Medizinische Klinik und Poliklinik II
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- N-2030-2015 (1)
Bei Patienten mit invasiver Aspergillose fanden sich gegenüber gesunden Probanden deutlich erhöhte Werte A. fumigatus spezifischer CD154+/CD4+ Zellen. Die Anwendbarkeit dieses Assays im klinischen Routinebetrieb und bei gegenüber A. fumigatus epxonierten Probanden und Patienten sollte in dieser translationalen Arbeit untersucht werden.
Für den vorbeschriebenen Assay zur Bestimmung CD154+/CD4+ Zellen aus aufgereinigten PBMCs zeigt diese Arbeit eine signifikant reduzierte Detektionsrate nach Blutprobenlagerung von über 2 Stunden. In der Literatur beschriebene Verfahren zur verlängerten Lagerungszeit von heparinisierten Blutproben mittels vorhergehender Dilution und Agitation ermöglichen keine Verlängerung präanalytischer Lagerungszeiten über 6 Stunden. Die Kryokonservierung frisch aufbereiteter PBMCs bei −20 C vor Bestimmung A. fumigatus spezifischer T-Zellen wird als Versandmöglichkeit in einem multizentrischen Setting gezeigt. Um die klinische Anwendbarkeit zu verbessern, wird ein Vollblutprotokoll zur Detektion A. fumigatus spezifischer CD154+/CD4+ Zellen demonstriert, das die Verwendung von bettseitig mit Vollblut beimpften Blutmonovetten mit vorgelegtem A. fumigatus-Lysat ermöglicht.
Die Anwendung des Assays zur Bestimmung A. fumigatus spezifischer T-Zellen wurde bei hämatoonkologischen Patienten vor und drei Monate nach Stammzelltransplantation untersucht. Insbesondere eine reduzierte Zellzahl der gemessenen Lymphozyten ist hier ein limitierender Faktor der erfolgreichen Messung. Aufgrund der generell nied- rigen Erfolgsrate von 20 % bzw. 54 % vor bzw. nach HSCT ist die Anwendbarkeit des Assays in diesem Kollektiv fraglich. Die Erhebung von Expositionsfaktoren gesunder Probanden gegenüber A. fumigatus ermöglicht die Einteilung in eine schwach und stark gegenüber A. fumigatus exponierte Gruppe mit signifikant erhöhtem Anteil A. fumigatus spezifischer CD154+/CD4+ Zellen. Hierzu trägt insbesondere das Vorliegen antigenspezifischer T-Gedächtniszellen als Korrelat einer langfristigen Exposition bei. Retrospektiv fand sich auch nach kurzfris- tiger beruflicher Exposition ein Anstieg CD154+/CD4+ spezifischer T-Zellen. Dies legt eine Verwendung CD154+/CD4+ spezifischer T-Zellen als Biomarker in Bereichen der umweltmedizinischen Abklärung von Schimmelpilzexposition oder der Diagnostik allergischer Erkrankungen nahe.
Invasive aspergillosis (IA) is an infectious disease caused by the fungal pathogen Aspergillus fumigatus that mainly affects immunocompromised hosts. To investigate immune cell cross-talk during infection with A. fumigatus, we co-cultured natural killer (NK) cells and dendritic cells (DC) after stimulation with whole fungal structures, components of the fungal cell wall, fungal lysate or ligands for distinct fungal receptors. Both cell types showed activation after stimulation with fungal components and were able to transfer activation signals to the counterpart not stimulated cell type. Interestingly, DCs recognized a broader spectrum of fungal components and thereby initiated NK cell activation when those did not recognize fungal structures. These experiments highlighted the supportive function of DCs in NK cell activation. Furthermore, we focused on soluble DC mediated NK cell activation and showed that DCs stimulated with the TLR2/Dectin-1 ligand zymosan could maximally stimulate the expression of CD69 on NK cells. Thus, we investigated the influence of both receptors for zymosan, Dectin-1 and TLR2, which are highly expressed on DCs but show only minimal expression on NK cells. Specific focus was laid on the question whether Dectin-1 or TLR2 signaling in DCs is important for the secretion of soluble factors leading to NK cell activation. Our results show that Dectin-1 and TLR2 are negligible for NK cell activation. We conclude that besides Dectin-1 and TLR2 other receptors on DCs are able to compensate for the missing signal.
Bereits in Vorstudien konnte dargelegt werden, dass eine signifikante Korrelation zwischen der T-Zell-Zytokin-Antwort und der berufs- bzw. umweltbedingten Schimmelpilzbelastung besteht. Ziel der vorliegenden Studie war, eine mögliche Kombination von Biomarkern ausfindig zu machen, die veränderte T-Zell-Antworten auf A. fumigatus- Antigene bei beruflich Exponierten im Vergleich zu Kontrollprobanden/-innen vorhersagen kann. Um geeignete Marker für das Bio-Monitoring zu finden, wurden zur T-Zell-Aktivierung ein myzeliales A. fumigatus - Lysat und 12 proteinogene Antigene in ELISpot-Versuchen für die Signaturzytokine IFN-γ (TH1), IL-5 (TH2) und IL-17A (TH17) der Haupt-TH-Subpopulationen getestet.
Es zeigten sich bei den Biolandwirten/-innen erwartungsgemäß erhöhte TH1- und TH2-Antworten auf die Mehrzahl der verwendeten spezifischen A. fumigatus-Antigene, die möglicherweise eine Schimmelpilzbelastung serologisch nachweisbar machen. Insbesondere die spezifischen A. fumigatus-Antigene Aspf22, CatB und CipC konnten eine Trennschärfe zwischen den beiden Kohorten hinsichtlich ihrer IFN-γ- und IL-5-Zytokinantwort erzielen. Unterschiede in der TH17-Antwort aufgrund chronischer beruflicher Sporenbelastung ohne Krankheitskorrelat konnten nicht explizit festgestellt werden. Weiterhin ergab sich, dass erhöhte TH2-Immunreaktionen, sofern sie mit einer adäquaten TH1-gerichteten Immunantwort einhergehen und damit eine ausgeglichene TH2/TH1-Balance besteht, nicht zwangsläufig zu Hypersensitivitätserkrankungen führen. Im Vergleich zu Langzeitexponierten wurden teilweise überlappende TH-Zellfrequenzen bei beruflich exponierten Biolandwirten/-innen ermittelt. Welche entscheidende Rolle Treg-Zellen bei der Eindämmung überschießender Immunantworten einnehmen, kann hieraus erahnt werden.
Aspergillus fumigatus ist ein opportunistisches fungales Humanpathogen, das ein breites Erkrankungsspektrum von der invasiven Aspergillose (IA) in immunkompromittierten Patienten bis zu einer Reihe von Hypersensitivitätserkrankungen in immunkompetenten Individuen hervorrufen kann. Die Diagnostik für A. fumigatus assoziierte Krankheitsbilder beruht auf mehreren diagnostischen Tests, die auch in ihrer Kombination oft zu späten und unzuverlässigen Diagnosen führen, was wiederum zu einer suboptimalen Patientenversorgung, erhöhter Mortalität und gesteigerten Kosten für das Gesundheitssystem führt. Es besteht daher die unbedingte Notwendigkeit, neue und bessere diagnostische Tests zur Detektion von A. fumigatus zu entwickeln. T Zell Assays sind vielversprechende, innovative diagnostische Tests, die bereits für andere Infektionskrankheiten in der Routinediagnostik eingesetzt werden. Erste Versuche wurden bereits unternommen, diese Assays auch für A. fumigatus assoziierte Erkrankungen einzusetzen. Die gängigsten, auf mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC)-basierten T Zell Assays sind der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Enzyme-linked Immuno Spot Assay (ELISPOT) und die Durchflusszytometrie. Das Ziel dieser Dissertation war die Entwicklung eines klinisch einsetzbaren T-Zell-Assays für A. fumigatus assoziierte Erkrankungen.
Die in der Literatur beschriebenen Assays zeigten in unseren Experimenten bei der Anwendung für mykologische Fragestellungen eine hohe Suszeptibilität gegenüber bereits kurzen präanalytischen Lagerzeiten und Krykonservierung, was einen klinischen Einsatz erschwerte. Wir entwickelten deshalb einen Vollblut basierten ELISA (VB-ELISA) mit dualer Kostimulation (α-CD28 und α-CD49d), hoher Reproduzierbarkeit und verbesserter Robustheit gegenüber präanalytischen Einflussfaktoren. Der VB ELISA konnte hohe Differenzen zwischen Typ 1 T Helferzellen (Th1) , Th2 und Th17 Zytokinkonzentrationen bei Patienten mit Aspergillus assoziierten Hypersensitivitätskrankheitsbildern und Kontrollpatienten feststellen. Um zu testen, ob dieser Anstieg auf die Erkrankung zurückzuführen ist oder auch bei hoher Aspergillus-Umweltexposition vorzufinden ist, wurde der Assay in Aspergillus exponierten gesunden ökologischen Landwirten getestet. In dieser Gruppe fanden wir ebenfalls eine erhöhte Th1 und Th2 Expansion und Zytokinsekretion gegenüber gesunden Kontrollspendern, jedoch wurde nur ein geringer Anstieg des Th17 Signalzytokines IL-17 detektiert. Die Detektion von IL-17 im VB-ELISA in Kombination mit anderen Zytokinmarkern ist daher ein vielversprechender Biomarker für die Diagnose von A. fumigatus assoziierten Hypersensitivitätserkrankungen.
Neben diesen Hypersensitivitätserkrankungen haben wir den VB-ELISA auch in immunkompromittierten Patienten nach allogener Stammzelltransplantation (alloSZT), einer Hochrisikogruppe für die IA und die durch das humane Cytomegalovirus (HCMV) ausgelöste Zytomegalie, evaluiert. Während in unserer monozentrischen Pilotstudie aufgrund der geringen Inzidenz keine Evaluation an IA-Patienten erfolgen konnte, wurde mittels VB-ELISA eine hohe Konkordanz der HCMV-spezifischen T Zell Antwort mit der HCMV Serologie sowie eine vergleichbare Leistung zum ELISPOT, dem am häufigsten eingestetzen Assay für diese Fragestellung, festgestellt.
Zusammenfassend haben wir mit dem VB ELISA einen vielversprechenden und breitflächig im Spektrum A. fumigatus assoziierter Erkrankungen einsetzbaren T Zell Assay entwickelt, der in der Zukunft in großen Studien mit klar definierten Patientenkohorten getestet werden sollte. Auf Grund von Daten aus Folgestudien, die auf dieser Arbeit basieren, ist des Weiteren davon auszugehen, dass der VB-ELISA auf Grund seiner Stärken potenziell in einer Vielzahl von Anwendungsgebieten und Pathogenen (eine Folgestudie mit SARS-CoV-2 wurde vor kurzem veröffentlicht) universell eingesetzt werden kann. Neben der Immundiagnostik für diverse Infektionserkrankungen könnte der Assay außerdem für T Zell Antworten auf Vakzinierungen und Immuntherapien, in vivo Experimente und in vitro Toxizitätstests verwendet werden.
Although the field of fungal infections advanced tremendously, diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis (IPA) in immunocompromised patients continues to be a challenge. Since IPA is a multifactorial disease, investigation from different aspects may provide new insights, helpful for improving IPA diagnosis. This work aimed to characterize the human immune response to Aspergillus fumigatus in a multilevel manner to identify characteristic molecular candidates and risk factors indicating IPA, which may in the future support already established diagnostic assays. We combined in vitro studies using myeloid cells infected with A. fumigatus and longitudinal case-control studies investigating patients post allogeneic stem cell transplantation (alloSCT) suffering from IPA and their match controls.
Characteristic miRNA and mRNA signatures indicating A. fumigatus-infected monocyte-derived dendritic cells (moDCs) demonstrated the potential to differentiate between A. fumigatus and Escherichia coli infection. Transcriptome and protein profiling of alloSCT patients suffering from IPA and their matched controls revealed a distinctive IPA signature consisting of MMP1 induction and LGAL2 repression in combination with elevated IL-8 and caspase-3 levels. Both, in vitro and case-control studies, suggested cytokines, matrix-metallopeptidases and galectins are important in the immune response to A. fumigatus. Identified IPA characteristic molecular candidates are involved in numerous processes, thus a combination of these in a distinctive signature may increase the specificity. Finally, low monocyte counts, severe GvHD of the gut (grade ≥ 2) and etanercept administration were significantly associated with IPA diagnosis post alloSCT. Etanercept in monocyte-derived macrophages (MDM) infected with A. fumigatus downregulates genes involved in the NF-κB and TNF-α pathway and affects the secretion of CXCL10.
Taken together, identified characteristic molecular signatures and risk factors indicating IPA may in the future in combination with established fungal biomarkers overcome current diagnostic challenges and help to establish tailored antifungal therapy. Therefore, further multicentre studies are encouraged to evaluate reported findings.
Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) ist der häufigste Erreger der invasiven Aspergillose, welche vornehmlich immunsupprimierte Patientinnen und Patienten betrifft und mit einer hohen Letalität einhergeht. Zur Entwicklung neuer diagnostischer sowie therapeutischer Ansätze ist ein besseres Verständnis der Interaktion von A. fumigatus mit dem humanen Immunsystem zwingend erforderlich. Zur Erforschung dieser Interaktion werden häufig Mausmodelle herangezogen, welche aufgrund der unterschiedlichen Biologie des Wirts jedoch nicht direkt übertragbar sind. Ziel dieser Studie war es, einen funktionellen in vitro Vergleich zwischen humanen und murinen Makrophagen, neutrophilen Granulozyten (PMNs) und dendritischen Zellen (DCs) in ihrer Interaktion mit A. fumigatus Konidien, Keimschläuchen sowie depletiertem Zymosan zu erstellen, um eine bessere Beurteilung und Übertragbarkeit des Mausmodells bei der invasiven Aspergillose zu ermöglichen. Dabei wurden die verschiedenen Zellen des Immunsystems auf standardisierte und reproduzierbare Weise generiert und Stimulationsversuche durchgeführt.
Hierbei zeigten humane und murine Zellen in vitro eine unterschiedliche Antwort auf die Stimulation mit A. fumigatus: Murine Makrophagen und neutrophile Granulozyten zeigten im Vergleich zu den humanen Zellen eine stärkere primäre Immunantwort mit einer vermehrten Ausschüttung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Humane DCs hingegen, welche als Bindeglied zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem fungieren, zeigten nach Stimulation mit A. fumigatus eine vermehrte Oberflächenexpression von Maturationsmarkern sowie eine höhere Phagozytoserate als die murinen DCs. Weiterhin konnte eine inverse Dectin-1-Expression auf humanen und murinen DCs nach Stimulation mit A. fumigatus nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass es für alle untersuchten Zelltypen Unterschiede zwischen humanen und murinen Zellen in der basalen und der Zytokinausschüttung nach Stimulation mit A. fumigatus gab.
In Zusammenschau der Ergebnisse dieser Arbeit zeigt das murine Immunsystem eine stärkere angeborene Immunantwort mit vermehrter ROS-Ausschüttung, jedoch auch eine anti-inflammatorische Zytokinantwort, um möglicherweise eine überschießende Inflammation zu verhindern. Dies könnte durch die stärkere Exposition der Maus gegenüber A. fumigatus durch den bodennahen Lebensraum sowie ihrer kurzen Lebensdauer bedingt sein. Im humanen System kommt hingegen der Aktivierung des adaptiven Immunsystems über die DCs eine übergeordnete Rolle zu. So zeigen beide Spezies distinkte Unterschiede in ihrer in vitro Immunantwort gegenüber A. fumigatus, welche bei der Übertragung von experimentellen Daten von der Maus auf den Menschen beachtet werden sollten.
Pulmonary mucosal immune response is critical for preventing opportunistic Aspergillus fumigatus infections. Although fungus‐specific CD4\(^{+}\) T cells in blood are described to reflect the actual host–pathogen interaction status, little is known about Aspergillus‐specific pulmonary T‐cell responses. Here, we exploit the domestic pig as human‐relevant large animal model and introduce antigen‐specific T‐cell enrichment in pigs to address Aspergillus‐specific T cells in the lung compared to peripheral blood. In healthy, environmentally Aspergillus‐exposed pigs, the fungus‐specific T cells are detectable in blood in similar frequencies as observed in healthy humans and exhibit a Th1 phenotype. Exposing pigs to 10\(^{6}\) cfu/m\(^{3}\) conidia induces a long‐lasting accumulation of Aspergillus‐specific Th1 cells locally in the lung and also systemically. Temporary immunosuppression during Aspergillus‐exposure showed a drastic reduction in the lung‐infiltrating antifungal T‐cell responses more than 2 weeks after abrogation of the suppressive treatment. This was reflected in blood, but to a much lesser extent. In conclusion, by using the human‐relevant large animal model the pig, this study highlights that the blood clearly reflects the mucosal fungal‐specific T‐cell reactivity in environmentally exposed as well as experimentally exposed healthy pigs. But, immunosuppression significantly impacts the mucosal site in contrast to the initial systemic immune response.
The human pathogen Aspergillus (A.) fumigatus is a fungal mold that can cause severe infections in immunocompromised hosts. Pathogen recognition and immune cell cross-talk are essential for clearing fungal infections efficiently. Immune cell interactions in particular may enhance individual cell activation and cytotoxicity towards invading pathogens.
This study analyzed the reciprocal cell activation of natural killer (NK) cells and monocyte-derived dendritic cells (moDCs) after stimulation with A. fumigatus cell wall fractions and whole-cell lysates. Furthermore, the impact of the on moDCs expressed fungal receptors Dectin-1 and TLR-2 on NK cell activation was analyzed. Stimulation of moDCs with ligands for Dectin-1 and TLR-2 and transfer of soluble factors on autologous NK cells showed that moDCs could induce NK cell activation solely by secreting factors. In summary, both cell types could induce reciprocal cell activation if the stimulated cell type recognized fungal morphologies and ligands. However, moDCs displayed a broader set of A. fumigatus receptors and, therefore, could induce NK cell activation when those were not activated by the stimulus directly.
Consequently, new fungal receptors should be identified on NK cells. The NK cell characterization marker CD56 was reduced detected in flow cytometry after fungal co-culture. Notably, this decreased detection was not associated with NK cell apoptosis, protein degradation, internalization, or secretion of CD56 molecules. CD56 was shown to tightly attach to hyphal structures, followed by its concentration at the NK-A. fumigatus interaction site. Actin polymerization was necessary for CD56 relocalization, as pre-treatment of NK cells with actin-inhibitory reagents abolished CD56 binding to the fungus. Blocking of CD56 suppressed fungal mediated NK cell activation and secretion of the immune-recruiting chemokines MIP-1α, MIP-1β, and RANTES, concluding that CD56 is functionally involved in fungal recognition by NK cells.
CD56 binding to fungal hyphae was inhibited in NK cells obtained from patients during immune-suppressing therapy after allogeneic stem cell transplantation (alloSCT). Additionally, reduced binding of CD56 correlated with decreased actin polymerization of reconstituting NK cells challenged with the fungus. The immune-suppressing therapy with corticosteroids negatively influenced the secretion of MIP-1α, MIP-1β, and RANTES in NK cells after fungal stimulation ex vivo. Similar results were obtained when NK cells from healthy donors were treated with corticosteroids prior to fungal co-culture. Thus, corticosteroids were identified to have detrimental effects on NK cell function during infection with A. fumigatus.
Einfluss von Hypoxie auf die Interaktion von moDCs und T-Zellen mit \(Aspergillus\) \(fumigatus\)
(2021)
Die invasive Aspergillose ist eine gefürchtete Erkrankung besonderes bei immunsupprimierten Patienten, die eine Stammzelltransplanation erhalten sollen. Diese Patienten leiden in der Regel an einer hämatologischen Grunderkrankung wie einer Leukämie oder einem Lymphom. Das Prinzip der Stammzelltransplanatation ist es, das kranke Knochenmark mittels Chemotherapie und Bestrahlung zu zerstören und es dann mit gesunden Stammzellen zu ersetzen. Während dieser Konditionierung ist der Patient also ohne eigene Abwehrzellen. In dieser Phase gestaltet sich die rechtzeitige Diagnose häufig als schwierig, weil die konventionellen Diagnosemethoden von der Anwesenheit von neutrophilen Granulozyten abhängen. Häufig ist die Infektion bei der Entwicklung von unspezifischen Symptomen wie Fieber oder Dyspnoe schon weit fortgeschritten. Hat sich der Pilz in der Lunge ausgebreitet, so kommt es zur Ausbildung einer Hypoxie und im Verlauf auch zu einer Hypoxämie aufgrund einer Diffusionsstörung in den entzündeten Lungenabschnitten.
Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von Hypoxie auf die Interaktion zwischen dendritischen Zellen und T-Zellen besser zu verstehen. Dendritische Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunabwehr von Pilzinfektion und bilden das Verbindungsstück zwischen angeborenen und erworbenen Immunsystem. T-Zellen übernehmen ebenfalls wichtige Aufgaben bei der Abwehr von Pilzinfektionen, indem sie Interferon gamma produzieren. Zudem sollte die Funktion verschiedener Botenstoffe in Signalkaskaden näher untersucht werden.
Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion von dendritischen Zellen mit Aspergillus fumigatus unter Hypoxie, die dendritischen Zellen anschließend unter Normoxie dazu befähigt, eine verstärkte adaptive Immunantwort hervorzurufen. Hypoxie könnte somit als zusätzlicher Faktor verwendet werden, um dendritische Zellen als effektive Adjuvantien in einer Impfung gegen Aspergillus fumigatus zu verwenden. Ursächlich für die verstärkte Fähigkeit naive T-Zellen zu aktivieren, scheint zum einen die Apoptose und zum anderen eine verstärkte Produktion von Interleukin 12p70 zu sein.
Invasive fungal infections are associated with high mortality rates and are mostly caused by the opportunistic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. Immune responses against these fungi are still not fully understood. Dendritic cells (DCs) are crucial players in initiating innate and adaptive immune responses against fungal infections. The immunomodulatory effects of fungi were compared to the bacterial stimulus LPS to determine key players in the immune response to fungal infections. A genome wide study of the gene regulation of human monocyte-derived dendritic cells (DCs) confronted with A. fumigatus, C. albicans or LPS was performed and Krüppel-like factor 4 (KLF4) was identified as the only transcription factor that was down-regulated in DCs by both fungi but induced by stimulation with LPS. Downstream analysis demonstrated the influence of KLF4 on the interleukine-6 expression in human DCs. Furthermore, KLF4 regulation was shown to be dependent on pattern recognition receptor ligation. Therefore KLF4 was identified as a controlling element in the IL-6 immune response with a unique expression pattern comparing fungal and LPS stimulation.