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Grundsätzlich sollte in dieser Arbeit der Einfluss der Glutamin-Restriktion als eine Form der Aminosäure-Restriktion auf das Proliferationsverhalten, den Stoffwechsel sowie die Morphologie der murinen Fibroblastenzelllinie L929 untersucht werden. Es sollte dabei auch gezeigt werden, ob sich Indizien für die Induktion eines LEM finden lassen. Weiterhin sollten die Polyamine Spermidin, Spermin, Putrescin und N-Acetylputrescin als CRMs diskutiert und ihr Einfluss auf das Proliferationsverhalten an sieben Zelllinien herausgestellt werden. Der antiproliferative Effekt der Polyamine Spermidin und Spermin auf das Wachstum der untersuchten Zelllinien konnte in dieser Arbeit bestätigt werden, wobei sich Spermin als potenter erwies als Spermidin. Eine durch Spermidin/Spermin induzierte Autophagie konnte in den Western Blots nicht signifikant nachgewiesen werden. Putrescin und N-Acetylputrescin zeigten nur leichte Wirkungen bei hoher Dosis (10 mM). Während Putrescin einen leicht antiproliferativen Effekt hatte, zeigte N-Acetylputrescin eine leicht proliferationssteigernde Wirkung. Die Autophagie-Induktion durch Methionin-Restriktion konnte durch den Nachweis Autophagie-assoziierter Proteine in den durchgeführten Western Blots bestätigt werden. Um regelmäßig von den positiven Effekten der Autophagie zu profitieren, wäre eine pflanzenbasierte Ernährungsweise sinnvoll und gut durchführbar, da Methionin hauptsächlich in tierischen Lebensmitteln und nur geringfügig in pflanzlichen Nahrungsmitteln vorkommt. Ein völliger Verzicht auf Methionin ist nicht empfehlenswert, da die Aminosäure essentiell ist und somit über die Nahrung aufgenommen werden muss. Um das Methionin-Level konstant, aber niedrig zu halten, erscheint eine Bedarfsdeckung über pflanzliche Nahrung als ideal. Die an den Zelllinien L929 und HeLa durchgeführten Proliferationsstudien zeigten, dass die Zellen selbst nach fünftägiger Glutamin- Restriktion geringfügig weiter proliferierten und keinerlei Merkmale des Zelltodes aufwiesen. Die massenspektrometrische Analyse der Modellzelllinie L929, welche über einen Zeitraum von fünf Tagen einer Glutamin-Restriktion ausgesetzt war, zeigte deutliche metabolische Veränderungen bei den über 150 untersuchten Metaboliten, die auf die Induktion eines LEM schließen lassen. Es konnte ein metabolischer Fingerabdruck nach 48 h für die Zelllinie L929 unter Glutamin-Restriktion definiert werden, der zukünftig als Referenz bei der Testung potentieller CRMs herangezogen werden kann.
Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind potente Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren, die strukturell der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) - Superfamilie zugeordnet werden. Sie spielen eine Schlüsselrolle in einer Vielzahl an zellulären Prozessen ab den frühen Stadien der Embryogenese. Dadurch sind BMPs nicht nur für die korrekte Festlegung der embryonalen Körperachse verantwortlich, sondern regulieren als multifunktionale Mediatoren neben der Morphogenese auch Proliferation, Differenzierung und Apoptose unterschiedlicher Zelltypen. Bone Morphogenetic Proteins sind somit für die Aufrechthaltung der Homöostase im adulten Körper mitverantwortlich. Ihre Funktionalität vermitteln die BMPs über eine Signalkaskade, indem sie als dimeres Protein spezifische transmembrane Serin/Threonin-Kinaserezeptoren von Typ I und Typ II in einem heteromeren Komplex assemblieren. Die intrazelluläre Signalweiterleitung verläuft über verschiedene Signalkaskaden (Smad-Proteine oder MAPKs), wodurch final im Zellkern Änderungen auf der Ebene der Gentranskription ausgelöst werden. Laut der namensgebenden Eigenschaft fungieren einige Wachstumsfaktoren als aktive Induktoren der Knochenbiosynthese. Ihre Anwesenheit ist essentiell für die vielen zellulären Prozesse, die während einer Frakturheilung auftreten, wobei eine Knochenneubildung ebenso stark abhängig ist vom Zusammenspiel verschiedener Stimulatoren und Inhibitoren, die die BMPs in ihrer Aktivität regulieren. Bedingt durch ihr großes Potential fanden die erstmals durch Marshal Urist 1965 aus Knochenmaterial isolierten BMP-Proteine ihren Einsatz in der regenerativen Medizin. Kommerziell erhältlich und bereits seit vielen Jahren in der klinischen Anwendung befindet sich derzeit das rhBMP-2 und rhBMP-7. Diese beiden Wachstumsfaktoren werden u.a. verwendet, um die Heilungsprozesse von langwierigen Schienbeinfrakturen zu verbessern, aber auch bei degenerativen Wirbelsäulenerkrankungen und in der Kieferchirurgie. Jedoch führt die schlechte Löslichkeit des BMPs aufgrund der ausgeprägten Aggregationstendenz zu gravierenden Problemen, nicht nur während der biotechnologischen Herstellung, sondern auch bei der klinischen Anwendung.
Der Schwerpunkt des Optimierungsbedarfs der BMP-2 Herstellung im Rahmen dieser Doktorarbeit lag daher auf der Etablierung eines prokaryotischen Expressionssystems für die lösliche Produktion von BMP-2. Dafür wurde zunächst der Fokus auf die ungünstigen Löslichkeitseigenschaften des Wachstumsfaktors gelegt. Um die hohe Aggregationsneigung des BMP-2 während der Produktion in Escherichia coli zu minimieren, wurden anhand einer Algorithmus-basierten Analyse BMP-2-Varianten entworfen, in denen Aminosäuren mit stark hydrophoben Eigenschaften gegen solche mit hydrophilem Charakter ausgetauscht wurden. Hierdurch konnten die zur Aggregation neigenden Bereiche des BMP-2 weitestgehend eliminiert werden. Es wurden für die bezüglich ihrer Löslichkeit optimierten Proteinvarianten unterschiedliche Expressionsstrategien etabliert, wodurch dimere BMP-2-Muteine in angepassten chromatographischen Profilen mit einem Aufreinigungsschritt und ohne jegliche Renaturierungsmaßnahmen gewonnen wurden. Allerdings verbleiben hierbei Restmengen an bakteriellen Kontaminationen, die vorwiegend aus endogenen ribosomalen E. coli-Proteinen stammen und nicht vollständig entfernt werden konnten. Während der umfassenden in vitro Charakterisierung der BMP-2-Varianten konnte durch massenspektroskopische Analysen die Gesamtmasse beider Zielproteine bestätigt werden, wobei sequenzspezifische Fragmente eine eindeutige Identifikation der eingebrachten Mutationen ermöglichten. CD-spektroskopische Analysen erweitert um Auswertealgorithmen konnten die wesentlichen Wt-BMP-2-typischen Sekundärstrukturelemente identifizieren. Die neu generierten BMP-2-Varianten zeigen in der dynamischen Lichtstreuungsanalyse stark verminderte Aggregationstendenz im Vergleich zum Wildtyp-BMP-2. Dessen Aggregationsverhalten wurde durch die kombinierte Analytik seiner mikrofluidischen Diffusion und der dynamischen Lichtstreuung zum ersten Mal über den Konzentrationsbereich von 0.5 µM bis 100 mM genau charakterisiert. Erste zellbiologische Versuche verliefen ohne Erfolg, wodurch die biologische Aktivität der BMP-Varianten nicht abschließend geklärt werden konnte.
Die simple Methode zur Expression und Aufreinigung der hydrophilisierte BMP-2-Muteine aus dieser Dissertation kann leicht in einen größeren Produktionsmaßstab überführt werden. BMP 2 kann dadurch schneller und kostengünstiger hergestellt werden. Final bleibt es jedoch erforderlich, die biologische Aktivität der neuen löslichen BMP-2-Varianten vollständig zu charakterisieren, um deren ganzes Funktionsspektrum zu entdecken. Der Fokus weiterer Forschung sollte zudem auf die verbleibende Oligomerisierungstendenz und die bestehende Kontamination mit Fremdproteinen gelegt werden, da diese beiden Faktoren letztendlich die Ausbeute an dimeren BMP-2 Varianten aus diesem System derzeit minimieren.