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Parasitäre Protozoen wie Leishmanien, Trypanosomen und Plasmodien weisen eine Vielzahl von Cystein-Proteasen der Papainfalimilie (CAC1) auf, welche als Pathogenitäts- und Virulenzfaktoren identifiziert werden konnten. Die aktuell eingesetzten Medikamente zur Behandlung der von diesen Parasiten hervorgerufenen Infektionskrankheiten (Leishmaniose, Afrikanische Schlafkrankheit, Chagas-Krankheit, Malaria) sind aufgrund von Nebenwirkungen, hohen Kosten und sich entwickelnden Resistenzen suboptimal. Die parasitären Cystein-Proteasen stellen daher potentielle Targets zur Entwicklung neuer Therapieansätze dar. Das angestrebte Ergebnis der Entwicklung ist es, selektive Inhibitoren der parasitären Proteasen zu entwickeln, während die Wirt-Proteasen unbeeinflusst bleiben.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Optimierung der literaturbekannten Aziridin-2,3-dicarboxylat-basierten Inhibitoren RV122C (Boc-(S)-Leu-(R)-Pro-(S,S)-Azi(OBn)2) und RV212C (Boc-(R)-Leu-(S)-Pro-(S,S)-Azi(OBn)2) sowie des Michael-Akzeptor-basierten Inhibitors 16a (Boc-(S)-Phg-(S)-vGln(Trt)-OEt) hinsichtlich ihrer selektiven inhibitorischen Aktivität an parasitären Cystein-Proteasen. Bei allen synthetisierten Verbindungen handelt es sich um potenziell irreversible, kovalente und kompetitive Inhibitoren. Der Aziridinring und das Michael-System stellen elektrophile Bausteine dar, die von dem nucleophilen Thiolatrest des aktiven Zentrums einer Cystein-Protease angegriffen werden und in der irreversiblen Alkylierung des aktiven Zentrums resultieren. Die Testung der synthetisierten Verbindungen erfolgte mittels fluorimetrischer und photometrischer Enzymassays. Zur Evaluierung der biologischen Aktivitäten wurden ggf. weitere biologische Testungen durchgeführt.
Die Leitstrukturen RV122C und RV212C der Aziridinylpeptide wurden als Inhibitoren von Proteasen der Cathepsin-L-Subfamilie identifiziert. Eine zweite Serie von Stereo- und Konstitutionsisomeren von RV122C und RV212C brachte ein Derivat hervor, CS09 (Boc-(S)-Leu-(R)-Pro-(R,R)-Azi(OBn)2), welches selektive Inhibition von parasitären Cystein-Proteasen aufwies, ohne humanes Cathepsin L zu hemmen. Neben leishmanizider Aktivität weisen sowohl RV122C und RV212C als auch CS09 keine Toxizität an den eingesetzten Zelllinien auf. Daher erfolgte die Fokussierung auf Untersuchungen in Leishmania major zur detaillierten Aufklärung zellulärer Effekte in vitro und in vivo. Der ausgelöste Zelltot wurde als Apoptose-ähnlich charakterisiert, welcher durch unvollständige Verdaunung in Lysosom-ähnlichen Vakuolen hervorgerufen wurde. In-vivo-Untersuchungen im Mausmodell zeigten, dass es das Ziel sein muss, Inhibitoren mit Selektivität insbesondere für die Cathepsin-B-ähnliche LmajcatB zu entwickeln. Ausgehend von CS09 als neue Leitstuktur wurden verschiedene Variationen zur Strukturoptimierung vorgenommen, um im Anschluss Struktur-Wirkungs-Beziehungen ableiten zu können.
Die Synthese erfolgte mittels Fragmentkupplung der zuvor stereoselektiv dargestellten Aziridin-Bausteine und der durch Standard-Peptidkupplungsreagenzien erhaltenen Aminosäure/Peptidbausteine. Die N-Acylierung wurde mittels des Kupplungsreagenzes PPA optimiert. Schließlich wurden die Verbindungen an den Cystein-Proteasen Cathepsin L, Cathepsin B, Cathepsin K, Cathepsin S, LmCPB2.8, LmajcatB, Rhodesain, Cruzain und Falcipain-2 auf ihre inhibitorische Aktivität getestet. Weiterhin wurden die Verbindungen im Rahmen der interdisziplinären Zusammenarbeit innerhalb des Sonderforschungsbereichs 630 auf ihre antiparasitäre Aktivität an Leishmanien, Trypanosomen und Plasmodien sowie auf ihre Cytotoxizität an der Makrophagenzelllinie J774.1 getestet. Vertreter dieser Serie erwiesen sich, ebenso wie CS09, als selektive Inhibitoren parasitärer, Cathepsin-L-ähnlicher Proteasen (LmCPB2.8, Rhodesain, Cruzain) und der Cathepsin-B-ähnlichen Protease (LmajcatB). Sehr gute Hemmung der Cathepsin-L-ähnlichen Protease LmCPB2.8 riefen Stereo- und Konstitutionsisomere von CS09 hervor, als auch Derivate, bei denen der Leucinrest gegen andere lipophile Reste mit ähnlichem oder größerem sterischen Anspruch substituiert ist. Die beste Inhibition des Cathepsin-B-ähnlichen Enzyms erfolgte durch Konstitutionsisomere von CS09 und durch Aziridinylpeptide, deren Prolinrest gegen einen Ornithin- oder einen Argininrest ersetzt wurde. Besonders hervor sticht CS25 (Boc-(S)-Ile-(R)-Pro-(R,R)-Azi(OBn)2), sich auszeichnend durch selektive Inhibition der LmajcatB (neben Cathepsin S) bei sehr guter leishmanizider Aktivität. Auch zeigen einige Vertreter selektive Hemmung von Rhodesain und/oder Cruzain. Mithilfe eines synthetisierten Aziridinylpeptids, welches bromierte Benzylesterreste trägt und sehr gute Hemmeigenschaften an parasitären Cystein-Proteasen aufweist (CS38), sollte die Kristallisation mit Rhodesain erfolgen, um die erste Röntgenstruktur eines Enzym-Aziridin-Inhibitor-Komplexes zu erhalten. Dieses Ziel konnte jedoch nicht realisiert werden. Aufgrund fehlender Röntgenstrukturen von Enzym-Inhibitor-Komplexen ist die Bindung der synthetisierten Inhibitoren noch immer spekulativ. Dockingstudien an Cruzain schlagen verschiedene Bindemodi vor, bei denen zwei von drei lipophilen Resten die hydrophoben S2- und S1´-Bindungstaschen adressieren. Die Mehrzahl der Aziridin-basierten Verbindungen konnte als leishmanizide und/oder trypanozide Verbindungen identifiziert werden. Mithilfe eines Biotin-markierten Derivats von RV122C (CS39) konnte durch active-site labeling nachgewiesen werden, dass Cystein-Proteasen von L.-major-Promastigoten die Targets des Inhibitors sind. Active-site-labeling und Untersuchungen durch Fluoreszenzaktivitätsassays mit L.-major-Promastigotenlysaten machten deutlich, dass bei Einsatz von RV122C und RV212C Cathepsin-B-ähnliche Proteasen beeinflusst werden. CS09 wies einen anderen Wirkmechanismus – ähnlich dem von E-64 – auf, wie Fluoreszenzaktivitätsassays zeigten. Hinsichtlich der Aufklärung dieser zellulären Effekte und zur Identifizierung weiterer möglicher Targets wurde ein Fluoreszenzfarbstoff-markierter Aziridin-Inhibitor (CS40) dargestellt. CS40 wies hervorragende Hemmeigenschaften an den isolierten Enzymen auf, war jedoch für In-vitro-Untersuchungen ungeeignet, da weder leishmanizide noch trypanozide Aktivität vorlagen. Durch antiplasmodiale Wirkung ist CS40 lediglich zu In-vitro-Studien an Plasmodien einsetzbar.
Für In-vitro-Studien wurde zur Aufklärung des Wirkmechanismus der Aziridin-2,3-dicarboxylat-basierten Inhibitoren der literaturbekannte, für Cathepsin-L-ähnliche Enzyme selektive, Epoxid-basierte Standardinhibitor CLIK-148 als Vergleichssubstanz dargestellt. Zum Beweis der Inaktivität des Diastereomers von CLIK-148 mit (R,R)-konfiguriertem Epoxidring wurde zudem das Derivat CS41 synthetisiert.
Die Synthese hierzu erfolgte zunächst über die stereoselektive Darstellung der trans-konfigurierten Diethyloxiran-2,3-dicarboxylate, die nach Verseifung der Ethylesterfunktionen mittels Peptidkupplungsreagezien mit den entsprechenden Aminen gekuppelt wurden.
Zur Ableitung der Struktur-Wirkungs-Beziehung von Michael-Akzeptor-basierten Verbindungen wurde die Leitstruktur 16a durch Variation der Konfigurationen sowie durch Substitution der Trityl-Schutzgruppe der Glutaminseitenkette durch sterisch weniger anspruchsvolle Schutzgruppen verändert. Die Synthese erfolgte ausgehend von der Darstellung des entsprechenden Dipeptids mit Methylesterschutzgruppen. Ausgehend davon wurden die Methylesterreste entweder mit DIBAL zum entsprechenden Aldehyd reduziert oder aus Gründen der Praktikabilität zum entsprechenden Alkohol reduziert, um anschließend in einer Swern-Oxidation den Aldehyd zu liefern. Die Aldehyde wurden im finalen Schritt in einer Masamune-Reaktion mit Triethylphosphonoacetat zu den vinylogen Dipeptidestern umgesetzt.
Die Stereoisomere CS42 und CS43 mit Tritylresten an der Glutaminseitenkette sind unspezifische, starke Inhibitoren humaner und parasitärer Enzyme. In vitro zeigten sie starke Hemmung des Parasiten-Wachstums als auch Cytotoxizität an Makrophagen. Die Verbindungen ohne Tritylrest (CS44, CS45) erwiesen sich weder als Proteaseinhibitoren, noch in vitro als wirksam.
Ferner wurden mit den synthetisierten Verbindungen in interdisziplinären Kooperationen weitere biologische Testungen durchgeführt. In Selektivitätsstudien an den Aspartat-Proteasen Plasmepsin II und IV erwiesen sich die getesteten trans-konfigurierten Aziridin-basierten Inhibitoren als inaktiv, während die Leitstruktur der Michael-Akzeptor-basierten Inhibitoren 16a sowie deren Distereomer CS42 (= 16b) als Inhibitoren von Plasmepsin IV identifiziert werden konnten. Weder in Testungen an Plasmodium berghei infizierten humanen Hepatomzellen in Leberstadien, noch im Blut-Hirn-Schrankenmodell einer Trypanosoma-brucei-gambiense-Infektion sowie im In-vitro-Screening an Trichomonas vaginalis zeigten die jeweils getesteten Verbindungen Aktivität. Allein die Aziridin-2,3-dicarboxylat-basierten Cystein-Protease-Inhibitoren wiesen Wirksamkeit bezüglich des Wachstums von Schistosoma mansoni auf. In einem visuellen Phänotyp-Screening inhibierte eine Vielzahl der getesteten Verbidungen das Wachstum der jungen Form (Schistosomula), im zweiten Schritts des In-vitro-Screenings zeigte sich jedoch keine Verbindung aktiv an der adulten Form (Schistosomen) des Parasiten.
Die durch Polyethylenabrieb bedingte Osteolyse trägt wesentlich zur Lockerung der Hüftgelenkendoprothese bei. Das Ziel der vorliegenden retrospektiven Studie war, den Einfluß der Patientenaktivität auf den Polyethylenabrieb zu bestimmen.
Es wurden 104 gut funktionierende primär implantierte Hüftgelenkprothesen [HG®-Pfanne, konventionelles PE, 28 mm Keramikköpfe] mittels Abriebmessungen [HipAnalysisSuite®Version 8.0.4.3] an 1203 Röntgenaufnahmen über durchschnittlich 12 Jahre untersucht.
Die Aktivität der durchschnittlich 58-jährigen Patienten wurde mit speziellen Fragebögen und einem Accelerometer bestimmt. Die Hochrechnung auf ein Jahr ergab 1,8 Millionen Lastwechsel im Durchschnitt und durchschnittlich 17 Stunden Aktivität pro Tag. Dabei zeigten die Messinstrumente HHS, Aktivitätseinschätzung
durch den Arzt, Gehstrecke, UCLA und TWB ansteigende Korrelationen zu den durchschnittlichen absoluten Lastwechseln pro Tag. Es zeigte sich eine durchschnittliche jährliche lineare Abriebrate von 0,1 mm, die zu 18 % von der Aktivität beeinflußt wurde und eine jährliche volumetrische Abriebrate von durchschnittlich 53 mm³, die zu 19 % von den durchgeführten Lastwechseln beeinflußt wurde. Klinische Faktoren wie Gewicht, Geschlecht, Alter bei Operation
oder Pfannenposition zeigten dagegen keine Korrelation zur
Abriebrate. Für die durchschnittlichen Lastwechsel im mittleren Aktivitätsniveau und die absoluten Lastwechsel in Kombination mit dem PeakActivityIndex ermittelte sich eine Prädiktion für das Risiko einer jährlichen linearen Abriebrate von mehr als 0,15 mm von 78%.
Diese Langzeitstudie etabliert eine direkte Korrelation zwischen der Patientenaktivität und dem Polyethylenabrieb und die untersuchte Gleitpaarung zeigte gute Langzeitergebnisse bei durchschnittlicher Aktivität berenteter Patienten. Die dem Operateur zur Verfügung
stehenden Messinstrumente, um die Patientenaktivität einzuschätzen, sind allenfalls begrenzt geeignet, die Patientenaktivität zu beurteilen. Der Operateur kann den Einfluss der Patientenaktivität auf die jährliche Abriebrate nur durch die Wahl der bestmöglichen Gleitpaarung minimieren.
Die Kontrolle der monoallelen Expression, antigenen Variation und Entwicklung in Trypanosoma brucei
(2013)
Die ausschließliche Expression von nur einem Gen aus einer großen Genfamilie ist ein weit verbreitetes Phänomen, das als monoallele Expression bezeichnet wird. In dem Blutparasiten Trypanosoma brucei stellt die Expression eines einzigen variablen Oberflächenglykoproteins (VSG) aus einem Repertoire von über 1000 verschiedenen Genen die Grundlage für die Immunevasion dar. Durch einen periodischen Wechsel der VSG Expression (Antigene Variation) bleibt der Parasit vom Immunsystem des Wirtes unerkannt. Die VSG Gene werden aus telomerischen Blutstromform Expressionsstellen (BES) transkribiert, von denen nur eine zu einem bestimmten Zeitpunkt aktiv ist. Die Kontrolle der monoallelen VSG Expression ist somit einer der wichtigsten Virulenzfaktoren von T. brucei.
Ziel dieser Arbeit war es, die Vorgänge eines transkriptionellen Wechsels zwischen zwei BESs zu beschreiben. Das Ausschalten des aktiven VSGs durch RNA-Interferenz hatte zuvor gezeigt, dass dies nicht zu einer erhöhten Wechselrate führt. Es wurde daher untersucht, welche Auswirkungen das Anschalten einer zweiten BES auf die monoallele Expression hat. Da es bisher keine Möglichkeit gibt, eine inaktive BES gezielt zu aktivieren, wurde ein artifizielles System gewählt, das die gezielte induzierbare Expression eines Gens ermöglicht. Die BESs unterscheiden sich in der Anzahl und Zusammensetzung der Expressionsstellen-assoziierte-Gene (ESAGs), jedoch besitzt jede BES ein telomernahes VSG. Somit wird, bei einer BES Aktivierung, in jedem Fall ein neues VSG exprimiert. Durch die induzierbare Expression eines zweiten VSGs wurde so das Anschalten einer neuen BES simuliert. Mithilfe dieses Systems konnte gezeigt werden, dass das VSG selbst für die Kontrolle der monoallelen Expression verantwortlich ist. Die ektopische Überexpression eines zweiten VSGs führte zu einer graduellen Inaktivierung der BES. Infolge dessen verlangsamte sich der Zellzyklus und die Zellen verblieben bis zu fünf Tage in einem ruhenden Zustand. Genauere Analysen dieses Zustandes zeigten, dass es sich hierbei um ein bisher unbekanntes, reversibles Zwischenstadium zwischen proliferierenden sogenannten Long Slender und arretierten sogenannten Short Stumpy Formen handelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit führten zu einem neuen Modell, das die Kontrolle der monoallelen VSG Expression mit der Entwicklung der Trypanosomen mechanistisch verbindet.
Modifikation von Titanoberflächen mittels elektrochemischer Abscheidung von Magnesiumphosphaten
(2013)
In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, die experimentellen Parameter für eine erfolgreiche elektrochemische Abscheidung sowohl von Struvit (MgNH4PO4 • 6H2O) als auch Newberyit (MgHPO4 • 3H2O) auf durch Sandstrahlen aufgeraute Titanproben zu ermitteln. Welche der beiden Phasen auf den Titanoberflächen abgeschieden wurde, hing dabei hauptsächlich von der jeweiligen Elektrolytzusammensetzung ab. Bei der Elektrodeposition selbst erwiesen sich eine Elektrolyttemperatur von 50 °C und Stromdichten von etwa 79 – 105 mA/cm2 als optimal, um geschlossene Schichten von hinreichender Dicke reproduzierbar herzustellen. Es zeigte sich, dass die für die jeweiligen Abscheidungsprodukte optimierten Parameter (79 mA/cm2 für Struvit und 105,3 mA/cm2 für Newberyit) zu deutlich unterschiedlichen Massenabscheidungen (4,4 mg/cm2 für Struvit und 0,6 mg/cm2 für Newberyit bei einer Beschichtungsdauer von 15 min) führten. Das Monohydrat Dittmarit (MgNH4PO4 • H2O) ließ sich nicht direkt abscheiden, konnte aber durch Dampfsterilisation von zuvor erzeugten Struvitschichten in einem Autoklaven erzeugt werden.
Um das Verhalten der Oberflächenmodifikationen in einer in-vivo-Umgebung zu simulieren, wurden die Beschichtungen für eine maximale Dauer von 14 Tagen in Simulated Body Fluid (SBF), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) und in fötalem Kälberserum (FCS) eingelagert. In bestimmten Zeitabständen wurden eingelagerte Proben ihrem Medium entnommen, getrocknet und die Schichten mit Hilfe der Röntgendiffraktometrie und der Rasterelektronen-mikroskopie hinsichtlich ihrer kristallographischen und morphologischen Eigenschaften charakterisiert. Dabei zeigten die drei Magnesiumphosphate jeweils unterschiedliches Degradationsverhalten in den verschiedenen Einlagerungsmedien. Struvit wandelte sich nach 14 Tagen in DMEM teilweise, in FCS größtenteils und in SBF vollständig zu Bobierrit (Mg3(PO4)2 • 8H2O) um. Ein ähnliches Verhalten zeigte sich bei Dittmarit, allerdings kam es hier in allen Medien zur Bildung einer weiteren Phase (Tri-Magnesium-Di-Phosphat-5-Hydrat, Mg3(PO4)2 • 5H2O), in FCS bildete sich zusätzlich noch Di-Magnesiumphosphathydroxid-4-Hydrat (Mg2PO4OH • 4H2O). Die Newberyit-Schichten hingegen zeigten keinerlei Phasenumwandlungen, lösten sich aber in den Einlagerungsversuchen teilweise auf.
Diese Ergebnisse zeigen, dass elektrochemisch erzeugte Beschichtungen auf Magnesiumphosphatbasis durchaus vielversprechend im Hinblick auf die funktionelle Modifikation metallischer Implantatoberflächen sind. Neben den literaturbekannten positiven Eigenschaften der Magnesiumphosphate (gute Zytokompatibilität, hohe Löslichkeit und mechanische Festigkeit) ist für zukünftige Forschungen vor allem das in dieser Arbeit untersuchte Degradationsverhalten von Interesse. Die in fast allen untersuchten Kombinationen aus Schichtmodifikation und Einlagerungsmedium auftretenden Phasenumwandlungen weisen auf durch die physiologische Umgebung hervorgerufene Resorptionsprozesse hin, die wiederum in vivo die Osteointegration des Implantats unterstützen könnten.
Ein weiterer Aspekt zukünftiger Untersuchungen ist die mögliche Beladung der biokompatiblen Schichten mit bioaktiven Substanzen (antibakterielle oder osteointegrative Wirkstoffe sowie Metallionen zur Unterstützung bzw. Steuerung biologischer Prozesse im implantatnahen Bereich). Hier könnten die unterschiedlichen Degradationsmechanismen der verschiedenen untersuchten Magnesiumphosphat-Modifikationen die Grundlage für kontrollierte und maßgeschneiderte Freisetzungskinetiken liefern.
Etwa zwei Drittel der Tumorpatienten sind im Laufe ihrer Erkrankung Schmerzen ausgesetzt, die ihre Lebensqualität nachhaltig beeinträchtigen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Zusammenhang zwischen der Häufigkeit und der Intensität von Schmerz und dem Vorliegen von psychischen Komorbiditäten (Depressivität, Angst), sozialer Unterstützung und soziodemographischen und medizinischen Merkmalen bei Tumorpatienten zu untersuchen.
Im Rahmen einer Querschnittsstudie wurden 770 Patienten mit Krebserkrankungen konsekutiv rekrutiert. Die Häufigkeit und Intensität von Schmerzepisoden wurden anhand eines Selbstbeurteilungsfragebogens zum subjektiven Schmerzerleben gemes-sen. Weiterhin wurden standardisierte und validierte Screeningfragebögen zur De-pressivität (PHQ), Angstsymptomatik (GAD) sowie sozialen Unterstützung (SSUK) eingesetzt. Soziodemografische Merkmale wurden anhand eines standardisierten Fra-gebogens erhoben, medizinische Merkmale auf der Basis der Krankenakte des Patien-ten. Das Composite International Diagnostic Interview (M-CIDI) in der DIA-X-Version wurde zur Diagnostik psychischer Störungen nach den Kriterien der ICD-10 benutzt.
Es wurden Regressionsanalysen mit den Prädiktoren Geschlecht, Alter, Tumorstadi-um, Metastasierung, Depressivität (PHQ), Ängstlichkeit (GAD), soziale Unterstüt-zung (SSUK) durchgeführt, um den quantitativen Einfluss dieser Variablen auf die Schmerzhäufigkeit und die Schmerzintensität zu bestimmen.
Die 770 Patienten setzten sich aus 407 (52,9 %) Frauen und 363 (47,1 %) Männern zusammen. Das durchschnittliche Alter der Gesamtstichprobe betrug 57,1 Jahre.
36,5 % der Patienten gaben aktuelle Schmerzen im Zusammenhang mit der Krebser-krankung an. Der Mittelwert der durchschnittlich angegebenen Schmerzintensität der aktuellen Woche betrug 4,3 (NRS). 62,5 % der Stichprobe wiesen eine zumindest leichte Depressivität auf (PHQ), und 49,3 % eine zumindest leichte Ängstlichkeit (GAD).
Die Analyse der das Vorhandensein von Schmerz beeinflussenden Faktoren ergab ei-nen signifikanten Effekt für Metastasierung, Depressivität und Ängstlichkeit. Kein signifikanter Zusammenhang wurde für die Parameter Geschlecht und soziale
Unterstützung gefunden. Der Zusammenhang zwischen der Tumorgröße und der Häufigkeit von Schmerz erreichte im Gegensatz zu der univariaten Auswertung keine Signifikanz in der multivariaten Auswertung.
In Bezug auf die Schmerzintensität konnte für die Tumorgröße und die Depressivität ein signifikanter Zusammenhang gezeigt werden. Im Gegensatz zur univariaten Aus-wertung fiel bei der multivariaten Analyse auf, dass Angst nicht signifikant mit der Schmerzintensität korrelierte. Weiterhin konnte kein signifikanter Zusammenhang mit dem Geschlecht, der Metastasierung und der sozialen Unterstützung gefunden werden.
Die Ergebnisse stehen teilweise im Einklang mit denen in der Literatur aufgeführten Studien. Die in dieser Studie gewonnenen Erkenntnisse belegen eindrücklich die Auswirkungen von Schmerz bei Tumorpatienten. Die genaue Kenntnis der Einfluss-faktoren von Schmerz und deren Effekt auf psychische Komorbiditäten sind für eine umfassendere und effizientere Betreuung der Krebspatienten vonnöten. Eine konse-quentere Einbeziehung des Schmerzes und seiner Auswirkungen in klinisch-therapeutische Bereiche wäre für die Optimierung der Versorgungsqualität der Pati-enten in Zukunft wünschenswert.
Pathomechanismen von Antikörpern gegen Aquaporin 4 in einem Tiermodell für die Neuromyelitis Optica
(2013)
Die Neuromyelitis Optica (NMO) ist eine schwerwiegende autoimmune Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), die mit rezidivierenden Optikusneuritiden und Querschnittsmyelitiden einhergeht. Als serologischer Biomarker wurden Autoantikörper gegen Aquaporin 4 (anti-AQP4-AK) identifiziert. Mit Hilfe eines passiv-Transfer Rattenmodelles mit implantierten intrathekalen Kathetern wurden aufgereinigte IgG Fraktionen (NMO-IgG) von Plasmapheresematerial anti-AQP4-AK positiver NMO Patienten verabreicht. Zum Nachweis der Antigen-Spezifität wurden in weiteren Versuchsgruppen rekombinante IgG-AK gegen AQP4 appliziert. Die repetitive Injektion von NMO-IgG oder anti-AQP4-AK führte zu einer signifikanten klinischen Verschlechterung und einer reduzierten motorischen Leistungsfähigkeit der Versuchstiere im Vergleich zu Kontrollen. Mittels Magnetresonanztomographie konnten exemplarisch Kontrastmittel-aufnehmende Läsionsareale im Rückenmark der Versuchstiere im Bereich der Katheterspitze detektiert werden. Histopathologisch zeigte sich in diesen Läsionsbereichen eine Anreicherung von intrathekal applizierten humanen IgG, ein Verlust der Expression von AQP4 und des Glutamattransporters EAAT2. Im Gegensatz zu der bisher bekannten, Komplement-induzierten Gewebedestruktion bei NMO-Patienten mit entzündlichen Läsionen wurde hier keine Depletion von Astrozyten oder Komplementaktivierung beobachtet. Stattdessen kam es in den hier beschriebenen Arealen mit IgG-Ablagerung zu einer Hypertrophie und Vermehrung der GFAP-positiven Astrozyten. Die Ergebnisse lassen auf eine pathophysiologisch relevante, intrinsische und komplement-unabhängige Wirkung von anti-AQP4-AK schließen.
Mukoviszidose als häufigste der seltenen Erkrankungen ist trotz intensiver For-schung und Behandlungsmöglichkeiten nach wie vor mit einer deutlich verkürzten Lebenserwartung assoziiert. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass körperliche Aktivität einen wichtigen Beitrag nicht nur zur Lebensqualität von Mukoviszidosepatienten leisten kann, sondern auch einen Einfluss auf den Krankheitsverlauf als solches hat. Die genauen Mechanismen des positiven Effekts von Sport auf den Krankheitsverlauf sind jedoch noch nicht hinreichend geklärt. Neben vielen anderen Mechanismen wie verbesserter Sekretelimination aus den Atemwegen, Training des Herz-Kreislaufsystems und Regulierung der überaktiven epithelialen Natriumkanäle wird zunehmend auch ein Anstoßen von Reparaturmechanismen durch Sport diskutiert. Dabei scheinen CD34+-Progenitorzellen und MSCs eine Rolle spielen zu können.
In der hier vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwiefern eine maximale Aus-dauerbelastung die Anzahl zirkulierender CD34+-Progenitorzellen und mesen-chymaler Progenitorzellen im peripheren Blut verändert, was sekundär mit Repa-raturvorgängen im Lungengewebe assoziiert sein könnte. Hierfür wurde bei 7 Patienten mit Mukoviszidose sowie 9 gesunden Probanden eine Spiroergometrie bis zur subjektiven Erschöpfung und vor sowie zehn Minuten nach Beendigung der Aktivität eine Blutentnahme durchgeführt. Neben einer Analyse des Blutbildes inklusive Differenzierung und Bestimmung von Entzündungsparametern erfolgte mittels Durchflusszytometrie die Quantifizierung von CD34+ und mesenchymalen Progenitorzellen. Es zeigte sich ein signifikanter Anstieg der CD34+ Progenitorzellen in beiden Studiengruppen nach Belastung, während die mesenchymalen Stammzellen keine signifikante Änderung der Anzahl zeigten.
Der Anstieg der CD34+-Progenitorzellen nach körperlicher Belastung ist in der Literatur mehrfach beschrieben und wird als eine Erklärung für die Prävention von Herz-Kreislauferkrankungen durch Sport genannt. Auch bei akuten wie chronischen Lungenerkrankungen scheinen hämatopoetische und endotheliale Progenitorzellen eine Rolle bei Reparaturvorgängen zu spielen. Die Rolle der mesenchymalen Stammzellen ist dagegen noch nicht hinreichend geklärt. Insgesamt erschwert die Heterogenität der Gruppe der mesenchymalen Stammzellen eine genaue Quantifizierung, ihr geringes Vorkommen im peripheren Blut stellt eine weitere Schwierigkeit bei der Charakterisierung und Quantifizierung dar. Nachdem zumindest der Nachweis von ansteigenden endothelialen Progenitorzellen auch bei Patienten mit Mukoviszidose gelingt, sollte in weiteren Studien die Rolle der mesenchymalen Stammzellen weiter untersucht werden. Insbesondere die Charakterisierung der Zellen in der Zellkultur sowie eine Untersuchung von Zytokinen, die für ein Homing von mesenchymalen Stammzellen verantwortlich sein könnten, scheint wesentlich, um den Mechanismus der Reparaturvorgänge besser zu verstehen und so mög-licherweise die Therapie der Mukoviszidose zu erweitern.
Bei der Betrachtung des Pathosystems Ustilago maydis/Zea mays kommen sich Proteine unterschiedlicher Organismen sehr nahe. Die derzeitige Hypothese zur lokalen Szenerie in der ausgebildeten Interaktionszone von Pflanze und Pilz spricht zwei SUC-Transportern dabei wichtige Rollen in der Pflanze/Pilz Interaktion zu. UmSrt1, der erste beschriebene pilzliche SUC-Transporter aus dem Maispathogen Ustilago maydis (Wahl et al., 2010) und ZmSUT1, der aus Zea mays stammende low affinity SUC-Transporter (Carpaneto et al., 2005) werden als Gegenspieler im Konkurrenzkampf um die extrazelluläre SUC beschrieben (Wahl et al., 2010).
ZmSUT1 ist in der Plasmamembran der Geleitzellen lokalisiert und dort für die Beladung des Phloems mit SUC aus dem Apoplasten zuständig. UmSrt1, für den eine Lokalisation in der Plasmamembran in Hefen gezeigt werden konnte, sorgt als „high affinity“ Transporter mit dem Import extrazellulärer SUC für die Kohlenhydratversorgung der pilzlichen Entwicklung und Ernährung (Wahl et al., 2010).
Gegenstand der vorliegenden Arbeit waren vergleichende elektrophysiologische Charakterisierungen der SUC-Transporteigenschaften von ZmSUT1 und UmSrt1. Durch heterologe Expression der Proteine in Xenopus Oozyten und anschließende Messungen unter Verwendung der DEVC-Technik wurden die Eigenschaften des SUC-Transports beider SUC-Transporter im Hinblick auf ihre Konzentrations-, pH-, Spannungsabhängigkeit, sowie auf die Substratspezifität hin untersucht. Diese vergleichenden Studien zur Charakterisierung beider Transportproteine ergaben ihren physiologischen Aufgaben entsprechende Unterschiede. ZmSUT1 konnte ein Verhalten als „low affinity/high capacity“ Transporter mit Affinitäten gegenüber SUC im millimolaren Bereich mit einer spannungsunabhängigen Transportaktivität bestätigt werden. Zudem konnte die Transportaktivität als stark H+-abhängig beschrieben werden (Carpaneto et al., 2005), deren Optimum nahe des physiologischen Bereichs des Apoplasten bestimmt werden konnte. Des Weiteren wurden Untersuchungen zur Substratspezifität angefertigt, die ZmSUT1 eindeutig eine Typ-II SUT Zugehörigkeit (Sivitz et al., 2005; Reinders et al., 2006; Sun et al., 2010) mit einem engen Substratspektrum belegen.
Für UmSrt1 dagegen wurde ein Transportverhalten als „high affinity/low capacity“ Transporter mit höheren Affinitäten gegenüber SUC im mikromolaren Bereich ermittelt (Wahl et al., 2010). Darüber hinaus beschreiben die Ergebnisse dieser Arbeit eine weitestgehend H+-unabhängige Transportaktivität in einem weiten pH-Wert Bereich. Im Profil der Substratspezifität zeigte sich neben SUC als primärem Substrat ein eher unspezifischer Transport weiterer Mono-, Di- und Trisaccharide. Die postulierte SUC-Spezifität von UmSrt1 (Wahl et al., 2010) konnte mit den vorliegenden Ergebnissen nicht bestätigt werden. Mit einem effektivem Import von SUC mittels UmSrt1 in den Pilz umgeht U. maydis die Hydrolyse von SUC im pflanzlichen Apoplasten und damit die Bildung extrazellulärer Glukose, die ein Signal in der pflanzlichen Pathogenabwehr darstellt (Herbers et al., 1996b; Ehness et al., 1997; Kocal et al., 2008). Somit scheint es für Ustillago maydis möglich zu sein, eine von der Wirtspflanze Zea mays weitestgehend „unbemerkte“ Aufnahme von Kohlenhydraten über einen breiten pH-Wert Bereich bewerkstelligen zu können. Die vielfach höheren Affinitäten gegenüber SUC und H+ verschaffen UmSrt1 im Konkurrenzkampf um die extrazelluläre SUC einen klaren Vorteil gegenüber ZmSUT1. Diese Daten deuten darauf hin, dass U. maydis auch unter Stressbedingungen der Pflanze und damit resultierenden Schwankungen der H+-Konzentrationen in der Lage ist, den SUC-Import für seine eigene Ernährung sicher zu stellen.
Das Gebiet posttranslationaler Modifikationen von SUC-Transportern ist weitestgehend unerforscht. In planta Versuche deuteten darauf hin, dass Redox-aktive Substanzen den Zuckertransport beeinflussen. Im Oozytensystem wurde deshalb die Aktivität von ZmSUT1 in Anwesenheit der Redox-aktiven Substanzen GSH, GSSG, H2O2 und DTT getestet. Der geringfügige Einfluss dieser Substanzen auf SUC-induzierte Ströme von ZmSUT1 deuten jedoch darauf hin, dass SUC-Transporter nicht ein direktes Ziel von Redox-Veränderungen darstellen.
Um die Struktur des pflanzlichen SUC-Transporters ZmSUT1 näher zu beleuchten und die an der Bindung von SUC involvierten Aminosäuren zu identifizieren, wurde auf der Basis der bereits bekannten Struktur von LacY aus E.coli, ebenfalls einem Vertreter der MFS, ein 3D-Modell für ZmSUT1 erstellt. Die AS, die in LacY an der Bindung des Substrats beteiligt sind, wurden bereits identifiziert (Vadyvaloo et al., 2006). Darauf aufbauend wurden im Rahmen einer Mutagenesestudie gezielt AS im Protein ZmSUT1 ausgewählt, die in verwandten SUC-Transportern konserviert und in homolgen Positionen zu den in LacY bereits identifizierten AS vorliegen. In diesen ausgewählten Positionen wurden mittels gerichteter Mutagenese acht Mutanten generiert. Die elektrophysiologische Charakterisierung dieser ZmSUT1-Mutanten identifizierte zwei Mutanten, die in der SUC-/H+-Translokation gestört waren sowie zwei WT-ähnliche. Es konnten vier Mutanten mit erniedrigten Affinitäten gegenüber SUC identifiziert werden, von denen zwei zusätzlich Veränderungen in ihrer Substratspezifität aufweisen. Diese vier AS werden als mögliche Kandidaten angesehen, an der Bindung und/oder Translokation von SUC beteiligt zu sein.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Interaktion von ANP und Ang II im Bereich der blutdruckbestimmenden Widerstandsgefäße zu untersuchen. Ein besonderer Augenmerk wurde hierbei auch auf die Bedeutung von RGS2 gerichtet. Durch das Zusammenspiel der beiden funktionellen Antagonisten ANP und Ang II wird der Blutdruck reguliert. ANP und Ang II üben hierbei jeweils gegenteilige Effekte aus. Ang II hat vasokonstriktorische Effekte auf die Blutgefäße, vermindert die Natriurese und Diurese und erhöht den Sympathikustonus. ANP hingegen besitzt blutdruckmindernde Effekte, hervorgerufen durch Vasodilatation, gesteigerte Diurese, die Erhöhung der endothelialen Durchlässigkeit und der Hemmung des Sympathikustonus. Da nichts über die Interaktion dieser beiden Hormone in der Mikrozirkulation bekannt ist, wurden im Rahmen der Dissertation intravitalmikroskopische Studien der Mikrozirkulation des Musculus cremaster der Maus, in Anlehnung an der von Baez (1973) publizierten Methode, durchgeführt. Darüber hinaus wurden auch die Effekte von Ang II und ANP auf den Blutdruck durch invasive Blutdruckmessung untersucht. Der Durchmesser von präkapillären Arteriolen des M. cremaster wurde vor und während lokaler Superfusion von Ang II oder ANP gemessen. Ang II löste eine konzentrationsabhängige stabile Konstriktion aus. Bei der ausschließlichen Superfusion von ANP in verschiedenen Konzentrationen hingegen, zeigte sich kein Effekt auf den basalen Vasotonus. ANP war jedoch in der Lage, an Ang II vorkontrahierten Arteriolen, den konstriktorischen Effekt von Ang II aufzuheben und sogar darüber hinaus eine ausgeprägte Vasodilatation zu bewirken. Dieser Effekt konnte auch bei der invasiven Messung des mittleren arteriellen Blutdrucks nachgewiesen werden. Der durch Ang II ausgelöste Blutdruckanstieg wurde durch die zusätzliche Infusion von ANP gemindert. Ang II aktiviert die Kontraktion von glatten Gefäßmuskelzellen durch den Gαq-gekoppelten AT1-Rezeptor. RGS2 hingegen ist ein negativer Regulator von Gαq. Da von RGS2 bekannt ist, dass er von cGKI phosphoryliert und stimuliert wird (Osei-Owusu et al., 2007), stellte sich die Frage, ob ANP über RGS2 dem vasokonstriktiven Effekt von Ang II entgegenwirkt. Bei den Versuchen an RGS2-KO Mäusen zeigt sich hierbei, dass ANP nicht mehr in der Lage ist, den vasokonstriktiven Effekt von Ang II aufzuheben. Daraus ist nun der Schluss zu ziehen, dass RGS2 eine bedeutende Rolle für die Wechselwirkung zwischen ANP und Ang II in der Mikrozirkulation spielt und somit eine wichtige Aufgabe bei der Regulation des peripheren Widerstands und des Blutdrucks hat.