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This compilation focuses on adolescent mental disorders and their prevention. It comprises three distinct studies, each contributing to a deeper understanding of this critical topic. This work addresses a critical gap in the understanding of, and approach to, adolescent mental health, and as a result reveals a critically important and urgently needed policy implication for action. The thematic structure of these studies begins with an examination of the epidemiology of child and adolescent mental disorders. Baseline data were collected from N = 877 adolescents with a mean age of 12.43 years (SD = 0.65). Mental health problems, such as depressive symptoms, non-suicidal self-injury, suicidal ideation, symptoms of eating disorders, and gender differences, are thoroughly examined. Results revealed a significant portion of our sample displaying mental health problems as early as the 6th and 7th grades, with girls generally being more affected than boys. The findings underscore the importance of early adolescence in the emergence of mental health problems and thereby emphasize the need for preventive measures. Moving beyond prevalence estimates, the compilation delves into the etiology of these disorders, exploring their potential correlation with a COVID-19 infection. Understanding the early signs and risk factors is crucial for timely support. While numerous studies have investigated potential risk and protective factors during the pandemic, our focus shifts to adolescents’ coping when an infection with the virus was involved (N = 2,154, M = 12.31, SD = 0.67). We hypothesized that students infected or with close family members infected, would exhibit an increased psychopathology and a decreased functioning of protective factors such as self-efficacy or self-esteem. We found no connection between infection and the mental health status within our sample, but protective factors and mental well-being were positively associated. Thus, universal primary prevention appears to be the preferred approach for promoting mental health. Lastly, the compilation introduces LessStress, a noteworthy contribution to more evidence-based prevention programs. This universal approach is designed to reduce stress in schools, accompanied by a cluster-randomized trial to evaluate its effectiveness (estimated sample size N = 1,894). Existing studies have demonstrated the effectiveness of stress prevention, leading us to introduce a short and easy-to-implement prevention program. There is positive evidence for one-lesson interventions in schools for promoting well-being and health behaviors among adolescents. LessStress is designed based on a life skills approach that not only imparts psychoeducational content but also teaches skills relevant to everyday life and directly applicable. Throughout these studies, a common thread emerges: the pressing need to address mental disorders during childhood and adolescence. These formative years play a pivotal role in the development of mental health problems. These formative years play a crucial role in the development of mental health problems. They highlight the importance of epidemiological data collection and analysis based on the latest models to develop prevention interventions that are not only effective but also reach young people on a global level.
Die Erforschung viraler Proteine ist wichtig, um virale Infektionen besser verstehen und
damit therapieren zu können. Die Aufklärung der DUB-Funktion auf dem viralen
Herpesprotein pUL36 ermöglicht ein besseres Verständnis des Infektionshergangs und
könnte zur Entwicklung eines Enzyminhibitors führen, der nur an diesem Enzym ansetzt,
nachdem es sich von den zellulären DUBs unterscheidet (Kattenhorn et al., 2005). In
dieser Arbeit konnten die vorherigen Daten, die eine stärkere Hemmung der DUB-
Mutante unter Interferoneinfluss zeigten, in unterschiedlichen Assay-Designs bestätigt
werden. Auch Versuche mit einem anderen Herpes simplex Virus Strang, bestätigten die
vorherigen Daten. Die Ergebnisse zeigen, dass die DUB-Funktion für HSV-1 wichtig ist für
die virale Evasion der zellulären Immunantwort. Die genaue Funktion der DUB in der
Infektion ist jedoch unklar. Aufgrund der vorbestehenden Datenlage erschien am
wahrscheinlichsten, dass die DUB-Funktion vor Eindringen des Herpes Simplex Virus in
den Zellkern zum Tragen kommt, womit es nach Abnahme des Interferons nicht zu einer
viralen Reaktivierung käme. Deshalb wurden Untersuchungen unternommen, um eine
mögliche Reaktivierung nach Abnahme des Interferons näher zu untersuchen. Hierfür
wurden zwei verschiedene Experimente entwickelt. Einmal wurde das Interferon direkt
nach Infektion und einmal 3 Tage nach Infektion (3dpi) abgenommen. Die Ergebnisse
zeigten beide eine stärkere Hemmung der DUB-HSV-1-Mutante unter Interferoneinfluss.
Bei Abnahme des Interferons direkt nach Infektion lag bei Wildtyp und Mutante ein
leichter Anstieg der Plaquezahlen vor, wobei dieser Effekt von der Dosis des Interferons
abhängig war. Eine hohe Interferondosis begünstigte bei beiden eine stärkere Hemmung,
allerdings bei beiden auch eine leichte Erhöhung der Plaquezahl nach Abnahme. Bei
einer niedrigen Dosis konnte nur eine stärkere Hemmung der DUB-Mutante, jedoch
keine Reaktivierung bei Wildtyp und Mutante nach Abnahme des Interferons gezeigt
werden. Bei Abnahme drei Tage nach Infektion zeigte sich sowohl bei dem Wildtyp-Virus
als auch der DUB- Mutante kein Anstieg in den Plaquezahlen. Es sind, nachdem
Deubiquitinierung nicht nur eine Rolle in der Verhinderung des proteosomalen Abbaus
von in die Zelle eingedrungenem Virus spielt, sondern auch der Zellregulation, mehrere
Szenarien denkbar, die diesen Phänotyp erklären könnten. Die DUB-Funktion könnte
zwar den proteosomalen Abbau durch Deubiqutinierung und damit Verhinderung der
Markierung des Virus zum zellulären Abbau verhindern. Allerdings könnten sich durch
einen langsameren Transport aus der Zelle oder in den Nucleus auch weniger Plaques
bei der Mutante als wie beim Wildtyp unter Interferoneinfluss bilden, nachdem das Virus
dann leichter Ziel antiviraler Proteine werden könnte. Oder die DUB-Funktion spielt eine
Rolle beim Eintritt in den Kern durch Modifikationen anderer Proteine. Virengenome
könnten auch durch eine fehlende DUB-Funktion reprimiert werden oder die Zelle durch
Apoptose absterben. Interessanterweise konnte keine Hemmung der DUB-Mutante in
Interferon behandelten U-2 OS Zellen gezeigt werden, von denen ein Defekt im STING-
vermittelten Signalweg bekannt ist. Vielleicht zeigt dies, dass das STING-Protein an dem
gezeigten DUB-Phänotyp beteiligt ist. Nachgewiesen ist außerdem bereits eine Funktion
des Enzyms bei der zweiten Umhüllung der Kapside bei Pseudorabiesvirus (Möhl, 2011).
Weitere Untersuchungen unter Einsatz bspw. von Immunfluoreszenz,
Proteasominhibitoren oder weiteren Zelllinien wie Saos-2, sind nötig, um die genaue
Funktion zu klären.
Arrhythmogene Kardiomyopathie (ACM) ist eine genetische Herzerkrankung, die durch Herzinsuffizienz, ventrikuläre Arrhythmien und plötzlichen Herztod gekennzeichnet ist. Mutationen in desmosomalen Proteinen der Zelladhäsion, wie Plakophilin 2 (PKP2) und Plakoglobin (PG), sind die häufigste Ursache der familiären ACM. Wie gestörte Zelladhäsion zum ACM-Phänotyp führt, ist jedoch nur teilweise geklärt. Potentielle Mechanismen sind eine gestörte Kalzium-(Ca2+)-Homöostase, mitochondrialer oxidativer Stress und metabolische Störungen. Ziel dieser Studie ist es, die mitochondriale Energetik und die Ca2+ -Homöostase in kardio-restriktiven PKP2-Knockout-Mäusen (KO) im Alter von 4, 8 und 12 Wochen sowie in PG-Knockout- Mäusen im Alter von 6 Wochen zu untersuchen. Vier Wochen alte PKP2-KO-Mäuse zeigten frühe Anzeichen von ACM, während alle anderen Altersgruppen typische Kennzeichen von ACM rekapitulierten. Kontraktilität, die damit verbundenen Ca2+ - Transienten, der Redoxstatus und das mitochondriale Membranpotenzial (ΔΨm) isolierter Kardiomyozyten wurden mit einem IonOptix-System bei elektrischer und β- adrenerger Stimulation untersucht. Alle desmosomalen KO-Kardiomyozyten zeigten eine verringerte diastolische Sarkomerlänge, was auf eine diastolische Dysfunktion hinwies. In allen PKP2 KO Kardiomyozyten lag außerdem ein erhöhter intrazellulärer Ca2+ -Spiegel vor, während in den PG KO-Kardiomyozyten das intrazellulärer Ca2+ unverändert war. PKP2 KO- und PG KO-Kardiomyozyten wiesen keine Ca2+ - Sensibilisierung der Myofilamente auf. Zur weiteren Bewertung der mitochondrialen Funktion wurde eine hochauflösende Respirometrie in isolierten Herzmitochondrien bei gleichzeitiger Überwachung von ΔΨm in PKP2 KO und PG KO Mäusen durchgeführt, welche in allen Versuchs- und Kontrollgruppen vergleichbar war. Im Verlauf der Versuche blieb der Redoxstatus stabil und es konnte kein Exzess reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) festgestellt werden. Daraus konnte gefolgert werden, dass weder PKP2 KO noch PG KO-Mäuse eine beeinträchtigte mitochondriale Atmung aufwiesen. Diese Studie zeigt, dass isolierte PKP2 KO- oder PG KO-Kardiomyozyten EC-Kopplungsdefekte ohne mitochondriale Dysfunktion aufwiesen. Eine mitochondriale Dysfunktion konnte als treibender Faktor für die Progression des ACM- Phänotyps in den vorgestellten Mausmodellen ausgeschlossen werden. Weitere Studien sind erforderlich, um die mitochondriale Funktion im Zusammenhang mit ACM zu entschlüsseln.
Die COVID-19 Pandemie ist die bisher verheerendste Pandemie des 21. Jahrhunderts. Durch die Einführung neuer mRNA-basierter Impfstoffe sowie der hohen Rate natürlicher Infektionen konnte die weltweite SARS-CoV-2-Immunität gesteigert werden. Trotz aller Erfolge zur Eindämmung der Pandemie kann eine Infektion auch heute noch zu schweren Verläufen und Tod führen. Eine adäquate COVID-19-Therapie ist folglich auf potente Virostatika angewiesen. Eine durch Umgehung zeitaufwändiger klinischer Studien schnell verfügbare Alternative zu neu entwickelten Arzneimitteln ist die Anwendung etablierter Medikamente. Wir isolierten und charakterisierten ein von einem Patienten stammendes SARS-CoV-2-Virus. Dieses Virusisolat wurde bisher in elf Publikationen verwendet. Mittels quantitativer Echtzeit-Polymerasekettenreaktion untersuchten wir eine Substanzbibliothek mit mehr als 300 neuen und bereits zugelassenen Wirkstoffen auf ihre Wirksamkeit gegen SARS-CoV-2. Dabei konnten wir zeigen, dass der selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer Fluoxetin die SARS-CoV-2-Replikation ab einer Dosis von 0,8 μg/ml signifikant inhibiert, einer bei der Behandlung von Depressionen häufig angewandten Dosierung. Der EC50-Wert lag bei 387 ng/ml. Die Behandlung mit Fluoxetin resultierte in einer reduzierten Zahl an Virusprotein-produzierenden Zellen, was darauf hindeutet, dass es die virale Reinfektion und/oder Proteinexpression inhibiert. Fluoxetin ist ein racemisches Gemisch, wobei das (S)-Enantiomer der potentere Serotonin-Wiederaufnahmehemmer ist. Wir konnten zeigen, dass beide Enantiomere einen vergleichbaren antiviralen Effekt gegen SARS-CoV-2 aufweisen, wodurch das (R)-Enantiomer bei virologischer Indikation gegebenenfalls präferiert werden sollte. Fluoxetin hat keinen Einfluss auf die Replikation des Tollwut-Virus und des Humanen Respiratorischen Synzytial-Virus, was auf eine Virusspezifität hindeutet. Weitere aus der Bibliothek stammende signifikante Inhibitoren der SARS-CoV-2-Replikation sind die am Institut für Organische Chemie Würzburg entwickelten Substanzen AKS 232 und AKS 128. Neben der medikamentösen Therapie ist die akkurate Bestimmung neutralisierender Antikörper gegen SARS-CoV-2 zur Quantifizierung des bestehenden (Re-) Infektionsschutzes sowie zur Planung zukünftiger Impfstrategien von großer Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit entwickelten wir unter Verwendung der quantitativen Echtzeit-Polymerasekettenreaktion erfolgreich ein zuverlässiges Testverfahren zur Detektion neutralisierender anti-SARS-CoV-2 Antikörper.
SPRED 2 wirkt inhibitorisch auf den Ras/ERK-MAPK-Signalweg. Im Knockout Mausmodell
zeigen sich einige schwerwiegende phänotypische Eigenschaften, unter anderem zeigen sich
ein genereller Minderwuchs, veränderte hormonelle Regelkreise, neurologische Auffälligkeiten,
eine deutlich verringerte Lebenserwartung, sowie kardiale Veränderungen. Besonders
schwerwiegende SPRED 2 KO typische Ausprägungen im Herzen sind hierbei eine myokardiale
Fibrosierung, eine myokardiale Hypertrophie und Herzrhythmusstörungen.
In dieser Arbeit wurden insbesondere kardiale Veränderungen auf Zell- und Proteinebene
untersucht. Zur Proteinanalyse der Kardiomyozyten wurden Western Blots und eine Schnittbildgebung
angefertigt. Für eine funktionelle Untersuchung wurden isolierte vitale Kardiomyozyten
mittels Fluoreszenzfarbstoffen untersucht und unter elektrischer Stimulation beobachtet.
Desweiteren wurden isolierte Mitochondrien auf ihren Stoffwechsel und eventuelle
Defekte hin analysiert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass junge SPRED2 KO Mäuse keine
wesentlichen hämodynamischen Einschränkungen aufweisen und eine gute Kompensationsfähigkeit
gegenüber einer Nachlaststeigerung aufweisen. Auch gezeigt werden konnte, dass
Veränderungen im Rahmen der Zellkontraktion beim Kalziumhaushalt und Membranpotential
existieren und im Zusammenhang mit einer verminderten Expression von SERCA und CaV1.2
stehen. Bei der Untersuchung von Mitochondrien konnten keine wesentlichen Defizite der
mitochondrialen Funktion der SPRED 2 KO Mäuse gefunden werden. In diesem Zusammenhang
ist die bekannte Störung der Autophagie am ehesten Ursache für eine gesteigerte Fibrosierung,
sowie der gesteigerten Apoptose der Kardiomyozyten. In Folge dessen könnten die
oben beschriebenen Veränderungen des Kalziumhaushaltes der Kardiomyozyten stehen und
letztendlich über maligne Herzrhythmusstörungen zum vorzeitigen Versterben führen.
Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is predominantly driven by mutations in KRAS and TP53. However, PDAC tumors display deregulated levels of MYC and are a paradigm example for MYC-driven and -addicted tumors. For many years MYC was described as a transcription factor that regulates a pleiotropic number of genes to drive proliferation. Recent work sheds a different light on MYC biology. First, changes in gene expression that come along with the activation of MYC are mild and MYC seems to act more as a factor that reduces stress and increases resilience towards challenges during transcription. Second, MYC is a strong driver of immune evasion in different entities. In this study we depleted MYC in murine PDAC cells and revealed the immune dependent regression of tumors in an orthotope transplant model, as well as the activation of the innate immune system using global expression analysis, immunoblotting and fCLIP.
These experiments revealed that endogenous double-stranded RNA is binding as a viral mimicry to Toll-like receptor 3, causing activation of TBK1 and downstream activation of a proimmunogenic transcription program. The regression of tumors upon depletion of MYC is dependent on this pathway since the knockout of TBK1 prevents regression of tumors after depletion of MYC.
We can summarize this study in three main findings: First, the dominant and most important function of MYC in tumors is not to drive proliferation but to promote immune evasion and prevent immune-dependent regression of tumors. Second, cells monitor defects or delay in splicing and RNA processing and activate the immune system to clear cells that face problems with co-transcriptional processing. Third, MYC suppresses the activation of the cell-intrinsic innate immune system and shields highly proliferating cells from the recognition by the immune system.
To translate this into a therapeutically approach, we replaced the shRNA mediated depletion of MYC by treatment with cardiac glycosides. Upon treatment with cardiac glycosides tumor cells reduce uptake of nutrients, causing a downregulation of MYC translation, inhibition of proliferation, glycolysis and lactate secretion. Lactate is a major reason for immune evasion in solid tumors since it dampens, amongst others, cytotoxic T cells and promotes regulatory T cells.
Treatment of mice with cardiac glycosides causes a complete and immune-dependent remission of PDAC tumors in vivo, pointing out that cardiac glycosides have strong proimmunogenic, anti-cancer effects. More detailed analyses will be needed to dissect the full mechanism how cardiac glycosides act on MYC translation and immune evasion in PDAC tumors.
Every year, stroke affects over 100 million people worldwide and the number of cases continues to grow. Ischemic stroke is the most prevalent form of stroke and rapid restoration of blood flow is the primary therapeutic aim. However, recanalization might fail or reperfusion itself induces detrimental processes leading to infarct progression. Previous studies identified platelets and immune cells as drivers of this so-called ischemia/reperfusion (I/R) injury, establishing the concept of ischemic stroke as thrombo-inflammatory disease. Reduced cerebral blood flow despite recanalization promoted the hypothesis that thrombus formation within the cerebral microcirculation induces further tissue damage. The results presented in this thesis refute this: using complementary methodologies, it was shown that infarct growth precedes the occurrence of thrombi excluding them as I/R injury-underlying cause. Blood brain barrier disruption is one of the hallmarks of ischemic stroke pathology and was confirmed as early event during reperfusion injury in the second part of this study. Abolished platelet α-granule release protects mice from vascular leakage in the early reperfusion phase resulting in smaller infarcts. Using in vitro assays, platelet α-granule-derived PDGF-AB was identified as one factor contributing to blood-brain barrier disruption.
In vivo visualization of platelet activation would provide important insights in the spatio-temporal context of platelet activation in stroke pathology. As platelet signaling results in elevated intracellular Ca2+ levels, this is an ideal readout. To overcome the limitations of chemical calcium indicators, a mouse line expressing an endogenous calcium reporter specifically in platelets and megakaryocytes was generated. Presence of the reporter did not interfere with platelet function, consequently these mice were characterized in in vivo and ex vivo models.
Upon ischemic stroke, neutrophils are among the first cells that are recruited to the brain. Since for neutrophils both, beneficial and detrimental effects are described, their role was investigated within this thesis. Neither neutrophil depletion nor absence of NADPH-dependent ROS production (Ncf-/- mice) affected stroke outcome. In contrast, abolished NET-formation in Pad4-/- mice resulted in reduced infarct sizes, revealing detrimental effects of NETosis in the context of ischemic stroke, which might become a potential therapeutic target.
Cerebral venous (sinus) thrombosis, CV(S)T is a rare type of stroke with mainly idiopathic onset. Whereas for arterial thrombosis a critical contribution of platelets is known and widely accepted, for venous thrombosis this is less clear but considered more and more. In the last part of this thesis, it was shown that fab-fragments of the anti-CLEC-2 antibody INU1 trigger pathological platelet activation in vivo, resulting in foudroyant CVT accompanied by heavy neurological symptoms. Using this novel animal model for CVT, cooperative signaling of the two platelet receptors CLEC-2 and GPIIb/IIIa was revealed as major trigger of CVT and potential target for treatment.
The mammalian central clock, located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the anterior hypothalamus, controls circadian rhythms in behaviour such as the sleep-wake cycle. It is made up of approximately 20,000 heterogeneous neurons that can be classified by their expression of neuropeptides. There are three major populations: AVP neurons (arginine vasopressin), VIP neurons (vasoactive intestinal peptide), and GRP neurons (gastrin releasing peptide). How these neuronal clusters form functional units to govern various aspects of rhythmic behavior is poorly understood. At a molecular level, biological clocks are represented by transcriptional-posttranslational feedback loops that induce circadian oscillations in the electrical activity of the SCN and hence correlate with behavioral circadian rhythms. In mammals, the sleep wake cycle can be accurately predicted by measuring electrical muscle and brain activity. To investigate the link between the electrical activity of heterogeneous neurons of the SCN and the sleep wake cycle, we optogenetically manipulated AVP neurons in vivo with SSFO (stabilized step function opsin) and simultaneously recorded an electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in freely moving mice. SSFO-mediated stimulation of AVP positive neurons in the anterior hypothalamus increased the total amount of wakefulness during the hour of stimulation. Interestingly, this effect led to a rebound in sleep in the hour after stimulation. Markov chain sleep-stage transition analysis showed that the depolarization of AVP neurons through SSFO promotes the transition from all states to wakefulness. After the end of stimulation, a compensatory increase in transitions to NREM sleep was observed. Ex vivo, SSFO activation in AVP neurons causes depolarization and modifies the activity of AVP neurons. Therefore, the results of this thesis project suggest an essential role of AVP neurons as mediators between circadian rhythmicity and sleep-wake behaviour.
Interleukin 6 (IL-6) bewirkt als Entzündungsmediator eine autokrine Makrophagen (MΦ) -Stimulation. Zur Verhinderung pathologischer Entzündungsaktivität sind IL-6-Signale stark reguliert, unter anderem durch die Dileucin-vermittelte Endozytose des Signaltransduktors gp130. Klassisches IL-6-Signaling ist abhängig von der Expression von IL-6Rα und gp130 auf der Zelloberfläche, während IL-6-trans-Signaling durch löslichen IL-6Rα nur von der gp130-Expression abhängt. Die Bedeutung des Dileucin-Internalisierungsmotivs für IL-6-vermittelte Signale in MΦ ist jedoch unklar.
Ziel der vorliegenden Arbeit war eine Charakterisierung muriner GM-CSF- und M-CSF-ausgereifter Knochenmarks (KM) -MΦ hinsichtlich der Relevanz des gp130-Internalisierungsmotivs für IL-6-vermittelte-Signale. Hierzu wurde die gp130LLAA-Mauslinie als knock in-Modell zur Suppression der gp130-Endozytose verwendet.
KM-MΦ entwickeln durch die Ausreifung mittels GM-CSF oder M-CSF einen distinkten Phänotyp: M-CSF-ausgereifte KM-MΦ exprimieren mehr gp130 und IL-6Rα auf der Zelloberfläche als GM-CSF-ausgereifte KM-MΦ. Dies limitiert sowohl klassisches als auch IL-6-trans-Signaling in GM-CSF-ausgereiften KM-MΦ: IL-6 induziert in diesen eine geringere STAT1-Aktivierung, das IL-6/IL-6Ra-Fusionsprotein hyper-IL-6 eine geringere STAT1- und STAT3-Aktivierung.
KM-MΦ aus gp130LLAA-Mäusen exprimieren mehr gp130 als KM-MΦ aus WT-Mäusen bei ähnlichen Mengen IL-6Rα. Dabei ist die Rezeptorexpression auf gp130LLAA-KM-MΦ unabhängig vom Ausreifungsfaktor GM-CSF oder M-CSF. Durch die erhöhte gp130-Expression induziert IL-6-trans-Signaling in gp130LLAA-KM-MΦ eine stärkere STAT1-Aktivierung als in WT-KM-MΦ, dies gilt insbesondere bei Ausreifung mit GM-CSF. Dagegen sind die STAT3-Aktivierung durch IL-6-trans-Signaling und die STAT1- und STAT3-Aktivierung durch klassisches IL-6-Signaling unabhängig von der Expression des Dileucin-Internalisierungsmotivs.
Unklar bleibt, warum IL6-vermittelte Signale in GM-CSF-ausgereiften KM-MΦ stärker durch Dileucin-abhängige gp130-Endozytose reguliert werden als in M-CSF-ausgereifte KM-MΦ. Weitere Untersuchungen sind nötig.
This decade saw the development of new high-end light microscopy approaches. These technologies are increasingly used to expand our understanding of cellular function and the molecular mechanisms of life and disease. The precision of state-of-the-art super resolution microscopy is limited by the properties of the applied fluorescent label. Here I describe the synthesis and evaluation of new functional fluorescent probes that specifically stain gephyrin, universal marker of the neuronal inhibitory post-synapse. Selected probe precursor peptides were synthesised using solid phase peptide synthesis and conjugated with selected super resolution capable fluorescent dyes. Identity and purity were defined using chromatography and mass spectrometric methods. To probe the target specificity of the resulting probe variants in cellular context, a high-throughput assay was established. The established semi-automated and parallel workflow was used for the evaluation of three selected probes by defining their co-localization with the expressed fluorescent target protein. My work provided NN1Dc and established the probe as a visualisation tool for essentially background-free visualisation of the synaptic marker protein gephyrin in a cellular context. Furthermore, NN1DA became part of a toolbox for studying the inhibitory synapse ultrastructure and brain connectivity and turned out useful for the development of a label-free, high-throughput protein interaction quantification assay.