Kathrin Leonie Heise

• Tumorzellen, Stromazellen, Extrazellulärmatrix (EZM) und lösliche Faktoren in der Tumormikroumgebung beeinflussen und verstärken sich gegenseitig in der Ausbildung eines malignen Phänotyps. Sowohl die fibrotische EZM als auch eine kleine Subpopulation von pluripotenten Tumorstammzellen sind bekanntermaßen für die Steigerung der Tumoraggressivität verantwortlich. Inwiefern diese beiden unabhängigen Faktoren im Kontext von Brustkrebs miteinander in Beziehung stehen, ist jedoch bis heute unklar. Um untersuchen zu können, welchen BeitragTumorzellen, Stromazellen, Extrazellulärmatrix (EZM) und lösliche Faktoren in der Tumormikroumgebung beeinflussen und verstärken sich gegenseitig in der Ausbildung eines malignen Phänotyps. Sowohl die fibrotische EZM als auch eine kleine Subpopulation von pluripotenten Tumorstammzellen sind bekanntermaßen für die Steigerung der Tumoraggressivität verantwortlich. Inwiefern diese beiden unabhängigen Faktoren im Kontext von Brustkrebs miteinander in Beziehung stehen, ist jedoch bis heute unklar. Um untersuchen zu können, welchen Beitrag Tumorzellen, Stromazellen, EZM und lösliche Faktoren einzeln und im Zusammenspiel zur Malignität eines Tumors leisten, ist die Entwicklung geeigneter in-vitro-Modelle unabdingbar. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, ein 3D-Mikrotumormodell zu generieren, in dem eine Analyse dieser genannten Faktoren stattfinden könnte. An diesem Modell wurden darüber hinaus erste Untersuchungen von im Tumorkontext bekannten EZM-Proteinen durchgeführt. Um die dreidimensionale Anordnung von Tumorzellen und ihrer Gewebeumgebung adäquat wiedergeben zu können, beinhalteten die 3D-Tumorsphäroide sowohl Brustkrebszellen (MDA-MB-231) als auch Stromazellen (hASCs). Die EZM als wichtiger Bestandteil der (Tumor-) Mikroumgebung sollte übersichtshalber durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung und detaillierter durch immunhistochemische Analyse nach zwei verschiedenen Kulturzeitpunkten charakterisiert werden, um EZM-Veränderungen im zeitlichen Verlauf darzustellen. Im Fokus der Analyse standen die beiden wichtigsten profibrotischen EZM-Proteine Fibronektin und Kollagen I, die maßgeblich an der Pathogenese von Brustkrebs beteiligt sind. Zudem wurde das Vorkommen des Myofibroblastenmarkers α-SMA untersucht. An den Sphäroiden einer Kontrollgruppe, die lediglich hASCs beinhaltete, sollte vergleichend eine Analyse der genannten EZM-Proteine sowie α-SMA durchgeführt werden. Um schließlich den Einfluss der von Tumorzellen sezernierten löslichen Faktoren in der Tumormikroumgebung herauszustellen, wurden Sphäroide aus hASCs in tumorkonditioniertem Medium gezüchtet und darin ebenfalls Matrixproteine und α-SMA untersucht. Abschließend erfolgte eine Korrelation der EZM-Analyse mit dem Vorhandensein von Tumorstammzellen in den 3D-Tumorsphäroiden. Dafür wurden die Tumorstammzellen mithilfe eines GFP-basierten Reporters für den Stammzellmarker NANOG (NANOG-GFP-Reporterzelllinie) in mikroskopischen Aufnahmen der 3D-Tumorsphäroide nachgewiesen und im Kontext mit der EZM lokalisiert.…
• Tumor cells, stromal cells, extracellular matrix (ECM), and soluble factors in the tumor microenvironment interact and potentiate mutually in the evolution of the malignant phenotype. Both fibrotic ECM as well as a small subpopulation of pluripotent tumor stem cells are well-known to enhance tumor aggressiveness. To what extend these independent factors interact with each other in the context of breast cancer is, however, unknown. In order to investigate in what ways tumor cells, stromal cells, ECM, and soluble factors enhance malignancyTumor cells, stromal cells, extracellular matrix (ECM), and soluble factors in the tumor microenvironment interact and potentiate mutually in the evolution of the malignant phenotype. Both fibrotic ECM as well as a small subpopulation of pluripotent tumor stem cells are well-known to enhance tumor aggressiveness. To what extend these independent factors interact with each other in the context of breast cancer is, however, unknown. In order to investigate in what ways tumor cells, stromal cells, ECM, and soluble factors enhance malignancy individually or in combination it is necessary to establish suitable in vitro models. Thus, the objective of this work was to generate a 3D microtumor model that could allow an analysis of these factors. Furthermore, initial investigations were made on those ECM proteins that are known for their significant role in tumors. To capture and reflect the three-dimensional structure of tumor cells and their microenvironment adequately the 3D tumor spheroids were produced from both breast cancer cells (MDA-MB-231) and from stromal cells (hASCs). The ECM being a pivotal component of the (tumor-) microenvironment was characterized by haematoxylin and eosin staining and more detailed by immunohistochemical analysis after two different culturing periods to outline the ECM alterations in the course of time. The focus was on the two most important profibrotic ECM proteins, fibronectin and collagen I, which are substantially involved in the pathogenesis of breast cancer. Furthermore, we evaluated the occurrence of the myofibroblastic marker α-SMA. With the help of spheroids of a control group containing solely hASCs we processed a comparative analysis of the above-mentioned ECM proteins as well as α-SMA. In order to expose the influence of soluble factors secreted by tumor cells in the tumor microenvironment we furthermore produced spheroids in tumor conditioned medium and again analyzed the matrix proteins and α-SMA. Finally, we investigated the correlation of ECM analysis with the occurrence of tumor stem cells in our 3D tumor spheroids. With the help of a GFP-based reporter cell line for the stem cell marker NANOG, we detected tumor stem cells and observed them being co-localized with ECM proteins in microscopic images.…