Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
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- DNA Analytics Core Facility, Biocenter, University of Würzburg, Würzburg, Germany (1)
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- D-1221-2009 (1)
- J-8841-2015 (1)
- N-2030-2015 (1)
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In this thesis, the development of a phylogenetic DNA microarray, the analysis of several gene expression microarray datasets and new approaches for improved data analysis and interpretation are described. In the first publication, the development and analysis of a phylogenetic microarray is presented. I could show that species detection with phylogenetic DNA microarrays can be significantly improved when the microarray data is analyzed with a linear regression modeling approach. Standard methods have so far relied on pure signal intensities of the array spots and a simple cutoff criterion was applied to call a species present or absent. This procedure is not applicable to very closely related species with high sequence similarity because cross-hybridization of non-target DNA renders species detection impossible based on signal intensities alone. By modeling hybridization and cross-hybridization with linear regression, as I have presented in this thesis, even species with a sequence similarity of 97% in the marker gene can be detected and distinguished from related species. Another advantage of the modeling approach over existing methods is that the model also performs well on mixtures of different species. In principle, also quantitative predictions can be made. To make better use of the large amounts of microarray data stored in public databases, meta-analysis approaches need to be developed. In the second publication, an explorative meta-analysis exemplified on Arabidopsis thaliana gene expression datasets is presented. Integrating datasets studying effects such as the influence of plant hormones, pathogens and different mutations on gene expression levels, clusters of similarly treated datasets could be found. From the clusters of pathogen-treated and indole-3-acetic acid (IAA) treated datasets, representative genes were selected which pointed to functions which had been associated with pathogen attack or IAA effects previously. Additionally, hypotheses about the functions of so far uncharacterized genes could be set up. Thus, this kind of meta-analysis could be used to propose gene functions and their regulation under different conditions. In this work, also primary data analysis of Arabidopsis thaliana datasets is presented. In the third publication, an experiment which was conducted to find out if microwave irradiation has an effect on the gene expression of a plant cell culture is described. During the first steps, the data analysis was carried out blinded and exploratory analysis methods were applied to find out if the irradiation had an effect on gene expression of plant cells. Small but statistically significant changes in a few genes were found and could be experimentally confirmed. From the functions of the regulated genes and a meta-analysis with publicly available microarray data, it could be suspected that the plant cell culture somehow perceived the irradiation as energy, similar to perceiving light rays. The fourth publication describes the functional analysis of another Arabidopsis thaliana gene expression dataset. The gene expression data of the plant tumor dataset pointed to a switch from a mainly aerobic, auxotrophic to an anaerobic and heterotrophic metabolism in the plant tumor. Genes involved in photosynthesis were found to be repressed in tumors; genes of amino acid and lipid metabolism, cell wall and solute transporters were regulated in a way that sustains tumor growth and development. Furthermore, in the fifth publication, GEPAT (Genome Expression Pathway Analysis Tool), a tool for the analysis and integration of microarray data with other data types, is described. It consists of a web application and database which allows comfortable data upload and data analysis. In later chapters of this thesis (publication 6 and publication 7), GEPAT is used to analyze human microarray datasets and to integrate results from gene expression analysis with other datatypes. Gene expression and comparative genomic hybridization data from 71 Mantle Cell Lymphoma (MCL) patients was analyzed and allowed proposing a seven gene predictor which facilitates survival predictions for patients compared to existing predictors. In this study, it was shown that CGH data can be used for survival predictions. For the dataset of Diffuse Large B-cell lymphoma (DLBCL) patients, an improved survival predictor could be found based on the gene expression data. From the genes differentially expressed between long and short surviving MCL patients as well as for regulated genes of DLBCL patients, interaction networks could be set up. They point to differences in regulation for cell cycle and proliferation genes between patients with good and bad prognosis.
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Mechanismen der Elektropermeabilisierung und Elektrofusion eukaryotischer Zellen und Protoplasten
(2008)
In dieser Arbeit konnten grundlegende Erkenntnisse über die Wirkung elektrischer Felder auf Membranen von eukaryotischen Zellen gewonnen werden. Dieses Wissen ermöglichte eine detaillierte Aufklärung der Mechanismen der Elektropermealisierung und der Elektrofusion. Maßgeblich hierfür war die dielektrische Analyse von Pflanzen- bzw. Hefeprotoplasten durch umfassende Messungen auf Basis der Elektrorotationsmethode. Mithilfe dieser Methode wurden die elektrischen Eigenschaften wie die flächenspezifische Membrankapazität und die innere Leitfähigkeit von Pichia pastoris Protoplasten ermittelt. Die Kenntnis dieser Zelleigenschaften verhalf dazu, einerseits das Sammelfeld im Hinblick auf seine Feldstärke und Frequenz einzustellen. Damit wurde ein optimaler Kontakt der Zellmembranen während der Fusion ermöglicht und störende Einflüsse, wie beispielsweise die Multizellrotation, minimiert. Anderseits wurde der Durchbruchpuls bezüglich der Pulslänge und der Feldstärke den Anforderungen für die Elektrofusion der relativ kleinen Protoplasten angepasst. In Folge dessen war es möglich, ein Protokoll zur Herstellung von Riesenzellen aus Pichia pastoris Protoplasten zu erstellen. Diese Erkenntnisse sind besonders interessant, da der Einsatz von Riesenzellen die Erforschung der aktiven elektrischen Eigenschaften von Zellmembranen durch kombinierte Anwendung intrazellulärer Mikroelektroden mit etablierten elektrophysiologischen Techniken ermöglicht. Als Beispiele seien hier „current-„ und „voltage-clamp“, „patch clamp“ sowie die Ladungspulsmethode genannt. Die erhebliche Vergrößerung der Membranoberfläche bei Riesenzellen führt zu einer Erhöhung der Gesamtzahl von Membranproteinen wie beispielsweise Transmembrankanäle. Daher kann erwartet werden, dass kanalvermittelte Signale deutlich stärker ausfallen und ihre Untersuchungen erleichtert werden. Die komplexen Ergebnisse der Elektrorotation von vakuolisierten BY-2 Protoplasten konnten sehr genau mit Hilfe des Dreischalenmodells erklärt werden, welches die Struktur der pflanzlichen Zellen, insbesondere die zwei seriell geschalteten Kapazitäten des Plasmalemmas und des Tonoplasten, berücksichtigt. Die Anwendung dieses Modells erlaubte eine getrennte Berechnung der Potentialprofile über das Plasmalemma (Up) und den Tonoplasten (Ut), welche durch einen kurzen Gleichstrompuls induziert wurden. Anhand dieser Potentialprofile war es möglich, die Abhängigkeit des Ca2+-Einstromes in das Cytoplasma aus der Vakuole oder dem extrazellulären Raum vom applizierten elektrischen Feld und der externen Leitfähigkeit zu erklären. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die Aufladung des Plasmalemmas und des Tonoplasten und daraus folgend der elektrischen Membrandurchbruch der jeweiligen Membran stark von der externen Leitfähigkeit abhängen. Die Tatsache, dass elektrische Pulssequenzen von niedriger Intensität einen erhebliche Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration bewirken können und sich durch Modulation ihrer Amplitude reizspezifische Ca2+-Signaturen simulieren lassen, eröffnet eine schonende Möglichkeit zur Untersuchung von Veränderungen des cytosolischen Ca2+-Spiegels unabhängig von persistierenden exogenen Stimuli. Da Ca2+ in Pflanzen ein wichtiger „second messenger“ ist, bieten sich elektrische Felder als neues wirksames Werkzeug zur Kontrolle zellinterne Signalwege für die Grundlagenforschung sowie für Anwendungen in der Biotechnologie, wie beispielsweise Elektrotransfektion und -fusion, an. Als wichtige Konsequenz kann aus den hier gewonnen Erkenntnissen gezogen werden, dass Behandlungen pflanzlicher Zellen mit elektrischen Feldern in niedrig leitende Medien durchgeführt werden, um eine minimale Freisetzung von Ca2+ und anderen Inhaltstoffen aus der Vakuole zu gewährleisten.
Der Connective tissue growth factor, CTGF, ist ein mit der EZM assoziiertes Protein, das diverse zelluläre Aktivitäten, einschließlich Adhäsion, Proliferation, Differenzierung und Migration, besitzt. Die umfassenden biologischen Eigenschaften des CTGF in verschiedenen Zelltypen spiegelt seine Fähigkeit, eine Vielfalt an Zelloberflächenmolekülen (HSPGs, Integrine, …) als auch andere bioaktive Moleküle (BMP-4, TGF-β1, ...) zu binden, wieder. Eine veränderte CTGF-Expression ist mit mehreren fibrotischen Erkrankungen assoziiert und CTGF selbst stimuliert die Entstehung und Progression fibrotischer Defekte. Genauere Informationen über den Einfluss des CTGF auf die Genexpression von Zellen waren bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurde zunächst humanes CTGF in HEK-Zellen exprimiert und anschließend in mehreren chromatographischen Schritten aufgereinigt. Die biologische Charakterisierung zeigte, dass das rekombinante Protein mit BMP-2 in Oberflächenplasmonresonanzstudien und auf Zellbasis interagiert. Desweiteren konnte auch eine Interaktion mit Balb3T3-Zellen festgestellt werden. Die biologische Aktivität des Proteins wurde durch Proliferationsassays mit einer Endothelzelllinie und primären Fibroblasten des menschlichen Tenon bestätigt. Das reine rekombinante Protein wurde für Genexpressionsanalysen an humanen primären Fibroblasten des Tenon eingesetzt. Ergebnisse dieser Studie der Genexpression von HTF von drei unabhängigen Spendern zeigten, dass CTGF verschiedene biologische und physiologische Prozesse beeinflusst. Bekannte proliferatorische Eigenschaften und der Einfluss auf die EZM konnten bestätigt werden. Neben den bisher bekannten Funktionen der durch CTGF verursachten Effekte bei der Wundheilung, die überwiegend in der zweiten und dritten Phase der Wundheilung im Bereich der Umstrukturierung der EZM zu finden sind, konnten mehrere regulierte Gene nachgewiesen werden, die eine Rolle in der ersten Phase der Wundheilung, der Inflammation, spielen. Die interessantesten bisher im Zusammenhang mit CTGF noch nicht beschriebenen proinflammatorischen Proteine sind die CXC-Chemokine 1, 2, 6 und 8 sowie IL-6, die in den CTGF behandelten Fibroblasten stärker exprimiert waren. CTGF scheint somit eine mannigfaltige koordinierte Rolle in der Wundheilung am Auge, einschließlich Inflammation und EZM-Remodeling sowie möglicherweise auch in der Angiogenese und Hämostase, zu spielen und damit seine Rolle als mulitmodularer Faktor zu bestätigen.
Die endogene Präsentation von intrazellulären Antigenen auf Major-Histokompatibilitätskomplex Klasse-II (MHC-II) -Molekülen ist von entscheidender Bedeutung für eine Reihe von immunologischen Prozessen. Die mechanistischen Grundlagen dieses Präsentationsweges sind aber noch weitgehend unverstanden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum molekularen Verständnis der Abläufe zu leisten, die an der endogenen Präsentation nukleärer Antigene auf MHC-II-Molekülen beteiligt sind. Dazu sollte am Beispiel des nukleär lokalisierten Modellantigens Neomycin-Phosphotransferase II (NucNeoR) sowie des viralen Kernantigens Epstein-Barr-virus nuclear antigen 3C (EBNA3C) und entsprechender antigenspezifischer MHC-II-restringierter CD4+ T-Zellen die verantwortlichen Präsentationswege in professionell und nicht-professionell antigenpräsentierenden Zellen untersucht werden. In beiden Zellsystemen wurde NucNeoR über einen endogenen Präsentationsweg und nicht über die Freisetzung und Wiederaufnahme als exogenes Protein auf MHC-II-Molekülen präsentiert. Durch die Verwendung chemischer Inhibitoren konnte eine Beteiligung der Autophagie an der endogenen Antigenpräsentation nachgewiesen werden. Da Autophagie ausschließlich im Zytoplasma stattfindet, wurde nach möglichen Eintrittspforten für nukleäre Proteine in diesen Abbauweg gesucht. Für die Autophagie-abhängige Präsentation von NucNeoR war weder ein CRM1-vermittelter aktiver Export des Antigens aus dem Kern ins Zytoplasma, noch eine Auflösung der Kernmembran im Rahmen der Zellteilung und der dadurch bedingten Durchmischung nukleärer und zytoplasmatischer Bestandteile notwendig. Mit Hilfe eines konditionalen Antigenexpressionsystems und der Auftrennung antigenexprimierender Zellen nach Zellzyklusphasen konnte eine verstärkte Antigenpräsentation in der G1/0-Phase nachgewiesen werden, die mit fortschreitendem Zellzyklus immer mehr abnahm. Die Antigenpräsentation korrelierte dabei mit der ebenfalls im Laufe des Zellzyklus abnehmenden Transkriptions- bzw. Translationsrate des Antigens, aber nicht mit der absoluten Menge an Antigen in den Zellen. Bei abgeschalteter Antigentranskription dagegen korrelierte die Antigenpräsentation mit der MHC-II-Oberflächenexpression, die von der G1/0- bis hin zur G2/M-Phase kontinuierlich zunahm. Eine ähnliche Korrelation von Antigentranskription/ Antigentranslation und Autophagie-abhängiger Antigenpräsentation wurde auch für EBNA3C und die zytoplasmatisch lokalisierte NeoR-Variante beobachtet. Diese Ergebnisse identifizieren die Autophagie-abhängige Präsentation neusynthetisierter Proteine als den verantwortlichen molekularen Mechanismus für die endogene Präsentation der untersuchten nukleären Antigene auf MHC-II-Molekülen. Durch die Kopplung von Translation und autophagischem Abbau erlangen Proteine unabhängig von ihrer subzellulären Lokalisation Zugang zu diesem Präsentationsweg und erweitern so das Spektrum der intrazellulären Antigene, die einer CD4+ T-Zellüberwachung unterliegen.
Listeria monocytogenes gehört zu den Gram-positiven fakultativ intrazellulären Bakterien, ist aber auch zu einem saprophytischen Leben in freier Natur fähig. Zahlreiche, umfassend charakterisierte Virulenzfaktoren sind für die verschiedenen Schritte im Infektionszyklus von L. monocytogenes erforderlich: InlA und InlB induzieren die Aufnahme von L. monocytogenes in nicht-phagozytische Zellen, LLO und PlcA sind für die Freisetzung aus dem primären Phagosom, ActA für die Zell-zu-Zell-Ausbreitung und LLO zusammen mit PlcA und vor allem PlcB für die Freisetzung der Listerien aus dem sekundären Phagosom erforderlich. Der Hexose-Phosphat-Transporter UhpT ist teilweise für die Vermehrung von L. monocytogenes im Zytosol der infizierten Wirtszelle verantwortlich. Die Gene, die für diese Virulenzfaktoren kodieren, sind größtenteils in dem 9,6 kb-großen Virulenzgencluster LIPI-1 zusammengefasst oder liegen verteilt auf dem Chromosom. Alle diese Virulenzgene werden durch den positiven Regulationsfaktor PrfA (PrfA = positive regulatory factor A) in ihrer Transkription kontrolliert. Das prfA-Gen, kodierend für PrfA, ist benfalls Bestandteil des Virulenzgenclusters (LIPI-1). In bisherigen Studien konnte gezeigt werden, dass die Verwertung der Kohlenstoffquellen Glukose, Mannose und Cellobiose zur Hemmung der PrfA-Aktivität in L. monocytogenes führt. Basierend auf Literaturdaten und eigenen Ergebnissen wurde die Hypothese aufgestellt, dass Komponenten der globalen Kohlenstoff-Katabolitrepression (KKR) oder des PTS (Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferase-System)-abhängigen Zuckertransports an der Modulation der PrfA-Aktivität beteiligt sind. Um zu überprüfen, ob über die KKR die Aktivität von PrfA gesteuert wird und dadurch auch die Regulation der PrfA-abhängigen Virulenzgenexpression, wurden in dieser Arbeit pLSV101-Insertionsmutanten für die Gene ccpA (kodierend für CcpA = catabolite control protein A), hprK (kodierend für die HPr-Kinase/Phosphorylase, die HPr am Ser46 phophoryliert) und ptsH (kodierend für das hitzestabile HPr) charakterisiert. Die Insertionsmutanten ::ccpA und ::hprK zeigten sowohl in BHI (undefiniertes nährstoffreiches Medium) als auch in definiertem Minimalmedium (MM) mit 50 mM Glukose ein verlangsamtes Wachstum und eine verringerte [14C]-Glukose-Aufnahme im Vergleich zum Wildtyp (WT). Die ::ptsH-Insertionsmutante war nur zu einem Wachstum in BHI fähig und zeigte erwartungsgemäß (fehlendes HPr) kein Wachstum in definiertem MM mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle. Die ::hprK- und (unter bestimmten Wachstumsbedingungen) auch die ::ptsH–Mutante wiesen sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene eine gesteigerte Expression PrfA-abhängiger Virulenzgene auf. Cellobiose-Verwertung führte auch in der ::hprK-Insertionsmutante zu einer Hemmung der PrfA-Aktivität. Dagegen wurde in der ::ccpA-Insertionsmutante eine geringere Expression aller PrfA-abhängigen Virulenzgene im Vergleich zum WT festgestellt. Die Revertanten RccpA, RhprK und RptsH wiesen im Wachstumsverhalten und in der PrfA-abhängigen Virulenzgenexpression wieder einen wildtypischen Phänotyp auf. Trotz der etwas gesteigerten Virulenzgenexpression zeigte die ::ptsH-Mutante eine deutlich verringerte Replikationsrate in J744 Makrophagen gegenüber dem WT. Die Transkriptomprofile der ::ccpA- und ::hprK-Insertionsmutanten zeigten im Vergleich zum WT viele hochregulierte Gene. Diese umfassen Gene, die v.a. für den PTS-abhängigen Zuckertransport, ABC-Transporter und Enzyme des C- und N-Metabolismus kodieren und im WT wahrscheinlich unter den gegebenen Wachstumsbedingungen unter KKR-Kontrolle stehen. Die erhöhte PrfA-abhängige Virulenzgenexpression in der ::hprK-Mutante korreliert mit der Herunterregulation einiger Gene, die in ihrer Transkription durch einen aktiven PTSvermittelten Glukose-Transport kontrolliert werden. Die gesteigerte PrfA-Aktivität und die Abwesenheit von HPr-Ser46~P (neben CcpA eine wichtige Komponente der KKR) in den ::hprK- und ::ptsH-Insertionsmutanten führten zu der Annahme, dass eine Korrelation zwischen der Menge an HPr-Ser46~P und der PrfA-Aktivität bestehen könnte. Die Untersuchung der PrfA-Aktivität und parallel dazu die Mengenbestimmung von HPr-Ser46~P in MM mit Glukose, Cellobiose und Glyzerin zeigte jedoch, dass weder HPr-Ser46~P noch HPr-His15~P direkte Modulatoren der PrfA-Aktivität sind. Eine direkte Interaktion zwischen HPr-Ser46~P und PrfA konnte mittels Biacor-Analyse ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Auch in vitro Transkriptions-Studien zeigten keinen inhibitorischen Effekt von HPr-Ser46~P auf die Initiation der Transkription bei PrfA-abhängigen Promotoren (S. Müller-Altrock, persönliche Mitteilung). Interessanterweise war bei einem aktiven Glukose-Transport, bei Bedingungen also, wo die EIIA-Komponenten aller aktiven Glukose-spezifischen PTS im unphosphoryliertem Zustand vorliegen (EIIA-Komponenten übertragen über EIIB das aktive Phosphat auf die über EIIC in die Bakterienzelle transportierte Glukose), die PrfA-Aktivität gering. Erst in der spätlogarithmischen bis stationären Wachstumsphasen, wenn Glukose nur noch in geringem Umfang von der Bakterienzelle aufgenommen wird und die Glukose-spezifischen EIIA-Komponenten in phosphorylierter Form vorliegen, steigt die PrfA-Aktivität. Die Verwertung der PTS-unabhängigen Kohlenstoffquelle Glyzerin zeigte gegenüber den PTS Zuckern Glukose und Cellobiose schon in der frühen Wachstumsphase eine erhöhte PrfA-Aktivität. Demnach scheint sich die Expression spezifischer PTS und der Phosphorylierungszustand von EIIA dieser PTS regulatorisch auf die PrfA-Aktivität auszuwirken. Die Glukose-Aufnahme in L. monocytogenes ist noch nicht vollständig aufgeklärt (R. Stoll, unveröffentlichte Ergebnisse). Doch kann aufgrund des Wachstumsverlustes der ::ptsH-Insertionsmutante in Glukose-haltigem MM davon ausgegangen werden, dass die Glukose-Aufnahme in L. monocytogenes ausschließlich PTS-abhängig erfolgt. Ein Glukose-spezifisches PtsG, das in B. subtilis und anderen Bakterien als wichtiger Glukose-Transporter beschrieben wurde, existiert in L. monocytogenes nicht. Hier konnte nur eine PtsG-spezifische EIIA-Komponente (kodiert von lmo1017) identifiziert werden. Wachstumsuntersuchungen in definiertem MM mit den Kohlenstoffquellen Glukose, Mannose, Cellobiose und Glyzerin ergaben keinen Wachstumsunterschied zwischen der in dieser Komponente defekten ΔeIIAGlc-Mutante und dem WT. Die PrfA-Aktivität dieser Mutante war leicht erhöht, was sich in einer etwas gesteigerten ActA- bzw. PrfA-Expression und einer höheren LLO-Aktivität gegenüber dem WT ausprägte. Es konnte jedoch keine eindeutige Interaktion zwischen dieser gereinigten EIIAGlc-Komponente und dem PrfA-Protein mittels Biacor-Analyse nachgewiesen werden (S. Müller-Altrock und G. Seidel, persönliche Mitteilung). Welche EIIA-Komponenten spezifischer PTS an der Modulation der PrfA-Aktivität beteiligt sind, konnte in dieser Arbeit damit nicht abschließend geklärt werden. Der Transport von phosphorylierten Zuckern, wie Glukose-1-, Glukose-6- oder Mannose-6- Phosphat, erfolgt in L. monocytogenes über den Hexose-Phosphat-Transporter UhpT, der von dem strikt PrfA-abhängig uhpT-Gen kodiert wird. Durch die Zugabe von Amberlite XAD-4 zu LB-Medium oder durch vorherigen Anzucht in Glyzerin-haltigem MM, Bedingungen, die sich stimulierend auf die PrfA-Aktivität auswirken, konnte ein effizientes Wachstum von L. monocytogenes in Glukose-6-Phosphat-haltigem Medium erreicht werden. Obwohl die Kohlenstoff-Verbindungen (Glukose, Cellobiose und Glukose-6-Phosphat) in die Glykolyse eingeschleust werden, führte die Verwertung von Glukose-6-Phosphat zur Aufhebung der KKR. Dies konnte durch vergleichende Gesamtgenom-Transkriptom-Analysen und an der Bestimmung der HPr-Ser46~P Meng gezeigt werden. Die PTS-unabhängige Glukose-6-Phosphat-Aufnahme führt, ähnlich wie die von Glyzerin, zu einer erhöhten Aktivität von PrfA. Neben Glyzerin können auch Dihydroxyaceton (Dha) und Pyruvat (letztere allerdings mit niedriger Wachstumseffizienz), nicht aber Glyzerin-3-Phosphat in vitro als C3-Quellen dienen. Da die ::ptsH-Insertionsmutante kein Wachstum in Glyzerin- oder Dha-haltigem Medium zeigte, lässt sich vermuten, dass die listeriellen Glyzerin-Kinase(n) (GlpK), ähnlich wie die von B. subtilis, durch HPr-His15~P aktiviert werden muss und die Dha-Kinase(n) (DhaK) von L. monocytogenes ebenfalls HPr-His15~P als Kofaktor für die Phosphorylierung von Dha verwendet. Der Glyzerin-Metabolismus in L. monocytogenes wurde vor allem über Gesamtgenom-Transkriptom-Analysen und Real-time RT-PCR Untersuchungen näher charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes mehrere Gene besitzt, die in Glyzerin-haltigem Medium verstärkt exprimiert werden und vermutlich am Glyzerin- bzw. Dha-Metabolismus beteiligt sind. L. monocytogenes besitzt zwei Dha-Kinasen (kodiert von lmo0347-48 und lmo2695-96), die beide eine hohe Homologie zur DhaK aus E. coli besitzen. Eine Deletion beider Dha-Kinasen (ΔdhaK = Δlmo0347-48/lmo2695-96) führte zu einer starken Wachstumshemmung in Glyzerin-haltigem MM und zur weitgehenden Inaktivierung von PrfA. Die ΔdhaK- und die ΔglpD/dhaK-Mutante wiesen in J744 Makrophagen eine verringerte Replikationsrate im Vergleich zum WT auf, was für eine Verwertung von Glyzerin und/oder Dha durch L. monocytogenes im Zytoplasma von Wirtszellen spricht. Da diese Mutanten aber noch –wenn auch mit verringerter Effizienz – in diesem Zellkompartiment der Makrophagen wachsen können, muss L. monocytogenes wohl auch in der Lage sein, weitere Kohlenstoffquellen dieser Wirtszelle verwerten zu können.
Natürliche Haftsysteme übertreffen technische Kleber in mehreren Aspekten: Sie haften auf nahezu allen Oberflächen, sind selbstreinigend und sind in ihrer Haftstärke dynamisch kontrollierbar. Für Tiere mit Haftorganen ist deren Kontrolle eine Grundvoraussetzung für effiziente Lokomotion. Wie können Tiere gut an Oberflächen haften und gleichzeitig schnell laufen? Wie werden Haftorgane kontrolliert, um auf rauen oder glatten Oberflächen senkrecht oder kopfüber zu haften und wieder loszulassen? Die vorliegende Arbeit untersucht am Beispiel vonWeberameisen (Oecophylla smaragdina), welche Kontrollmechanismen Insekten verwenden, um den Konflikt zwischen Haftung und Fortbewegung zu bewältigen. Weberameisen besitzen an ihren Füßen zwischen den Krallen ein entfaltbares Haftorgan (Arolium), welches im Vergleich zu anderen Hymenopteren stark vergrößert ist. Ihre enormen Haftkräfte (mehr als das 100-fache ihres Körpergewichtes) werden hauptsächlich eingesetzt, um Blätter für ihren Nestbau in den Baumkronen zusammenzuziehen. Sie sind Meister der Haftung und gute Läufer zugleich und eigneten sich daher sehr gut als Modellsystem. In der Arbeit wurde dieWechselwirkung von Haftung und Bewegung auf mehreren hierarchischen Ebenen untersucht, vom gesamten Körper über die Beine bis zum Haftorgan selbst. Es zeigte sich, dass Kontrollmechanismen auf allen drei Ebenen vorliegen. Im ersten Teil der Arbeit wurde durch Manipulationen an der Krallenziehersehne die komplexe innere Mechanik des Prätarsus aufgeklärt. Es zeigte sich, dass die Bewegungen von Tarsus, Krallen und Arolium in einer koordinierten Reihenfolge erfolgten. Durch Amputationen der Krallenspitzen an lebenden Ameisen konnte bestätigt werden, dass die Entfaltung des Aroliums durch das Verhaken der Krallen auf rauen Oberflächen mechanisch eingeschränkt wird. Der Einsatz des Aroliums war auch abhängig von der Oberflächenorientierung. Weberameisen setzten ihr Haftorgan beim aufrechten Laufen überhaupt nicht ein, beim Kopfüberlaufen auf glatten Oberflächen wurde dagegen nur ein Bruchteil der maximal möglichen Haftkontaktfläche entfaltet. Die Versuche zeigten, dass Ameisen die Entfaltung des Aroliums entweder aktiv, d. h. durch Kontraktion des Krallenziehermuskels, oder passiv durch Zugbewegungen des Tarsus graduell variieren. Beide Mechanismen werden von den Ameisen verwendet, um die ansonsten klein gehaltene Haftkontaktfläche bei Bedarf (z. B. bei Zusatzbeladungen) zu vergrößern. Die passive Entfaltung ist von der neuromuskulären Kontrolle entkoppelt und unterliegt somit nicht den Zeitverzögerungen von Reflexreaktionen. Durch plötzliche laterale Verschiebung der Laufoberfläche durch einen Stoß konnte eine schlagartige Ausfaltung der Arolien ausgelöst werden, die wesentlich schneller ablief als alle bekannten Reflexreaktionen. Dies kann als Sicherheitsmechanismus interpretiert werden, womit sich die Ameisen bei starken Erschütterungen der natürlichen Laufsubstrate (Blätter) durchWindstöße oder Regentropfen festhalten können. Sowohl Kraftmessungen an der Krallenziehersehne, welche die Kontraktion des Krallenziehermuskels nachahmten als auch Reibungskraftmessungen zur passiven Entfaltung des Aroliums zeigten, dassWeberameisen im Vergleich zu einer bodenlebenden Ameise ihre Haftorgane leichter entfalten konnten. Dies erleichtert es ihnen, ihre Haftorgane über lange Zeit im entfalteten Zustand zu halten, wie es beispielsweise beim Nestbau erforderlich ist. Mit Hilfe von dreidimensionalen Kinematikstudien konnte gezeigt werden, dass Weberameisen durch Änderungen des Beinwinkels zur Oberfläche das Schälverhalten der Haftorgane beeinflussen. Ein flacherer Winkel verhinderte das Abschälen der Haftorgane während der Standphase oder beim Tragen von Zusatzlasten; ein steilerer Tarsus hingegen erleichterte das Abschälen während der Ablösephase. Dieses Verhalten wurde mit dem Modell eines Klebebandes verglichen. Allerdings veränderten sich die Haftkräfte in einem bestimmten Winkelbereich deutlich stärker, als die Schältheorie es vorhersagen würde. Die starken Unterschiede in der Haftkraft an dieser Schwelle sind jedoch biologisch sinnvoll und werden wahrscheinlich von den Ameisen verwendet, um schnell zwischen Haften und Lösen zu wechseln. Messungen der Bodenreaktionskräfte zeigten einen weiteren Ablösemechanismus: Während der Ablösephase wird durch distales Schieben des Beines das Haftorgan entlastet und so eine passive Rückfaltung des Aroliums erlaubt. Beide Ablösemechanismen (Schälen und Entlasten) wurden für einzelne Beinpaare im unterschiedlichen Ausmaß von den Ameisen verwendet. Eine Umorientierung zur Schwerkraftrichtung, z. B. beim Kopfüberlaufen, hatte auch Einfluss auf das Laufmuster und die Beinstellung relativ zum Körperschwerpunkt. Die Ameisen passten beim Kopfx überlaufen ihren Gang so an, dass sie mehrere Beine gleichzeitig in Bodenkontakt hielten und langsamere und kürzere Schritte machten. Entstandene Drehmomente beim Tragen von Zusatzlasten wurden durch gezielte Änderungen der Beinpositionen ausgeglichen. Meine Arbeit zeigt, dass Insekten die Oberflächenhaftung auf verschiedenen hierarchischen Ebenen mit Hilfe verschiedener Anpassungen kontrollieren und dabei elegant neuromuskuläre Steuerungen mit rein passiven Mechanismen vereinigen. Die hier für Weberameisen exemplarisch untersuchten Effekte sind von allgemeiner Bedeutung für alle Tiere, die sich mit Hilfe von Haftorganen fortbewegen. Ein Verständnis der Mechanismen, mit denen Insekten Haftung dynamisch kontrollieren, könnte wichtige Anregungen für die Entwicklung von kletterfähigen Laufrobotern liefern.
Myelinmutationen des zentralen und peripheren Nervensystems verursachen erheblich behindernde und bislang nicht heilbare Erkrankungen. In dieser Arbeit verwendeten wir transgene PLP überexprimierende Mäuse (PLPtg) als Modell für zentrale Myelinopathien und heterozygot P0 defiziente (P0+/-) Mäuse als Modell für hereditäre Neuropathien des peripheren Nervensystems. Beide Modelle zeigen eine niedriggradige Inflammation des Nervengewebes. Durch Verpaarung mit immundefizienten Mausstämmen konnten wir die Relevanz von Makrophagen und T- Lymphozyten in der Entstehung der Myelinpathologie zeigen. Nachdem wir beweisen konnten, dass CD8+ T- Lymphozyten maßgeblich zur Pathologie in PLPtg Mäusen beitragen untersuchten wir den Einfluss eines wichtigen zytotoxischen Moleküls, Granzym B, auf den neuralen Schaden. Durch Generierung von Granzym B defizienten PLPtg Knochenmarkschimären konnten wir eine deutliche Reduktion des glialen Schadens und der Oligodendrozytenapoptose nachweisen. Granzym B ist also zumindest teilweise verantwortlich für die Schädigung, die durch T- Lymphozyten hervorgerufen wird. Um die zusätzliche Informationen über die Rolle der Immunmodulation in unseren Modellen zu gewinnen, untersuchten wir das koinhibitorische Molekül PD-1, einen CD-28 verwandten Rezeptor, der auf B- und T- Lymphozyten exprimiert wird. Bei der Untersuchung von Myelinmutanten des ZNS und PNS (PLPtg und P0+/-), die zusätzlich PD-1 defizient waren, konnten wir einen signifikanten Anstieg von CD8+ T- Lymphozyten und eine deutliche Verschlechterung des glialen Schadens beobachten. In PLPtg Mäusen induzierte die Abwesenheit von PD-1 verstärkte Oligodendrozytenapoptose und klonale Expansion. Außerdem neigen ZNS- Lymphozyten aber nicht periphere CD8+ T- Zellen zur verstärkten Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen. In P0+/- Mäusen führt Abwesenheit von PD-1 zu moderaten motorischen und sensorischen Störungen, was die wichtige Rolle von PD-1 in immunologischen Regulationsmechanismen unterstreicht. Zusammenfassend kann man festhalten, daß Granzym B ein wichtiges Effektormolekül zytotoxischer T- Zellen in PLPtg Mäusen ist. PD-1 spielt eine wichtige Rolle in der Regulation von Effektorzellen in unseren Modellen für zentrale und periphere Myelinopathien. Veränderungen dieser Regulation können deutliche Neuroinflammation mit starker Myelinpathologie hervorrufen. Diese Ergebnisse können dazu beitragen, die starke klinische Variabilität von polygenen und sogar monogenen neurologischen Erkrankungen zu erklären.
Die komplexen Aktivitätsmuster während der Futtersuche bei Ameisen sind kein Resultat einer einfachen Selbstorganisation mit starren Regeln sind, sondern diese Regeln werden vielmehr permanent durch den Informationsaustausch zwischen den Arbeiterinnen modifiziert. Die Furagierökologie hat vor allem einen Einfluss auf die Rekrutierungsstrategie der Tiere. Blattschneiderameisen furagieren an großen und stabilen Nahrungsressourcen auf diese sie nach dem Auffinden sofort stark rekrutieren. Camponotus rufipes besucht hingegen Futterquellen, die in ihrer Ergiebigkeit schlecht vorhersagbar sind. Daher steigern die Tiere ihre Rekrutierungsintensität erst nachdem sie sich durch mehrmaliges Aufsuchen der Futterquelle von deren Beständigkeit überzeugt haben.
Die Zusammenlageurng spleißosomaler UsnRNPs erfolgt beim Menschen und anderen Vertebraten durch den makromolekularen SMN-Komplex. Dieser besteht aus insgesamt neun Proteinen, genannt SMN und Gemin2-8. In dieser Arbeit wurde die Evolution dieser molekularen Maschine untersucht. Dazu wurden die Genome mehrerer Modellorganismen bioinformatisch nach Orthologen von SMN und seinen Komplexpartnern durchsucht. Es zeigte sich, dass SMN und Gemin2 die Kernkomponenten des Komplexes darstellen. Von diesen ausgehend kamen weitere Komponenten im Laufe der Evolution hinzu und zwar blockweise, wie es ihrer physischen Assoziation im humanen Komplex entspricht. Um diese Befunde einer biochemischen Überprüfung zu unterziehen, wurde ein neues Affinitätsepitop, das TagIt-Epitop, entwickelt. Nach stabiler Transfektion von Drosophila Schneider2-Zellen konnte das Fusionsprotein effizient exprimiert und der Drosophila-SMN-Komplex nativ aufgereinigt werden. Die massenspektrometrische Untersuchung des Komplexes zeigte, dass SMN und Gemin2 seine einzigen stöchiometrischen Komponenten sind. Dies ist in eindrucksvoller Übereinstimmung mit den bioinformatischen Daten. Der aufgereinigte Komplex lagert in vitro Sm-Proteine mit der entsprechenden UsnRNA zum UsnRNP-core-Komplex zusammen. Diese Ergebnisse ließen sich nach rekombinanter Rekonstitution des SMN/Gemin2-Dimers rekapitulieren. Dabei zeigte sich, dass der SMN-Komplex die unkoordinierte Bindung der Sm-Proteine an „falsche“ RNAs verhindert. Folglich genügen SMN und Gemin2 zur Zusammenlagerung des Sm-core-Komplexes, während die übrigen Gemine weitere Funktionen im Kontext der UsnRNP-Biogenese spielen könnten. Aus evolutionsbiologischer Sichtweise ist der SMN-Komplex aus Drosophila ein eindrückliches Beispiel, wie die Vereinfachung eines biochemischen Prozesses zur Kompaktierung des Genoms beitragen kann.
Das DNA-Mismatch-Reparatur-(MMR-) System ist das einzig bekannte postreplikativ arbeitende DNA-Reparatur-System. Es wurde gezeigt, dass die MMR-Aktivität für den Erhalt der genomischen Stabilität in Prokaryoten und Eukaryoten notwendig ist. Defekte in Genen des MMR-Systems (wie beispielsweise MLH1 oder MSH2) wurden als Ursache für die Entstehung des hereditären nicht-polypösen kolorektalen Karzinoms (HNPCC) und anderen Tumorarten beschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurde die Tumorgenese in Mlh1 defizienten Mäusen (Mlh1-/-) untersucht und eine umfassende Charakterisierung der hier auftretenen Lymphome vorgenommen und die Bedeutung des Immunsystems für die Tumorgenese in Mlh1 defizienten Mäusen durch Einkreuzen zusätzlicher Immundefizienzen erruiert. Die auf einen reinen genetischen Hintergrund zurückgekreuzten Mlh1-/--Mäuse zeigten eine in zwei Wellen ablaufende Tumorgenese: Eine frühe Phase, in der Mäuse lymphoide Tumoren entwickelten und eine spätere Phase, in der die Mlh1-/--Tiere vorwiegend an Gastrointestinaltumoren erkrankten. Wir konnten zeigen, dass die Mlh1 defizienten Mäuse ein breiteres Lymphomspektrum, als beispielsweise Msh2 defiziente Tiere aufweisen. Eine Vielzahl der untersuchten Lymphome Mlh1 defizienter Mäuse war mikrosatelliteninstabil (MSI). Die Tatsache, dass mikrosatellitenstabile (MSS) Lymphome in den Mlh1-/--Tieren vorkamen, impliziert aber auch, das MMR-Defizienz nicht zwingend durch Mikrosatelliteninstabilität gekennzeichnet sein muss. Es ist möglich, dass sich eine Mikrosatelliteninstabilität erst zu einem späteren Zeitpunkt der Tumorentwicklung in MMR-defizienten Zellen manifestiert. Darauf deuten auch die MSI-Analysen der in den Rag-/-/Mlh1-/--Mäusen frühzeitiger als in Mlh1-/--Mäusen auftretenden Gastrointestinaltumoren hin. Einige dieser untersuchten Gastrointestinaltumoren in den Rag-/-/Mlh1-/--Mäusen waren mikrosatellitenstabil, wohingegen sämtliche Gastrointestinaltumoren der Mlh1 defizienten Mauspopulation Mikrosatelliteninstabilität aufwiesen. In einigen der untersuchten Lymphome fehlte die MHC Klasse I-Molekülexpression, was auf deutet den Einfluss des Immunsystems auf die Erkennung und Eliminierung von (durch MMR-Defizienz entstandenen) Tumoren hindeutet. Um die Art der Immunantwort und die verantwortlichen Komponenten des Immunsystems für die Abwehr MMR-defizienter Tumoren einzugrenzen, wurden verschiedene immunkompromitierte oder immundefiziente Mauslinien in Mlh1 defiziente Mäuse eingekreuzt. Dieses waren Mauslinien mit beta2Mikroglobulin- (b2m-/--), Perforin- (pfp-/--), beta2Mikroglobulin/Perforin- (b2m-/-/pfp-/--) und Recombination activation gene- (Rag-/--) Defizienz. Häufig wurde in diesen Tieren eine Verschiebung im Tumorspektrum und ein beschleunigtes zeitliches Auftreten der Tumoren beobachtet. Anhand dieser Modelle konnten wir demonstrieren, dass insbesondere die Regulierung der MHC Klasse I-Molekülexpression ein bedeutsamer Schritt für die Ausprägung verschiedener Lymphomarten ist, welcher das „Überleben“ der Tumorzellen gewährleistet. Auch die Notwendigkeit einer balancierten Expression von NK-Zell-stimulatorischen und –inhibitorischen Liganden auf der Tumorzelloberfläche, welche die Erkennung und Eliminierung von Tumorzellen durch Nicht-MHC Klasse I-abhängige Immunzellen (wie z.B. den Natürliche Killerzellen) reguliert, liess sich mit Hilfe der beta2Mikroglobulin- und Perforin-Mausmodelle aufzeigen. Offensichtlich sind für die in Mlh1 defizienten Mäusen vorkommenden verschiedenen Tumorarten unterschiedliche zelluläre Komponenten und Abwehrmechanismen des Immunsystems für die Erkennung und Eliminierung verantwortlich. So beeinflussen insbesondere cytotoxische T-Zellen (CTLs) die Entstehung von Gastrointestinaltumoren in Mlh1 defizienten Mäusen. Für die lymphoiden Tumoren ergab sich ein divergentes Bild. Hier beschränkte sich der Einfluss der CTLs bei der Lymphomabwehr auf die Erkennung und Eliminierung disseminierter T- und B-Zell-Lymphome. Die in den Mlh1-/--Mäusen nachgewiesenen thymischen T-Zell Lymphome dagegen unterlagen der perforin-vermittelten Zellabwehr durch Nicht-MHC Klasse I-beschränkte Immunzellen (z.B. Natürlichen Killerzellen). Die Relevanz der vorliegenden Mausmodelle wird deutlich, wenn man sich die Situation von immunsupprimierten Posttransplantationspatienten und immundefizienten HIV-Patienten vor Augen führt. Häufig beobachtet man in diesen Patientengruppen das Auftreten lymphoider Tumoren. Diese sind oftmals Mikrosatelliteninstabil, was auf eine vorliegende MMR-Defizienz hindeutet. Zudem zeigen diese Lymphome ähnliche Merkmale, wie die durch Mlh1-Defizienz entstandenen lymphoiden Tumoren. Insbesondere für Studien solcher Lymphome stellt die Mlh1-defiziente Maus mit den verschiedenen eingekreuzten Immundefizienzen ein geeignetes in vivo Model dar.
Past experience contributes to behavioural organization mainly via learning: Animals learn otherwise ordinary cues as predictors for biologically significant events. This thesis studies such predictive, associative learning, using the fruit fly Drosophila melanogaster. I ask two main questions, which complement each other: One deals with the processing of those cues that are to be learned as predictors for an important event; the other one deals with the processing of the important event itself, which is to be predicted. Do fruit flies learn about combinations of olfactory and visual cues? I probe larval as well as adult fruit flies for the learning about combinations of olfactory and visual cues, using a so called ‘biconditional discrimination’ task: During training, one odour is paired with reinforcement only in light, but not in darkness; the other odour in turn is reinforced only in darkness, but not in light. Thus, neither the odours nor the visual conditions alone predict reinforcement, only combinations of both do. I find no evidence that either larval or adult fruit flies were to solve such task, speaking against a cross-talk between olfactory and visual modalities. Previous studies however suggest such cross-talk. To reconcile these results, I suggest classifying different kinds of interaction between sensory modalities, according to their site along the sensory-motor continuum: I consider an interaction ‘truly’ cross-modal, if it is between the specific features of the stimuli. I consider an interaction ’amodal’ if it instead engages the behavioural tendencies or ‘values’ elicited by each stimulus. Such reasoning brings me to conclude that different behavioural tasks require different kinds of interaction between sensory modalities; whether a given kind of interaction will be found depends on the neuronal infrastructure, which is a function of the species and the developmental stage. Predictive learning of pain-relief in fruit flies Fruit flies build two opposing kinds of memory, based on an experience with electric shock: Those odours that precede shock during training are learned as predictors for punishment and are subsequently avoided; those odours that follow shock during training on the other hand are learned as signals for relief and are subsequently approached. I focus on such relief learning. I start with a detailed parametric analysis of relief learning, testing for reproducibility as well as effects of gender, repetition of training, odour identity, odour concentration and shock intensity. I also characterize how relief memories, once formed, decay. In addition, concerning the psychological mechanisms of relief learning, first, I show that relief learning establishes genuinely associative conditioned approach behaviour and second, I report that it is most likely not mediated by context associations. These results enable the following neurobiological analysis of relief learning; further, they will form in the future the basis for a mathematical model; finally, they will guide the researchers aiming at uncovering relief learning in other experimental systems. Next, I embark upon neurogenetic analysis of relief learning. First, I report that fruit flies mutant for the so called white gene build overall more ‘negative’ memories about an experience with electric shock. That is, in the white mutants, learning about the painful onset of shock is enhanced, whereas learning about the relieving offset of shock is diminished. As they are coherently affected, these two kinds of learning should be in a balance. The molecular mechanism of the effect of white on this balance remains unresolved. Finally, as a first step towards a neuronal circuit analysis of relief learning, I compare it to reward learning and punishment learning. I find that relief learning is distinct from both in terms of the requirement for biogenic amine signaling: Reward and punishment are respectively signalled by octopamine and dopamine, for relief learning, either of these seem dispensible. Further, I find no evidence for roles for two other biogenic amines, tyramine and serotonin in relief learning. Based on these findings I give directions for further research.
Untersuchung von gene-drive-Strategien als neue Interventionsstrategien zur Eindämmung der Malaria
(2008)
In der vorliegenden Arbeit haben wir unter Nutzung bioinformatischer Methoden eine innovative Strategie zur Eindämmung der Malaria entwickelt. Die genetische Modifikationsstrategie beinhaltet sowohl Manipulationen aufseiten des gefährlichsten Erregers, Plasmodium falciparum, als auch des Hauptvektors, Anopheles gambiae. In den Genomen beider Spezies wurden eine Reihe neuer konkreter targets identifiziert. Auch bereits beschriebene targets und Ansätze wurden in die Strategie einbezogen bzw. weiter ausgestaltet. Bezüglich der Vektormoskitos wird die Verbreitung eines gegenüber Plasmodien resistenten Genotyps angestrebt. Es werden einerseits effiziente natürliche und künstliche Resistenzgene diskutiert und andererseits eine bekannte Strategie zur Fixierung natürlicher Resistenzallele in natürlichen Populationen verbessert. Auf der Seite der Plasmodien erweiterten wir einen bereits von A. Burt (2003) beschriebenen Eradikationsansatz um weitere targets. Aus ethischen und evolutionsbiologischen Erwägungen bevorzugen wir jedoch eine alternative Strategie, welche die Etablierung von in ihrer Virulenz gemilderten Parasiten zum Ziel hat. Der attenuierte Genotyp wird unter anderem durch komplexe Pathway-Remodellierungen beschrieben (Löwe, Sauerborn, Schirmer, Dandekar, A refined genome engineering strategy against parasites and vectors, Manuskript beim Journal „Genome Biology“ eingereicht). Da sich Mutanten in der Natur gegen Wildtyp-Organismen kaum durchsetzen können, werden zwei drive-Systeme beschrieben, welche für die Implementierung der genetischen Manipulationsstrategie entwickelt wurden. Beide Konstrukte wurden zur Patentierung angemeldet (Patentanmeldung U30010 DPMA bzw. Aktenzeichen 102006029354.1). Zusätzlich zur deutschen wurde für eines der beiden Konstrukte eine PCT-Anmeldung eingereicht, welche in Zukunft einen internationalen Patentschutz ermöglichen soll. Es werden Kalkulationen vorgelegt, welche die Verbreitungstendenzen der Konstrukte in natürlichen Populationen vorhersagen. Die Beschreibung der entwickelten Konstrukte beschränkt sich nicht auf das primäre Anwendungsgebiet der Arbeit (Malaria), sondern beinhaltet auch andere Anwendungsgebiete, vor allem im Bereich der Medizin und Molekularbiologie.
Investigations of Measles virus regulation on activation and function of antigen presenting cells
(2008)
Interaction with dendritic cells (DCs) is considered as central to immunosuppression induced by viruses, including measles virus (MV). Commonly, viral infection of DCs abrogates their ability to promote T cell expansion, yet underlying mechanisms at a cellular level are undefined. It appears that MV-WTF infection modulate DCs morphology and dynamic adhesion on extra cellular matrix proteins such as FN or ICAM-1. By morphological criteria, WTF-DCs resembled LPS-DCs, associated with their mature phenotype also adhered less efficiently to the FN or ICAM-1 support. Reduced adhesion could not be explained by a lack of 1-integrin expression or activation. Similarly, MV-DCs strongly resembled LPS-DCs in that levels of focal adhesion kinase phosphorylated at Y397 were high and not further enhanced upon FN ligation. Fascin, a downstream effector of integrin signaling was highly upregulated in LPS-DCs and moderately in WTF-DCs, and differences in its subcellular distribution were not observed between both cell cultures. Apparently, however, fascin associated less efficiently with PKC in WTF-DCs then in LPS-DCs. In line with findings for murine DCs, high motility of mature human DCs was found to require expression of Rac-GTPases. Human LPS-DCs and more so, DC transfected to express constitutively active Rac1 were the most motile DC-species analysed, confirming that migration of human DC also involved Rac activity. The velocity of WTF-DCs on FN is below that of LPS-DCs, indicating that maturation induced by WTF may be insufficient to completely promote integrin signaling which leads to Rac activation. The organisation of MV-DC/T cell interfaces was consistent with that of functional immune synapses with regard to CD3 clustering, MHC class II surface recruitment and MTOC location. These analyses are based in the selection of stable conjugates. Subsequently, however, neither contacts nor calcium flux can be stabilised and sustained in the majority of MV-DC/T cell conjugates and only promoted abortive T cell activation. Formation of spatially organised IS in T cells requites, prolonged contact durations. Therefore, aberrant distribution patterns of CD3 in these structures, if occurring, are not likely to contribute to the type of contacts predominating for WTF-DC/T cell interactions. It is also likely that transient interactions of less than 2 minutes may if at all, not efficiently support viral transmission to T cells. Transient interactions are typically observed with immature DCs in the absence of antigen, but this is not likely to be relevant in our allogenic system, which includes SA-loaded WTF-DCs. Thus, MV-infected DCs retain activities required for initiating, but not sustaining T cell conjugation and activation. This is partially rescued if surface expression of the MV glycoproteins on DCs is abolished by infection with a recombinant MV encoding VSV G protein instead, indicating that these contribute directly to synapse destabilisation and thereby act as effectors of T cell inhibition.
In the course of this study, several endogenous compounds and model substances were used to mimic the conditions in patients suffering from hypertension. As endogenous compounds, angiotensin II and aldosterone were chosen. As model substances, 4-nitroquinoline-1-oxide (NQO), hydrogen peroxide and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) were selected. Benfotiamine as well as α-tocopherol proved in the course of the experiments to be able to prevent angiotensin II-induced formation of oxidative DNA strand breaks and micronuclei. This could be due to a prior inhibition of the release of reactive oxygen species and is in contrast to results which were achieved using thiamine. Furthermore, experiments in which cells were pre-incubated with benfotiamine followed by incubation with NQO showed that benfotiamine was not able to prevent the induction of oxidative stress. The hypothesis that benfotiamine has, like α-tocopherol, direct antioxidative capacity was fortified by measurements in cell free systems. In brief, a new working mechanism for benfotiamine in addition to the ones already known could be provided. In the second part of the study, angiotensin II was shown to be dose-dependently genotoxic. This effect is mediated via the angiotensin II type 1 receptor (AT1R) which. Further experiments were extended from in vitro settings to the isolated perfused kidney. Here it could be shown that angiotensin II caused vasoconstriction and DNA strand breaks. Co-perfusion of kidneys with angiotensin II and candesartan prevented vasoconstriction and formation of strand breaks. DNA strand break formation due to mechanical stress or hypoxia could be ruled out after additional experiments with the thromboxane mimetic U 46619. Detailed investigation of the DNA damage in vitro revealed that angiotensin II induces single strand breaks, double strand breaks and 8-hydroxydeoxyguanosine (8-oxodG)-adducts as well as abasic sites. Investigations of the effects of aldosterone-treatment in kidney cells showed an increase of oxidative stress, DNA strand breaks and micronuclei which could be prevented by the steroidal mineralocorticoid receptor antagonist eplerenone. Additional experiments with the non-steroidal mineralocorticoid receptor antagonist (S)-BR-4628 revealed that this substance was also able to prevent oxidative stress and genomic damage and proved to be more potent than eplerenone. In vivo, hyperaldosteronism was imitated in rats by aid of the deoxycorticosteroneacetate (DOCA) salt model. After this treatment, levels of DNA strand breaks and chromosomal aberrations in the kidney could be observed. Furthermore, an increase in the release of ROS could be measured. Treatment of these animals with spironolactone , BR-4628 and enalaprile revealed that all antagonists were effective BR-4628 was the most potent drug. Finally, rosuvastatin was investigated. In HL-60 cells phorbol 12-myristate 13-acetate caused oxidative stress. Rosuvastatin was able to prevent the release of ROS and subsequent oxidative DNA damage when co-incubated with PMA. Furthermore, not only an inhibition of PMA-induced oxidative stress but also inhibition of the unspecific release of ROS induced by hydrogen peroxide was observable. Addition of farnesyl pyrophosphate (FPP), geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), and mevalonate, intermediates of the cholesterol pathway, caused only a marginal increase of oxidative stress in cells treated simultaneously with PMA and rosuvastatin, thus indicating the effect of rosuvastatin to be HMG-CoA-reductase-independent. Investigation of the gene expression of subunits of NAD(P)H oxidase revealed a down-regulation of p67phox following rosuvastatin-treatment. Furthermore, it could be shown that rosuvastatin treatment alone or in combination with PMA increased total glutathione levels probably due to an induction of the gene expression and enzyme activity of γ-glutamylcysteine synthetase (γ-GCS).
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der psychischen Befindlichkeit und anderer gesundheitsbezogenen Konditionen der Frauen und Männer mit familiären Mamma- und Ovarialkarzinomrisiko sowie die Klärung hinsichtlich der Bewältigung und Auswirkung genetischer Risikoinformation. Es wurden Risikowahrnehmung, Informationsstand, Inanspruchnahme der Beratungsangebote sowie der Früherkennungsmaßnahmen, Einstellung gegenüber genetischer Brustkrebsdiagnostik und familiärer/sozialer Kommunikation untersucht. Die vollständig ausgefüllten Fragebögen von Ratsuchenden und Betroffenen, die an der Beratung und Befragung im Zentrum für „Familiären Brust-/Eierstockkrebs“ teilgenommen haben, wurden von uns ausgewertet. Für die beratenden Institutionen ist das Wissen der vielfältigen psychischen und sozialen Folgen bei den Testsuchenden und deren Familien sehr wichtig. Nur so kann das Betreuungskonzept und das Beratungsangebot verbessert werden.
Melanome stellen die gefährlichste Form von Hautkrebs mit der höchsten Mortalitätsrate dar. Der Transformation normaler Melanozyten zu malignen Melanomen liegen komplexe molekulare und biochemische Veränderungen zu Grunde. Im Xiphophorus-Melanom-Modell ist die onkogene Rezeptortyrosinkinase "Xiphophorus melanoma receptor kinase" (Xmrk) der alleinige Auslöser der Melanominitiation und -progression. Die Aufklärung der Xmrk-vermittelten Signaltransduktion kann zum besseren Verständnis von Ereignissen, die auch bei der humanen Melanomentwicklung eine Rolle spielen, beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der Microarray-Technologie die Regulation der Genexpression durch Xmrk analysiert. Zu den nach Rezeptoraktivierung am stärksten herabregulierten Genen gehörten "son of sevenless homolog 1" (Sos1) und "ubiquitin-conjugating enzyme E2I" (Ube2i); stark hochreguliert waren "early growth response 1" (Egr1), "cysteine-rich protein 61" (Cyr61), "dual-specificity phosphatase 4" (Dusp4), "fos-like antigen 1" (Fosl1), "epithelial membrane protein" (Emp1), Osteopontin (Opn), "insulin-like growth factor binding protein 3" (Igfbp3) und "tumor-associated antigen L6" (Taal6). Die für die Regulation dieser Gene verantwortlichen Signalwege wurden durch die Anwendung von niedermolekularen Inhibitoren und siRNA identifiziert, wobei für die SRC-Kinase FYN eine zentrale Bedeutung bei der Xmrk-abhängigen Regulation der Genexpression festgestellt wurde. Darüber hinaus wurde die Expression der Gene in humanen Melanomzelllinien im Vergleich zu normalen humanen Melanozyten untersucht. Als besonders vielversprechende Kandidaten stellten sich dabei DUSP4 und TAAL6 heraus, deren Rolle in der humanen Melanominduktion und -progression Gegenstand zukünftiger Studien sein wird. In einem anderen Ansatz zur Aufklärung des Signalnetzwerkes sollten Zielproteine von Xmrk durch Protein-Protein-Interaktionsstudien mit Hilfe des Split-Ubiquitin-Systems ermittelt werden. Aufgrund ungünstiger Expressions- oder Faltungseigenschaften von Xmrk in diesem System war es aber nicht möglich, den Rezeptor als Köderprotein einzusetzen. Das für die Xmrk-vermittelte Melanomentstehung zentrale Protein FYN konnte jedoch als Köder etabliert und seine Wechselwirkung mit der Tyrosinkinase FAK analysiert werden. Es wurde gezeigt, dass der phosphorylierte Tyrosinrest an Position 397 von FAK für die Interaktion einer N-terminal trunkierten FAK-Variante mit FYN notwendig ist und dass diese Phosphorylierung in Hefe gewährleistet zu sein scheint. Die Suche nach neuen Interaktionspartnern von FYN mittels der Split-Ubiquitin-Technologie könnte Einblicke in weitere FYN-abhängige Ereignisse bieten, die zur Aufklärung seiner zentralen Rolle bei der Tumorentstehung dienen könnte.
Insects living in temperate latitudes need to adjust their life-history to a seasonally variable environment. Reproduction, growth, and development have to be completed within the limited period where environmental conditions are favourable while climatically adverse conditions have to be spent in a state of diapause. Consequently, questions how individuals adapt their life-history to seasonality and which mechanisms underlie the responses to seasonal cues, like photoperiod, are important issues in the study of life-history strategies. This thesis focuses on the life-history adaptation to seasonality in the wing-dimorphic common pond skater Gerris lacustris L. (Heteroptera: Gerridae). Using a combination of field and laboratory studies as well as mathematical modelling, it is adressed how variation in the availability of thermal energy impacts on various aspects of larval development such as accumulated thermal energy (i.e. physiological development time), developmental pathway (direct reproduction vs. diapause) and wing dimorphism.
In einer vorangegangenen Arbeit konnte eine hypomorphe Mutation innerhalb des Genlokus einer putativen Serin-/Threonin-Kinase als Auslöser der Aggregatbildung des Aktive-Zone- Proteins Bruchpilot in larvalen Motoneuronaxonen identifiziert werden (Nieratschker, 2004). Aufgrund der Homologien dieser Kinase zu SR-Proteinkinasen wurde der Name Serin- /Threonin-Proteinkinase 3 (SRPK3) vorgeschlagen. Laut ursprünglicher Annotation der „Flybase“ (http://flybase.bio.indiana.edu) codiert der Genlokus der Srpk3, der auf dem linken Arm des dritten Chromosoms innerhalb der Region 79D4 lokalisiert ist und sich über ca. 10,3 kb erstreckt, für zwei Transkripte (Srpk3-RC und Srpk3-RB). Diese beiden Transkripte haben unterschiedliche Transkriptions- und Translationsstartpunkte und unterscheiden sich in ihrem ersten kodierenden Exon, ab dem vierten Exon sind sie allerdings identisch. Das Srpk3-RCTranskript umfasst ca. 4,2 kb, das Srpk3-RB-Transkript ca. 3,8 kb. Die von diesen Transkripten kodierten Proteine bestehen aus 816 (Srpk3-RC) bzw. 749 (Srpk3-RB) Aminosäuren. Diese beiden ursprünglich annotierten Transkripte konnten durch RT-PCR-Experimente bestätigt werden. Dabei wurde auch ein zusätzliches, alternativ gespleißtes Exon von 159 bp entdeckt, das beiden Transkripten zugeordnet werden kann. Somit codiert der Srpk3-Genlokus für mindestens vier Transkripte, die Transkripte der RC/RF-Transkriptgruppe mit (Srpk3-RF) und ohne (Srpk3-RC) das alternativ gespleißte Exon und die Transkripte der RB/RETranskriptgruppe mit (Srpk3-RE) und ohne (Srpk3-RB) das alternativ gespleißte Exon. Die Existenz eines weiteren Transkriptes Srpk3-RD, die in der aktuellen Version der „Flybase“ annotiert ist, konnte durch RT-PCR-Experimente nicht nachgewiesen werden. Zu Beginn dieser Arbeit lag eine hypomorphe Mutante für die SRPK3 schon vor (Srpk3P1; Eberle, 1995). Diese Linie trägt eine P-Elementinsertion innerhalb des ersten Exons der RC/RF-Transkriptgruppe, die das Leseraster dieser Transkriptgruppe zerstört, so dass in dieser Linie nur die RB/RE-Transkriptgruppe gebildet werden kann. Wie bereits erwähnt, konnte diese Mutation in vorangegangenen Arbeiten bereits als der Auslöser der Aggregatbildung des Bruchpilot-Proteins in larvalen Motoneuronaxone, sowie einiger Verhaltensdefekte identifiziert werden (Nieratschker, 2004; Bock 2006). Diese Verhaltensdefekte ähneln stark denen, die durch einen knock-down der Bruchpilot-Expression mittels RNAi ausgelöst werden (Wagh et al., 2006; Bock, 2006), was auf eine Interaktion beider Proteine schließen lässt. Um nun den Beweis führen zu können, dass tatsächlich diese Mutation die beobachteten Phänotypen verursacht, wurden Rettungsversuche durchgeführt. Die Srpk3-RF-cDNA war dabei in der Lage die durch die hypomorphe Mutation der SRPK3 verursachten Phänotypen vollständig, oder zumindest teilweise zu retten (vgl. auch Bock, 2006; Bloch, 2007). Damit konnte belegt werden, dass die hypomorphe Mutation der SRPK3 tatsächlich die in der Mutante Srpk3P1 beobachteten Phänotypen verursacht. Um die durch in situ Hybridisierung erhaltenen Daten zur Lokalisation der SRPK3 im larvalen Gehirn (Nieratschker, 2004) bestätigen, sowie weitere Daten erhalten zu können, wurden Isoform-spezifische Antisera gegen die SRPK3 generiert. Diese Antiseren sind in der Lage überexprimiertes Protein zu detektieren (Bloch, 2007), allerdings ist es mit diesen Antiseren nicht möglich die SRPK3 in wildtypischen Präparaten nachzuweisen. Weitere Daten zur Lokalisation der SRPK3, die durch die Verwendung eines SRPK3-eGFPFusionsproteins erhalten wurden, zeigten, dass eine der ektopisch überexprimierten SRPK3- Isoformen mit Bruchpilot an der Aktiven Zone kolokalisiert. Dieses Ergebnis, in Verbindung mit den durch die Mutation der SRPK3 verursachten Bruchpilot-Aggregaten in larvalen Motoneuronaxonen und den Verhaltensdefekten, gibt Hinweise auf eine mögliche direkte Interaktion beider Proteine….
In this thesis, synaptic transmission was studied electrophysiologically at an invertebrate model synapse, the neuromuscular junction of the Drosophila 3rd instar wandering larvae. In the first part, synaptic function is characterized at the neuromuscular junction in fly lines which are null mutants for the synaptic proteins “the synapse associated protein of 47 kDa” (Sap-47156), Synapsin (Syn97), the corresponding double mutant (Sap-47156, Syn97), a null mutant for an as yet uncharacterized Drosophila SR protein kinase, the Serine-Arginine protein kinase 3 (SRPK3), and the Löchrig (Loe) mutant which shows a strong neurodegenerative phenotype. Intracellular voltage recordings from larval body wall muscles 6 and 7 were performed to measure amplitude and frequency of spontaneous single vesicle fusion events (miniature excitatory junction potentials or mEJPs). Evoked excitatory junction potentials (eEJPs) at different frequencies and calcium concentrations were also measured to see if synaptic transmission was altered in mutants which lacked these synaptic proteins. In addition, structure and morphology of presynaptic boutons at the larval neuromuscular junction were examined immunohistochemically using monoclonal antibodies against different synaptic vesicle proteins (SAP-47, CSP, and Synapsin) as well as the active zone protein Bruchpilot. Synaptic physiology and morphology was found to be similar in all null mutant lines. However, Löchrig mutants displayed an elongated bouton morphology, a significant shift towards larger events in mEJP amplitude frequency histograms, and increased synaptic facilitation during a 10 Hz tetanus. These deficits suggest that Loe mutants may have a defect in some aspect of synaptic vesicle recycling. The second part of this thesis involved the electrophysiological characterization of heterologously expressed light activated proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Channelrhodopsin-2 (ChR2), a light gated ion channel, and a photoactivated adenylate cyclase (PAC) were expressed in larval motor neurons using the UAS-Gal4 system. Single EJPs could be recorded from muscles 15, 16, and 17 when larva expressing ChR2 were illuminated with short (100 ms) light pulses, whereas long light pulses (10 seconds) resulted in trains of EJPs with a frequency of around 25 Hz. Larva expressing PAC in preparations where motor neurons were cut from the ventral ganglion displayed a significant increase in mEJP frequency after a 1 minute exposure to blue light. Evoked responses in low (.2 mM) calcium were also significantly increased when PAC was stimulated with blue light. When motor nerves were left intact, PAC stimulation resulted in light evoked EJPs in muscles 6 and 7 in a manner consistent with RP3 motor neuron activity. ChR2 and PAC are therefore useful and reliable tools for manipulating neuronal activity in vivo.
Das Nijmegen Breakage Syndrom ist eine seltene autosomal- rezessive Erkrankung, die durch ein typisches Erscheinungsbild mit Mikrozephalie, Wachstumsretardierung, Immundefizienz sowie durch eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung und eine erhöhte Prädisposition gegenüber malignen Tumoren charakterisiert wird. Die Erkrankung wird durch Mutationen im NBS1-Gen verursacht, welches auf Chromosom 8q21 lokalisiert werden konnte. Das NBS1-Gen Produkt, Nibrin, ist Teil des MRE11-RAD50-Nibrin Proteinkomplexes, welcher eine zentrale Rolle bei der Erkennung und der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen spielt. Das Fehlen von Nibrin führt zu einer fehlerhaften DNA-Reparatur und erklärt die verschiedenen klinischen und zellulären Symptome bei NBS-Patienten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Daten von 40 Patienten ausgewertet, die im Rahmen der Verdachtsdiagnose eines Nijmegen Breakage Syndroms mit der Durchflusszytometrie untersucht wurden. Für die Unterscheidung zwischen NBS-positiven und NBS-negativen Fällen sind folgende Parameter von diagnostischer Relevanz: 1) der Anteil nichtproliferierender Zellen (G0/G1-Phase-Zelle), welcher bei NBS-Patienten meist deutlich höher sind als bei gesunden Kontrollen. Sie spiegeln bei erhöhten Werten die herabgesetzte Mitogenantwort wider. 2) die G2/GF-Ratio als Maß für Strahlensensitivität, welche bei NBS-Patienten charakteristischerweise erhöht ist. Die Auswertung der Daten erlaubte es in 22 Fällen die Verdachtsdiagnose NBS auszuschließen, da diese für beide Parameter Werte im Normalbereich zeigten. In 16 Fällen ergab sich ein positives Ergebnis mit erhöhtem Anteil nichtproliferierender Zellen und erhöhter Strahlensensitivität. Unter den positiven Fällen konnte bei 9 Patienten die Diagnose des Nijmegen Breakage Syndroms mittels Mutationsanalyse bestätigt werden. Bei 7 Patienten konnte jedoch trotz erhöhter Strahlensensitivität keine Mutation im NBS1-Gen nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Durchflusszytometrie das Vorliegen einer erhöhten Strahlensensitivität eindeutig nachweisen kann. Eine erhöhte Strahlensensitivität ist wiederum ein charakteristisches Merkmal des Nijmegen Breakage Syndroms, da es in direkten Zusammenhang mit dem verursachenden Gendefekt steht. Die Durchflusszytometrie kann daher als ein sinnvolles diagnostisches Verfahren von hoher Sensitivität bei Patienten mit der Verdachtsdiagnose NBS angesehen und erfolgreich eingesetzt werden. Allerdings ist die Spezifität des Verfahrens sehr viel geringer. Die Methode der Wahl für die Primärdiagnostik des Nijmegen Breakage Syndroms wird in Zukunft daher die Mutationsanalyse sein.
Im gleichen Maße wie informatisches Wissen mehr und mehr in den wissenschaftlichen Alltag aller Lebenswissenschaften Einzug gehalten hat, hat sich der Schwerpunkt bioinformatischer Forschung in stärker mathematisch und informatisch-orientierte Themengebiete verschoben. Bioinformatik heute ist mehr als die computergestützte Verarbeitung großer Mengen an biologischen Daten, sondern hat einen entscheidenden Fokus auf der Modellierung komplexer biologischer Systeme. Zur Anwendung kommen hierbei insbesondere Theorien aus dem Bereich der Stochastik und Statistik, des maschinellen Lernens und der theoretischen Informatik. In der vorliegenden Dissertation beschreibe ich in Fallstudien die systematische Modellierung biologischer Systeme aus einem informatisch - mathematischen Standpunkt unter Anwendung von Verfahren aus den genannten Teilbereichen und auf unterschiedlichen Ebenen biologischer Abstraktion. Ausgehend von der Sequenzinformation über Transkriptom, Metabolom und deren regulatorischer Interaktion hin zur Modellierung von Populationseffekten werden hierbei aktuelle biologische Fragestellungen mit mathematisch - informatischen Modellen und einer Vielzahl experimenteller Daten kombiniert. Ein besonderer Augenmerk liegt dabei auf dem Vorgang der Modellierung und des Modellbegriffs als solchem im Rahmen moderner bioinformatischer Forschung. Im Detail umfassen die Projekte (mehrere Publikationen) die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Einbettung und Visualisierung von Multiplen Sequenz- und Sequenz-Strukturalignments, illustriert am Beispiel eines Hemagglutininalignments unterschiedlicher H5N1 Varianten, sowie die Modellierung des Transkriptoms von A. thaliana, bei welchem mit Hilfe einer kernelisierten nicht-parametrischen Metaanalyse neue, an der Infektionsabwehr beteiligten, Gene ausfindig gemacht werden konnten. Desweiteren ist uns mit Hilfe unserer Software YANAsquare eine detaillierte Untersuchung des Metabolismus von L. monocytogenes unter Aktivierung des Transkriptionsfaktors prfA gelungen, dessen Vorhersagen durch experimentelle 13C Isotopologstudien belegt werden konnten. In einem Anschlußprojekt war der Zusammenhang zwischen Regulation des Metabolismus durch Regulation der Genexpression und der Fluxverteilung des metabolischen Steady- State-Netzwerks das Ziel. Die Modellierung eines komplexen organismischen Phänotyps, der Zellgrößenentwicklung der Diatomee Pseudo-nitzschia delicatissima, schließt die Untersuchungen ab.
This work was aimed at experimentally studying whether climatic variables act as environmental cues for workers’ building behaviour in leaf-cutting ants of the genus Acromyrmex, and to what extent building responses account for the maintenance of nest climate in a proper range for the inhabiting colony. Specifically, this work presents independent analysis in different Acromyrmex species with disparate ecology and nesting habits, aimed at understanding to what extent: i) temperature and humidity act as cues for workers’ building behaviour, ii) inter- and intraspecific differences in the nesting habits observed in South American Acromyrmex are based on distinct building behaviours and on the variation in regional climate across continent, iii) differences in nest architecture account for the maintenance of nest climate in a proper range for colony members and, iv) climatic variables trigger building responses aimed at controlling short-term changes in nest climate. It is first experimentally shown that soil temperature acts as a cue for workers’ digging behaviour. Acromyrmex lundi workers were observed to respond to both soil temperature as well as its changes, and to decide accordingly where to start or whether to stop digging. The soil temperature range preferred by workers to dig, between 20°C and maximally 30.6°C, matches the range at which colony growth is expected to be maximized. Temperature-sensitive digging might therefore lead to the establishment of the fungus chambers in soil layers with a proper range of temperatures for colony growth. Based on that, it was hypothesized that nest depth in Acromyrmex largely depends on the depth at which this temperature range is located across the soil profile, i.e., the higher the temperature in the superficial soil layers, the deeper the nest location, since soil temperature decreases with increasing depth. A bibliographic survey on nesting habits of 21 South American Acromyrmex species confirmed that the warmer the soil temperature at 50 cm depth throughout the South American continent, the higher the number of species presenting subterranean nests, compared with those inhabiting superficial nests. Temperature-sensitive digging in Acromyrmex would therefore explain the geographical distribution of nesting habits observed for this genus in the South American continent, i.e., subterranean in the northern tropical regions, and superficial in the southern temperate ones. In addition, results showed that Acromyrmex colonies from temperate regions indeed achieve thermoregulatory benefits through the determination of nest depth based on thermoregulatory needs. In sympatrically-occurring colonies of the grass-cutting ant A. heyeri, temperature inside superficial thatched nests was higher, and more suitable for colony growth, than that inside subterranean nests. This temperature surplus was even higher in spring, at the time of production of sexual brood, than in winter or summer. It was demonstrated that such temperature surplus was brought about by the low thermal diffusivity of the nest thatch, which prevents diurnal nest overheating by the incoming solar radiation, and avoids losses of the accumulated daily heat into the cold air during night, thus leading to high average nest temperatures. Although highly advantageous for colonies in terms of nest temperature, the determination of nest depth based on thermoregulatory needs may differentially affect nest ventilation and humidity depending on how nest exposition influences the exchange of nest air with the outside air. For instance, colonies with a superficial nesting habit might benefit from improved nest ventilation, but be at risk of desiccation due to their exposition and the consequent humidity losses into the dry outside air. Results demonstrated that in two Acromyrmex species, short-term regulatory building responses triggered and spatially organized by climatic variables occur, and may counteract undesired changes in internal nest humidity. Workers of the thatching grass-cutting ant A. heyeri, for instance, closed a number of nest-thatch openings as a response to desiccation of the outside air, even at a nest temperature that otherwise triggered the response of opening them so as to reduce nest temperature. In the leaf-cutting ant A. ambiguus, the direction of the airflow inside nest tunnels was shown to act as a cue for spatially guiding the building behaviour of plugging nest entrances. However, workers only responded if the humidity content of the circulating air was low, trading therefore nest ventilation for humidity maintenance.
Background: The frequency of the most observed cancer, Non Hodgkin Lymphoma (NHL), is further rising. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is the most common of the NHLs. There are two subgroups of DLBCL with different gene expression patterns: ABC (“Activated B-like DLBCL”) and GCB (“Germinal Center B-like DLBCL”). Without therapy the patients often die within a few months, the ABC type exhibits the more aggressive behaviour. A further B-cell lymphoma is the Mantle cell lymphoma (MCL). It is rare and shows very poor prognosis. There is no cure yet. Methods: In this project these B-cell lymphomas were examined with methods from bioinformatics, to find new characteristics or undiscovered events on the molecular level. This would improve understanding and therapy of lymphomas. For this purpose we used survival, gene expression and comparative genomic hybridization (CGH) data. In some clinical studies, you get large data sets, from which one can reveal yet unknown trends. Results (MCL): The published proliferation signature correlates directly with survival. Exploratory analyses of gene expression and CGH data of MCL samples (n=71) revealed a valid grouping according to the median of the proliferation signature values. The second axis of correspondence analysis distinguishes between good and bad prognosis. Statistical testing (moderate t-test, Wilcoxon rank-sum test) showed differences in the cell cycle and delivered a network of kinases, which are responsible for the difference between good and bad prognosis. A set of seven genes (CENPE, CDC20, HPRT1, CDC2, BIRC5, ASPM, IGF2BP3) predicted, similarly well, survival patterns as proliferation signature with 20 genes. Furthermore, some bands could be associated with prognosis in the explorative analysis (chromosome 9: 9p24, 9p23, 9p22, 9p21, 9q33 and 9q34). Results (DLBCL): New normalization of gene expression data of DLBCL patients revealed better separation of risk groups by the 2002 published signature based predictor. We could achieve, similarly well, a separation with six genes. Exploratory analysis of gene expression data could confirm the subgroups ABC and GCB. We recognized a clear difference in early and late cell cycle stages of cell cycle genes, which can separate ABC and GCB. Classical lymphoma and best separating genes form a network, which can classify and explain the ABC and GCB groups. Together with gene sets which identify ABC and GCB we get a network, which can classify and explain the ABC and GCB groups (ASB13, BCL2, BCL6, BCL7A, CCND2, COL3A1, CTGF, FN1, FOXP1, IGHM, IRF4, LMO2, LRMP, MAPK10, MME, MYBL1, NEIL1 and SH3BP5; Altogether these findings are useful for diagnosis, prognosis and therapy (cytostatic drugs).
Human caretaker genes play a central role in the DNA damage response. Their defects cause a number of rare diseases which show genetic instability and increased propensity to malignant cell growth. The first of these diseases to be described in this thesis is Fanconi anemia (FA), a rare chromosome instability disorder with recessive inheritance characterized by progressive bone marrow failure, variable congenital malformations, and cancer predisposition. There are at least 13 FA complementation groups (FA-A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M and N), each representing mutations in a distinct gene. To date, except FANCI all the corresponding genes have been identified, denoted as FANC-A, B, C, D1/BRCA2, D2, E, F, G, J/BRIP1/BACH1, L/PHF9, M/Hef and N/PALB2.Further information is provided in chapters 1 and 2. FA cells are characterized by high sensitivity to DNA crosslinking agents and to elevated oxygen tension, but it is controversial whether they are also radiosensitive. Systematic testing (chapter 3) of primary skin fibroblast cultures from all currently known FA complementation groups revealed no increased sensitivity towards ionizing radiation (IR) and ultra-violet light (UV) when growing cells at physiological (5% v/v) oxygen levels. Despite considerable interstrain variations FA cells showed no systematic differences to cell cultures derived from healthy controls, whereas positive controls (Ataxia telangiectasia and Cockayne syndrome) proved highly sensitive to IR or UV. Lack of radiosensitivity was also shown for the FANCD2 gene, a central gene in the FA/BRCA pathway whose mutational inactivation was studied in a large patient cohort. FA patients excluded previously from complementation groups FA-A, -C, E, F, G or L were screened for mutations in FANCD2. Even though mutation analysis of FANCD2 is complicated by the presence of pseudogene regions, biallelic FANCD2 mutations were identified in a series of 32 patients (chapter 4). The predominant types of mutations result in aberrant splicing causing exon skipping, exonisation of intronic sequence, activation of cryptic and creation of new 3´ splice sites. Many alleles were recurrent and could be associated with ethnicity. Interestingly, residual FANCD2 protein was observed in all available patient cell lines, and functionality was indicated by the presence of the monoubiquitinated FANCD2 isoform. This suggests that viability of FA-D2 patients depends on the presence of hypomorphic or leaky mutations. In chapter 5 the worldwide second FA patient belonging to complementation group FA-L is reported. Genetic analysis of patient derived fibroblasts revealed heterozygosity for a 5-bp deletion (exon 7) and a missense substitution (exon 11). In contrast to the tested fibroblasts two independent lymphoid cell lines proved resistant to the DNA crosslinking agent mitomycin C and showed proficient FANCD2 monoubiquitination. The functional reversion due to a compensating mutation in the splice acceptor site results in aberrant splicing and the restoration of the open reading frame. However, the revertant mosaicsm was restricted to the lymphatic cell lines such that there was no clinical improvement involving the other hematopoietic cell lineages, and bone marrow transplantation was required to treat the patients bone marrow failure. A direct link of Fanconi anemia to other DNA repair processes was provided by the identification of the BRCA1 interacting protein 1, BRIP1/BACH1, as a genuine FA gene (chapter 6). Genetic mapping of consanguineous Inuit families resulted in the identification of truncating mutations in BRIP1. In contrast to most of the other FA patients FANCD2 monoubiquitination was intact, linking these patients to complementation group FA-J. Biallelic mutations in BRIP1 were found in eight additional patients, one of whom was assigned previously to FA-J by somatic cell fusion. Therefore it could be shown that the postulated FANCJ gene is identical with BRIP1. This finding emphasizes the close connection between the BRCA- and the FA-family of genes, both involved in the DNA damage response. Biallelic mutations in BRCA2/FANCD1 cause a severe form of Fanconi anemia with childhood malignancies. Recently, a BRCA2 interacting protein was identified as a “partner and localizer of BRCA2” (PALB2) which confers cellular MMC resistance. A candidate gene approach revealed biallelic mutations in seven FA patients that developed solid tumors in early childhood (chapter 7). Patient cells show no or little PALB2 protein, lack of MMC induced RAD51 foci formation, and high chromosomal instability. Transduction of PALB2 cDNA complemented the MMC sensitive phenotype. Therefore, biallelic mutations in PALB2 cause a new subtype of FA, denoted as FA-N, which is connected with a high and early cancer risk. With respect to one of the most prominent but least understood caretaker gene syndromes, Fanconi anemia, this thesis has expanded our knowledge as follows: 1. refutation of major cellular radiosensitivity of FA cell lines regardless of complementation group, 2. detection of hypomorphic mutations and residual protein levels as a prerequisite for viability of the FANCD2 gene, 3. description of the worldwide second patient belonging to complementation group FA-L whose lymphocytes exhibit a novel type of somatic reversion, 4. participation in the discovery and functional characterization of two novel FA genes (FANCJ and FANCN). The last chapter of the thesis deals with a DNA repair pathway that is activated following exposure to ionizing radation. One of the central proteins responding to radiation-induced DNA damage is the product of the ATM gene which signals to a myriad of other proteins in response to DNA double strand breaks, including the NMR complex. This complex formed by the NBS1/MRE11/RAD50 proteins is thought to act as a specifi c sensor of DNA double-strand breaks. Mutations of MRE11 and NBS1 are associated with the radiation sensitivity syndromes Ataxia-telangiectasia-like disorder (AT-LD) and Nijmegen breakage syndrome (NBS), respectively. Chapter 8 presents the first ever identified patient with RAD50 deficiency due to biallelic germline mutations in the RAD50 gene. An 18-year-old German girl who has a variant form of NBS without immunodeficiency was found to be compound heterozygous for a nonsense mutation and the loss of the natural termination signal in the RAD50 gene. RAD50 protein expression was reduced to less than one tenth of normal in her fibroblasts and lymphoblastoid cells. At the nuclear level, RAD50 deficiency was associated with a high frequency of spontaneous chromatid exchanges and with the failure to form MRE11 and NBS1 nuclear foci in response to irradiation. ATM autophosphorylation, phosphorylation of p53 at serine 15 and the transcriptional induction of p21/WAF1 mRNA were reduced, and there was no evidence for Ser343 phosphorylation of NBS1 in RAD50 defi cient cells following irradiation. These defects could be complemented by expression of wildtype RAD50 cDNA. Our data shows that RAD50 modulates, like NBS1 and MRE11, the ATM-mediated DNA damage response and the G1/S cell cycle checkpoint. In addition, RAD50 appears to be required for nuclear localization of MRE11, and for NBS1 focus formation, underlining its importance for the proper function of the NMR complex. Owing to the studies performed within the framework of this thesis, RAD50 deficiency can now be added to the growing list of human caretaker gene syndromes with pronounced radiosensitivity that is distinctive at both the cellular and the clinical level from deficiencies involving the other members of the NMR complex.
1. Zusammenfassung Lösliche humane TRAIL-Varianten (hTRAIL), die nur die “TNF homology domain” (THD) beinhalten, binden sowohl den TRAILR1 aus auch den TRAILR2, stimulieren jedoch nur den TRAILR1. Nach sekundärem Quervernetzen des Liganden wird dann aber auch der TRAILR2 effektiv aktiviert. Entsprechende murine TRAIL-Varianten (mTRAIL) dagegen zeigen nur eine schwache Rezeptorbindung und sind selbst nach sekundärem Quervernetzen nur wenig aktiv. Interessanterweise kann ein Fusionsprotein aus der THD von mTRAIL und der Trimerisierungsdomäne von Tenascin-C (TNC), das wie mTRAIL selbst auch als Trimer vorligt, effizient an TRAIL-Rezeptoren binden und nach sekundärem Quervernetzen den TRAILR2 gut stimulieren. Weiterhin kann eine mTRAIL-Variante, die neben der THD auch die Stammregion des Moleküls enthält, die die THD von der Transmembrandomäne trennt, nach sekundärem Quervernetzen Apoptose induzieren, jedoch nicht so effektiv wie das TNC-mTRAILFusionsprotein. Die spezifische Bioaktivität der humanen TRAIL-Varianten wird gleichfalls, wenn auch weniger stark, durch Fusion mit der Tenascin-C-Trimerisierungsdomäne gesteigert. Die Fixierung des N-Terminus der THD, die hier durch die TNCDomäne sonst jedoch durch die Stamm- oder Transmembrandomäne gewährleistet wird, könnte demnach für mTRAIL für eine gute Rezeptorbindung und effektive Apoptoseinduktion nötig sein. Dies deutet auf eine bisher nicht erkannte Rolle der Stammregion für die Aktivität dieser Liganden hin und bietet die Möglichkeit, rekombinante lösliche Liganden der TNF-Familie mit erhöhter Aktivität zu generieren. Die TRAIL-induzierte Apoptose kann für die Behandlung von Tumorzellen nützlich sein. Es wurde jedoch kürzlich gezeigt, dass TRAIL neben Apoptose auch proinflammatorische, d. h. potentiell tumorfördernde Signalwege, insbesondere in apoptoseresistenten Zellen induzieren kann. Im Folgenden sollte untersucht werden, inwiefern TRAIL solche Signalwege in Myelomzellen stimuliert. Oligomerisiertes TRAIL kann bei allen analysierten Zelllinien Caspasen aktivieren und Apoptose induzieren. Werden die Zelllinien mit dem pan-Caspaseinhibitor ZVAD behandelt, kann die Caspase- Aktivierung bei allen Zellen blockiert werden, die Apoptoseinduktion jedoch nur bei zwei Zelllinien. Im Gegensatz dazu schützt ZVAD drei andere Myelomzelllinien nur partiell vor der TRAIL-induzierten Apoptose. Dies zeigt, dass TRAIL in Myelomzellen auch caspaseunabhängigen Zelltod induzieren kann. TRAIL induziert in den Myelomzellen auch proinflammatorische Signalwege wie den NFкB-, den JNK-, den p38- und den p42/44-Signalweg. Die Stimulation des JNK- und des p38-Signalwegs erwies sich hierbei in zelltypspezifischer Weise caspaseabhängig, die Aktivierung des NFкB- und p42/44-Signalwegs immer als caspaseunabhängig. Zusammenfassend geht aus diesen Ergebnissen hervor, dass zur Behandlung des multiplen Myeloms, TRAIL in Kombination mit anti-inflammatorisch wirkenden Mitteln eingesetzt werden sollte, insbesondere um mögliche proinflammatorische Nebenwirkungen durch TRAIL zu minimieren.
Interleukin-5 (IL-5) is a member of the hematopoietic class I cytokines and is specifically involved in eosinophil activation. IL-5 plays an important role in disease conditions such as allergic asthma and other hypereosinophilias, which are characterized by highly increased levels of eosinophils in peripheral blood and tissues. The IL-5 receptor is a heterodimer consisting of a binding alpha subunit (IL- 5Rα) and a common beta subunit (IL-5Rβ). This IL-5Rβ is shared with the IL-3 and GM-CSF receptors. The IL-5Rα is required for ligand-specific binding, whereas the association of the IL-5Rβ subunit triggers intracellular signal transduction. Previous studies have described the crystallographic structure of human IL-5 (hIL-5), as well as that of the common IL-5Rβ chain (IL-5Rβc) However, no experimental structural data are yet available for the interaction of the high-affinity IL-5 receptor IL-5Rα with its ligand IL-5. Therefore, this thesis had the principle objective to gain new insights into the basis of this important agonist-receptor interaction. In particular, data on the recombinant expression, purification and preparation of the binary complex of hIL-5 bound to the receptor ectodomain of hIL-5Rα are shown, as well as the subsequent crystal structure analysis of the binary ligand-receptor (hIL-5Rα/hIL-5) complex. Both proteins were expressed in an Escherichia coli expression system, purified to homogeneity, and crystallized. However, since the initial analysis of these crystals did not show any X-ray diffraction, each step of the preparation and crystallization procedure had to be stepwise optimized. Several improvements proved to be crucial for obtaining crystals suitable for structure analysis. A free cysteine residue in the N-terminal domain of the hIL-5Rα ectodomain protein was mutated to alanine to remove protein heterogeneity. In addition, hIL-5 affinity chromatography of the receptor protein proved to be absolutely crucial for crystal quality. Additive screening using the initial crystallization condition finally yielded crystals of the binary complex, which diffracted to 2.5Å resolution and were suitable for structure analysis. The preliminary structure data demonstrate a new receptor architecture for the IL-5Rα ligand-binding domain, which has no similarities to other cytokine class I receptor structures known so far. The complex structure demonstrates that the ligand-binding region of human IL-5Rα is dispersed over all three extracellular domains, and adopts a binding topology in which the cytokine recognition motif (CRM) needs the first Fn-III domain of the human IL-5Rα to bind the ligand. In a second project, a prokaryotic expression system for murine IL-5 (mIL-5) was established to allow the production of mIL-5 and mIL-5 antagonist that should facilitate functional studies in mice. Since the expression of mIL-5 in E. coli had never been successful so far, a fusion protein system was generated expressing high yields of mIL-5. Chemical cleavage with cyanogen bromide (CNBr) was used to release mIL-5 monomers, which were subsequently purified and refolded. This technique yielded an active murine IL-5 dimer as confirmed by TF-1 cell proliferation assays. The protein was crystallized and the structure of mIL-5 could be determined at 2.5Å resolution. The molecular structure revealed a symmetrical left-handed four helices bundle dimer similar to human IL-5. Analysis of the structure-/function relationship allowed us to design specific mIL-5 antagonist molecules, which are still under examination. Taken together, these findings provide further insights in the IL-5 and IL-5R interaction which may help to further understand and depict this and other cytokine-receptor interactions of similar architecture, e.g. the IL-13 ligand-receptor system. Ultimately, this may represent another piece of puzzle in the attempts to rationally design and engineer novel IL-5-related pharmacological therapeutics.
Immunsupprimierte Patienten besitzen ein erhöhtes Risiko für opportunistische Infektionen, die hauptsächlich durch das humane Cytomegalievirus (HCMV) und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus verursacht werden. Aufgrund ihrer Lokalisation in den Geweben unterhalb von Lungenepithelien und des Gastrointestinaltraktes werden dendritische Zellen (DCs) als diejenigen Zellen betrachtet, die während der frühen Phase einer Infektion in Kontakt mit HCMV und A. fumigatus kommen und eine Aktivierung von angeborenen und adaptiven Abwehrmechanismen vermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Bedeutung von humanen DCs bei der Bekämpfung von HCMV und A. fumigatus näher untersucht. Um mit dem klinisch relevanten HCMV Stamm TB40E arbeiten zu können, musste zuerst ein geeignetes Zellkultursystem zur Anzucht von HCMV etabliert werden. Die aus Fibroblasten aufgereinigten Viren eigneten sich zur erfolgreichen Infektion von DCs, was durch verschiedene Färbemethoden nachgewiesen werden konnte. Aus diesem Grund war es möglich, in Abhängigkeit der Zeit ein Expressionsprofil von Klasse I Interferonen (IFN-alpha, IFN-beta), ausgesuchten Cytokinen (CXCL10, CXCL11, Rantes) und den wichtigen Immunrezeptoren Toll-like Rezeptor 3 (TLR3) und dendritic cell-specific ICAM3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN) zu erstellen. Nachdem ein RNA Interferenz (RNAi) System zur erfolgreichen Transfektion von DCs mit small interfering RNA (siRNA) etabliert werden konnte, gelang es die Expression von TLR3 signifikant herunterzuregulieren. Stimulationsexperimente mit dem synthetisch hergestellten Polymer poly I:C identifizierten TLR3 als den Rezeptor, der die Expression von IFN-beta vermittelt. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass TLR9 bei ex vivo generierten DCs keine Funktion besitzt. Eine direkte Aktivierung von TLR3 durch HCMV konnte mittels siRNA nicht nachgewiesen werden. Durch den Einsatz von genomweiten Microarray-Analysen konnten eine Vielzahl an Genen gefunden werden, die nach Co-Kultivierung von DCs und lebenden A. fumigatus Keimschläuchen (KS) differentiell exprimiert waren. Dabei wurde ein breites Spektrum an Cytokinen (TNF-alpha, IL-6, IL-10, IL-12), Chemokinen (IL-8, CCL20, CXCL10), Co-stimulatorischen Molekülen (CD40, CD80, CD83, CD86), Prostaglandin Synthese Genen (PTGS2) und Immunrezeptoren (PTX-3, TLR2, TLR4) gefunden, deren zeitabhängiges Expressionsprofil mittels qRT-PCR eindeutig bestätigt wurde. Als Wachen des Immunsystems müssen DCs Krankheitserreger zu einem frühen Zeitpunkt der Infektion erkennen. Die Erkennung von Pilzen wird durch die unterschiedlichen Rezeptoren vermittelt, die TLRs, C-Typ Lektine und Pentraxine umfassen, wobei ihre Bedeutung für humane DCs bisher nur unzureichend geklärt ist. Durch den Einsatz von siRNA konnte die Expression von TLR2, TLR4, myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88), DC-SIGN, Pentraxin-3 (PTX-3) und caspase recruitment domain family member 9 (Card-9) signifikant verringert werden. Für TLR2, TLR4, PTX-3 und DC-SIGN konnte durch den Einsatz der RNAi aufgezeigt werden, dass diese Rezeptoren nicht an der Induktion einer pro-inflammatorischen Immunantwort von DCs nach Infektion mit A. fumigatus beteiligt sind. Sowohl die Stimulierung mit den TLR Liganden Zymosan und LPS, als auch mit A. fumigatus, führte zu einer erhöhten Expression von TNF-alpha und IL-12 (Light Cycler), die sich in einer vermehrten Cytokinfreisetzung (ELISA) bemerkbar machte. Im Gegensatz zur TLR4 siRNA Transfektion und LPS-Stimulation war keine Reduktion der Expression von TNF-alpha und IL-12 nach TLR2 und TLR4 siRNA Transfektion und anschließender Pilzinfektion zu beobachten. Auch der Einsatz von gegen TLRs gerichteten Antikörpern konnte eine mögliche Signaltransduktion bei DCs nicht unterbinden. Anstelle von TLR2 und TLR4 wurde Dectin-1 als DC-Immunrezeptor für A. fumigatus KS identifiziert. Mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers gegen Dectin-1 war es möglich, die Freisetzung von TNF-alpha und IL-12 nach Pilzinfektion zu blockieren. In einem unabhängigen Experiment mit siRNA wurde Dectin-1 als Rezeptor für A. fumigatus bestätigt. Wie fortführende Experimente mit Candida albicans KS und Zymosan gezeigt haben, handelt es sich bei Dectin-1 auf humanen DCs um einen generellen Rezeptor für Pilze. Die durchgeführten SNP-Analysen (single nucleotide polymorphism) zur Ermittlung eines Zusammenhanges mit einem erhöhten Virus- und Pilzinfektionsrisiko für Patienten nach Stammzelltransplantation erbrachten die Erkenntnis darüber, dass zwei Marker (rs735240, rs2287886) in DC-SIGN mit einer erhöhten Empfänglichkeit für HCMV, und drei Marker (rs1554013, rs3921, rs4257674) in CXCL10 mit einem vergrößerten Riskio für eine invasive Aspergillose assoziiert waren. Ein Screening von Patienten auf das Vorhandensein dieser definierten SNPs könnte helfen, die individuelle Gefahr für HCMV und A. fumigatus nach nach allogener Stammzelltransplantation abzuschätzen.
In the present study a knockout mouse model of the Popeye domain containing gene 2 (Popdc2) was generated and functionally characterized. The Popdc2 null mutants were viable with an apparent normal life span. ß-galactosidase staining to visualize the expression of the Popdc2-LacZ transgene revealed the presence of the Popdc2 in heart, bladder, smooth and skeletal muscles. In the heart LacZ was found to be present in cardiac myocytes with elevated levels in the myocytes of the cardiac conduction system. Holter ECGs records of the heart function of the 8 months (but not in 3 and 6 months) old mutant and WT littermates revealed a pronounced sinus bradycardia in the mutant mice in response to three different stress regimens: isoproterenol infusion, mental stress and a physical exercise. Histological examination of the Popdc2 null mutants SAN revealed structural alterations as was detected by HCN4 staining. Moreover, volume measurements using 3-D reconstructions of serial sections stained with HCN4 antibody revealed a volume reduction of about 30% in the mutant SAN. Taken together data presented in this study suggest that the Popdc2 KO mouse line may serve as an animal model of human sick sinus syndrome. In the second part of this thesis the Popdc2 gene promoter was analyzed. Three transcription factors binding sites were predicted in the promoter region and characterized.
The Ras/RAF/MEK/ERK cascade is a central cellular signal transduction pathway involved in cell proliferation, differentiation, and survival where RAF kinases are pivotal kinases implicated in cancer. The development of specific irreversible kinase inhibitors is a rewarding but difficult aim. CI-1033 was developed to irreversibly inhibit erbB receptor tyrosine kinases by reacting to the Cys113 residue (p38alpha MAP kinase numbering) of the kinase domain. In this study we tried a similar approach to target the RAF oncoproteins which posses a similar cysteine at position 108 in the hinge region between the small n-lobe and the large c-lobe of the kinase domain. A novel synthetic approach including a lyophilization step allowed us the synthesis of a diphenyl urea compound with an epoxide moiety (compound 1). Compound 1 possessed inhibitory activity in vitro. However our time kinetics experiments and mass spectroscopic studies clearly indicate that compound 1 does not react covalently with the cysteine residue in the hinge region. Moreover, in cell culture experiments, a strong activation of the RAF signaling pathway was observed, an effect which is known from several other RAF kinase inhibitors and is here reported for the first time for a diphenyl urea compound, to which the clinically used unspecific kinase inhibitor BAY 43-9006 (Sorafinib, Nexavar) belongs. Although activation was apparently independent on B- and C-RAF hetero-oligomerization in vitro, in vivo experiments support such a mechanism as the activation did not occur in starved knockout cells lacking either B-RAF or C-RAF. Furthermore, we developed a mathematical model of the Ras/RAF/MEK/ERK cascade demonstrating how stimuli induce different signal patterns and thereby different cellular responses, depending on cell type and the ratio between B-RAF and C-RAF. Based on biochemical data for activation and dephosphorylation, we set up differential equations for a dynamical model of the Ras/RAF/MEK/ERK cascade. We find a different signaling pattern and response result for B-RAF (strong activation, sustained signal) and C-RAF (steep activation, transient signal). We further support the significance of such differential modulatory signaling by showing different RAF isoform expression in various cell lines and experimental testing of the predicted kinase activities in B-RAF, C-RAF as well as mutated versions. Additionally the effect of the tumor suppressor DiRas3 (also known as Noey2 or ARHI) on RAF signaling was studied. I could show that DiRas3 down-regulates the mitogenic pathway by inhibition of MEK, a basis for a refined model of the Ras/RAF/MEK/ERK cascade.
Many arthropods and vertebrates can cling to surfaces using adhesive pads on their legs. These pads are either smooth and characterised by a specialised, soft cuticle or they are hairy, i.e. densely covered with flexible adhesive setae. Animals climbing with adhesive organs are able to control attachment and detachment dynamically while running. The detailed mechanisms of how tarsal pads generate adhesive and frictional forces and how forces are controlled during locomotion are still largely unclear. The aim of this study was to clarify the attachment mechanism of smooth adhesive pads as present in many insects and tree frogs. To understand the function of these fluid-based adhesive systems, I characterized their performance under standardized conditions. To this end, experiments were conducted by simultaneously measuring adhesion, friction, and contact area in single adhesive pads. The first result of this study showed that friction in stick insect attachment pads is anisotropic: Attachment pads regularly detached when slid away from the body. Further analyses of "immobilized" arolia revealed that this anisotropy is not caused by an increased shear stress in the proximal direction, but by the instability of the tarsus when pushed distally. In the second part of this study, I analysed the role of the pad secretion present in insects and tree frogs. In stick insects, shear stress was largely independent of normal force and increased with velocity, seemingly consistent with the viscosity effect of a continuous fluid film. However, measurements of the remaining force two minutes after a sliding movement showed that adhesive pads could sustain considerable static friction in insects and tree frogs. Repeated sliding movements and multiple consecutive pull-offs of stick insect single legs to deplete adhesive secretion showed that on a smooth surface, friction and adhesion strongly increased with decreasing amount of fluid in insects. In contrast, stick insect pull-off forces significantly decreased on a rough substrate. Thus, the secretion does not generally increase attachment but does so only on rough substrates, where it helps to maximize contact area. When slides with stick insect arolia were repeated at one position so that secretion could accumulate, sliding shear stress decreased but static friction remained clearly present. This suggests that static friction in stick insects, which is biologically important to prevent sliding, is based on non-Newtonian properties of the adhesive emulsion rather than on a direct contact between the cuticle and the substrate. % Analogous measurements in toe pads of tree frogs showed that they are also able to generate static friction, even though their pads are wetted by mucus. In contrast to the mechanism proposed for insects, static friction in tree frogs apparently results from the very close contact of toe pads to the substrate and boundary lubrication. In the last section of this study, I investigated adhesive forces and the mode of detachment by performing pull-off measurements at different velocities and preloads. These experiments showed that preload has only an increasing effect on adhesion for faster pull-offs. This can be explained by the viscoelastic material properties of the stick insect arolium, which introduce a strong rate-dependence of detachment. During fast pull-offs, forces can spread over the complete area of contact, leading to forces scaling with area. In contrast, the pad material has sufficient time to withdraw elastically and peel during slow detachments. Under these conditions the adhesive force will concentrate on the circumference of the contact area, therefore scaling with a length, supporting models such as the peeling theory. The scaling of single-pad forces supported these conclusions, but large variation between pads of different stick insects did not allow statistically significant conclusions. In contrast, when detachment forces were quantified for whole insects using a centrifuge, forces scaled with pad contact area and not with length.
In dieser Arbeit untersuche ich das Verhalten von Arbeiterbienen beim Brutwärmen, die Wärmeübertragung von den Bienen auf die gedeckelte Brut, die thermophysikalischen Eigenschaften des Brutnests und spezielle Aspekte des Brutnestaufbaus, die für dieses Thema relevant sind und bisher nicht untersucht wurden. Meine Arbeit umfasst Verhaltensbeobachtungen und thermografische Messungen an individuellen Bienen, die Simulation des Heizverhaltens von Arbeiterinnen und das Messen der Temperaturänderungen in der Wabe, die Messung der thermophysikalischen Eigenschaften der Brutwabe und der Zellwände (Wärmeleitfähigkeit und Durchlässigkeit für Wärmestrahlung), die Auswertung von Brutzelltemperaturen als Ergebnis des Verhaltens von Arbeiterbienen, die Analyse der Anzahl und der räumlichen Verteilung von Brutlücken (Auswertung in 2-D und 3-D bezüglich beider Wabenseiten) und die Entwicklung spezifischer Computersoftware, die zur Erarbeitung dieser Ergebnisse unverzichtbar ist. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist die Entdeckung und Beschreibung eines bemerkenswerten, bislang unbekannten Verhaltens der Honigbiene: Die Aufrechterhaltung hoher Thoraxtemperaturen (TTh) bei Langzeitbesuchen in offenen Zellen („Lücken“) die verstreut in der gedeckelten Brutfläche vorkommen. Hier zeige ich, dass die Aufrechterhaltung der hohen TTh nicht auf den Zellinhalt (z. B. offene Brut) bezogen ist - in den meisten Fällen waren die besuchten Zellen ohnehin leer - sondern auf die direkt benachbarte gedeckelte Brut, mit der diese Zellen über gemeinsame Zellwände in Kontakt stehen. Dieses Verhalten liefert eine Erklärung für Langzeitzellbesuche von sehr langer Dauer ohne erkennbare Aktivität, die in früheren Arbeiten beschrieben aber nicht völlig verstanden wurden, und es rehabilitiert die scheinbar „faulen“ Bienen im Zellinnern. Diesem Verhalten kommt eine große Bedeutung für das Brutwärmen zu, da sich der aufgeheizte Thorax tief in der Wabe (fast an der Mittelwand) befindet wo der Wärmeverlust an die Luft minimiert ist und von wo bis zu 6 umliegende Puppenzellen gleichzeitig gewärmt werden können. Im Vergleich zum Brutwärmeverhalten an der Wabenoberfläche (Andrücken des Thorax an die Brutdeckel), wo nur 1 oder Teile von 3 Brutdeckeln mit dem Thorax in Berührung stehen, ist das Wärmen im Zellinnern mit derselben TTh bis zu 2,6-fach effizienter. Die Messung der thermophysikalischen Eigenschaften der Brutwabe und die Simulation des Brutwärmeverhaltens unter kontrollierten Bedingungen zeigen, dass sich die Wabe langsam aufwärmt und eher ein lokal begrenztes Wärmen als eine rasche Wärmeausbreitung über eine große Fläche begünstigt. Der Einflussbereich eines einzelnen Zellbesuchers hängt von seiner TTh und der Dauer des Zellbesuchs ab. Anstiege der Bruttemperatur in bis zu 3 Zellen Abstand zum Zellbesucher sind nachweisbar. Das hier beschriebene Brutwärmeverhalten im Innern von Lücken (offenen Zellen) bietet nicht nur neue Einsichten in das Bienenverhalten. Es ermöglicht auch eine Neubewertung der Lücken und ihrer Nützlichkeit für die Bienen. Eine von mir entwickelte Computersoftware („CombUse 2.0“) ermöglicht es, das Vorkommen und die räumliche Verteilung von Lücken mit hoher Genauigkeit auf der Ebene einzelner Zellen zu erfassen und auszuwerten. Die räumliche Verteilung der Lücken in der gedeckelten Brutfläche zeigt, dass schon bei geringen Lückenhäufigkeiten von ca. 4 bis 10 %, die in gesunden Kolonien normal sind, eine überraschend große Zahl gedeckelter Brutzellen (88 % bis 99 %, wenn die dreidimensionale Verteilung berücksichtigt wird) im Einflussbereich von Brut wärmenden Zellbesuchern sind. Obwohl das Brutwärmeverhalten im Zellinnern schwer zu entdecken und zu beobachten ist, führen die in dieser Arbeit präsentierten Daten zu dem Schluss, dass es sich dabei um einen wichtigen Bestandteil der Nestklimatisierung bei Honigbienen handelt.
Unter Fanconi Anämie versteht man eine rezessiv vererbbare Multisystem-Erkrankung, die einhergeht mit erhöhter spontaner Chromosomenbrüchigkeit, sowie erhöhter Anfälligkeit für toxische Substanzen, wie Mitomycin C (MMC) oder Diepoxybutan (DEB).Gentherapeutische Versuche scheitern bei FA letztlich daran, dass bei fortgeschrittener aplastischer Anämie (= Knochenmarkversagen) die Gewinnung der zur erfolgreichen Transduktion erforderlichen Mengen an CD34 positiven Stamm-Blutzellen schwierig bis unmöglich ist. Die Fortschritte bei den Fremdspender-Transplantationen lassen erwarten, dass zukünftig nahezu alle FA-Patienten mit dieser Therapieform mit guten Erfolgsaussichten behandelt werden können. Insofern ist auch zu erwarten, dass die Option einer somatischen Gentherapie - trotz vielversprechenden Ergebnissen - zukünftig wieder an Bedeutung verlieren wird.
Der Neurotransmitter Serotonin spielt ein Rolle bei der Entwicklung von Ethanoltoleranz und Alkoholismus. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Funktion von Serotonin (5HT) im Bezug auf Ethanolsensitivität und Toleranz in Drosophila melanogaster. Pharmakologisch wurden die 5HT Konzentrationen durch Füttern eines Vorläufers der 5HT Synthese kurzeitig erhöht oder mit einem Syntheseinhibitor reduziert. Die Veränderung der 5HT Konzentrationen mittels dieser Pharmaka hatte jedoch keinen Einfluss auf die Entwicklung von Ethanolsensitivität oder Toleranz. 5HT wird durch den 5HT Transporter (SERT) aus dem synaptischen Spalt in die Präsynapse wieder aufgenommen. Die kurzzeitige Fütterung des SERT Inhibitors Paroxetin führt zu erhöhter Ethanolsensitivität und reduzierter Toleranz. Ein ähnlicher Phänotyp wurde in der hypomorphen sert55 Mutante, die eine reduzierte dsert Expression aufweist, beobachtet. Dies legt nahe, dass kurz- wie langfristige Reduktion der SERT Funktion die Entwicklung einer vollständigen Ethanoltoleranz verhindern. Folglich hat die Verlängerung der 5HT Signaltransduktion im synaptischen Spalt, nicht aber die allgemeine Erhöhung von 5HT Konzentrationen im Fliegengehirn einen Einfluss auf die Entwicklung von Ethanoltoleranz. Zur genauen Bestimmung der SERT Expression im adulten Gehirn der Fliege wurde ein Drosophila SERT (dSERT) Antikörper hergestellt. Mit Hilfe dieses Antikörpers konnte gezeigt werden, dass der dSERT mit serotonergen Somata, Axonen und Dendriten kolokalisiert. Ferner sollten 5HT Konzentrationen im synaptischen Spalt durch Überexpression des wildtypischen dsert in einem Großteil der Neurone mit Hilfe des UAS/GAL4 Systems reduziert werden. Diese Fliegen wiesen weder eine veränderte 5HT Konzentration in den Köpfen auf noch war die Ethanolsensitivität bzw. Toleranz verändert. Das kann einerseits daran liegen, dass der dSERT nicht in die Membran integriert wird oder andererseits daran, dass unser Konstrukt nicht funktional ist. Die Überexpression eines inaktiven dSERTs sollte theoretisch zur Erhöhung von 5HT Konzentrationen im synaptischen Spalt führen. Wurde ein inaktiver dSERT in den meisten Neuronen der Fliege exprimiert, erhöhten sich zwar die 5HT Konzentrationen in den Köpfen der Fliegen, dennoch war das ethanolinduzierte Verhalten nicht verändert. Zusätzlich wurde untersucht, welchen Einfluss die Inhibition der 5HT Ausschüttung auf die Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz hat. Zur Inhibition der Neurotransmission in serotonergen Zellen wurde ein Tetanus Toxin (TNT) Transgen in Verbindung mit verschiedenen GAL4 Treiberlinien eingesetzt. Die Inhibition von serotonergen und dopaminergen Neuronen mit Hilfe einer GAL4 Linie, die einen Abschnitt des Gens der Dopamin Decarboxylase (ddc) beinhaltet, führte zu keiner Veränderung von Ethanolsensitivität bzw. Toleranz. Für weitere GAL4 Linien wurde zunächst das Expressionsmuster neuroanatomisch untersucht. Von vier ausgewählten GAL4 Linien zeigten zwei Expression in serotonergen Neuronen. Die sert1+2-GAL4 Linie mit einem Stück Promotorregion des dsert zeigt Expression in 46% der serotonergen Neuronen. Wurden diese mit Hilfe von Tetanus Toxin inhibiert, zeigten die Fliegen eine leicht aber signifikant erhöhte Ethanolsensitivität und eine unveränderte Toleranz. Die zweite GAL4 Linie enthält ein Stück Promotorregion des 5HT1b Rezeptors und zeigt Expression in ebenfalls 46% der serotonergen Neurone, weitgehend überlappend mit der Expression der Linie sert1+2-GAL4. Jedoch exprimiert die 5htr1b-GAL4 Linie zusätzlich in vier serotonergen Neuronen, in elf dopaminergen und einem unbekannten Neuron. Interessanterweise ist nach Inhibition der Neurotransmission in diesen Neuronen eine stark erhöhte Ethanolsensitivität sowie eine reduzierte Ethanoltoleranz zu beobachten. Folglich könnte die Inhibition der Neurotransmission in dopaminergen Neuronen für die Reduktion der Ethanolsensitivität verantwortlich sein. Deshalb wurde die Neurotransmitteraussschüttung in dopaminergen Neuronen mit Hilfe der th-GAL4 Linie und TNT unterdrückt und diese Fliegen wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, Ethanolsensitivtät und/oder Toleranz zu entwickeln. Nach Inhibition der von th-GAL4 getriebenen dopaminergen Neurone wurde eine erhöhte Ethanolsensitivität gemessen, aber keine signifikant veränderte Ethanoltoleranz. Da die ddc-GAL4 Linie im Vorfeld keinen ethanolinduzierten Verhaltensphänotyp gezeigt hat, sollte bestimmt werden, welche dopaminergen Neuronen der 5htr1b-GAL4 sowie der th-GAL4 Linie für die erhöhte Ethanolsensitivität verantwortlich sind. Serotonerge Neuronengruppen, die in die Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz involviert sein könnten, sind SE1, SE2, SE3, LP1, LP2, SP1, SP2 und IP, während es sich bei den dopaminergen Neuronengruppen um PAL1, PPL1, PPM2, PPM3 und SVP1 handeln könnte. Einige Neurone der 5htr1b-GAL4 Linie projizieren in den Ellipsoidkörper, eine Struktur des Zentralkomplexes, für die bereits gezeigt wurde, dass sie in die Entwicklung vonEthanoltoleranz involviert ist. Jedoch muss näher untersucht werden, welche Neuronen für die Innervation verantwortlich sind. Dafür sollten GAL4 Linien verwendet werden, die eine ähnliche Expression wie die 5htr1b-GAL4 Linie, aber ausschließlich im Ellipsoidkörper, zeigen. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass serotonerge und dopaminerge Neurone in die Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz in Drosophila melanogaster involviert sind. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine veränderte 5HT Signaltransduktion zu einer reduzierten Toleranz führt. Weiterführend ist die Identifizierung von serotonergen Neuronen, die für die Entwicklung von Ethanolsensitivität und/oder Toleranz verantwortlich sind, von großem Interesse. Ziel ist es, die neuronalen Schaltkreise aufzudecken, die den Phänomenen Ethanolsensitivität und Toleranz zugrundeliegen.
Die Entwicklung und Zulassung von Arzneimitteln sowie die Bewertung von Xenobio-tika erfordern eine Reihe von Testsystemen zur Toxizitätsermittlung. Für die Überprüfung der Gentoxizität stehen eine Vielzahl etablierter Testsysteme zur Verfügung, die oft auf Krebszelllinien basieren. Krebszelllinien haben jedoch die Eigenschaft, neben den für die Testung notwendigen Veränderungen weitere Veränderungen zu tragen, die zu Reaktionen führen können, wie sie in den Primärzellen des Organismus nicht auftreten. Daher ist die Kenntnis des genetischen Hintergrunds der verwendeten Krebszelllinien wertvoll, um Testergebnisse bewerten und gentoxische Risikopotentiale abschätzen zu können. Die Mauslymphomzelllinie L5178Y nimmt unter den auf Krebszellen basierenden Testsystemen eine besondere Stellung ein, da sie die weltweit in der Gentoxizi-tätsprüfung am häufigsten eingesetzte Zelllinie ist. In der vorliegenden Arbeit wurde in dieser Zellllinie eine Veränderung nachgewiesen, die das Mismatch-Reparatur-System (MMR-System) betrifft. Bei der MMR handelt es sich um einen Mechanismus, der daran beteiligt ist, die Integrität des Genoms zu gewährleisten. In MMR-profizienten Zellen werden Fehler in der DNA, die bei der Replikation, der homologen Rekombination oder durch äußere gentoxische Einwirkungen entstehen, entweder erkannt und repariert, oder die geschädigten Zellen werden durch die Induktion von Apoptosen eliminiert. Im Gegensatz dazu überleben MMR-defiziente Zellen trotz gravierender DNA-Schäden und akkumulieren diese. In der vorliegenden Arbeit wurde die Akkumulierung von Genomschäden bei L5178Y-Zellen als Reaktion auf Behandlung mit alkylierenden Agenzien beobachtet, während andere Vergleichszelllinien Apoptosen induzierten. Dieses Verhalten der L5178Y-Zellen, das in der Literatur bei MMR-defizienten Zellen für alkylierende Agenzien beschrieben ist, führte zu der Vermutung, dass die L5178Y-Zellen einen MMR-defizienten Phänotyp aufweisen. Dieser MMR-defiziente Phänotyp wurde durch gezielte Behandlung von L5178Y-Zellen und Zellen mit bekanntem MMR-Status mit dem alkylierenden Agenz MNNG und dem anschließenden Vergleich der Reaktionen geprüft und bestätigt. Der Ver-gleich erfolgte durch den Nachweis gentoxischer Effekte im Mikrokern-Test und im Comet Assay. Auf Proteinebene konnte für den gezeigten MMR-defizienten Phänotyp bei den drei wichtigsten, in die MMR involvierten Proteine, MLH1, MSH2 und MSH6 keine Ursa-che gefunden werden: Alle untersuchten Proteine zeigten eine Expression, die mit denen der MMR-profizienten Kontrollzelllinien vergleichbar war. Auf DNA-Ebene wurde durch die Analyse aller bekannter, in die MMR involvierter Gene durch die Sequenzierung der kodierenden Bereiche als wichtigste Verände-rung eine Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 gefunden. Diese führt nach 260 Aminosäuren zu einer Leserasterverschiebung und nach 313 Aminosäuren zu einem Abbruch der Aminosäuresequenz aufgrund eines Stop-Codons. Zwar ist somit die Information für den N-terminalen Bereich von PMS2, der die DNA-Bindedomäne und die ATP-ase aktiven Stellen beinhaltet, vorhanden, die für den C-Terminus hingegen, der für die Dimerisierung mit dem MMR-Protein MLH1 und damit für die Funktion essentiell ist, fehlt. Insgesamt wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die L5178Y-Zelllinie MMR-defizient ist. Mit der Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 wurde eine molekulare Ursache gefunden, die diese Defizienz erklären kann. Daraus folgt für den Einsatz der L5178Y-Zelllinie in Gentoxizitätstests, dass die Berücksichtigung ihrer MMR-Defizienz die Möglichkeit der Bewertung von Testergebnissen erheblich erweitern kann.
Interaktionen zwischen Insekten und Pflanzen können auf chemischen oder mechanischen Faktoren beruhen. Mechanische Faktoren spielen eine besonders wichtige Rolle bei den Fallen karnivorer Pflanzen. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle mechanischer Faktoren in der Interaktion zwischen der Kannenpflanze Nepenthes bicalcarata und der Ameise Camponotus schmitzi aufzuklären, bei der Ameisen Gegenanpassungen zu spezialisierten pflanzlichen Fangstrukturen entwickelt haben. Im Rahmen meiner Arbeit habe ich mich mit den Fragen beschäftigt, 1) welche Kannenstrukturen und welche Mechanismen für den Fang von Arthropoden wichtig sind und 2) welche speziellen Anpassungen C. schmitzi-Ameisen für das Leben auf ihrer karnivoren Wirtspflanze besitzen. Bisher wurde angenommen, dass Nepenthes-Kannen Tiere mit Hilfe von rutschigen Wachskristallschichten fangen. Ich konnte zeigen, dass ein weiterer, bisher unbekannter Fangmechanismus existiert, welcher auf speziellen Oberflächeneigenschaften des Kannenrandes (Peristom) und "Insekten-Aquaplaning" basiert. Das Peristom besitzt eine regelmäßige Mikrostruktur, welche dafür sorgt, dass die Oberfläche vollständig mit Wasser benetzbar ist, so dass sie bei feuchter Witterung von homogenen Flüssigkeitsfilmen überzogen ist. Auf dem trockenen Peristom können Ameisen ohne Schwierigkeiten laufen und Nektar von den am inneren Peristomrand gelegenen Nektarien ernten. Wird die Oberfläche aber beispielsweise durch Regen nass, rutschen die meisten Tiere ab und stürzen in die Kanne. Messungen der Reibungskräfte von Weberameisen (Oecophylla smaragdina) auf dem Peristom von N. bicalcarata zeigten, dass Flüssigkeitsfilme auf der Oberfläche die Anhaftung der Haftorgane (Arolien) verhindern, und dass die Mikrostruktur des Peristoms auch den Einsatz der Krallen unterbindet. Versuche an Nepenthes alata zeigten darüber hinaus, dass dieser Fangmechanismus des Peristoms auch für Nepenthes-Arten mit wachsbereifter Kanneninnenwand essentiell, und die Wachsschicht eher für die Retention gefangener Tiere wichtig ist. Zur Analyse der ökologischen Auswirkungen des "Aquaplaning"-Fangmechanismus habe ich die Peristomfeuchte von Nepenthes rafflesiana var. typica-Kannen zeitgleich mit meteorologischen Daten im Feld kontinuierlich aufgezeichnet und mit Experimenten zur Beurteilung der Fangeffizienz der Kannen kombiniert. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, dass die Kannen abhängig vom Befeuchtungsgrad des Peristoms zeitweise sehr effiziente Fallen mit Fangraten von 80% sein können, während sie zu anderen Zeiten vollkommen ineffizient sind. Die Variation der Peristomfeuchte wird durch Regen, Kondensation und von den Peristomnektarien sezerniertem Nektar verursacht. Es ist zu vermuten, dass die nur zeitweise und unvorhersehbare Aktivierung der Nepenthes-Kannenfallen durch Nässe der Evolution von Vermeidungsstrategien bei Beutetieren entgegenwirkt. Im Rahmen der Untersuchungen, welche mechanischen Anpassungen C. schmitzi-Ameisen für das Leben auf N. bicalcarata besitzen habe ich mich auf die Fragen konzentriert, wie es den Ameisen gelingt den Peristom-Fangmechanismus zu umgehen und welche Anpassungen sie besitzen um in der Kannenflüssigkeit tauchend und schwimmend nach Nahrung zu suchen. Im Gegensatz zu generalistischen Arten stürzen C. schmitzi-Ameisen auf dem nassen Peristom nicht ab. Durch selektive Manipulation der tarsalen Haftstrukturen konnte ich demonstrieren, dass die Arolien für die Peristomlauffähigkeit der C. schmitzi-Ameisen eine wesentliche Rolle spielen. Für das Furagieren in der Kannenflüssigkeit verfügen C. schmitzi-Ameisen über ein sich wiederholendes, stereotypes Verhaltensmuster, welches aus einer Unterwasserlauf- und einer Oberflächenschwimmphase besteht. Meine Untersuchungen dieses Verhaltensmusters zeigten, dass die Ameisen am Ende der Unterwasserlaufphase mit Hilfe ihres stets vorhandenen Auftriebs zur Flüssigkeitsoberfläche aufsteigen. Dabei taucht ein Teil ihres Hinterleibs aus der Kannenflüssigkeit auf, was den Ameisen die Sauerstoffaufnahme aus der Luft ermöglicht. Nach dem Auftauchen schwimmen C. schmitzi-Ameisen mittels schneller Beinbewegungen an der Oberfläche der Kannenflüssigkeit. Dabei ähnelt die Bewegungskoordination ihrer Beine dem bei Ameisen für die Fortbewegung an Land typischen Dreifußgang. Ein Vergleich der Kinematik von schwimmenden und laufenden C. schmitzi-Ameisen hat gezeigt, dass schwimmende Ameisen ihre Beine in der Schlagphase mit einer höheren Winkelgeschwindigkeit als in der Rückholphase bewegen, während dies bei den laufenden Tieren genau umgekehrt ist. Ferner strecken schwimmende Ameisen ihre Beine während der Schlagphase weiter aus als in der Rückholphase, wohingegen laufende Ameisen in beiden Bewegungsphasen vergleichbare Beinradien aufweisen. Dies lässt den Schluss zu, dass die Schwimmkinematik der C. schmitzi-Ameisen eine abgewandelte Form ihrer Laufkinematik darstellt, welche für die Erzeugung von Vortrieb im Wasser optimiert wurde.
Vertebrate and invertebrate visual systems exhibit similarities in early stages of visual processing. For instance, in the human brain, the modalities of color, form and motion are separately processed in parallel neuronal pathways. This basic property is also found in the fly Drosophila melanogaster which has a similar division in color- sensitive and (color blind) motion-sensitive pathways that are determined by two distinct subsets of photoreceptors (the R1-6 and the R7/8 system, respectively). Flies have a highly organized visual system that is characterized by its repetitive, retinotopic organization of four neuropils: the lamina, the medulla, the lobula and the lobula plate. Each of these consists of columns which contain the same set of neurons. In the lamina, axon bundles of six photoreceptors R1-6 that are directed towards the same point in space form columnar structures called cartridges. These are the visual sampling units and are associated with four types of first-order interneuron that receive common input from R1-6: L1, L2, L3 and the amacrine cells (amc, together with their postsynaptic partner T1). They constitute parallel pathways that have been studied in detail at the anatomical level. Little is known, however, about their functional role in processing behaviorally relevant information, e.g. for gaze stabilization, visual course control or the fixation of objects. The availability of a variety of neurogenetic tools for structure-function analysis in Drosophila allowed first steps into the genetic dissection of the neuronal circuitry mediating motion and position detection. In this respect, the choice of the effector turned out to be crucial. Surprisingly, it was found that the clostridial tetanus neurotoxin failed to block mature Drosophila photoreceptor synapses, but caused irreversible damage when expressed during their development. Therefore, the dominant-negative shibire allele shits1 which turned out to be better suited was used for blocking lamina interneurons and thereby analyzing the necessity of the respective pathways. To determine whether the latter were also sufficient for the same behavioral task, the inverse strategy was developed, based on the fact that lamina interneurons express histamine receptors encoded by the ort gene. The specific rescue of ort function in defined channels in an otherwise mutant background allowed studying their sufficiency in a given task. Combining these neurogenetic methods with the optomotor response and object induced orientation behavior as behavioral measures, the aim of the present thesis was to answer the following questions: (a) Which pathways feed into elementary motion detectors and which ones are necessary and/or sufficient for the detection of directional motion? (b) Do pathways exist which specifically mediate responses to unidirectional motion? (c) Which pathways are necessary and/or sufficient for object induced orientation behavior? Some basic properties of the visual circuitry were revealed: The two central cartridge pathways, represented by the large monopolar cells L1 and L2, are key players in motion detection. Under a broad range of stimulatory conditions, the two subsystems are redundant and are able to process motion independently of each other. To detect an impairment when only one of the pathways is intact, one has to drive the system to its operational limits. At low signal to noise ratios, i.e. at low pattern contrast or low background illumination, the L2 pathway has a higher sensitivity. At intermediate pattern contrast, both pathways are specialized in mediating responses to unidirectional motion of opposite stimulus direction. In contrast, neither the L3, nor the amc/T1 pathway is necessary or sufficient for motion detection. While the former may provide position information for orientation, the latter has a modulatory role at intermediate pattern contrast. Orientation behavior turned out to be even more robust than motion vision and may utilize a less sophisticated mechanism, as it does not require a nonlinear comparison of signals from neighboring visual sampling units. The position of objects is processed in several redundant pathways, involving both receptor subsystems. The fixation of objects does not generally require motion vision. However, motion detection improves the fixation of landmarks, especially when these are narrow or have a reduced contrast.