vergleich zum Amoebapore A geringere spezifische Aktivität aus. Diese Eigenschaften weisen darauf hin, dass es sich um einen anderen Wirkungsmechanismus handeln könnte. Für die SAPLIP-Domäne 12 wäre eine über die positiven Ladungen der Proteinoberfläche vermittelte Interaktion mit den negativ geladenen Phospholipidköpfen von Membranen denkbar, die bei Erreichen einer bestimmten Konzentration in einer Störung der Lipidordnung und letztendlich in der Auflösung der Membranstruktur resultieren könnte. SAPLIP 3 ähnelt den Amoebapores in der Größe und molekularen Architektur und kann somit als funktionelle Einheit angesehen werden, es unterscheidet sich aber durch eine hohe negative Nettoladung von den Amoebapores. Außerdem ist das rekombinante SAPLIP 3 nicht antibakteriell und die Membraninteraktionen dieses SAPLIPs unterscheiden sich grundlegend von denjenigen, die für die Amoebapores beschrieben sind. SAPLIP 3 zerstört nicht einfach die Liposomenstruktur wie von den porenbildenden Amoebapores bekannt, sondern es vermittelt die Fusion von multilamellaren Liposomen unter Freisetzung des Liposomeninhalts. Diese Aktivität ist abhängig von der Anwesenheit anionischer Lipide und von einem sauren pH-Wert. Die Fähigkeit zur Vesikelfusion sowie die Verteilung der negativen Ladungen von SAPLIP 3 auf der Proteinoberfläche ähneln Merkmalen des humanen Saposin C. Neben der Funktion als Cofaktor von Exohydrolasen, die im Sphingolipid Katabolismus involviert sind, wird angenommen, dass die Fähigkeit von Saposin C, Vesikel zu fusionieren, wichtig für die Reorganisation der humanen lysosomalen Kompartimente ist. Die Saposin C-ähnlichen Charakteristika von SAPLIP 3 geben Grund zu der Annahme, dass es bereits in einem so basalen Organismus wie der Amöbe ein Protein mit Saposin-ähnlichen membranfusionierenden Aktivitäten gibt und dass dieses SAPLIP entsprechende Funktionen während endo- und exozytotischer Transportprozesse in der Amöbe übernehmen könnte.
Staphylococcus aureus ist ein bedeutender opportunistischer Krankheitserreger, der eine Vielzahl von Infektionen in Menschen und Tieren hervorrufen kann. Das Krankheitsbild reicht von leichten Hautinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Endokarditis, Sepsis oder Pneumonien. S. aureus ist ein Haupterreger nosokomialer Infektionen. Besonders die Antibiotikaresistenzentwicklung von S. aureus–Stämmen ist problematisch. Als wirksame Antibiotika können zur Zeit oft nur noch Vancomycin, Synercid oder Linezolid zur Therapie eingesetzt werden. Die alarmierende Resistenzentwicklung in S. aureus verdeutlicht, dass die Entwicklung neuer Antibiotika und die Identifizierung neuer bakterieller Angriffsstrukturen dringend erforderlich ist. Gängige antiinfektive Therapeutika sind gegen die bakterielle Zellwandsynthese, den DNA- und RNA-Stoffwechsel oder die Proteinbiosynthese gerichtet. In dieser Arbeit sollten Virulenz-relevante Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Antibiotika untersucht werden. Insgesamt wurden sieben Gene analysiert, von denen vier zu Anfang dieser Arbeit in S. aureus noch nicht charakterisiert waren. Die Zielgene (clpP, purH, ssrA und smpB) in S. aureus sollten deletiert werden, um ihre Überlebensnotwendigkeit in vitro- und in vivo zu überprüfen. Eine Deletion gelang bei den Genen clpP und purH, die somit als nicht essenziell in S. aureus zu betrachten sind. Die bereits zuvor als nicht-essenziell charakterisierten Gene arlR, arlS und putP wurden deletiert und die Mutanten dclpP, darlR, darlS, dpurH und dputP wurden phänotypisch in Hinsicht auf ihren Einfluss auf die Pathogenität in S. aureus analysiert. Die differenzielle Genexpression der Mutanten dclpP und darlR wurde mit Hilfe von Microarray-Hybridisierungsexperimenten untersucht. Die ∆clpP-Mutante zeigte einen starken Wachstumsdefekt bei verschiedenen Temperaturen (30, 37, 42°C) und war nicht mehr in der Lage bei 20°C zu wachsen. Ebenso war das Wachstum unter anaeroben Bedingungen stark beeinträchtigt. Der Stamm dclpP wies eine verringerte hämolytische Aktivität sowie eine verminderte Adhärenz an Polystyren auf. Außerdem konnte eine stark erhöhte autolytische Aktivität in einem Triton X-100-Assay beobachtet werden. In einem Invasions-Zellkulturassay mit 293T-Epithelzellen konnte eine ~10-fach erhöhte Invasivität im Vergleich zu dem isogenen Wildtyp festgestellt werden. Die Komplementierung der ∆clpP-Mutante durch Einführung eines clpP-Expressionsvektors führte nahezu bei allen getesteten Bedingungen zur Wiederherstellung des wildtypischen Phänotyps. Die Transkriptomanalyse der dclpP-Mutante ergab eine deutliche Veränderung in der Genexpression (15 % aller Gene). Eine computerunterstützte Analyse der Upstreambereiche der deregulierten Gene führte zu der Identifizierung verschiedener Regulons, die bei der bakteriellen Antwort auf verschiedene Stressbedingungen eine Rolle spielen. Die clpP-Deletion betrifft besonders Regulatoren, deren Aktivität in Abhängigkeit zu veränderten Redox-Bedingungen reguliert wird, wie z. B. verschiedenen Stressbedingungen und Anaerobiose. Die Konstruktion der darlR- und darlS-Mutanten führte zu einer gesteigerten hämolytischen Aktivität, einer erhöhten Adhärenz an Polystyren sowie einer erhöhten autolytischen Aktivität in Triton X-100-Assays. Die Internalisierungsrate durch 293T-Epithelzellen war vermindert. Die darlR-Mutante wurde in einem Katheter-assoziierten Infektionsmodell in Ratten eingesetzt. Die kompetitive Infektion mit Mutante und Wildtyp ergab einen deutlichen Nachteil bei der Etablierung einer Infektion durch die Mutante. Die Transkriptomanalyse der 8325darlR-Mutante in der exponenziellen und in der stationären Phase unterstreicht den großen Einfluss des ArlRS-Zwei-Komponenten-Systems auf die Regulation der Genexpression in S. aureus. In der exponenziellen Phase wurden insgesamt 5 % und in der stationären Phase 15 % der Gene differenziell exprimiert. dpurH- und dputP-Mutanten wiesen in vitro keine Veränderungen im Wachstums-verhalten, der Biofilmbildung oder hämolytischen Aktivität auf. In einem Infektionsmodell in Ratten führte die Deletion von purH in dem S. aureus-Stamm MA12 zu einer signifikanten Verminderung der Virulenz. Die Herstellung von smpB- und ssrA-Deletionsmutanten verlief ohne Erfolg. Es wurde versucht, einen direkten Nachweis für den essenziellen Charakter dieser Gene durch den Einsatz konditional letaler Expressionssysteme zu erbringen. Weder der Austausch des wildtypischen durch einen regulierbaren Promotor noch eine Antisense-RNA-Strategie war für eine eindeutige Klärung dieser Frage ausreichend. Es konnte durch diese Arbeit jedoch gezeigt werden, dass die Antisense-RNA-Strategie eine Beeinträchtigung des Wachstums von S. aureus bewirkt.
Der Gram-positive Erreger Staphylococcus aureus ist ein Bestandteil der normalen Haut und Schleimhautflora des Menschen, kann aber auch ein weites Spektrum von Krankheitsbildern hervorrufen. Ein besonderes Charakteristikum dieses Pathogens besteht in der Expression von Oberflächenstrukturen, welche eine hohe Affinität für Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) von eukaryontischen Organismen aufweisen und die kollektiv als MSCRAMM (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) bezeichnet werden. Das auf der Bakterienoberfläche gebundene Fn kann in der Folge als eine Art molekulare Brücke zwischen FnBP exprimierenden S. aureus und dem Fn-Rezeptor auf der Wirtszellseite, dem Integrin 51, dienen. Neben der Anheftung an das Wirtsgewebe kann die indirekte Assoziation mit Integrin 51 die Aufnahme der Bakterien durch die eukaryontische Zelle auslösen. Wie die bakterielle Adhäsion an Integrin 51 und die Aggregation der Integrine durch die mit Fn-beschichteten Bakterien in ein Signal zur Aufnahme der Pathogene durch die Zelle umgesetzt wird, ist nicht vollständig geklärt und sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde ein neues und effektives Protokoll zur fluoreszenzmikroskopischen Differenzierung von extra- und intrazellulären Bakterien entwickelt. Diese Methode besitzt den Vorteil, von Bakterien-spezifischen Antikörpern unabhängig zu sein. Dadurch bietet sich die Möglichkeit, Bakterien, gegen die es noch keine spezifischen Antiseren gibt, dennoch auf ihre zelluläre Lokalisation und Invasivität mittels mikrobiologischer Methoden untersuchen zu können. Im Hinblick auf die nähere Untersuchung der Signaltransduktion bei der Invasion von S. aureus war die kritische Rolle von Tyrosinkinasen für die Integrin-vermittelte Invasion ein erster wichtiger Hinweis. Diese Befunde führten zu weiteren spezifischeren Untersuchungen, wobei eine wichtige Rolle für Kinasen der Src Familie gezeigt werden konnte. Ein weiterer Hinweis auf die Bedeutung der Src-Kinasen für die Internalisierung von S. aureus war ein dramatischer Rückgang der Aufnahmerate in Src/Yes/Fyn-defizienten Maus-Fibroblasten, verglichen mit Src-rekonstituierten Zellen. Auf biochemischer Ebene konnte eine deutliche Aktivierung der Src-Kinase nach einer Infektion mit S. aureus, nicht aber nach Infektion mit dem nicht-pathogenen S. carnosus festgestellt werden. Integrin-reiche fokale Kontakte (FK) sind angereichert mit Proteinen wie Talin, Vinculin, Paxillin, Tensin, -Actinin oder Zyxin sowie Signalenzymen wie der Fokalen Adhäsions Kinase (FAK) oder Kinasen der Src Familie. Die Protein Tyrosin Kinase (PTK) FAK ist nach Integrinstimulierung eines der Schlüsselenzyme in FK. Dies war der Anlass nach der Bedeutung von FAK für die Integrin-vermittelte Internalisierung von S. aureus zu fragen. Ebenfalls ein wichtiger Hinweis waren die starken Rekrutierungen von Markerproteinen von fokalen Komplexen zum Ort von zellgebunden S. aureus nicht aber von S. carnosus. Daraufhin wurde mittels dominant-negativer FAK-Mutanten und FAKdefizienter Mausfibroblasten der Einfluss von FAK für die Internalisierung von S. aureus untersucht. Bei beiden Versuchsansätzen konnte ein starker Rückgang der Aufnahme beobachtet werden. Zusammengefasst bestätigten diese Ergebnisse die essentielle Rolle von FAK für die Integrin vermittelte Aufnahme der pathogenen S. aureus. Bei der Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts spielen eine Reihe von Proteinen eine wichtige Rolle, darunter auch Cortactin. Cortactin ist ein bekanntes Substrat der Src-Kinasen und es lag nahe, nach einer funktionellen Verbindung von Src, FAK und Cortactin zu suchen. Dominant-negative Cortactin-Mutanten, die keine Assoziation mit dem Arp2/3 Komplex oder mit Dynamin aufweisen, oder welche die von Src-vermittelte Phosphorylierung am C-Terminus verhindern, blockierten die Aufnahme von S. aureus. Mikroskopisch konnte eine starke Rekrutierung von Cortactin zu zellgebundenen S. aureus beobachtet werden, jedoch wurde die Rekrutierung nicht von FAK beeinflusst. Die Phosphorylierung von Cortactin aufgrund S. aureus-Infektion war allerdings FAK- und Src-abhängig. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ine bisher unbeschriebene FAK/Src Cortactin Signalachse für die Regulation der Integrin-Internalisierung verantwortlich ist. Die detaillierten Untersuchungen der rezeptorvermittelten Aufnahme und der dabei induzierten Signaltransduktion in Wirtszellen gaben neue Erkenntnisse über die Pathogenitätsstrategien von S. aureus. Darüber hinaus ermöglichen diese Arbeiten neue Einblicke in die molekularen Vorgänge, welche die Internalisierung von Integrinen steuern.
The establishment of genomic approaches including the sequence determination of complete bacterial genomes started a new era in microbiological research. Since then more than two hundred prokaryotic and eukaryotic genomes have been completely sequenced, and there are additional complete genome projects including different bacterial species and strains in progress (http://www.tigr.org, http://www.sanger.ac.uk). The continously growing amount of bacterial DNA sequence information gives us also the possibility to gain deeper insight into bacterial pathogenesis. With the help of comparative genomics, microbiological research can focus on those DNA sequences that are present in pathogenic bacteria but are absent in non-pathogenic strains. With this knowledge and with the help of molecular biological methods such as PCR,DNA-chip technology, subtractive hybridisation, transcriptomics and proteomics we can analyse in detail what makes a particular bacterial strain pathogenic. This knowledge also gives us the possibility to develop new vaccines, therapeutic approaches or diagnostic tools. The aim of this work was the structural and functional analysis of DNA regions of uropathogenic Escherichia coli strain 536 that belong to the flexible E. coli gene pool. The first part of this thesis focused on the identification and structural characterisation of pathogenicity island V of strain 536 (PAI V536). PAI V536 is integrated at the pheV tRNA gene at 64 minutes of the E. coli K-12 chromosome. In addition to the intact pheV tRNA gene, a truncated copy ('pheV) that represents the last 22 bp of this gene’s 3'-end was identified 49 kb downstream of pheV on PAI V536. The analysis of the DNA sequence flanked by pheV and 'pheV revealed characteristics that are typical of PAIs. This DNA region exhibits homology to IS-elements and prophages and also comprises determinants coding for the Pix fimbriae, a phosphoglycerate transport system, an autotransporter, as well as for hypothetical proteins. Downstream of 'pheV, the K15 capsule determinant (kpsK15) of this strain is located. Structural analysis of the 20-kb kpsK15 locus revealed a so far unknown genetic organisation indicative of recombination events between a group 2 and group 3 capsule gene cluster. Downstream of the capsule determinant, the genes encoding a type II secretion system (general secretion pathway -GSP) are located on PAI V536. The K15 capsule locus was functionally characterized. Specific inactivation of each of the regions 1 to 3 of the kpsK15 gene cluster, and the use of a K15 capsule-specific antiserum demonstrated that this determinant is the functional K15 capsule locus of strain 536. It has been shown in an experimental murine model of ascending urinary tract infection with suckling mice that the K15 capsule contributes to urovirulence. Interestingly, the K15 capsule is not involved in serum resistance of strain 536. Inactivation of the PAI V536-encoded type II secretion system excluded a role of this general secretion pathway for capsule biosynthesis and virulence of strain 536 in the murine ascending urinary tract infection model. In the second part of the thesis, the transferability of PAIs was further investigated. Using PAI II536 as a model, mobilisation of this island from strain 536 into suitable recipient strains was investigated. For this purpose, an antibiotic resistance cassette, the R6K origin of replication as well as plasmid pGP704 carrying the mobilisation region of plasmid RP4 have been inserted into PAI II536. Transformation with the helper plasmid RP4, resulted a derivative of strain 536 that was used as a donor for conjugation experiments, while for recipient the pir + laboratory strain SY327 was used. After deletion the circularised PAI II536 was mobilised with the help of the conjugative helper plasmid (RP4) into the recipient laboratory strain SY327. The frequency of this event was about 10-8. It was also demonstrated that in the transconjugant strains the mobilized PAI II536 could be permanently present as a circular form and also can be integrated into the chromosome at the same chromosomal insertion site (leuX) as in the donor strain 536. Furthermore, after mobilisation and chromosomal integration of PAI II536 it was possible to remobilise this PAI back to a PAI II536-negative derivative of strain 536. The results obtained in this thesis increase our knowledge of the structure and function of a pathogenicity island of uropathogenic E. coli strain 536 and shed some light on the mechanisms contributing to genome plasticity and evolution of pathogenic E. coli variants.
Infektionen durch MRSA können aufgrund der zunehmenden Therapieresistenz der Erreger ernsthafte Verläufe zeigen. Daher ist die Entwicklung alternativer Behandlungsstrategien ein Ziel der aktuellen Infektionsforschung. Ein vielversprechender Ansatz liegt in der Verwendung pathogenspezifischer, monoklonaler Antikörper gegen immunodominante Antigene der Erreger. Durch die Fortschritte in der Genomforschung der vergangenen Jahre ist nun die Analyse der Gesamtheit der Pathogenitätsfaktoren eines bakteriellen Erregers möglich. Durch eine funktionelle Genomanalyse mit Hilfe immunologischer Detektionssysteme können antigene Bakterienzellstrukturen identifiziert werden. Daraus abgeleitete Targetstrukturen sollen die Grundlage bilden für die Entwicklung spezifischer humaner Antikörper, die in alternativen Therapieansätzen zusätzlich zur antimikrobiellen Chemotherapie zukünftig an Bedeutung gewinnen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Expressionsgenbank eines MRSA-Stammes hergestellt und mittels Patientenseren nach immunodominanten Antigenen gesucht. Die aus einem Partialverdau der genomischen DNA gewonnenen Fragmente wurden in einen Expressionsvektor kloniert. Die so hergestellte Genbank des ausgewählten MRSA-Stammes A 134 umfasst ca. 10000 Klone. Ein vergleichendes Screening der Genbank erfolgte mit dem Serum eines Patienten mit einer MRSA-Sepsis und mit dem Serum einer negativen Kontrollperson. Die DNA-Inserts der immunoreaktiven Klone wurden sequenziert und durch Datenbankvergleiche identifiziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen deutlich, dass der gewählte Ansatz geeignet ist, um immunodominante Antigene, die während einer Sepsis exprimiert werden, zu identifizieren. Die in der vorliegenden Arbeit gefundenen putativen immunodominanten Antigenstrukturen umfassen ein Holin, die Amidase LytA, Faktoren des isd-Genclusters, der für die Cadmiumresistenz wichtige Transporter CadA, unbekannte Proteine der Staphylokokken-Pathogenitätsinsel SaPI3 und Protein A. Interessanterweise wurden durch den methodischen Ansatz vorwiegend Proteine auf mobilen genetischen Elementen identifiziert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass während einer S. aureus-Infektion nicht nur Gene für das Wachstum der Zellen und Virulenzfaktoren wie Toxine und Adhäsine, sondern auch mobile Elemente exprimiert werden. Die Bedeutung dieser Prozesse für das Infektionsgeschehen ist allerdings bislang unbekannt und zukünftige Untersuchungen müssen zeigen, inwieweit diese Elemente für die Pathogenese von Bedeutung sind. Die in dieser Arbeit identifizierten Antigene müssen auch in zukünftigen Arbeiten durch Subklonierung weiter charakterisiert werden. Eine weitere interessante Beobachtung ist die Identifizierung eines Bakteriophagens, der in das isd-Gencluster inserierte, das für die Aufnahme von Eisen eine Bedeutung besitzt. Inwieweit durch die Insertion des Phagens die Eisenaufnahme in dem klinischen Isolat gestört wird, müssen zukünftige Studien zeigen. Die positive Reaktion des Patientenserums mit dem Protein A ist am wahrscheinlichsten auf die Antiköperbindung am FC-Fragment zurückzuführen. Es ist jedoch auch möglich, dass während der Infektion verstärkt Protein A gebildet wird, das durch die Bindung von Antikörpern am Fc-Teil eine immunsuppressive Wirkung durch die Neutralisierung opsonisierender und Toxin-inaktivierender Antikörper besitzt. Durch die Sequenzierung und Datenbankanalyse der positiven Klone konnte ein erster Überblick über immunodominante Antigene von S. aureus erhalten werden. Da auf den Insertelementen meist mehrere putative Antigene kodiert sind, müssen in zukünftigen Arbeiten die identifizierten Insertelemente subkloniert und damit weiter charakterisiert werden. Dadurch sollte es möglich sein, die immunogenen Strukturen zu erkennen und diese für die Entwicklung monoklonaler Antikörper zu nutzen.
Dendritische Zellen stellen ein essentielles Bindeglied zwischen angeborener und adaptiver Immunität dar. Sie stammen aus dem Knochenmark und bilden ein Netzwerk von heterogenen Zellpopulationen. In peripheren Geweben liegen sie als unreife Zellen mit einem hohen Potential zur Aufnahme und Prozessierung von Mikroorganismen vor. Nach der Aufnahme von eindringenden Mikroorganismen beginnen dendritische Zellen jedoch, sich von einem prozessierenden in ein präsentierendes Stadium zu differenzieren, und wandern zu den sekundären lymphatischen Organen, um dort den naïven T-Zellen die mikrobiellen Antigene zu präsentieren. Die gerichtete Wanderung von dendritischen Zellen ist hierbei ein zentraler Bestandteil der immunstimulatorischen und -modulatorischen Funktion dieser Zellen. Eine essentielle Rolle bei diesem Migrationsverhalten spielen chemotaktische Zytokine (Chemokine). Chemokine sind Proteine mit einem niedermolekularen Gewicht (8-10 kDa), welche anhand ihres strukturellen Cysteinmotifs in vier Gruppen unterteilt und entweder als CXC-, CC-, C- und CX3C- Chemokine oder als α-, β-, δ- und γ-Chemokine bezeichnet werden. Arbeiten der eigenen Arbeitsgruppe am Modell der kutanen Leishmaniose haben jedoch gezeigt, dass die Funktion von Chemokinen weitaus mehr umfasst, als lediglich die zielgerichtete Steuerung der Migration immunologisch wichtiger Zellen. So konnte in diesen Studien nicht nur gezeigt werden, dass das Muster der Expression von Chemokinen mit der Schwere des Krankheitsbildes korreliert, sondern auch, dass das Chemokin CCL2/MCP-1 in der Lage ist, einen direkten Einfluss auf die intrazelluläre Erregerabwehr zu nehmen. Diese Arbeiten bezogen sich jedoch auf humane Hautbiopsien und aus Humanblut isolierten Zellen. Eine detaillierte Analyse des Infektionsverlaufes unter definierten Bedingungen (konstante Infektionsdosis und -art, kontrollierte Infektionsdauer, Verwendung von klonierten Parasiten, einheitlicher genetischer Hintergrund des Wirts) ist bei Patienten jedoch nicht möglich. Deshalb wurde die experimentelle Leishmanieninfektion von Inzuchtmäusen (suszeptible BALB/c- und resistente C57BL/6-Mäuse) herangezogen, um die Kinetik der Chemokinexpression und deren Korrelation mit dem Verlauf der kutanen Leishmaniose zu bestimmen. Die Arbeiten dieser Doktorarbeit zeigen erstmals, dass ebenso wie im humanen System bei der experimentellen Leishmaniose in der Maus die Fähigkeit zur Abwehr dieses Erregers mit einer verstärkten Expression von CCL2/MCP-1 in der infizierten Haut korreliert. Des Weiteren konnte zwar eine CCL2/MCP-1-induzierte leishmanizide Wirkung in murinen Makrophagen festgestellt werden, ein vergleichbarer Effekt blieb bei Langerhans-Zellen, den dendritischen Zellen der Haut, jedoch aus. Weiterhin sollte der Einfluss einer Leishmanieninfektion auf das CCL2/MCP-1- induzierte Wanderungsverhalten von Langerhans-Zellen untersucht werden, da aus der Literatur bekannt ist, dass das Chemokin CCL2/MCP-1 die Migration dendritischer Zellen induziert. Die Studien der Doktorarbeit ergaben hierbei, dass eine Infektion mit Leishmania major zu einer signifikanten Verminderung der durch CL2/MCP-1 oder CCL3/MIP-1α induzierten Migration von Langerhans-Zellen führt. Eine mögliche Ursache für dieses Resultat war hierbei in dem Einfluss einer Infektion mit Leishmanien auf die Expression von Chemokinrezeptoren in dendritischen Zellen zu finden. Anschließende Untersuchungen der mRNA-Expression dieser Rezeptoren konnten diese Vermutung bestätigen. So wurde nach einer Infektion von dendritischen Zellen mit L. major eine Reduktion der mRNA-Expression der Chemokinrezeptoren CCR2 und CCR5 festgestellt. Anschließende FACS-Analysen und Studien mit Hilfe des konfokalen Lasermikroskops führten zu einem ähnlichen Resultat. Interessanterweise bewirkt die Infektion mit L. major andererseits eine Hochregulation der mRNA-Expression von CCR7 in dendritischen Zellen. Von diesem Rezeptor ist bekannt, dass er die Chemokine CCL19/MIP-3β und CCL21/6Ckine, welche im Lymphknoten konstitutiv exprimiert werden, mit großer Affinität bindet und für die zielgerichtete Migration dendritischer Zellen in dieses Organ essentiell ist. Weitere Versuche ergaben zudem eine verstärkte CXCL10/IP-10-mRNA-Expression in dendritischen Zellen aus L. major-resistenten C57BL/6-Mäusen, welche bei dendritischen Zellen aus BALB/c-Mäusen nicht festgestellt worden ist. Zusammenfassend konnte in dieser Doktorarbeit gezeigt werden, dass eine Infektion dendritischer Zellen mit L. major sowohl bei suszeptiblen als auch bei resistenten Mäusen zu einer Modulation der Expression von Chemokinrezeptoren führt, die sowohl für die Lokalisation der Zellen in den entzündeten Hautarealen verantwortlich sind (CCR2 und CCR5), als auch ihre Wanderung in die Lymphknoten steuern CCR7). Darüber hinaus lässt die wirtsspezifische Modulation des Chemokins CXCL10/IP-10 in resistenten Tieren vermuten, dass sie zur Kontrolle der Infektion beiträgt.
Marine Schwämme (Porifera) sind sessile Invertebraten, deren Biomasse bis zu 60% von assoziierten Mikroorganismen gebildet werden kann. Dieses mikrobielle Konsortium ist phylogenetisch komplex, die monophyletischen Abstammungslinien sind hochgradig wirtsspezifisch und bisher konnte kein Vertreter dieser Mikroflora kultiviert werden. In seiner Zusammensetzung unterscheidet sich dieses Konsortium sowohl von der Mikroflora mariner Sedimente, als auch vom marinen Bakterioplankton. Durch 16S rRNA Sequenzanalysen und Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) konnte während dieser Arbeit das neue Candidatus Phylum Poribacteria kultivierungsunabhängig identifiziert werden. Poribacteria bilden definitionsgemäß ein unabhängiges Candidatus Phylum, da sie weniger als 75% Sequenzhomologie innerhalb der 16S rRNA zu anderen prokaryontischen Phyla zeigen. Sie sind verwandt mit Planctomycetes. Der Name „Poribacteria“ wurde gewählt, da diese Organismen spezifisch mit marinen Porifera assoziiert zu sein scheinen. Bisher konnten Poribacteria in Porifera der Ordnungen Verongida, Haplosclerida und Lithistida nachgewiesen werden, während sie in den Ordnungen Poecilosclerida, Agelasida, Halichondrida und Hadromerida nicht nachweisbar waren. Im marinen Sediment und im Bakterioplankton wurden Poribacteria ebenfalls nicht detektiert. Durch FISH Analysen wurde deutlich, dass Poribacteria in A. aerophoba (Verongida) eine abundante Fraktion der assoziierten Mikroflora bilden. Da Vertreter des mikrobiellen Konsortiums mariner Schwämme bisher nicht kultiviert werden konnten, wurde das „Metagenom“ dieser Mikroorganismen durch die ex situ Isolierung hoch molekularer DNA direkt kloniert. Eine Charakterisierung von Metagenomen erlaubt unabhängig von der Kultivierbarkeit der entsprechenden Organismen direkte Einblicke in deren Genotyp und liefert so eine erste Verbindung zwischen phylogenetischer Diversität und physiologischen Eigenschaften. Für die Erstellung der Metagenombank wurde mikrobielle Biomasse aus A. aerophoba vom Mesohyl getrennt und lysiert und die gereinigte DNA in Fosmid Vektoren in E. coli kloniert. Die resultierende Metagenombank APAE02 umfasst ca. 1,1 Gb hoch molekularer prokaryontischer genomischer DNA. Eine Bestimmung der in dieser Metagenombank archivierten mikrobiellen Diversität lieferte zusätzlich zu bekannten 16S rRNA kodierenden Loci aus Cyanobacteria, Chloroflexi, Acidobacteria und Gammaproteobacteria einen 16S rRNA kodierenden poribakteriellen Fosmidklon. Die Annotation der flankierenden genomischen Regionen des 16S rRNA Gens führte zur Detektion eines unterbrochenen rrn Operons, eines wahrscheinlich neuen Transporters, einer neuen Molybdän enthaltenen Oxidoreduktase und orthologer „open reading frames“ (ORFs) aus Rhodopirellula baltica (Planctomycetes) in Poribacteria. Die Charakterisierung dieses 38,7 kb DNA Fragmentes stellt die Basis für weitere genomische Untersuchungen an Poribacteria dar. Metagenombanken repräsentieren eine reichhaltige Quelle zum Nachweis neuer Enzyme oder Biosyntheseoperons. Somit konnten in der Metagenombank APAE02 neuartige Typ I Polyketidsynthasen (PKS) nachgewiesen werden. Phylogenetische Analysen der Ketosynthasedomäne zeigten, dass diese Systeme nicht herkömmlichen Typ I cis-AT bzw. trans-AT (Acyltransferase) PKS Systemen zugeordnet werden können. Die kodierenden Bereiche der PKS Systeme sind mit nur ca. 10 kb relativ klein. Im Gegensatz zu der Organisation sich wiederholender multipler Module herkömmlicher PKS Typ I Systeme bestehen sie nur aus einem einzigen Modul und könnten vermutlich bei der Synthese von Fettsäuren beteiligt sein. Die Struktur und Funktion der Produkte ist bisher unbekannt. Generell ist durch in silico Analysen eine Abbildung des „funktionellen Repertoires“ unkultivierter Mikroorganismen möglich. Es wäre denkbar, dass durch weitere Studien fundierte Einblicke in den Genpool der Poribacteria und anderer Organismen des mikrobiellen Konsortiums aus Poriferen eröffnet werden, um metabolische Eigenschaften zu rekonstruieren und die Mechanismen zur Interaktion mit dem Wirt verstehen zu können.
According to the hygiene hypothesis, the exposure to infectious agents in early childhood prevents the development of allergen-specific Th2 immune responses because it establishes Th1-based immunity or alternatively, induces the generation of T regulatory cells. Based on this theory, the present study pretended to identify promising microorganism-derived vaccine candidates against allergic asthma in the murine model. In the first part of this work, the efficacy of four different known Th1-inducing adjuvants, i.e. live BCG, heat-killed BCG, CpG and PPD, as components of vaccines aimed at inhibiting allergic asthma was compared. All the adjuvants were effective in inhibiting the development of allergen-induced airway eosinophilia, mucus production, and with the exception of PPD also airway hyperreactivity (AHR), when they were applied together with OVA/alum. Suppression of airway eosinophilia was not observed in IFN-gamma- or IL-12-deficient mice (hk-BCG, CpG-ODN and PPD). Interestingly, live BCG was still able to suppress allergen-induced Th2 responses in the absence of either IFN-gamma or IL-12. The effect of live BCG was also independent on IL-10-, TLR-2-, TLR-4- or MyD88-mediated signaling. When mice vaccinated with the different adjuvants together with OVA/alum were subjected to a second period of OVA/alum immunization, only live and hk-BCG were able to efficiently suppress the development of airway inflammation. This effect could be adoptively transferred by CD4+ T cells. Taken together our data suggest that live BCG>>hk-BCG>CpG>PPD are effective in suppressing allergen-induced Th2 responses. Secondly, the evaluation of a dendritic cell-based vaccination strategy leading to the induction of allergen-specific Th1 cells to protect against the development of allergen-specific Th2 responses was performed. The application of OVA-pulsed BM-DC maturated with CpG was unable to reduce airway eosinophilia and inflammation in OVA-immunized mice. OVA-specific IgG1 or IgE serum levels were also not reduced. The experiments using LC pulsed with OVA yielded similar results. However, the mice vaccinated with CpG/OVA pulsed BM-DC had greatly enhanced levels of OVA-specific IgG2a in the serum, suggesting the induction of allergen-specific Th1 responses in vivo. Thus, these data suggest that the vaccination of mice with OVA-pulsed BM-DC matured with CpG or OVA-pulsed LC did not result in a reduction of allergen-specific Th2 responses in a murine model of severe atopic asthma. Lastly, NES, an excretory/secretory product derived from the helminth Nippostrongylus brasiliensis was evaluated as a new potential adjuvant to prevent the development of allergic responses. The application of NES together with OVA/alum greatly inhibited the development of airway eosinophilia, airway goblet cell metaplasia and mucus production and the development of airway hyperreactivity after metacholine challenge. Furthermore, OVA-specific IgG1 and IgE levels in the serum were also strongly reduced. NES preparations contained small amounts of endotoxin, which may explain these results. However, the suppressive effects of NES on the development of allergen-specific Th2 responses was independent upon IFN-gamma or TLR-4 and still observed in mice treated with LPS-depleted NES. NES reduced OVA-induced Th2 responses also in a IL-10-independent manner. In addition, the digestion with proteinase K or the heat-treatment of NES did not abolish its ability to inhibit allergen-induced Th2 responses. Interestingly, NES suppress OVA-specific Th2 responses in vivo in the presence of a strong NES-specific Th2 environment. Taken together our results suggest that the helminth N. brasiliensis secretes substances which interfere with the development of allergic Th2 responses. In summary, distinct substances derived from microorganisms or helminths which may be used as potential adjuvants to prevent the development of allergic Th2 responses were identified. These findings contribute to the design of efficient vaccines protecting humans from developing allergic asthma.
Die Bedeutung von Mykosen hat wegen der wachsenden Zahl immunsupprimierter Patienten in den letzten Jahren immer mehr zugenommen. Diese erkranken häufig an oberflächlichen sowie lebensbedrohlichen systemischen Infektionen mit dem opportunistisch humanpathogenen Hefepilz Candida albicans, da der Keim, der oftmals als harmloser Kommensale auf den Schleimhäuten im Gastrointestinaltrakt gesunder Menschen vorkommt, vom geschwächten Immunsystem nicht mehr in Schach gehalten werden kann. In dieser Arbeit sollten bestimmte Gene von C. albicans, die in anderen Organismen als essentiell für deren Lebensfähigkeit bzw. Virulenz beschrieben wurden, als potentielle Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Antimykotika charakterisiert werden. Das CMP1-Gen kodiert für die katalytische Untereinheit der konservierten Calcium/Calmodulin-abhängigen Phosphatase Calcineurin, die in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae und in anderen Organismen verschiedene physiologische Prozesse reguliert und essentiell für die Virulenz des pathogenen Hefepilzes Cryptococcus neoformans ist. Um die Bedeutung von Calcineurin für das Überleben und die Virulenz von C. albicans zu untersuchen, wurden homozygote cmp1 knock-out-Mutanten sowohl in einem auxotrophen C. albicans-Laborstamm als auch, mit Hilfe eines neuen dominanten Selektionsmarkers, in einem prototrophen Wildstamm hergestellt. Die Mutanten erwiesen sich als hypersensitiv gegenüber Natrium, Calcium, Mangan und Lithium sowie gegenüber alkalischem pH-Wert. Darüber hinaus konnten die mutierten Zellen Membranstreß, der durch SDS- oder Fluconazol-Zugabe verursacht wurde, nicht tolerieren und waren unter diesen Bedingungen stark in ihrem Wachstum gehemmt. Andere wichtige Virulenzeigenschaften wie die Toleranz gegenüber Wirts-Körpertemperatur und die Fähigkeit zur Hyphenbildung zeigten sich durch die CMP1-Deletion in vitro nicht beeinträchtigt. Dennoch machte die Anwendung eines murinen Modells einer systemischen Candidose in vivo deutlich, daß die Mutanten sehr stark in ihrer Virulenz attenuiert waren. Der Virulenzdefekt war vermutlich zumindest zum Teil dadurch bedingt, daß die Calcineurin-defizienten Zellen im Gegensatz zum Wildtyp in humanem Serum nicht wachsen konnten und deshalb möglicherweise schlechter über die Blutbahn disseminieren konnten. Außer Calcineurin wurden in Kooperation mit einem Industriepartner drei weitere Gene, YML127, YPR143, und YML93, die in S. cerevisiae als essentiell beschrieben wurden und die keine signifikanten Homologien zu Vertebraten-Genen aufwiesen, in der C. albicans-Genomsequenz identifiziert und auf ihre Eignung als potentielle Targets hin untersucht. Die Funktion dieser Gene war zu Beginn dieser Arbeit unbekannt; vor kurzem wurde jedoch gezeigt, daß sie in S. cerevisiae eine Rolle beim Chromatin-Remodeling bzw. bei der rRNA-Prozessierung haben. Nachdem sich alle Gene auch in C. albicans als essentiell herausgestellt hatten, wurden konditional letale Mutanten hergestellt, in denen die Gene durch induzierbare Deletion mit Hilfe der site-spezifischen Rekombinase FLP aus dem Genom entfernt wurden. Dadurch wurde eine Population von Nullmutanten erhalten, in denen der terminale Phänotyp der Gendeletion analysiert werden konnte. Die funktionelle Analyse des YML127 (RSC9) Gens wies darauf hin, daß es in C. albicans eine ähnliche Funktion hat wie in der Bäckerhefe, in der das Rsc9-Protein ein Bestandteil des RSC-Protein-Komplexes ist, der die Struktur des Chromatins in Abhängigkeit von Zellzyklus und Umweltbedingungen umorganisiert und damit die Aktivität von Genen steuert. Mit Hilfe eines HA-Epitop markierten YML127-Gens konnte das Genprodukt im Zellkern von C. albicans lokalisiert werden. Die C. albicans yml127-Nullmutanten produzierten verlängerte, mehrfach knospende Zellen, was einen Verlust der Koordination zwischen Mitose und Zytokinese vermuten ließ. Die beiden Gene YPR143 und YML93 (UTP14) scheinen wie ihre homologen Vertreter in S. cerevisiae an der Prozessierung der ribosomalen RNA beteiligt zu sein. Heterozygote Mutanten wiesen eine Haploinsuffizienz auf, die sich in einer erhöhten Suszeptibilität gegenüber Hemmstoffen der rRNA-Synthese und der Ribosomenaktivität zeigte, und in den induzierten Nullmutanten akkumulierten Vorstufen der reifen rRNAs. In beiden Fällen führte die Gendeletion zu Anomalien im Zellzyklus; die ypr143-Mutanten wiesen eine vergrößerte unförmige Zellmorphologie auf, und die yml93-Mutanten bildeten große, rundliche Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben nicht nur wichtige Einblicke in die Funktion der untersuchten Gene in essentiellen zellulären Prozessen, sondern zeigen auch deren Bedeutung für die Virulenz bzw. für das Überleben des humanpathogenen Hefepilzes C. albicans. Die entsprechenden Genprodukte sollten sich deshalb prinzipiell als Angriffspunkte für die Entwicklung neuer antimykotischer Medikamente eignen.
Die opportunistische Hefe Candida albicans ist in der Lage durch ein koordiniertes Zusammenspiel bestimmter zellulärer Eigenschaften sich unterschiedlichen Umweltbedingungen anzupassen und unterschiedliche Nischen innerhalb des menschlichen Wirts zu kolonisieren. Die Sekretion hydrolytischer Enzyme, wie Proteinasen und Phospholipasen, stellt eine wichtige Eigenschaft des Pilzes dar, die als wesentlicher Faktor für die Aufrechterhaltung der Pathogenität von C. albicans angesehen wird. Ein Schwerpunkt der hier vorliegenden Studie ist die funktionale Charakterisierung des caPLB5-Gens, eines neuen Mitglieds der insgesamt 5 Mitglieder umfassenden Phospholipase-B-Genfamilie. Im Gegensatz zu den gut untersuchten sekretorischen PLBs caPlb1p and caPlb2p scheint das caPlb5-Protein GPI-verankert und letztlich zellwandgebunden zu sein. Mittels Northernexpressions-Studien ließen sich in verschiedenen C.-albicans-Stämmen und unterschiedlichen Wachstumsbedingungen caPLB5-spezifische Transkripte nachweisen. Während des Hefe-Hyphe-Wechsels in Lee’s Medium zeigte sich interessanterweise eine differentielle Regulation der Gene caPLB5, caPLB1 and caPLB2. Durch Sequenzanalyse einzelner caPLB5-Allele konnte die Anwesenheit zweier unterschiedlicher Allele in C. albicans bei verschiedenen Stämmen nachgewiesen werden. Die gezielte Geninaktivierung beider Allele in zwei verschiedenen Stämmen resultierte in einer attenuierten Virulenz, was sich im Mausmodell für systemische Infektion anhand des Kolonisationsgrads des Wirtsgewebes messen ließ. Die Phänotypen sowohl der Nullmutanten als auch der caPLB5-Revertanten belegen, dass die Phospholipase B caPlb5p für die vollständige Virulenz des Pathogens benötigt wird und dabei eine Rolle bei der in vivo Organbesiedlung spielt. Diese Arbeit präsentiert zudem die Isolierung und Charakterisierung des ATP-Binding-Cassette-(ABC)-Transporter-Gens caMLT1 aus C. albicans. CaMlt1p zählt zur MRP/CFTR-Unterfamilie ATP-bindender Transportproteine, eine Proteinkategorie, die in diesem Pilz bislang noch nicht beschrieben wurde. Energiebetriebene Transportproteine der ABC-Superfamilie schleusen eine Vielzahl unterschiedlicher Substrate aktiv durch biologische Membranen und erfüllen dabei wichtige Funktionen im zellulären Metabolismus und in der Entgiftung. Das caMlt1-Protein zeigt hohe sequenzielle und strukturelle Ähnlichkeiten zu den vakuolaren Efflux-Pumpen Ycf1p und Bpt1p von S. cerevisiae. Durch genomische Markierung mit dem grün fluoreszierenden GFP-Protein konnte caMlt1p in der vakuolaren Membran lokalisiert werden. Northernblothybridisierungen belegten die Induzierbarkeit der Gentranskripte durch die metabolischen Gifte Cadmium und CDNB, beides Substrate der scYcf1-Pumpe. Obwohl diese Untersuchungen darauf hindeuten, dass caMlt1p ein Ortholog von scYcf1p sein könnte, zeigte sich bei dem Komplementationsversuch einer scycf1-negativen S.-cerevisiae-Mutante mit einer caMLT1-Genkopie keine Reversion des sensitiven Phänotyps gegenüber Cadmium oder CDNB. Auch wiesen die in dieser Arbeit konstruierten, camlt1-negativen Mutanten in C. albicans, die zur Identifizierung potentieller caMlt1p-Substrate eingesetzt wurden, keinen hypersensitiven Phänotyp gegenüber CdCl2, CDNB oder irgendeiner anderen getesteten inhibitorischen Substanz auf. CaMlt1p ist demzufolge kein funktionales Homolog von scYcf1p. Als vakuolar lokalisiertes Protein weist caMLT1 ein für diese Proteingruppe typisches Transkriptionsprofil auf. Die mRNA-Expression erfolgt dabei wachstumsphasenabhängig mit der höchsten Geninduktion während des Diauxic-Shifts, wenn ein Mangel an Glucose (und anderen Nährstoffen) im Medium entsteht. Eine generierte camlt1-Nullmutante war interessanterweise in einem murinen Peritonitismodell in ihrer Fähigkeit die Leber zu invadieren drastisch reduziert. Durch Reintegration einer funktionalen caMLT1-Genkopie konnte der Virulenzdefekt aufgehoben werden. CaMlt1p scheint in die Fähigkeit von C. albicans involviert zu sein an intestinale Organe adhärieren und Gewebebarrieren penetrieren zu können, möglicherweise durch Einbindung des Transporters in Stressantwort- und Detoxifikationsmechanismen. Beide Gene, caMLT1 und caPLB5, wurden auf zweierlei Weise inaktiviert: mittels einer klassischen Mutagenesemethode für C. albicans (dem URA3-Blaster-System im Ura--auxotrophen Stamm CAI4) und durch Entwicklung eines neuen dominanten Selektionssysstems. Die dominante Selektion basiert dabei auf der genomischen Insertion einer Einzelkopie eines mutierten caIMH3-Allels (MPAR), das Transformanten Resistenz gegenüber Mycophenolsäure (MPA) verleiht. Dieses System ermöglicht die genetische Manipulation von C. albicans Wildtypstämmen, wodurch die mühselige Konstruktion auxotropher und oft avirulenter Stämme nicht mehr nötig ist.
Bislang inhibieren antibakterielle Substanzen in erster Linie die Zellwandsynthese, den DNA- und RNA-Stoffwechsel sowie die Proteinsynthese. In dieser Arbeit wurde ein erster Versuch unternommen, neue Zielstrukturen für die Antibiotika-Therapie in S. aureus zu finden. Insgesamt wurden 10 Gene untersucht, die Funktion von 7 dieser Gene war in S. aureus unbekannt. Zunächst sollte herausgefunden werden, ob diese 10 Zielgene: topB, polA, nusG, SA1857, SA1444, SA1063, SA0453, SA0241, SA0245, SA0367, für S. aureus essentiell sind. Es wurde versucht, jedes dieser Gene in S. aureus zu deletieren. Außer den Genen SA1444, SA0245 und nusG konnten alle Zielgene deletiert werden und waren daher für S. aureus nicht essentiell. Die Deletionsmutanten ΔtopB, ΔpolA, ΔSA1857, ΔSA1063, ΔSA0453, ΔSA0241, ΔSA0367 wurden außerdem in einem Sepsismodell in Mäusen untersucht und waren nicht attenuiert. Gene, die weder in vitro noch in vivo essentiell sind, sind nur von geringem Interesse für die Entwicklung neuer Antibiotika. Zur Untersuchung essentieller Gene in S. aureus wurden vier verschiedene konditionale Expressionssystem untersucht. Bei drei dieser Systeme wurde der wildtypische Promotor gegen einen regulierbaren Promotor ausgetauscht. Bei einem weiteren System handelte es sich um einen Antisense-RNA-Ansatz. Zur Überprüfung der konditionalen Expressionssysteme („proof-of-principle“) wurden die bekannten essentiellen Gene ligA und dnaE in S. aureus mutiert. Eines dieser konditionalen Expressionssysteme, das pLL30/Pspac/pMJ8426-System, konnte erfolgreich in S. aureus angewandt werden. Die konditionale Expression von ligA und von SA0245 wurde mit diesem System erzielt. Der Temperatur-sensitive Shuttle-Vektor pLL30 dieses konditionalen Expressionssystems enthält eine Insertionskassette, die das Antibiotikaresistenzgen cat (Chloramphenicol-Acetyltransferase) sowie den regulierbaren Promotor Pspac enthält. Ein wesentliches Merkmal des pLL30/Pspac/pMJ8426-Systems ist die stabile Integration des Resistenzmarkers cat und des Pspac-Promotors durch ein doppeltes Crossover Ereignis vor dem Zielgen. Der Temperatur-sensitive Shuttle-Vektor pLL30 kann anschließend durch mehrfaches Subkultivieren der Bakterien bei nicht permissiver Temperatur eliminiert werden. Der Repressor LacI wird auf einem Extra-Plasmid pMJ8426 kodiert und wird nach erfolgter Integration des Pspac-Promotors vor dem Zielgen in die Bakterien transformiert. Mehrere Kopien des Repressorplasmids ermöglichen eine gute Repression an Pspac. Durch die Zugabe des Induktors IPTG kann der Repressor LacI inaktiviert und die Gen-Expression induziert werden. Insbesondere konnte dieses konditionale Expressionssystem erfolgreich im Tiermodell angewandt werden. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die genetische und funktionelle Charakterisierung von SA0367. Durch biochemische Untersuchungen wurde gezeigt, dass dieses Gen für eine FMN-enthaltende Oxidoreduktase codiert. Auf Grundlage der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur Funktion des Proteins wurde das Gen SA0367, in Analogie zum orthologen Gen nfrA aus B. subtilis, in nfrA umbenannt. Die Oxidoreduktase NfrA oxidiert NADPH in Gegenwart von FMN. In Gegenwart von NADPH und FMN zeigt das Enzym NfrA außerdem Nitroreduktase- und eine leichte Disulfidreduktase-Aktivität. Induktionsexperimente im Wildtyp zeigten, dass nfrA durch oxidativen Stress, verursacht von Diamide oder Nitrofurantoin, und durch Ethanol induziert wird. Ethanol und oxidativer Stress führt zu Denaturierung von Proteinen. NfrA könnte an der Reparatur geschädigter Proteine beteiligt sein. Die Induktion von nfrA in S. aureus erfolgt unabhängig vom alternativen Sigmafaktor SigB. Durch Primer Extension-Experimente wurde eine putative PerR-Box vor dem nfrA-Gen identifiziert. Diese könnte für die Regulation von nfrA wichtig sein. Außerdem wird nfrA während des gesamten Wachstumszyklus von einem SigAabhängigen Promotor exprimiert. Die Deletionsmutante ΔnfrA zeigt nur in Gegenwart hoher Ethanolkonzentrationen von 6,5 % einen leichten Wachstumsnachteil im Vergleich zum Wildtyp. Außerdem weist die ΔnfrA-Mutante eine höhere Resistenz gegenüber Nitrofurantoin auf. In weiteren Untersuchungen wurde begonnen die Funktion der Ser/Thr-Kinase SA1063 durch Microarray-Experimente aufzuklären. Hierbei wurde deutlich, dass dieses Gen eine regulatorische Rolle bei der Zellwandsynthese in S. aureus spielen könnte.
1. Summary Candida albicans is an opportunistic human fungal pathogen that causes a variety of infections, ranging from superficial mucosal to deep-seated systemic infections, especially in immunocompromised patients. Although the ability of C.albicans to cause disease largely depends on the immune status of the host, the fungus also exhibits specific characteristics that facilitate colonization, dissemination, and adaptation to different host niches and thereby turn C.albicans from a harmless commensal to an aggressive pathogen. In response to various environmental stimuli C.albicans switches from growth as a budding yeast to invasive filamentous growth, and this morphogenetic switch plays an important role in C.albicans pathogenesis. Nitrogen limitation is one of the signals that induce filamentous growth in C.albicans, and the control of the morphogenetic transition by nitrogen availability was studied in detail in the present work. Ammonium is a preferred nitrogen source for yeasts that is taken up into the cells by specific transporters. It was found in this study that C.albicans possesses two major ammonium transporters, encoded by the CaMEP1 and CaMEP2 genes, expression of which is induced by nitrogen starvation. Whereas mep1 or mep2 single mutants grew as well as the wild-type strain on limiting concentrations of ammonium, deletion of both transporters rendered C.albicans unable to grow at ammonium concentrations below 5 mM. In contrast to mep1 mutants, mep2 mutants failed to filament and grew only in the yeast form under nitrogen starvation conditions, indicating that in addition to its role as an ammonium transporter CaMep2p also has a signaling function in the induction of filamentous growth. CaMep2p was found to be a less efficient ammonium transporter than CaMep1p and to be expressed at much higher levels, a distinguishing feature important for its signaling function. By the construction and analysis of serially truncated versions of CaMep2p, the C-terminal cytoplasmic tail of the protein was shown to be essential for signaling but dispensable for ammonium transport, demonstrating that these two functions of CaMep2p are separable. In C.albicans at least two signal transduction pathways, a MAP kinase cascade and a cAMP-dependent pathway ending in the transcriptional regulators Cph1p and Efg1p, respectively, control filamentous growth, and mutants defective in either one of these pathways are defective for filamentation under nitrogen starvation conditions. A hyperactive CaMEP2 allele rescued the filamentation defect of a cph1 or a efg1 mutant, but not of a cph1 efg1 double mutant or a mutant deleted for RAS1, which acts upstream of and activates both signaling pathways. Conversely, a dominant active RAS1 allele or addition of exogenous cAMP rescued the filamentation defect of mep2 mutants. These results suggest that CaMep2p activates both the MAP kinase and the cAMP pathway in a Ras1p dependent manner to promote filamentous growth under nitrogen starvation conditions. At sufficiently high concentrations, ammonium repressed filamentous growth even when the signaling pathways were artificially activated. Therefore, C.albicans has established a regulatory circuit in which a preferred nitrogen source, ammonium, serves as an inhibitor of morphogenesis that is taken up into the cell by the same transporter that induces filamentous growth in response to nitrogen starvation. Although a detailed understanding of virulence mechanisms of C.albicans may ultimately lead to novel approaches to combat infections caused by this pathogen, the identification and characterization of essential genes as potential targets for the development of antifungal drugs is a strategy favoured by most pharmaceutical companies. Therefore, C.albicans homologs of three genes that are essential in other fungi were selected in collaboration with an industrial partner and functionally characterized in this work. RAP1 encodes the repressor/activator protein 1, a transcription factor and telomere binding protein that is essential for viability in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. However, deletion of the C.albicans RAP1 homolog did not affect viability or growth of the mutants, suggesting that it is not a promising target. CBF1 (centromere binding factor 1) is necessary for proper chromosome segregation and transcriptional activation of methionine biosynthesis genes in S.cerevisiae and is essential for viability in the related yeasts Kluyveromyces lactis and Candida glabrata. Deletion of CBF1 in C.albicans did not result in an increased frequency of chromosome loss, indicating that it has no role in chromosome segregation in this organism. However, the C.albicans cbf1 mutants exhibited severe growth impairment, temperature sensitivity at 42°C, and auxotrophy for sulphur amino acids, suggesting that Cbf1p is a transcription factor that is important for normal growth of C.albicans. YIL19 is an essential gene in S.cerevisiae that is involved in 18S rRNA maturation. YIL19 was found to be an essential gene also in C.albicans. Conditional mutants in which the YIL19 gene could be excised from the genome by inducible, FLP-mediated recombination were non-viable and accumulated rRNA precursors, demonstrating that YIL19 is essential for this important cellular process and for viability of C.albicans and could serve as a target for the development of antifungal drugs.
Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 beschrieben, nachdem der Erreger aus dem Lungengewebe eines Patienten isoliert wurde, der an einer schweren atypischen Pneumonie erkrankt war. Das Bakterium zeichnet sich durch ein duales Wirtssystem aus und kann sich sowohl in Protozoen als auch in humanen Zellen vermehren. Ein Ziel dieser Arbeit war es, wichtige Faktoren einer Legionelleninfektion seitens der Wirtszelle zu betrachten. Als Wirtsmodell diente die soziale Amöbe Dictyostelium discoideum. Mit Hilfe eines von Patrick Farbrother (Universität Köln) etablierten Dictyostelium DNA-Microarrays mit 5906 genspezifischen Sonden, wurde die Genexpression von D. discoideum in Reaktion auf eine Infektion durch L. pneumophila untersucht. Zur Kontrolle dienten uninfizierte Zellen, und Zellen, die mit L. hackeliae bzw. einer dotA-Mutante von L. pneumophila koinkubiert wurden. Diese beiden Stämme weisen eine verminderte Pathogenität bzw. ein deletiertes Pathogenitätsgen auf. Für den Zeitpunkt 24 h nach Infektionsbeginn wurden 140 Gene gefunden, die in D. discoideum in Reaktion auf eine Infektion mit L. pneumophila differentiell exprimiert werden. Einige Gene codieren bereits bekannte Proteine von D. discoideum. Dazu gehören das RtoA (ratioA, Fusion von Vesikeln), Discoidin I, CotB (spore coat Protein SP70) und die lysosomale α-Mannosidase. Mit Hilfe von Homologie-Suchen konnte weiteren unbekannten Proteinen eine Funktion zugeteilt werden. Hierzu zählen die Chaperone ClpB (heat shock protein Hsp104), β’-COP (coat protein) und drei calciumbindende Proteine. Nach Einteilung in funktionelle Kategorien, konnte gezeigt werden, dass viele Gene reguliert werden, deren Produkte am Aminosäure-Metabolismus beteiligt sind oder bei denen es sich um ribosomale Proteine handelt. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit das Nramp-Protein von D. discoideum näher untersucht. Nramp transportiert zweiwertige Kationen über die phagosomale Membran. Es konnte festgestellt werden, dass die Aufnahme von L. pneumophila und M. avium in eine nramp-Mutante deutlich reduziert ist. Allerdings ist eine vermehrte Replikation von Legionellen und Mykobakterien in der Wirtsmutante zu beobachten. In Zusammenarbeit mit Salvatore Bozzaro (Turin, Italien) konnte gezeigt werden, dass während einer Infektion mit L. pneumophila die nramp-Expression sinkt und bereits nach 48 h annähernd keine nramp-RNA im Northern-Blot nachweisbar ist. Im Gegensatz dazu bleibt die nramp-Expression während einer Infektion mit M. avium relativ konstant. In Infektionsstudien konnte nachgewiesen werden, dass sich die Endozytobionten TUME1, UWE25 und UWC6 in D. discoideum vermehren können. Mit Hilfe von spezifischen Cy3-markierten 16S-rRNA Sonden wurde die intrazelluläre Zunahme der Bakterien über 48 h beobachtet. Zum Zeitpunkt 48 h nach Inokulation konnte eine erhöhte Anzahl der drei Endozytobionten in D. discoideum festgestellt werden. Anhand von elektronenmikro-skopischen Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass die Stämme TUME1 und UWE25 im Zytoplasma des Wirtes von membranösen Strukturen eng umschlossen sind. UWC6 konnte sowohl in Vakuolen als auch frei im Zytoplasma nachgewiesen werden. Die Lokalisierung der Endozytobionten entspricht ihrer Lokalisierung in ihren natürlichen Wirten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Funktionsanalyse des Mip-Proteins aus L. pneumophila. Das Mip-Protein von Legionella gehört in die Klasse der FK506-Bindeproteine. Es besitzt Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomeraseaktivität und bildet Homodimere. Mip kann an die extrazelluläre Matrix von Lungenepithelzellen binden, speziell an das Collagen IV. Mit Hilfe von Transwell-Versuchen konnte festgestellt werden, dass Mip für die Penetration von Legionella durch eine Barriere aus Lungenepithelzellen verantwortlich ist. Die Penetrationsfähigkeit konnte nach Hemmung der PPIase-Aktivität durch FK506 bzw. Rapamycin gehemmt werden. Ebenso waren Legionellen nach Hemmung der Serinproteaseaktivitäten im Transwell-System nicht mehr in der Lage die Barriere aus Epithelzellen mit extrazellulärer Matrix zu durchwandern. Mit Hilfe von Degradationsassays mit S35-markierter extrazellulärer Matrix konnte gezeigt werden, dass mip-positive Legionellen extrazelluläre Matrix degradieren können. Nach Hemmung der PPIase-Aktivität bzw. Serinproteaseaktivität konnten mip-positive Legionellen extrazelluläre Matrix nicht mehr degradieren.
In Säugetieren existieren im wesentlichen zwei Abwehrsysteme gegen oxidativen Streß, in welchen die Glutathionreduktase (GR) und Thioredoxinreduktase (TrxR) Schlüsselenzyme sind. Ein einzelnes Gen der Taufliege, genannt dmtrxr-1, kodiert sowohl für die durch alternatives Splicing entstehende cytoplasmatische und mitochondriale Form der DmTrxR-1. Zum Teil innerhalb des dmtrxr-1-Gens findet sich auf dem Komplementärstrang ein weiteres Gen, welches sniffer genannt wurde. In Kooperation wurde nachgewiesen, daß dieses Gen essentiell zur Verhinderung alterungsbedingter Neurodegeneration ist. Durch biochemische Charakterisierung konnte das rekombinant hergestellte Produkt dieses Gens in der vorliegenden Arbeit als Carbonylreduktase, ein zu den Kurzketten-Dehydrogenasen (short-chain dehydrogenases) gehörendes Enzym, identifiziert werden. Sniffer weist das für Carbonylreduktasen typische Substratspektrum mit Phenanthrenequinone als bestem Substrat auf und wird von Flavonoiden wie Quercetin und Rutin sowie Hydroxymercuribenzoat gehemmt. In verschiedenen Ansätzen konnten Kristalle des rekombinanten Proteins gewonnen werden, die inzwischen in Kooperation vermessen wurden und so zu einer Kristallstruktur mit einer Auflösung von 1,7 Angström führten. Durch diese Arbeiten konnte zum ersten Mal eine Verbindung zwischen einem charakterisierten Gen (snifffer), oxidativem Streß und neurodegenerativen Effekten auf molekularer Ebene nachgewiesen werden. Parasiten haben während ihres Lebenszyklus einen hohen Bedarf an Energie und sind abhängig von einer starken Syntheseleistung. Zur Bewältigung dieses Stresses benötigen sie hohe Aktivitäten an Adenylatkinase (AK; ATP + AMP  2 ADP) und GTP-AMP-Phosphotransferase (GAK; GTP + AMP  GDP + ADP). Beide Enzyme wurden in Blutstadien des Malariaparasiten Plasmodium falciparum identifiziert und die entsprechenden Gene der PfAK und PfGAK auf den Chromosomen 10 und 4 respektive lokalisiert. Klonierung und heterologe Expression in E. coli ergab enzymatisch aktive Proteine mit einer Größe von 28,9 (PfAK), bzw. 28,0 kDa (PfGAK). Das rekombinante Protein der PfAK entspricht in seinen biochemischen Charakteristika denen der authentischen PfAK. Dies gilt auch für eine mögliche Assoziation mit einem stabilisierenden Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 70 kDa und der hohen Substratspezifität für das Monophosphat-Nukleotid AMP. Die Spezifität für das Triphosphat-Substrat ist weniger stringent. Das beste Triphosphat-Substrat ist ATP mit einem Vmax-Wert von 75 U/mg und einem kcat von 2800 min-1. Die Sequenz der PfAK enthält eine amphiphatische Helix, welche als notwendig für die Translokation zytosolischer Adenylatkinasen in den Intermembranraum der Mitochondrien beschrieben wurde. Die PfGAK bevorzugt GTP und AMP als Substrat (100 U/mg; kcat = 2800 min-1 bei 25°C) und zeigt als Besonderheit keine messbare Aktivität mit ATP. Im Gegensatz zu ihrem Ortholog im Menschen (AK3) enthält die Sequenz der PfGAK ein Zinkfinger-Motiv und bindet Eisenionen. Erste Immunfluoreszenz-Analysen lokalisieren die PfGAK in den Mitochondrien. PfAK und PfGAK werden von den Dinukleosid-Pentaphosphat-Verbindungen AP5A beziehungsweise GP5A gehemmt. Die Ki-Werte liegen mit ca. 0.2 µM ungefähr 250-fach niedriger als die KM-Werte der entsprechenden Nukleotidsubstrate. Zur Lösung der vor allem im Rahmen einer rationalen Medikamentenentwicklung notwendigen Kristallstruktur des Zielmoleküls konnten bereits Kristalle der PfGAK erhalten werden.
In the last years more than one hundred microbial genomes have been sequenced, many of them from pathogenic bacteria. The availability of this huge amount of sequence data enormously increases our knowledge on the genome structure and plasticity, as well as on the microbial diversity and evolution. In parallel, these data are the basis for the scientific “revolution” in the field of industrial and environmental biotechnology and medical microbiology – diagnostics and therapy, development of new drugs and vaccines against infectious agents. Together with the genomic approach, other molecular biological methods such as PCR, DNA-chip technology, subtractive hybridization, transcriptomics and proteomics are of increasing importance for research on infectious diseases and public health. The aim of this work was to characterize the genome structure and -content of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (O6:K5:H31) and to compare these data with publicly available data on the genomes of different pathogenic and non-pathogenic E. coli strains and other closely related species. A cosmid genomic library of strain Nissle 1917 was screened for clones containing the genetic determinants contributing to the successful survival in and colonization of the human body, as well as to mediate this strain’s probiotic effect as part of the intestinal microflora. Four genomic islands (GEI I-IVNissle 1917) were identifed and characterized. They contain many known fitness determinants (mch/mcm, foc, iuc, kps, ybt), as well as novel genes of unknown function, mobile genetic elements or newly identified putative fitness-contributing factors (Sat, Iha, ShiA-homologue, Ag43-homologues). All islands were found to be integrated next to tRNA genes (serX, pheV, argW and asnT, respectively). Their structure and chromosomal localization closely resembles those of analogous islands in the genome of uropathogenic E. coli strain CFT073 (O6:K2(?):H1), but they lack important virulence genes of uropathogenic E. coli (hly, cnf, prf/pap). Evidence for instability of GEI IINissle 1917 was given, since a deletion event in which IS2 elements play a role was detected. This event results in loss of a 30 kb DNA region, containing important fitness determinants (iuc, sat, iha), and therefore probably might influence the colonization capacity of Nissle 1917 strain. In addition, a screening of the sequence context of tRNA-encoding genes in the genome of Nissle 1917 was performed to identify genome wide potential integration sites of “foreign” DNA. As a result, similar “tRNA screening patterns” have been observed for strain Nissle 1917 and for the uropathogenic E. coli O6 strains (UPEC) 536 and CFT073. I. Summary 4 The molecular reason for the semi-rough phenotype and serum sensitivity of strain Nissle 1917 was analyzed. The O6-antigen polymerase-encoding gene wzy was identified, and it was shown that the reason for the semi-rough phenotype is a frame shift mutation in wzy, due to the presence of a premature stop codon. It was shown that the restoration of the O side-chain LPS polymerization by complementation with a functional wzy gene increased serumresistance of strain Nissle 1917. The results of this study show that despite the genome similarity of the E. coli strain Nissle 1917 with the UPEC strain CFT073, the strain Nissle 1917 exhibits a specific set of geno- and phenotypic features which contribute to its probiotic action. By comparison with the available data on the genomics of different species of Enterobacteriaceae, this study contributes to our understanding of the important processes such as horizontal gene transfer, deletions and rearrangements which contribute to genome diversity and -plasticity, and which are driving forces for the evolution of bacterial variants. At last, the fim, bcs and rfaH determinats whose expression contributes to the mutlicellular behaviour and biofilm formation of E. coli strain Nissle 1917 have been characterized.
The present investigation report a protocol to obtain dendritic cells (DC) that protects mice against fatal leishmaniasis. DC were generated from bone marrow precursors, pulsed with leishmanial antigen and activated with CpG oligodeoxinucleotides. Mice that were vaccinated with these cells were strongly protected against the clinical and parasitological manifestations of leishmaniasis and developed a Th1 immune response. protection was solid and long-lasting, and was also dependent of the via of administration. Whe the mechanism of protection was studied, it was observed that the availability of the cytokine interleukin-12 at the time of vaccination was a key requirement, but that the source of this cytokine is not the donor cells but unidentified cells from the recipients.
Citrobacter freundii sind Gram-negative, bewegliche, stäbchenförmige Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Als opportunistischer Erreger kann C. freundii beispielsweise Harnwegsinfektionen und Neugeborenen-Meningitis verursachen. Die Internalisierung von C. freundii 3009 in das Endosom von Harnblasenepithelzellen (T24) erfolgt in vitro über einen ausschließlich Mikrotubuli-abhängigen Mechanismus. Als genetische Grundlage der Invasionskompetenz von C. freundii 3009 wurde in Vorarbeiten eine im Chromosom lokalisierte Invasionsdeterminante identifiziert, die eine hohe Identität zum Typ 1 Fimbrien Gencluster (fim) von Salmonella enterica serovar Typhimurium aufweist. Diese in Plasmid pTO3 klonierte Invasionsdeterminante vermittelt nicht-invasiven E. coli K12 Stämmen Invasivität. Im Gegensatz dazu sind rekombinante E. coli K12 Klone, die das fim Operon aus S. enterica serovar Typhimurium bzw. E. coli oder andere E. coli Adhäsindeterminanten tragen, nicht invasiv. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die für die Invasionsfähigkeit von C. freundii 3009 essentiellen Gene der klonierten Invasionsdeterminante ermittelt. Dies geschah zum einen durch Subklonierung von Teilen des Plasmids pTO3. In anschließenden Invasionsassays wurden die entsprechenden E. coli K12 Klone hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Invasion untersucht. Die Internalisierung des Wildtyps C. freundii 3009 sowie der invasiven rekombinanten E. coli K12 Stämme konnte nicht nur, wie erwartet, mittels Mannose, sondern auch mittels Chitinhydrolysat [(GlcNAc)n] inhibiert werden. Zum anderen wurden C. freundii Wildtypmutanten konstruiert, in denen der zentrale Teil der Invasionsdeterminante deletiert ist. Diese chromosomalen Deletionsmutanten weisen im Vergleich zum Wildtyp 3009 eine deutlich reduzierte Invasionsrate in die humane Harnblasenepithelzellinie T24 auf. Für die Komplementante wurde die Wiederherstellung des invasiven Phänotyps demonstriert. Darüber hinaus ist bekannt, dass C. freundii 3009 in humane mikrovaskuläre Endothelzellen aus dem Gehirn (HBMEC) eindringen und dort replizieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sowohl C. freundii 3009 als auch der, die fimCf Determinante tragende, rekombinante E. coli Stamm HB101pPH1 in der Lage sind, im Tiermodell mit neugeborenen Ratten die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Neben der Analyse der Funktion der klonierten C. freundii 3009 fim Determinante in Invasionsassays und mittels Mannose-sensitiver Hefeagglutination, wurden die Genprodukte selbst ebenfalls nachgewiesen. Durch radioaktive Markierung der für die Invasivität essentiellen Proteine nach induzierter Transkription in einem T7 Phagenexpressionssystem konnten die Molekulargewichte von FimCfA, FimCfD, FimCfF und FimCfH ermittelt werden. Diese stimmen mit den von der DNA Sequenz abgeleiteten Molekulargewichten gut überein. Sowohl mit C. freundii 3009 als auch mit entsprechenden rekombinanten E. coli K12 Stämmen gelang es in Westernblots, das Adhäsin FimCfH an der Bakterienoberfläche nachzuweisen. Dies konnte auch für FimCfF in denselben rekombinanten E. coli K12 Stämmen gezeigt werden. Allerdings scheinen die FimCf Proteine nicht zu einem Pilus assembliert zu werden, da in elektronenmikroskopischen Untersuchungen von C. freundii 3009 oder die fimCf Determinante tragenden E. coli K12 Stämmen niemals Fimbrien beobachtet werden konnten. Da auch bestimmte Typ 1 Fimbrien Varianten aus E. coli über das Adhäsin FimEcH die Internalisierung der Bakterien in Blasenepithelzellen zu induzieren vermögen, wurden die fimEc Gencluster aus den beiden human pathogenen E. coli Stämmen 536 (uropathogenes Isolat) und IHE3034 (Neugeborenen-Meningitis Isolat) kloniert. Zudem wurde die Invasionsfähigkeit des E. coli K1 Stamms IHE3034 und der fim negativen Insertionsmutante IHE3034-2 charakterisiert. Typ 1 Fimbrien werden als wichtige Virulenzfaktoren von uropathogenen E. coli (UPEC) angesehen. Trotzdem konnte eine Reihe von klinischen UPEC Isolaten identifiziert werden, die diesen Adhäsintyp nicht mehr exprimieren. Genetische Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit ergaben, dass in 11 Isolaten das fimEc Operon vollständig aus dem Chromosom der Bakterien deletiert ist. In den übrigen 6 Isolaten ist noch ein Teil des 3´-Endes des Gens fimECH vorhanden. Außerdem ist in die Deletionsstelle dieser 6 Isolate ein IS1 Element von E. coli inseriert. In den übrigen uropathogenen Isolaten sind auch angrenzende DNA Bereiche von der Deletion betroffen. Abschließend kann festgestellt werden, dass eine fim ähnliche Determinante in C. freundii 3009 als Invasionssystem fungiert. Die Typ 1 Fimbrien der E. coli Stämme 536 und IHE3034 sind zwar notwendig, aber nicht hinreichend für die Invasivität. Obwohl Typ 1 Fimbrien als wichtige Virulenzfaktoren von uropathogenen E. coli gelten, ist dennoch in einer Reihe von klinischen UPEC Isolaten das fimEc Operon deletiert.
Enterokokken gelten primär als opportunistische Erreger mit geringer Pathopotenz. Sie zeichnen sich allerdings durch ausgeprägte natürliche und erworbene Resistenzen gegen eine Vielzahl von Antibiotika aus. Besorgniserregend ist hierbei insbesondere das Auftreten von Vancomycin-resistenten Enterokokken. Glycopeptidantibiotika, wie Vancomycin und Teicoplanin, werden als Reserveantibiotika gegen multiresistente gram-positive Erreger, wie zum Beispiel Methicillin-resistente Staphylococcus aureus-Stämme (MRSA) eingesetzt. Der VanA-Typ der Glycopeptidresistenz, welcher zuerst in Enterococcus faecium beschrieben wurde, ist die in Zentraleuropa vorherrschende Variante der Glycopeptidresistenz. Das Transposon Tn1546, das die vanA-Resistenzdeterminante kodiert, liegt häufig auf großen konjugativen Plasmiden vor und kann zwischen Enterokokken-Stämmen transferiert werden. In dieser Arbeit wurde der direkte Einfluss von Vancomycin und eines weiteren Antibiotikums, Flavophospholipol (FPL), auf die Rate des konjugativen Transfers des vanA-Operons in E. faecium untersucht. Das Phosphoglycolipidantibiotikum FPL wird derzeit als Leistungsförderer in der Tiermast eingesetzt. Beide Antibiotika induzieren die Expression der Glycopeptidresistenz vom VanA-Typ. Es konnte gezeigt werden, dass Flavophospholipol in unterschiedlichen Konzentrationen die Häufigkeit des Transfers von konjugativen VanA-Plasmiden sowohl in klinischen E. faecium-Isolaten, als auch in E. faecium-Stämmen aus Tierfaeces signifikant hemmte. Vancomycin zeigte keinen signifikanten Effekt auf die Transferrate der VanA-Plasmide. Somit konnte nachgewiesen werden, dass in E. faecium kein funktionaler Zusammenhang zwischen der Induktion des vanA-Operons durch Vancomycin und FPL und der Transferfrequenz der konjugativen VanA-Plasmide unter dem Einfluss der beiden Antibiotika besteht. Weiterhin wurde die Induktion des vanA-Operons unter dem Einfluss verschiedener Antibiotika in einem E. faecium-Isolat näher untersucht. Hierbei wurde die Expression des 39 kDa VanA-Ligase Proteins direkt durch das Western Blot-Verfahren dargestellt. Eine Induktion der Expression des VanA-Ligase Proteins erfolgte durch Inhibitoren der späten Phase der Zellwandsynthese, wie Vancomycin, Flavophospholipol, Bacitracin und Tunicamycin. Außerdem konnte eine leichte Induktion des VanA-Ligase Proteins durch Fosfomycin, Cefalexin und Cefuroxim, Meropenem und Clindamycin nachgewiesen werden. Somit konnte gezeigt werden, dass Cefuroxim und Clindamycin zwei Antibiotika, die in klinischen Studien eine Besiedelung mit VRE begünstigen, auch eine geringe Zunahme der VanA-Ligase Expression bewirken. Zudem wurde deutlich, dass durch den Einfluss von Hitzestress und osmotischem Stress keine Induktion der 39 kDa VanA-Ligase Bande erfolgt. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung einer putativen Resistenz-determinante gegen Flavophospholipol. Die Eigenschaft der FPL-Resistenz konnte nicht durch in vitro-Filterkonjugation von FPL-resistenten auf FPL-sensitive E. faecium-Stämme übertragen werden. Zur molekularen Untersuchung der Resistenz gegen Flavophospholipol wurde ein resistenter E. faecium-Stamm durch das konjugative Transposon Tn916 mutagenisiert. In allen identifizierten FPL-sensitiven Mutanten war die Insertionstelle des Transposons und dessen Orientierung im Chromosom identisch und es deletierte ein 1,5 kb großer genomischer Bereich „downstream“ der Transposon-Insertionsstelle. Dieser Bereich umfasste das 3´-Endes des Gens für eine putative Threonyl-tRNA Synthetase und den Genlocus für einen putativen Transkriptionsregulator. Die Sequenzen in allen Mutanten begannen ca. 200 bp vor dem Startcodon eines Gens für ein putatives Penicillin-Bindeprotein (PBP). In Northern Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass die Transkription des putativen PBP in der Mutante 64/3-1 schwächer war als im Wildtyp 64/3. Außerdem wurden durch 3H Penicillin-Markierung von PBP-Extrakten Unterschiede im Expressionsmuster der Penicillin-Bindeproteine im Wildtyp und in der Mutante deutlich. Während im Wildtyp fünf Penicillin-Bindeproteine zu erkennen waren, fehlten PBP2 und PBP3 in der Mutante 64/3-1. Die Größe von PBP3 entsprach hierbei der geschätzten Größe des putativen PBP von 79 kDa. In der Mutante 64/3-1 fand wahrscheinlich durch den Verlust eines putativen Regulators oder wichtiger regulatorischer Bereiche eine Veränderung im Expressionsmuster der Penicillin-Bindeproteine statt, welche zum FPL-sensitiven Phänotyp führte. In dieser Arbeit konnte zudem gezeigt werden, dass Flavophospholipol in E. faecium an PBP2 und PBP3 bindet und es sich hierbei um bifunktionale „high molecular weight“ Penicillin-Bindeproteine mit Transglycosylase- und Transpeptidase-Untereinheit handeln muss.