Lehrstuhl für Orthopädie
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The role of serum amyloid A (SAA) proteins, which are ligands for toll-like receptors, was analyzed in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs) and their osteogenic offspring with a focus on senescence, differentiation andmineralization. In vitro aged hMSC developed a senescence-associated secretory phenotype (SASP), resulting in enhanced SAA1/2, TLR2/4 and proinflammatory cytokine (IL6, IL8, IL1\(\beta\), CXCL1, CXCL2) expression before entering replicative senescence. Recombinant human SAA1 (rhSAA1) induced SASP-related genes and proteins in MSC, which could be abolished by cotreatment with the TLR4-inhibitor CLI-095. The same pattern of SASP-resembling genes was stimulated upon induction of osteogenic differentiation, which is accompanied by autocrine SAA1/2 expression. In this context additional rhSAA1 enhanced the SASP-like phenotype, accelerated the proinflammatory phase of osteogenic differentiation and enhanced mineralization. Autocrine/paracrine and rhSAA1 via TLR4 stimulate a proinflammatory phenotype that is both part of the early phase of osteogenic differentiation and the development of senescence. This signaling cascade is tightly involved in bone formation and mineralization, but may also propagate pathological extraosseous calcification conditions such as calcifying inflammation and atherosclerosis.
Im seltenen Krankheitsbild der Hypophosphatasie (HPP) treten aufgrund der Fehlfunktion der Gewebe-unspezifischen Alkalischen Phosphatase (tissue-nonspecific alkaline phosphatase, TNAP) skelettale und dentale Symptome in sehr variabler Ausprägung auf. Der vorzeitige Verlust von Milchzähnen ist das zahnmedizinische Leitsymptom und in vielen Fällen ein erstes Anzeichen dieser Erkrankung. In dieser Arbeit wurde ein in vitro Modell der HPP etabliert und der Fokus auf die dentalen Aspekte dieser Erkrankung gelegt. Hierzu wurden mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus Bereichen analysiert, die bei einer Erkrankung von dieser Mineralisierungsstörung betroffen sind. Es wurden dentale Stammzellen aus der Pulpa (dental pulp stem cells, DPSCs) und dem parodontalen Ligament (periodontal ligament stem cells, PDLSCs) isoliert und im Vergleich zu Stammzellen aus dem Knochenmark (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) charakterisiert. Um den Einfluss der Spendervariabilität zu reduzieren, wurden aus dem gesamten dentalen Probenmaterial nur vollständige Probenpaare aus DPSCs und PDLSCs von 5 Spendern für die vergleichenden Analysen verwendet. Die dentalen MSCs konnten somit paarweise direkt miteinander verglichen werden.
DPSCs gelten seit ihrer Entdeckung von Gronthos et al. im Jahr 2000 als geeignete Quelle für die Stammzellgewinnung mit vielversprechenden Anwendungsmöglichkeiten im Bereich des Tissue Engineering und der regenerativen muskuloskelettalen Medizin. PDLSCs sind aufgrund der parodontalen Problematik der HPP von besonderem Interesse in dieser Arbeit. Die Isolation von Stammzellen aus Pulpa und PDL konnte mit dem Nachweis der sogenannten Minimalkriterien für MSCs bestätigt werden.
In diesem durch Enzyminhibition mit Levamisol induzierten in vitro Modell der HPP wurde die TNAP-abhängige Genexpression, die Enzym-Aktivität und das osteogene Differenzierungspotenzial an diesen drei Mineralisierungs-assoziierten MSCs untersucht. Die erweiterte Genexpressionsanalyse in Kooperation mit der Core Unit Systemmedizin der Universität Würzburg mit einer RNA-Sequenzierung der PDLSCs ergab interessante Einblicke in die differentielle Genexpression nach der TNAP-Inhibition während der osteogenen Differenzierung und Ansatzpunkte für weitere Analysen. Die beobachteten Genregulationen waren nach dem derzeitigen Verständnis pathologischer Zusammenhänge nachvollziehbar und simulierten in vitro HPP-relevante Signalwege repräsentativ. Insbesondere die signifikante Genregulation von P2X7 und DMP1, sowie Zusammenhänge aus dem Wnt-Signalweg zeigen hinsichtlich der dentalen Aspekte der HPP neue Ansatzpunkte auf. Die erhöhte P2X7-Expression in diesem in vitro HPP-Modell scheint mit der Parodontitis-Problematik der HPP zu korrelieren und verdeutlicht unter anderem die multifaktorielle Ätiologie und Pathogenese der Parodontitis. Die Tatsache, dass die experimentellen Beobachtungen in Einklang mit dem klinischen Bild der HPP gebracht werden können, bestätigt die Relevanz des hier etablierten in vitro Modells. Zusammenfassend konnten anhand dieses in vitro Modells der HPP neue Aspekte aufgedeckt werden, die nicht nur im Hinblick auf die dentale Problematik der HPP aufschlussreich sind.
Phosphat stellt einen essenziellen Bestandteil der Knochenhartsubstanz dar und ist zudem erforderlich, um mesenchymale Stammzellen osteogen zu differenzieren. Bei der Aufklärung molekularer Pathomechanismen von Störungen der Phosphathomöostase wurden in den vergangenen zehn Jahre mehrere Botenstoffe identifiziert, die spezifische Wirkungen auf den systemischen Phosphathaushalt haben. Die als „Phosphatonine“ bezeichneten Substanzen FGF23 (Fibroblastenwachstumsfaktor 23), sFRP4 (secreted frizzled related protein 4), FGF7 (Fibroblastenwachstumsfaktor 7) und MEPE (matrix extracellular phosphoglycoprotein) induzieren eine negative Phosphatbilanz, indem sie an der Niere phosphaturisch wirken. Ziel dieser Arbeit war es, eventuell vorhandene Interaktionen zwischen knochenbildenden Zellen, Phosphat und den inzwischen bekannten Substanzen mit Wirkung auf den Phosphathaushalt zu charakterisieren. Dazu wurden immortalisierte Zelllinien mesenchymaler Stammzellen (hMSC-TERT) und fetaler Osteoblasten (hFOB) konzentrations- und zeitabhängig mit Phosphat stimuliert (von 1,25 mM bis 20 mM, von 0 bis 48 h). Die quantitative real-time-PCR zur relativen mRNA-Quantifizierung wurde dabei in der Arbeitsgruppe als Methode etabliert, um den Einfluss dieser erhöhten Phosphatspiegel im Nährmedium auf die Expression von Genen des Phosphatstoffwechsels und Markern der osteogenen Differenzierung zu analysieren. Untersucht wurden Col1 (Kollagen 1), OC (Osteokalzin), AP (Alkalische Phosphatase) und OP (Osteopontin) als Differenzierungsmarker, Pit-1 (Natrium-Phosphattransporter), sFRP4, MEPE und FGF23 als Schlüsselsubstanzen im Phosphatstoffwechsel sowie Aktin und EF1a als Housekeeping-Gene. Die real-time-PCR wurde mit der SYBR® Green-Methode durchgeführt, die Effizienzbestimmung erfolgte mit LinRegPCR, die Auswertung mit REST© und REST 2005, jeweils für die ermittelte Effizienz und die als optimal angenommene Effizienz (E=2). Zunächst konnte die Expression des Natrium-Phosphattransporters Pit-1 in den Zellen hMSC-TERT und hFOB nachgewiesen werden. Bei beiden Zelllinien zeigte sich, dass die Expression von sFRP4 mit steigender Phosphatkonzentration bzw. steigender Stimulationsdauer nach unten reguliert wird. Beim Vergleich aller stimulierten Proben mit den unstimulierten Kontrollen fiel das Expressionsverhältnis bei hMSC-TERT ungefähr auf die Hälfte des Ausgangswertes (0,52; p<0,05), bei hFOB reduzierte es sich auf zwei Drittel (0,67; p<0,05). Es ist somit anzunehmen, dass Phosphat in der Lage ist, die Genexpression von sFRP4 in hMSC-TERT und hFOB nach unten zu regulieren. Für Pit-1 ergab sich bei hMSC-TERT der Hinweis auf eine gesteigerte mRNA-Expression unter Phosphateinwirkung, für hFOB-Zellen konnte diese Beobachtung nicht gemacht werden. Beide Zelllinien zeigten unter Phosphat-Stimulation und maximaler Einwirkzeit von 48 h kein einheitliches Expressionsmuster, das auf eine beginnende Differenzierung hinweisen würde. Der in dieser Arbeit gefundene Hinweis auf eine Phosphatsensitivität von sFRP4 in mesenchymalen Stammzellen und Osteoblasten lässt somit die Vermutung einer physiologischen Beteiligung von sFRP4 an der Phosphatregulation zu. Es bleibt zu klären, inwieweit andere Phosphatonine an solchen Signalachsen beteiligt sind. Spekuliert werden kann, dass sFRP4 auch als Antagonist des Wnt-Signalweges bei Differenzierungsvorgängen eine größere Rolle spielt als bisher angenommen. Des Weiteren sollte in der vorliegenden Arbeit ein Genexpressionssystem (Tet-On™ Konstrukt) in mesenchymalen adulten Stammzellen (hMSC-TERT) etabliert werden, mit dem im Endzustand die Expression beliebiger Gene Tetracyclin-abhängig induziert werden kann. Diese Arbeiten konnten bis zur ersten Transfektion erfolgreich durchgeführt werden: Für einen Referenz-Vektor zeigte sich eine ausgeprägte Induzierbarkeit durch Doxycyclin. Als erstes Gen sollte sFRP4 überexprimiert werden, das dafür zunächst isoliert, sequenziert und kloniert wurde und nun für den Einsatz in diesem Genexpressionssystem zur Verfügung steht. Die Aufklärung der Regulationsmechanismen und auch der Wirkungsweise von Phosphat wird ein wichtiges Ziel zukünftiger Forschung sein und eventuell neue therapeutische Möglichkeiten zur Behandlung von krankhaften Abweichungen der Phosphathomöostase eröffnen.
Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob mittels IHH-Gentransfer aus Hüftköpfen gewonnene hMSCs chondrogen im Pelletkultursystem differenziert werden können und ob zugleich durch IHH eine Modulation der hypertrophen Enddifferenzierung der hMSCs in diesem System möglich ist. IHH bestimmt in der Wachstumsfuge zusammen mit PTHrP während der endochondralen Ossifikation die Chondrozytenreifung und -differenzierung entscheidend mit und ist daher ein interessanter Kandidat zur Induktion von hyalinem oder zumindest hyalin-ähnlichem Knorpelgewebe in der stammzellbasierten Gentherapie. Nach Gewinnung und Kultivierung der hMSCs wurden diese mit Ad.GFP, Ad.IHH, Ad.IHH+TGF-β1, Ad.IHH+SOX-9 oder Ad.IHH+BMP-2 transduziert bzw. ein Teil für die Negativkontrolle nicht transduziert und im Anschluss alle Gruppen zu Pellets weiterverarbeitet. Histologische, biochemische sowie molekularbiologische Untersuchungen wurden an verschiedenen Zeitpunkten zur Evaluierung des chondrogenen Differenzierungsgrades sowie der hypertrophiespezifischen Merkmale der kultivierten Pellets durchgeführt. Es konnte durch diese Arbeit sowohl auf Proteinebene als auch auf Genexpressionsebene reproduzierbar gezeigt werden, dass primäre hMSCs im Pelletkultursystem sowohl durch den adenoviralen Gentransfer von IHH allein als auch durch die Co-Transduktionsgruppen IHH+TGF-β1, IHH+SOX-9 und IHH+BMP-2 chondrogen differenziert werden können. Dabei zeigten alle IHH-modifizierten Pellets Col II- und CS-4-positive immunhistochemische Anfärbungen, eine gesteigerte Synthese von Glykosaminoglykanen im biochemischen GAG-Assay sowie eine Hochregulation von mit der Chondrogenese assoziierten Genen. Das Auftreten hypertropher Merkmale bei den chondrogen differenzierten MSCs konnte durch IHH-Gentransfer nach 3 Wochen in vitro-Kultivierung nicht vollkommen unterdrückt werden, war jedoch besonders stark ausgeprägt, wenn BMP-2 co-exprimiert wurde und war etwas weniger evident in der IHH+SOX-9-Gruppe. Dabei zeigte die Ad.IHH+BMP-2-Gruppe sowohl in der ALP-Färbung als auch in dem ALP-Assay und der quantitativen RT-PCR die stärkste Hochregulierung des hypertrophen Markers ALP. Möglicherweise brachte die Überexpression von IHH das fein aufeinander abgestimmte Regulationssystem zwischen IHH und PTHrP aus dem Gleichgewicht und könnte als ein Grund dafür angeführt werden, warum die Hypertrophie im Pelletkultursystem nicht vollkommen supprimiert werden konnte. Es bleibt abzuwarten, ob IHH in vivo die Chondrogenese induzieren und dabei zugleich das Phänomen der chondrogenen Hypertrophie regulieren kann. In der Zukunft würde dies letztlich der stammzellbasierten Knorpelregeneration in vivo zu Gute kommen.
Chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells and articular cartilage reconstruction
(2008)
Articular cartilage defects are still one of the major challenges in orthopedic and trauma surgery. Today, autologous chondrocyte transplantation (ACT), as a cell-based therapy, is an established procedure. However, one major limitation of this technique is the loss of the chondrogenic phenotype during expansion. Human mesenchymal stem cells (hMSCs) have an extensive proliferation potential and the capacity to differentiate into chondrocytes when maintained under specific conditions. They are therefore considered as candidate cells for tissue engineering approaches of functional cartilage tissue substitutes. First in this study, hMSCs were embedded in a collagen type I hydrogel to evaluate the cartilaginous construct in vitro. HMSC collagen hydrogels cultivated in different culture media showed always a marked contraction, most pronounced in chondrogenic differentiation medium supplemented with TGF-ß1. After stimulation with chondrogenic factors (dexamethasone and TGF-ß1) hMSCs were able to undergo chondrogenesis when embedded in the collagen type I hydrogel, as evaluated by the temporal induction of cartilage-specific gene expression. Furthermore, the cells showed a chondrocyte-like appearance and were homogeneously distributed within a proteoglycan- and collagen type II-rich extracellular matrix, except a small area in the center of the constructs. In this study, chondrogenic differentiation could not be realized with every hMSC preparation. With the improvement of the culture conditions, e.g. the use of a different FBS lot in the gel fabrication process, a higher amount of cartilage-specific matrix deposition could be achieved. Nevertheless, the large variations in the differentiation capacity display the high donor-to-donor variability influencing the development of a cartilaginous construct. Taken together, the results demonstrate that the collagen type I hydrogel is a suitable carrier matrix for hMSC-based cartilage regeneration therapies which present a promising future alternative to ACT. Second, to further improve the quality of tissue-engineered cartilaginous constructs, mechanical stimulation in specific bioreactor systems are often employed. In this study, the effects of mechanical loading on hMSC differentiation have been examined. HMSC collagen hydrogels were cultured in a defined chondrogenic differentiation medium without TGF-ß1 and subjected to a combined mechanical stimulation protocol, consisting of perfusion and cyclic uniaxial compression. Bioreactor cultivation neither affected overall cell viability nor the cell number in collagen hydrogels. Compared with non-loaded controls, mechanical loading promoted the gene expression of COMP and biglycan and induced an up-regulation of matrix metalloproteinase 3. These results circumstantiate that hMSCs are sensitive to mechanical forces, but their differentiation to chondrocytes could not be induced. Further studies are needed to identify the specific metabolic pathways which are altered by mechanical stimulation. Third, for the development of new cell-based therapies for articular cartilage repair, a reliable cell monitoring technique is required to track the cells in vivo non-invasively and repeatedly. This study aimed at analyzing systematically the performance and biological impact of a simple and efficient labeling protocol for hMSCs. Very small superparamagnetic iron oxide particles (VSOPs) were used as magnetic resonance (MR) contrast agent. Iron uptake was confirmed histologically with prussian blue staining and quantified by mass spectrometry. Compared with unlabeled cells, VSOP-labeling did neither influence significantly the viability nor the proliferation potential of hMSCs. Furthermore, iron incorporation did not affect the differentiation capacity of hMSCs. The efficiency of the labeling protocol was assessed with high resolution MR imaging at 11.7 Tesla. VSOP-labeled hMSCs were visualized in a collagen type I hydrogel indicated by distinct hypointense spots in the MR images, resulting from an iron specific loss of signal intensity. This was confirmed by prussian blue staining. In summary, this labeling technique has great potential to visualize hMSCs and track their migration after transplantation for articular cartilage repair with MR imaging.
Aus dem Knochenmark isolierte humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) sind als Vorläuferzellen der Osteoblasten an der Knochenformation sowie an der Knochenremodellierung beteiligt und aufgrund ihrer Multipotenz in der Lage, in mesenchymales Gewebe (Knochen, Knorpel, Fett) zu differenzieren. Aufgrund dieser Eigenschaften gelten sie als Quelle der Regeneration und der Heilung im Hinblick auf zellbasierte Therapien zur Behandlung degenerativer Erkrankungen (Arthrose, Osteoporose) des muskuloskelettalen Systems. Die besondere Situation der Geweberegeneration beim älteren Menschen ist gekennzeichnet durch den Anstieg der Produktion von Hemmstoffen der Geweberegeneration und durch verschiedene häufige Mangelzustände wie z.B. den Vitamin D-Mangel. In der vorliegenden Arbeit wurden Modulatoren (Morphogene) untersucht, die in der Lage sind, die hMSC in vitro in ihrem proliferativen, undifferenzierten Zustand (transient amplifying pool) und am Übergang in die Differenzierung und Reifung zu beeinflussen. Ziel war es, durch die Charakterisierung solcher Modulatoren, Verfahren zu etablieren, die zu einer verbesserten Zellqualität bei regenerativen Therapiestrategien führen, sei es in situ oder beim Tissue Engineering. Der Fokus lag auf der Geweberegeneration beim älteren Menschen. Dafür wurden als Morphogene 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25D3), Aktivin A (AA), Myostatin (MSTN) und Low Oxygen (LO) ausgewählt und hinsichtlich ihrer Wirksamkeit auf Stemness, Differenzierung und Seneszenzentwicklung in der Zellkultur getestet. Alle 4 Kandidaten nehmen im menschlichen Organismus wichtige regulatorische Aufgaben ein. 1,25D3 wirkt nicht nur lokal auf Zellen und Gewebe, sondern mit der Mineralisierung des Knochens und der Regulierung des Kalzium- und Phosphatspiegels im Serum auch systemisch. AA und MSTN werden als Mitglieder der TGFβ-Familie mit dem muskuloskelettalen System in Verbindung gebracht, da eine Inaktivierung von MSTN bei Mensch und Tier zu einem deutlichen Anstieg der Skelettmuskelmasse führt. Gleichzeitig fördert ein Aktivin Antagonist, der neue Wirkstoff Sotatercept (ACE-011), die Knochenbildung im Menschen. Mit der Kultivierung der hMSC unter reduzierter Sauerstoffspannung (2,5 % Sauerstoff, LO) sollten Bedingungen in der Zellkultur geschaffen werden, die - im Vergleich zur traditionellen Kultivierung mit einem atmosphärischen Sauerstoffgehalt von 21 % - näher an den physiologischen Gegebenheiten bei der Geweberegeneration sind. Zu Beginn wurde sichergestellt, dass alle 4 Modulatoren die Expression typischer mesenchymaler Oberflächenmarker nicht beeinflussten und die klonogene Kapazität der stimulierten hMSC erhielten. Im Rahmen weiterer Untersuchungen zeigte sich, dass eine permanente 1,25D3 Supplementierung die chondrogene, adipogene und osteogene Differenzierungskapazität der hMSC erhielt und somit den Stammzellcharakter der hMSC nicht beeinträchtigte. Die verstärkte Expression der Quieszenz-assoziierten Gene in 1,25D3 stimulierten hMSC deutete darauf hin, dass sich die hMSC aufgrund der 1,25D3 Supplementation in Richtung Quieszenz verändern. Die permanente 1,25D3 Supplementation übt somit eine vor Alterungsprozessen schützende Wirkung in der Zellkultur aus, indem die Entwicklung replikativer Seneszenz verzögert wird und das multipotente Potential der hMSC erhalten wird. Im Bezug auf die Differenzierungsfähigkeit der Zellen verhielten sich rh AA und rh MSTN konträr. Während eine rh MSTN Stimulation keine Wirkung auf die adipogene und osteogene Differenzierung hatte, schränkte rh AA das adipogene und osteogene Differenzierungspotential der hMSC nahezu vollständig ein und die Zellen wurden in einem Zustand des Prä-Kommittments festgehalten. Da die LO Expandierung die Stemness erhöhte bzw. die Seneszenz reduzierte und die hMSC in einem proliferativen Zustand bei gleichzeitiger Hemmung der Differenzierung arretierte, scheint diese Art der Kultivierung ein besonderer Schutz für die hMSC zu sein. Mit der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, wirksame Morphogene (1,25D3, rh AA, LO) zu finden, die in der Lage sind, modulatorisch auf die hMSC einzuwirken ohne dabei den Stammzellcharakter zu verändern. Durch ihre Modulation kann nicht nur die Qualität der hMSC verbessert werden, sondern je nach Bedarf können auch die verschiedenen Phasen der Geweberegeneration insbesondere beim Übergang vom „transient amplifying pool“ zur Differenzierung gesteuert werden. Diese Ergebnisse können Konsequenzen für die Anwendung haben, bei der in situ Geweberegeneration ebenso wie für das ex vivo Tissue Engineering.
Osteoporosis, or steroid-induced osteonecrosis of the hip, is accompanied by increased bone marrow adipogenesis. Such a disorder of adipogenic/osteogenic differentiation, affecting bone-marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs), contributes to bone loss during aging. Here, we investigated the effects of extracellular vesicles (EVs) isolated from human (h)BMSCs during different stages of osteogenic differentiation on the osteogenic and adipogenic differentiation capacity of naïve (undifferentiated) hBMSCs. We observed that all EV groups increased viability and proliferation capacity and suppressed the apoptosis of naïve hBMSCs. In particular, EVs derived from hBMSCs at late-stage osteogenic differentiation promoted the osteogenic potential of naïve hBMSCs more effectively than EVs derived from naïve hBMSCs (naïve EVs), as indicated by the increased gene expression of COL1A1 and OPN. In contrast, the adipogenic differentiation capacity of naïve hBMSCs was inhibited by treatment with EVs from osteogenic differentiated hBMSCs. Proteomic analysis revealed that osteogenic EVs and naïve EVs contained distinct protein profiles, with pro-osteogenic and anti-adipogenic proteins encapsulated in osteogenic EVs. We speculate that osteogenic EVs could serve as an intercellular communication system between bone- and bone-marrow adipose tissue, for transporting osteogenic factors and thus favoring pro-osteogenic processes. Our data may support the theory of an endocrine circuit with the skeleton functioning as a ductless gland.
WISP3 is a member of the CCN family which comprises six members found in the 1990’s: Cysteine-rich,angiogenic inducer 61 (CYR61, CCN1), Connective tissue growth factor (CTGF, CCN2), Nephroblastoma overexpressed (NOV, CNN3) and the Wnt1 inducible signalling pathway protein 1-3 (WISP1-3, CCN4-6).They are involved in the adhesion, migration, mitogenesis, chemotaxis, proliferation, cell survival, angiogenesis, tumorigenesis, and wound healing by the interaction with different integrins and heparan sulfate proteoglycans. Until now the only member correlated to the musculoskeletal autosomal disease Progressive Pseudorheumatoid Dysplasia (PPD) is WISP3. PPD is characterised by normal embryonic development followed by cartilage degradation over time starting around the age of three to eight years. Animal studies in mice exhibited no differences between knock out or overexpression compared to wild type litter mates, thus were not able to reproduce the symptoms observed in PPD patients. Studies in vitro and in vivo revealed a role for WISP3 in antagonising BMP, IGF and Wnt signalling pathways. Since most of the knowledge of WISP3 was gained in epithelial cells, cancer cells or chondrocyte cell lines, we investigated the roll of WISP3 in primary human mesenchymal stem cells (hMSCs) as well as primary chondrocytes.
WISP3 knock down was efficiently established with three short hairpin RNAs in both cell types, displaying a change of morphology followed by a reduction in cell number. Simultaneous treatment with recombinant WISP3 was not enough to rescue the observed phenotype nor increase the endogenous expression of WISP3. We concluded that WISP3 acts as an essential survival factor, where the loss resulted in the passing of cell cycle control points followed by apoptosis. Nevertheless, Annexin V-Cy3 staining and detection of active caspases by Western blot and immunofluorescence staining detected no clear evidence for apoptosis. Furthermore, the gene expression of the death receptors TRAILR1 and TRAILR2,important for the extrinsic activation of apoptosis, remained unchanged during WISP3 mRNA reduction. Autophagy as cause of cell death was also excluded, given that the autophagy marker LC3 A/B demonstrated to be uncleaved in WISP3-deficient hMSCs. To reveal correlated signalling pathways to WISP3 a whole genome expression analyses of WISP3-deficient hMSCs compared to a control (scramble) was performed. Microarray analyses exhibited differentially regulated genes involved in cell cycle control, adhesion, cytoskeleton and cell death. Cell death observed by WISP3 knock down in hMSCs and chondrocytes might be explained by the induction of necroptosis through the BMP/TAK1/RIPK1 signalling axis. Loss of WISP3 allows BMP to bind its receptor activating the Smad 2/3/4 complex which in turn can activate TAK1 as previously demonstrated in epithelial cells. TAK1 is able to block
caspase-dependent apoptosis thereby triggering the assembly of the necrosome resulting in cell death by necroptosis.
Together with its role in cell cycle control and extracellular matrix adhesion, as demonstrated in human mammary epithelial cells, the data supports the role of WISP3 as tumor suppressor and survival factor in cells of the musculoskeletal system as well as epithelial cells.
Fragestellung:
Die Therapie von Knochendefekten kritischer Größe mit kompromittiertem Regenerationspotential, stellt ein schwerwiegendes Problem dar. Die Forschung auf dem Gebiet der Knochenheilung hat sich in jüngster Vergangenheit daher auf die Anwendung mesenchymaler Vorläuferzellen (MSZ) zur Stimulierung des Knochenwachstums konzentriert. In der vorliegenden Studie wurde in humanen MSZ eine Überexpression spezifischer Wachstumsfaktoren induziert mit dem Ziel, deren osteogenes Potential zu steigern.
Methodik:
MSZ wurden nach etablierten Protokollen expandiert. Durch adenovirale Transfektion wurde eine überexpression von grün fluoreszierendem Protein (GFP, Kontrolle), indian hedgehog (IHH), bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) und IHH in Kombination mit BMP-2 induziert. Die MSZ wurden für 28 Tage mit osteogenem Differenzierungs- und Kontrollmedium kultiviert. Als weitere Kontrolle dienten native MSZ. Es wurden die Auswirkungen der jeweiligen genetischen Veränderungen auf die metabolische Aktivität (Alamar Blau), die Proliferation (Qubit dsDNA BR), die Aktivität des Enzyms alkalische Phosphatase (ALP)(p-Nitrophenylphosphat), die Mineralisierung (Alizarinrot S, Calcium O-Cresolphthalein) sowie auf die Expression charakteristischer Markergene untersucht (qRT-PCR).
Ergebnis:
In den ersten 72h nach Transfektion konnte eine leichte, im Vergleich zu nativen Zellen nicht signifikante Abnahme der metabolischen Aktivität in allen Gruppen beobachtet werden. Das Proliferationsverhalten transfizierter und nativer MSZ unterschied sich während des Untersuchungszeitraums nicht signifikant. Bei der Analyse der ALP-Aktivität zeigte sich ein typisches Rise-and-Fall Muster. Alle ost Gruppen wiesen sowohl im Assay als auch in der PCR eine signifikant höhere ALP-Aktivität auf. Die Überexpression von BMP-2 und IHH+BMP-2 bewirkte eine signifikant stärkere Mineralisierung an Tag 28. In der PCR zeigte sich für BMP-2 ost und IHH+BMP2 ost ein signifikanter Anstieg der Osteopontin und BMP-2 Expression über die Zeit. Zudem stieg bei allen ost Gruppen die Runx2 Expression bis Tag 21 an.
Schlussfolgerung:
Die virale Transfektion hatte keinen negativen Einfluss auf die metabolische Aktivität der Zellen oder deren Proliferationsverhalten. Die Überexpression von BMP-2 ohne oder in Kombination mit IHH führte zu einer vermehrten Produktion extrazellulärer Matrix und zu einer gesteigerten Genexpression osteogener Marker. Die virale Transfektion stellt daher eine vielversprechende Möglichkeit dar, das osteogene Potential von MSZ zu steigern.