Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
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Critical size bone defects and nonunion fractures remain difficult to treat. Although cell‐loaded bone substitutes have improved bone ingrowth and formation, the lack of methods for achieving viability and the uniform distribution of cells in the scaffold limits their use as bone grafts. In addition, the predominant mechanical stimulus that drives early osteogenic cell maturation has not been clearly identified. Further, it is challenging to evaluate mechanical stimuli (i.e., deformation and fluid–flow-induced shear stress) because they are interdependent. This thesis compares different mechanical stimuli applied to cell-seeded scaffolds to develop bone grafts efficiently for the treatment of critical size bone defects. It also seeks to understand how deformation strain and interstitial fluid–flow-induced shear stress promote osteogenic lineage commitment. In this thesis, different scaffolds were seeded with primary human bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) from different donors and subjected to static and dynamic culture conditions. In contrast with the static culture conditions, homogenous cell distributions were accomplished under dynamic culture conditions. Additionally, the induction of osteogenic lineage commitment without the addition of soluble factors was observed in the bioreactor system after one week of cell culture. To determine the role of mechanical stimuli, a bioreactor was developed to apply mechanical deformation force to a mesenchymal stem sell (MSC) line (telomerase reverse transcriptase (TERT)) expressing a strain-responsive AP-1 luciferase reporter construct on porous scaffolds. Increased luciferase expression was observed in the deformation strain compared with the shear stress strain. Furthermore, the expression of osteogenic lineage commitment markers such as osteonectin, osteocalcin (OC), osteopontin, runt-related transcription factor 2 (RUNX2), alkaline phosphate (AP), and collagen type 1 was significantly downregulated in the shear stress strain compared with the deformation strain. These findings establish that the deformation strain was the predominant stimulus causing skeletal precursors to undergo osteogenesis in earlier stages of osteogenic cell maturation. Finally, these findings were used to develop a bioreactor in vitro test system in which the effect of medication on osteoporosis could be tested. Primary human BM-MSCs from osteoporotic donors were subjected to strontium ranelate (an osteoporotic drug marketed as Protelos®). Increased expression of collagen type 1 and calcification was seen in the drugtreated osteoporotic stem cells compared with the nondrug-treated osteoporotic stem cells. Thus, this bioreactor technology can easily be adapted into an in vitro osteoporotic drug testing system.
Bevor ein zellbasiertes GTMP erstmalig beim Menschen angewendet werden kann, müssen verschiedene notwendige nicht-klinische Studien durchgeführt werden. Wichtig ist hier u.a. die Untersuchung der Biodistribution im Tiermodel. Diese umfasst die Verteilung, das Engraftment, die Persistenz, die Eliminierung und gegebenenfalls die Expansion der humanen Zellen in verschiedenen Organen, meistens im Mausmodel. Deshalb wurde eine qPCR-basierte Analysenmethode entwickelt, mit der humane genomische DNA innerhalb von muriner genomischer DNA bestimmt werden kann, und entsprechend den regulatorischen Richtlinien der European Medicines Agency und des International Council for Harmonisation validiert. Anschließend wurde diese Methode innerhalb einer präklinischen worst-case Szenario Biodistributionsstudie angewendet. Das Ziel dieser Studie war die Untersuchung des Biodistributionsprofils von genetisch modifizierten Blood Outgrowth Endothelial Cells von Hämophilie A Patienten 24 Stunden und sieben Tage nach intravenöser Applikation einer Dosis von 2x106 Zellen. Die Isolation, genetische Modifikation und die Expansion der Zellen sollte entsprechend den Richtlinien der Guten Herstellungspraxis durchgeführt werden. Hierbei ist die Auswahl und Anwendung geeigneter und essentieller Rohstoffe wichtig. Gleichermaßen ist die Durchführung einer definierten Qualitätskontrollstrategie notwendig und die Patientenzellen sollten nur innerhalb von nicht-klinischen Studien eingesetzt werden, wenn alle Akzeptanzkriterien erfüllt wurden. Die Validierung der qPCR-Methode zeigte eine hohe Genauigkeit, Präzision und Linearität innerhalb des Konzentrationsintervalls von 1:1x103 bis 1:1x106 humanen zu murinen Genomen. Bei Anwendung dieser Methode für die Biodistributionsstudie konnten nach 24 Stunden humane Genome in vier der acht untersuchten Mausorgane bestimmt werden. Nach sieben Tagen konnten in keinem der acht Organe humane Genome nachgewiesen werden...
Bei der zystischen Fibrose (CF) sowie der primären Ziliendyskinesie (PCD) handelt es sich um zwei seltene Erkrankungen, die unter anderem den mukoziliären Transport beeinträchtigen. CF gehört hierbei zu den am häufigsten vorkommenden angeborenen Stoffwechselerkrankungen, wobei Betroffene unter einem Defekt des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductor Regulator (CFTR)-Gens leiden, der durch die Produktion von hochviskosem Sekret in muzinproduzierenden Organen, wie dem gastrointestinalen Trakt und der Lunge, gekennzeichnet ist. Patienten, die an PCD leiden, weisen Defekte in, zum jetzigen Zeitpunkt, ca. 38 bekannten und PCD-assoziierten Genen auf, die in strukturellen Defekten des ziliären Apparats und somit in dysfunktionalen Kinozilien resultieren. Da aktuell weder für die CF noch für die PCD eine Heilung möglich ist, steht bei der Therapie vor allem die Linderung der Symptome im Fokus. Grundlegendes Ziel ist der langfristige Erhalt der Lungenfunktion sowie die Prävention bakterieller Infekte. Als bisherige Modellsysteme zur Erforschung möglicher Therapeutika gelten Tiermodelle, die den humanen Phänotyp aufgrund von Speziesdiversität nicht vollständig abbilden können. Als vielversprechende Testsysteme für die zystische Fibrose gelten humane intestinale Organoidkulturen. Nachdem allerdings vorwiegend respiratorische Symptome für die Mortalität der Patienten verantwortlich sind, stellen CF-Atemwegsmodelle bessere Testsysteme für zukünftige Therapeutika dar. Atmungsorganoidkulturen wurden verwendet, um die CFTR-Funktionalität zu untersuchen, repräsentieren aber nicht vollständig die in vivo Situation. Deshalb werden zur Entwicklung neuer Therapiestrategien patientenspezifische 3D in vitro Testsysteme der humanen Atemwege benötigt, die insbesondere im Hinblick auf personalisierte Medizin ihren Einsatz finden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine für den Lehrstuhl neue Methode zur Zellgewinnung aus nasalen Schleimhautabstrichen etabliert, die eine standardisierte Versorgung mit humanem Primärmaterial garantiert. Zur Generierung einer krankheitsspezifischen Zelllinie, wie beispielsweise einer PCD-Zelllinie mit Hilfe des CRISPR/Cas9-Systems, ist eine Atemwegszelllinie erforderlich, die die in vivo Situation vollständig repräsentiert. So wurden vier verschiedene respiratorische Epithelzelllinien (HBEC3-KT, Calu-3, VA10 und Cl-huAEC) auf ihren mukoziliären Phänotyp hin untersucht, wobei lediglich die Zelllinie HBEC3-KT in zilientragende Zellen differenzierte. Diese zeigten jedoch nur auf ca. 5 % der Modelloberfläche Kinozilien, wodurch die humane respiratorische Mukosa nicht komplett abgebildet werden konnte und die HBEC3-KT-Zelllinie keine geeignete Zelllinie zur Generierung einer PCD-Zelllinie darstellte. Mit Hilfe des Tissue Engineering war es möglich, 3D in vitro Testsysteme basierend auf zwei unterschiedlichen Matrices, der biologischen SIS (small intestinal submucosa) und der synthetischen Polyethylenterephthalat (PET)-Membran, aufzubauen. Es wurden 3D Atemwegstestsysteme mit humanen primären nasalen und tracheobronchialen Epithelzellen generiert. Ergänzend zu histologischen Untersuchungen und zur Charakterisierung spezifischer Marker des respiratorischen Systems mittels Immunfluoreszenz, wurde die Ultrastruktur der Modelle, mit speziellem Fokus auf ziliäre Strukturen, analysiert. Um Rückschlüsse auf die ziliäre Funktionalität ziehen zu können und somit eine hohe in vivo Korrelation zu bestätigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit am Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin die Methode der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie etabliert, welche die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Ebenfalls wurde der Einfluss von isotoner Kochsalzlösung und des � 2-adrenergen Agonisten Salbutamol, das vor allem als Bronchodilatator bei Asthmapatienten eingesetzt wird, auf die Zilienschlagfrequenz analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass beide Substanzen den Zilienschlag im Atemwegsmodell erhöhen. Zur Generierung der Testsysteme der beiden seltenen Erkrankungen CF und PCD wurden Epithelzellen der betroffenen Patienten zunächst mittels nicht-invasiver Raman-Spektroskopie auf einen potentiellen Biomarker untersucht, welcher Einsatz in der Diagnostik der beiden Krankheiten finden könnte. Es konnte jedoch weder für die CF noch für die PCD ein Biomarker aufgedeckt werden. Jedoch zeigten PCD-Zellen eine geringe Auftrennung gegenüber nicht-PCD Zellen. Anschließend wurden 3D-Atemwegstestsysteme basierend auf Patientenzellen aufgebaut. Der Phänotyp der CF-Modelle wurde mittels immunhistologischer Färbung und der Analyse des gestörten mukoziliären Transports verifiziert. Strukturelle ziliäre Defekte konnten durch die ultrastrukturelle Analyse von Zilienquerschnitten in drei donorspezifischen PCD-Modellen identifiziert werden. Darüber hinaus konnte die ziliäre Funktionalität mit Hilfe der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, eine neue Methode zur vollständigen Charakterisierung von 3D-Atemwegstestsystemen zu etablieren, die die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass mit Hilfe des Tissue Engineering ein personalisiertes Krankheitsmodell für die PCD auf Segmenten eines dezellularisierten porzinen Jejunums generiert werden kann, das zukünftig ein Testsystem für potentielle Therapeutika darstellen kann.
Induction of ectopic bone formation by site directed immobilized BMP2 variants \(in\) \(vivo\)
(2020)
In contrast to common bone fractures, critical size bone defects are unable to self-regenerate and therefore external sources for bone replacement are needed. Currently, the gold standard to treat critical size bone fractures, resulting from diseases, trauma or surgical interventions, is the use of autologous bone transplantation that is associated with several drawbacks such as postoperative pain, increased loss of blood during surgery and extended operative time.
The field of bone tissue engineering focuses on the combination of biomaterials and growth factors to circumvent these adverse events and thereby to improve critical size bone defects treatment.
To this aim, a promising approach is represented by using a collagen sponge soaked with one of the most powerful osteoinductive proteins, the bone morphogenetic protein 2 (BMP2). After the approval by the Food and Drug Administration (FDA), BMP2 was used to successfully treat several severe bone defects. However, the use of BMP2 delivery systems is associated with severe side effects such as inflammation, swelling, ectopic bone formation outside of the site of implantation and breathing problems if implanted in the area of the cervical spine. The occurrence of severe side effects is related to the supraphysiological amounts of the applied protein at the implantation site. The BMP2 is typically adsorbed into the scaffold and diffuses rapidly after implantation. Therefore, intensive research has been conducted to improve the protein’s retention ability, since a prolonged entrapment of the BMP2 at the implantation site would induce superior bone formation in vivo due to a minimized protein release. By controlling the release from newly designed materials or changing the protein immobilization methods, it seems possible to improve the osteoinductive properties of the resulting BMP2-functionalized scaffolds.
The combination of biocompatible and biodegradable scaffolds functionalized with a covalently immobilized protein such as BMP2 would constitute a new alternative in bone tissue engineering by eliminating the aforementioned severe side effects. One of the most common immobilization techniques is represented by the so-called EDC/NHS chemistry. This coupling technique allows covalent biding of the growth factor but in a non-site direct manner, thus producing an implant with uncontrollable and unpredictable osteogenic activities. Therefore, the generation of BMP2 variants harboring functional groups that allow a site-directed immobilization to the scaffold, would enable the production of implants with reproducible osteogenic activity.
The new BMP2 variants harbor an artificial amino acid at a specific position of the mature polypeptide sequence. The presence of the unnatural amino acid allows to use particular covalent immobilization techniques in a highly specific and site directed manner. The two selected BMP2 variants, BMP2 E83Plk and BMP2 E83Azide, were expressed in E. coli, renatured and purified by cation exchange chromatography. The final products were intensively analyzed in terms of purity and biological activity in vitro. The two BMP2 variants enabled the application of different coupling techniques and verify the possible options for site directed immobilization to the scaffold.
Intensive analyses on the possible side effects caused by the coupling reactions and on the quantification of the coupled protein were performed. Both click chemistry reactions showed high reaction efficacies when the BMP2 variants were coupled to functionalized fluorophores. Quantification by ELISA and scintillation counting of radioactively labeled protein revealed different outcomes. Moreover, the amounts of protein detected for the BMP2 variants coupled to microspheres were similar to that of the wild type protein. Therefore, it was not possible to conclude whether the BMP2 variants were covalently coupled or just adsorbed.
BMP2 variants being immobilized to various microspheres induced osteogenic differentiation of C2C12 cells in vitro, but only in those cells that were located in close proximity to the functionalized beads. This selectivity strongly indicates that the protein is for a great portion covalently coupled and not just adsorbed. Moreover, the difference between the covalently coupled BMP2 variants and the adsorbed BMP2 WT was confirmed in vivo. Injection of the BMP2-functionalized microspheres in a rat model induced subcutaneous bone formation.
The main aim of the animal experiment was to prove whether covalently coupled BMP2 induces bone formation at significant lower doses if compared to the amount being required if the protein is simply adsorbed. To this aim, several BMP2 concentrations were tested in this animal experiment. The BMP2 variants, being covalently immobilized, were hypothesized to be retained and therefore bio-available at the site of implantation for a prolonged time. However, in the animal experiments, lower doses of either coupled or adsorbed protein were unable to induce any bone formation within the 12 weeks.
In contrast, the highest doses induced bone formation that was first detected at week 4. During the 12 weeks of the experiment, an increase in bone density and a steady state bone volume was observed. These results were obtained only for the covalently coupled BMP2 E83Azide but not for BMP2 E83Plk that did not induce bone formation in any condition. The negative outcome after application of BMP2 E83Plk suggested that the coupling reaction might have provoked changes in the protein structure that extremely influenced its osteogenic capabilities in vivo.
However, the histological examination of the different ossicles induced either by BMP2 WT or BMP2 E83Azide, revealed clear morphological differences. BMP2 WT induced a bone shell-like structure, while the covalently coupled protein induced uniform bone formation also throughout the inner part. The differences between the two newly formed bones can be clearly associated with the different protein delivery mechanisms. Thus, the developed functionalized microspheres constitute a new interesting strategy that needs further investigations in order to be able to be used as replacement of the currently used BMP2 WT loaded medical devices.
Cardiovascular diseases are considered the leading cause of death worldwide according to the World Health Organization. Heart failure is the last stage of most of these diseases, where loss of myocardium leads to architectural and functional decline.
The definitive treatment option for patients with CVDs is organ or tissue transplantation, which relies on donor availability. Therefore, generating an autologous bioengineered myocardium or heart could overcome this limitation. In addition, generating cardiac patches will provide ventricular wall support and enable reparative stem cells delivery to damaged areas. Although many hurdles still exist, a good number of researches have attempted to create an engineered cardiac tissue which can induce endogenous cardiac repair by replacing damaged myocardium.
The present study provided cardiac patches in two models, one by a detergent coronary perfusion decellularization protocol that was optimized, and the other that resulted in a 3D cell-free extracellular matrix with intact architecture and preserved s-glycosaminoglycan and vasculature conduits. Perfusion with 1% Sodium dodecyle sulfate (SDS) under constant pressure resulted in cell-free porcine scaffold within two and cell-free rat scaffold in 7 days, whereas scaffold perfused with 4% sodium deoxycholate (SDO) was not able to remove cells completely. Re-reendothelialization of tissue vasculature was obtained by injecting human microvascular endothelial cell and human fibroblast in 2:1 ratio in a dynamic culture. One-week later, CD31 positive cells and endothelium markers were observed, indicating new blood lining. Moreover, functionality test of re-endothelialized tissue revealed improvement in clotting seen in decellularized tissues. When the tissue was ready to be repopulated, porcine induced pluripotent stem cells (PiPSc) were generated by transfected reprogramming of porcine skin fibroblast and then differentiated to cardiac cells following a robust protocol, for an autologous cardiac tissue model. However, due to the limitation in the PiPSc cell number, alternatively, human induced pluripotent stem cells generated cardiac cells were used.
For reseeding a coculture of human iPSc generated cardiac cells, human mesenchymal stem cells and human fibroblast in 2:1:1 ratio respectively were used in a dynamic culture for 6-8 weeks. Contractions at different areas of the tissue were recorded at an average beating rate of 67 beats/min. In addition, positive cardiac markers (Troponin T), Fibroblast (vemintin), and mesenchymal stem cells (CD90) were detected. Not only that, but by week 3, MSC started differentiating to cardiac cells progressively until few CD90 positive cells were very few by week 6 with increasing troponin t positive cells in parallel. Electrophysiological and drug studies were difficult to obtain due to tissue thickness and limited assessment sources. However, the same construct was established using small intestine submucosa (SISer) scaffold, which recorded a spontaneous beating rate between 0.88 and 1.2 Hz, a conduction velocity of 23.9 ± 0.74 cm s−1, and a maximal contraction force of 0.453 ± 0.015 mN. Moreover, electrophysiological studies demonstrated a drug-dependent response on beating rate; a higher adrenalin frequency was revealed in comparison to the untreated tissue and isoproterenol administration, whereas a decrease in beating rate was observed with propranolol and untreated tissue.
The present study demonstrated the establishment of vascularized cardiac tissue, which can be used for human clinical application.
Breast cancer is the most common cancer among women worldwide and the second most common cause of cancer death in the developed countries. As the current state of the art in first-line drug screenings is highly ineffective, there is an urgent need for novel test systems that allow for reliable predictions of drug sensitivity.
In this study, a tissue engineering approach was used to successfully establish and standardize a 3-dimensional (3D) mamma carcinoma test system that was optimized for the testing of anti-tumour therapies as well as for the investigation of tumour biological issues. This 3D test system is based on the decellularised scaffold of a porcine small intestinal segment and represents the three molecular subsets of oestrogen receptor-positive, HER2/Neu-overexpressing and triple negative breast cancer (TNBC). The characterization of the test system with respect to morphology as well as the expression of markers for epithelial-mesenchymal transition (EMT) and differentiation indicate that the 3D tumour models cultured under static and dynamic conditions reflect tumour relevant features and have a good correlation with in vivo tumour tissue from the corresponding xenograft models. In this respect, the dynamic culture in a flow bioreactor resulted in the generation of tumour models that exhibited best reflection of the morphology of the xenograft material. Furthermore, the proliferation indices of 3D models were significantly reduced compared to 2-dimensional (2D) cell culture and therefore better reflect the in vivo situation. As this more physiological proliferation index prevents an overestimation of the therapeutic effect of cytostatic compounds, this is a crucial advantage of the test system compared to 2D culture. Moreover, it could be shown that the 3D models can recapitulate different tumour stages with respect to tumour cell invasion. The scaffold SISmuc with the preserved basement membrane structure allowed the investigation of invasion over this barrier which tumour cells of epithelial origin have to cross in in vivo conditions during the process of metastasis formation. Additionally, the data obtained from ultrastructural analysis and in situ zymography indicate that the invasion observed is connected to a tumour cell-associated change in the basement membrane in which matrix metalloproteinases (MMPs) are also involved. This features of the model in combination with the mentioned methods of analysis could be used in the future to mechanistically investigate invasive processes and to test anti-metastatic therapy strategies.
The validation of the 3D models as a test system with respect to the predictability of therapeutic effects was achieved by the clinically relevant targeted therapy with the monoclonal antibody trastuzumab which induces therapeutic response only in patients with HER2/Neu-overexpressing mamma carcinomas due to its specificity for HER2. While neither in 2D nor in 3D models of all molecular subsets a clear reduction of cell viability or an increase in apoptosis could be observed, a distinct increase in antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) was detected only in the HER2/NEU-overexpressing 3D model with the help of an ADCC reporter gene assay that had been adapted for the application in the 3D model in the here presented work. This correlates with the clinical observations and underlines the relevance of ADCC as a mechanism of action (MOA) of trastuzumab. In order to measure the effects of ADCC on the tumour cells in a direct way without the indirect measurement via a reporter gene, the introduction of an immunological component into the models was required. This was achieved by the integration of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), thereby allowing the measurement of the induction of tumour cell apoptosis in the HER2/Neu-overexpressing model. Hence, in this study an immunocompetent model could be established that holds the potential for further testing of therapies from the emergent field of cancer immunotherapies.
Subsequently, the established test system was used for the investigation of scientific issues from different areas of application. By the comparison of the sensitivity of the 2D and 3D model of TNBC towards the water-insoluble compound curcumin that was applied in a novel nanoformulation or in a DMSO-based formulation, the 3D test system was successfully applied for the evaluation of an innovative formulation strategy for poorly soluble drugs in order to achieve cancer therapy-relevant concentrations. Moreover, due to the lack of targeted therapies for TNBC, the TNBC model was applied for testing novel treatment strategies. On the one hand, therapy with the WEE1 kinase inhibitor MK 1775 was evaluated as a single agent as well as in combination with the chemotherapeutic agent doxorubicin. This therapy approach did not reveal any distinct benefits in the 3D test system in contrast to testing in 2D culture. On the other hand, a novel therapy approach from the field of cellular immunotherapies was successfully applied in the TNBC 3D model. The treatment with T cells that express a chimeric antigen receptor (CAR) against ROR1 revealed in the static as well as in the dynamic model a migration of T cells into the tumour tissue, an enhanced proliferation of T cells as well as an efficient lysis of the tumour cells via apoptosis and therefore a specific anti-cancer effect of CAR-transduced T cells compared to control T cells. These results illustrate that the therapeutic application of CAR T cells is a promising strategy for the treatment of solid tumours like TNBC and that the here presented 3D models are suitable for the evaluation and optimization of cellular immunotherapies.
In the last part of this work, the 3D models were expanded by components of the tumour stroma for future applications. By coculture with fibroblasts, the natural structures of the intestinal scaffold comprising crypts and villi were remodelled and the tumour cells formed tumour-like structures together with the fibroblasts. This tissue model displayed a strong correlation with xenograft models with respect to morphology, marker expression as well as the activation of dermal fibroblasts towards a cancer-associated fibroblast (CAF) phenotype. For the integration of adipocytes which are an essential component of the breast stroma, a coculture with human adipose-derived stromal/stem cells (hASCs) which could be successfully differentiated along the adipose lineage in 3D static as well as dynamic models was established. These models are suitable especially for the mechanistic analysis of the reciprocal interaction between tumour cells and adipocytes due to the complex differentiation process.
Taken together, in this study a human 3D mamma carcinoma test system for application in the preclinical development and testing of anti-tumour therapies as well as in basic research in the field of tumour biology was successfully established. With the help of this modular test system, relevant data can be obtained concerning the efficacy of therapies in tumours of different molecular subsets and different tumour stages as well as for the optimization of novel therapy strategies like immunotherapies. In the future this can contribute to improve the preclinical screening and thereby to reduce the high attrition rates in pharmaceutical industry as well as the amount of animal experiments.
Die Risikobewertung von Chemikalien ist für die öffentliche Gesundheit von entschei-dender Bedeutung, weshalb strenge Testverfahren zu deren toxikologischer Begutach-tung angewandt werden. Die ursprünglich tierbasierten Testverfahren werden aufgrund von neuen wissenschaftlichen Erkenntnissen und wegen ökonomischer Ineffizienz sowie ethischer Fragwürdigkeit immer mehr durch alternative Methoden ohne Tiermodelle ersetzt. Für den toxikologischen Endpunkt der Augenreizung wurden bereits die ersten alternativen Testsysteme auf der Basis von ex vivo- oder in vitro-Modellen entwickelt. Jedoch ist bis dato kein alternatives Testsystem in der Lage, das gesamte Spektrum der verschiedenen Kategorien der Augenreizungen nach dem global harmonisierten System zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien (GHS) vorherzusagen und damit den tierbasierten Draize-Augenreizungstest vollends zu ersetzen. Gründe hierfür sind fehlende physiologische Merkmale im Modell sowie eine destruktive Analysemethode.
Aufgrund dessen wurden in dieser Studie die Hypothesen getestet, ob ein verbessertes In-vitro-Modell oder eine zerstörungsfreie, hochsensitive Analysemethode die Vorher-sagekraft des Augenreizungstests verbessern können. Dafür wurden zunächst neue Mo-delle aus humanen Hornhaut- und Hautepithelzellen entwickelt. Die Modelle aus pri-mären cornealen Zellen zeigten eine gewebespezifische Expression der Marker Zytokera-tin 3 und 12 sowie Loricrin. In beiden Modellen konnte durch die Verkürzung der Kul-turdauer die Ausbildung einer Hornschicht verhindert werden. Die Modelle wiesen dadurch eine sensiblere Barriere vergleichbar der nativen Cornea auf. Darüber hinaus konnte durch die chemische Quervernetzung mit Polyethylenglykolsuccinimidylglutara-tester ein transparentes, nicht kontrahierendes Stroma-Äquivalent etabliert werden. Der Stroma-Ersatz konnte zur Generierung von Hemi- und Voll-Cornea-Äquivalenten einge-setzt werden und lieferte somit erste Ansatzpunkte für die Rekonstruktion der nativen Hornhaut.
Parallel dazu konnte ein zerstörungsfreies Analyseverfahren basierend auf der Impe-danzspektroskopie entwickelt werden, das wiederholte Messungen der Gewebeintegri-tät zulässt. Zur verbesserten Messung der Barriere in dreidimensionalen Modelle wurde hierfür ein neuer Parameter, der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) bei der Frequenz von 1000 Hz, der TEER1000 Hz definiert, der eine genauere Aussage über die Integrität der Modelle zulässt. Durch die Kombination der entwickelten cornealen Epithelzellmodelle mit der TEER1000 Hz-Messung konnte die Prädikitivität des Augenrei-zungstests auf 78 - 100 % erhöht werden. Von besonderer Bedeutung ist dabei, dass die nicht destruktive Messung des TEER1000 Hz zum ersten Mal erlaubte, die Persistenz von Irritationen durch wiederholte Messungen in einem in vitro-Modell zu erkennen und somit die GHS-Kategorie 1 von GHS-Kategorie 2 zu unterscheiden. Der wissenschaftli-che Gewinn dieser Forschungsarbeit ist ein neues Testverfahren, das alle GHS-Kategorien in einem einzigen in vitro-Test nachweisen und den Draize-Augenreizungstest gänzlich ersetzen kann.
Die Implantation eines Medizinprodukts in den menschlichen Körper ruft eine Immunreaktion hervor, die zur fibrösen Einkapselung führen kann. Makrophagen in direktem Kontakt mit der Oberfläche des Implantats erfassen sensorisch den Fremdkörper und übersetzten das Signal in die Freisetzung zahlreicher löslicher Mediatoren. Das generierte Entzündungsmilieu moduliert die Heilungsreaktion und kann zur Anreicherung von Fibroblasten sowie zur Erhöhung der Matrixsyntheserate in der Wundumgebung führen. Eine dichte fibröse Kapsel um ein Medizinprodukt beeinträchtigt den Ersatz von Körperstrukturen, das Unterstützen physiologischer Körperfunktionen sowie die Effizienz einer medizinischen Therapie. Zur Identifizierung potenzieller Biomaterialkandidaten mit optimalen Eigenschaften ist jedoch eine evidenzbasierte Entscheidungsfindung notwendig und diese wiederum muss durch geeignete Testmethoden unterstützt werden.
Zur Erfassung lokaler Effekte nach Implantation eines Biomaterials begründet die Komplexi-tät der ablaufenden Fremdkörperreaktion die Anwendung von Tiermodellen als Goldstandard. Die Eingliederung von in vitro Modellsystemen in standardisierte Testverfahren scheitert oft an der Verfügbarkeit validierter, verlässlicher und reproduzierbarer Methoden. Demnach ist kein standardisiertes in vitro Testverfahren beschrieben, das die komplexen dreidimensionalen Gewebsstrukturen während einer Fremdkörperreaktion abbildet und sich zur Testung über längere Kontaktphasen zwischen Blutkomponenten und Biomaterialien eignet. Jedoch können in vitro Testungen kosten- und zeiteffizienter sein und durch die Anwendung humaner Zellen eine höhere Übertragbarkeit auf den Menschen aufweisen. Zusätzlich adressiert die Präferenz zu in vitro Testmethoden den Aspekt „Reduzierung“ der 3R-Prinzipien „Replacement, Reduction, Refinement“ (Ersatz, Reduzierung, Verbesserung) von Russel und Burch (1959) zu einer bewussten und begründeten Anwendung von Tiermodellen in der Wissenschaft. Ziel von diesem Forschungsvorhaben war die Entwicklung von humanen in vitro Modellsystemen, die den Kontakt zu Blutkomponenten sowie die Reaktion des umliegenden Bindegewebes bei lokaler Implantation eines Biomaterials abbilden. Referenzmaterialien, deren Gewebsantwort nach Implantation in Tiere oder den Menschen bekannt ist, dienten als Validierungskriterium für die entwickelten Modellsysteme. Die Anreicherung von Zellen sowie die Bildung extrazellulärer Matrix in der Wundumgebung stellen wichtige Teilprozesse während einer Fremdkörperreaktion dar. Für beide Teilprozesse konnte in einem indirekten zellbasierten Modellsystem der Einfluss einer zellvermittelten Konditionierung wie die Freisetzung von löslichen Mediatoren durch materialadhärente Makrophagen auf die gerichtete Wanderung von Fibroblasten sowie den Umbau eines dreidimensionalen Bindegewebsmodells aufgezeigt werden.
Des Weiteren ließ sich das Freisetzungsprofil von Zytokinen durch materialständige Makrophagen unter verschiedenen Testbedingungen wie der Kontamination mit LPS, der Oberflächenbehandlung mit humanem Blutplasma und der Gegenwart von IL-4 bestimmen. Die anschließende vergleichende statistische Modellierung der generierten komplexen multifaktoriellen Datenmatrix ermöglichte die Übersetzung in eine Biomaterialbewertung. Dieses entwickelte Testverfahren eignete sich einerseits zur Validierung von in vitro Testbedingungen sowie andererseits zur Bewertung von Biomaterialien. Darüber hinaus konnte in einem dreidimensionalen Fremdkörpermodell die komplexe dreidimensionale Struktur der extrazellulären Matrix in einer Wunde durch die Kombination unterschiedlicher Zell- und Matrixkomponenten biomimetisch nachgebaut werden. Diese neuartigen dreidimensionalen Fremdkörpermodelle ermöglichten die Testung von Biomaterialien über längere Testphasen und können in anschließenden Studien angewandt werden, um dynamische Prozesse zu untersuchen. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit drei unterschiedliche Teststrategien entwickelt werden, die (I) die Bewertung von Teilprozessen ermöglichen, (II) die Identifizierung verlässlicher Testbedingungen unterstützen und (III) biomimetisch ein Wundgewebe abbilden. Wesentlich ist, dass biomimetisch ein dreidimensionales Gewebemodell entwickelt werden konnte, das eine verlässliche Unterscheidungskapazität zwischen Biomaterialien aufweist.
Herzschrittmachersysteme sind eine weitverbreitete Möglichkeit Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu behandeln. Wegen der natürlichen Reaktion des Immunsystems auf Fremdkörper, erfolgt aber eine fortschreitende Verkapselung der Herzschrittmacherelektrode. Die Folge ist eine ansteigende Verminderung der Stimulationseffizienz durch Erhöhung der Anregungsschwelle. Die Integration der Elektrode in das Gewebe ist dabei mangelhaft und wird bestimmt durch Implantateigenschaften wie Größe, Flexibilität und Dimensionalität. Um die Integration zu verbessern, stellen dreidimensionale (3D) bzw. gewebeartige Elektroden eine Alternative zu den derzeit verwendeten planaren Metallelektroden dar. Zur Entwicklung einer leitfähigen, 3D und faserförmigen Elektrode wurden in dieser Arbeit Kohlenstoff-Nanofaser-Scaffolds über Elektrospinnen hergestellt. Durch die Modifikation des Fasergerüstes mit Natriumchlorid (NaCl) während der Scaffoldherstellung, konnte das Fasernetzwerk aufgelockert und Poren generiert werden. Die Kohlenstofffaser-Elektroden zeigten einen effizienten Energieübertrag, welcher vergleichbar mit heutigen Titannitrid (TiN) -Elektroden ist. Die Auflockerung des Fasergewebes hatte eine verbesserte Flexibilität des Faserscaffolds zu Folge. Neben der Flexibilität, konnte auch die Infiltration von Zellen in das poröse Faserscaffold erheblich verbessert werden. Dabei konnten Fibroblasten durch das gesamte Scaffold migrieren. Die Kompatibilität mit kardialen Zellen, die Grundvoraussetzung von Herzschrittmacherelektroden, wurde in vitro nachgewiesen. Durch die Kombination aus dem 3D-Elektrodengerüst mit einer Co-Kultur aus humanen Kardiomyozyten, mesenchymalen Stammzellen und Fibroblasten, erfolgte eine Einbettung der Elektrode in funktionelles kardiales Gewebe. Dadurch konnte ein lebender Gewebe-Elektroden-Hybrid generiert werden, welcher möglicherweise die Elektrode vor Immunzellen in vivo abschirmen kann. Eine Zusammenführung der hybriden Elektrode mit einen Tissue-Engineerten humanen kardialen Patch in vitro, führte zu Bildung einer nahtlosen Elektronik-Gewebe-Schnittstelle. Die fusionierte Einheit wurde abschließend auf ihre mechanische Belastbarkeit getestet und konnte über einen Elektroden-Anschluss elektrisch stimuliert werden.
The pancreas and the small intestine are pivotal organs acting in close synergism to regulate glucose metabolism. After absorption and processing of dietary glucose within the small intestine, insulin and glucagon are released from pancreatic islet cells to maintain blood glucose homeostasis. Malfunctions affecting either individual, organ-specific functions or the sophisticated interplay of both organs can result in massive complications and pathologic conditions. One of the most serious metabolic diseases of our society is diabetes mellitus (DM) that is hallmarked by a disturbance of blood glucose homeostasis. Type 1 (T1DM) and type 2 (T2DM) are the main forms of the disease and both are characterized by chronic hyperglycemia, a condition that evokes severe comorbidities in the long-term. In the past, several standard treatment options allowed a more or less adequate therapy for diabetic patients. Albeit there is much effort to develop new therapeutic interventions to treat diabetic patients in a more efficient way, no cure is available so far. In view of the urgent need for alternative treatment options, a more systemic look on whole organ systems, their biological relation and complex interplay is needed when developing new therapeutic strategies for DM.
T1DM is hallmarked by an autoimmune-mediated destruction of the pancreatic β-cell mass resulting in a complete lack of insulin that is in most patients restored by applying a life-long recombinant insulin therapy. Therefore, novel regenerative medicine-based concepts focus on the derivation of bioartificial β-like cells from diverse stem cell sources in vitro that survive and sustain to secrete insulin after implantation in vivo. In this context, the first part of this thesis analyzed multipotent intestinal stem cells (ISCs) as alternative cell source to derive bioartificial, pancreatic β-like cells in vitro. From a translational perspective, intestinal stem cells pose a particularly attractive cell source since intestinal donor tissues could be obtained via minimal invasive endoscopy in an autologous way. Furthermore, intestinal and pancreatic cells both derive from the same developmental origin, the endodermal gut tube, favoring the differentiation process towards functional β-like cells. In this study, pancreas-specific differentiation of ISCs was induced by the ectopic expression of the pancreatic transcription factor 1 alpha (Ptf1a), a pioneer transcriptional regulator of pancreatic fate. Furthermore, pancreatic lineage-specific culture media were applied to support the differentiation process. In general, ISCs grow in vitro in a 3D Matrigel®-based environment. Therefore, a 2D culture platform for ISCs was established to allow delivery and ectopic expression of Ptf1a with high efficiency. Next, several molecular tools were applied and compared with each other to identify the most suitable technology for Ptf1a delivery and expression within ISCs as well as their survival under the new established 2D conditions. Success of differentiation was investigated by monitoring changes in cellular morphology and induction of pancreatic differentiation-specific gene expression profiles. In summary, the data of this project part suggest that Ptf1a harbors the potential to induce pancreatic differentiation of ISCs when applying an adequate differentiation media. However, gene expression analysis indicated rather an acinar lineage-determination than a pancreatic β-cell-like specification. Nevertheless, this study proved ISCs not only as interesting stem cell source for the generation of pancreatic cell types with a potential use in the treatment of T1DM but alsoPtf1a as pioneer factor for pancreatic differentiation of ISCs in general.
Compared to T1DM, T2DM patients suffer from hyperglycemia due to insulin resistance. In T2DM management, the maintenance of blood glucose homeostasis has highest priority and can be achieved by drugs affecting the stabilization of blood glucose levels. Recent therapeutic concepts are aiming at the inhibition of the intestinal glucose transporter Na+-D-Glucose cotransporter 1 (SGLT1). Pharmacological inhibition of SGLT1 results in reduced postprandial blood glucose levels combined with a sustained and increased Glucagon-like peptide 1 (GLP-1) secretion. So far, systemic side effects of this medication have not been addressed in detail. Of note, besides intestinal localization, SGLT1 is also expressed in various other tissues including the pancreas. In context of having a closer look also on the interplay of organs when developing new therapeutic approaches for DM, the second part of this thesis addressed the effects on pancreatic islet integrity after loss of SGLT1. The analyses comprised the investigation of pancreatic islet size, cytomorphology and function by the use of a global SGLT1 knockout (SGLT1-/-) mouse model. As SGLT1-/- mice develop the glucose-galactose malabsorption syndrome when fed a standard laboratory chow, these animals derived a glucose-deficient, fat-enriched (GDFE) diet. Wildtype mice on either standard chow (WTSC) or GDFE (WTDC) allowed the discrimination between diet- and knockout-dependent effects. Notably, GDFE fed mice showed decreased expression and function of intestinal SGLT1, while pancreatic SGLT1 mRNA levels were unaffected. Further, the findings revealed increased isled sizes, reduced proliferation- and apoptosis rates as well as an increased α-cell and reduced β-cell proportion accompanied by a disturbed cytomorphology in islets when SGLT1 function is lost or impaired. In addition, pancreatic islets were dysfunctional in terms of insulin- and glucagon-secretion. Moreover, the release of intestinal GLP-1, an incretin hormone that stimulates insulin-secretion in the islet, was abnormal after glucose stimulatory conditions. In summary, these data show that intestinal SGLT1 expression and function is nutrient dependent. The data obtained from the islet studies revealed an additional and new role of SGLT1 for maintaining pancreatic islet integrity in the context of structural, cytomorphological and functional aspects. With special emphasis on SGLT1 inhibition in diabetic patients, the data of this project indicate an urgent need for analyzing systemic side effects in other relevant organs to prove pharmacological SGLT1 inhibition as beneficial and safe.
Altogether, the findings of both project parts of this thesis demonstrate that focusing on the molecular and cellular relationship and interplay of the small intestine and the pancreas could be of high importance in context of developing new therapeutic strategies for future applications in DM patients.