Medizinische Fakultät
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Das Multiple Myelom muss trotz stetiger Fortschritte im Hinblick auf die verfügbaren Therapieoptionen und die Krankheitsprognose weiterhin im Wesentlichen als eine unheilbare Erkrankung angesehen werden. Dies kann vor allem auf die große inter- und intraindividuelle Heterogenität des MM zurückgeführt werden, welche die Entwicklung gezielter molekularer Therapiestrategien erheblich erschwert. Hierbei stellen loss-of-function- Experimente, welche die Identifikation einzelner oder mehrerer potenziell therapeutisch relevanter Zielstrukturen durch die (kombinierte) Depletion von Proteinen ermöglichen, eine wichtige Säule dar, für deren Durchführung verschiedene Systeme mit jeweils eigenen Vor- und Nachteilen zur Verfügung stehen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Etablierung eines auf RNA-Interferenz basierenden stabilen und induzierbaren Knockdownsystems durch Elektroporation von MM Zelllinien mit Einzel- und Mehrfach-shRNA-Vektoren abgeschlossen werden. Die Transfektion von tet-Repressor-exprimierenden Zellinien mit einer oder mehreren shRNAExpressionskassetten innerhalb eines Plasmidvektors ermöglicht durch die vollständige Repression der shRNA-Transkription im nicht-induzierten Zustand die Selektion erfolgreich transponierter Zellen ohne Effekt-vermittelte Bias und die Generierung großer Zellmengen für Versuchsreihen in vergleichsweise kurzer Zeit. Die Induktion der verschiedenen in dieser Arbeit evaluierten Einzel- und Mehrfach-shRNA-Konstrukte gegen (Kombinationen von) Zielstrukturen im Ras/MAPK- sowie im NFκB-Signalsystem mittels Doxyzyklin als Induktionsagens zeigte durchweg deutliche und den Erwartungen aus transienten Experimenten entsprechende Knockdownergebnisse. Auch die Resultate hinsichtlich funktioneller Readouts und zellphysiologischer Effekte der induzierten Knockouts stehen im Einklang mit vorangegangenen Experimenten und bestätigen somit die Äquivalenz des stabilen induzierbaren Systems zu transienten Ansätzen auf RNAi-Basis oder zu pharmakologischen Inhibitoren. Der hierbei erzielte hypomorphe Phänotyp innerhalb einer polyklonalen Zellpopulation bildet die Realität einer medikamentösen Blockade einer oder weniger Zielstrukturen einer heterogenen MM Tumorpopulation näherungsweise ab, weshalb das vorgestellte System ein hilfreiches, kosteneffizientes und leicht zu handhabendes Werkzeug für die Identifikation potenziell relevanter Zielstrukturen für molekulare Therapieansätze im Multiplen Myelom darstellt
Natrium-Glukose Transporter (SGLT) gehören zur „solute carrier 5“ (SLC5) Familie, die sich durch einen sekundär aktiven, natriumabhängigen Transport von Zuckern und an-deren Molekülen nach intrazellulär auszeichnen. Die durch das Gen SLC5A4 kodierte Isoform SGLT3 transportiert dagegen keinen Zucker, sondern verhält sich als Glukosesensor, der nach Bindung seiner Liganden eine Membrandepolarisation induziert. In genomweiten Exomsequenzierungsstudien (whole exome sequencing, WES) mehrerer erweiterter Stammbäume mit hoher Prävalenz des Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätssyndroms (ADHS) wurde im Vorfeld eine ATG-Tripletdeletion in SLC5A4 identifiziert, die zum Verlust einer Aminosäure (ΔM500) in SGLT3 führt und zumindest partiell mit dem klinischen Phänotyp kosegregiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde die zentralnervöse Expression von SGLT3 auf RNA- Ebene mittels Reverse-Transkriptase PCR sowie real-time PCR aus humanen Gesamt-RNAs nachgewiesen. Dabei konnte eine ubiquitäre Expression im Gehirn mit relativ erhöhter Expression unter anderem in Striatum und Hypothalamus, deren Dysfunktion in der Pathogenese des ADHS impliziert wurde, gezeigt werden. Da Mutationen in homologen Domänen der eng strukturverwandten Isoformen SGLT1 und SGLT2 sowohl intestinale als auch renale Funktionen schwer beeinträchtigen, wurden in dieser Arbeit funktionelle Charakteristika sowohl des wildtypischen als auch der ΔM500 und der benachbarten ΔI501 Deletionsvariante von SGLT3 mittels Zwei-Elektroden Spannungs- und Stromklemme in entsprechend cRNA-injizierten Xenopus laevis Oozyten untersucht. Der hochpotente SGLT3-spezifische Iminozuckeragonist 1-Desoxynojirimycin (DNJ) induzierte an SGLT3-exprimierenden Oozyten in sauren Bedingungen etwa dreifach größere Kationeneinströme als D-Glukose, was sowohl im Spannungsklemmen-, und anhand einer entsprechenden Membrandepolarisation im Stromklemmenmodus gezeigt wurde. Die mit der ΔM500 bzw. ΔI501 Variante injizierten Oozyten dagegen zeigten in den maximalen Aktivierungsbedingungen um 92% bzw. 96% (p<0,01) reduzierte Kationeneinströme, sodass diese als hochgradig schädliche „Loss of Function“ Mutationen in SGLT3 charakterisiert wurden. Dieser Befund wurde mittels bioinformatischer in-silico Effektvorhersage validiert.
Um Konsequenzen der Sequenzalteration auf den Membraneinbau der Transporter zu untersuchen, wurden die mit einem gelb fluoreszierenden Farbstoff (YFP) markierten Transporter in Oozytenmembranen mittels Laser-Scanning Mikroskop nachgewiesen und die jeweiligen Mengen der Konstrukte anhand der Fluoreszenzintensitäten quantifiziert. Dabei zeigte sich eine um 53% bzw. 42% (p<0,01) reduzierte Menge der mutierten Konstrukte ΔM500 bzw. ΔI501 in der Membran, was zusätzliche schädliche Effekte der Mutationen auf das sogenannte Membrantargeting der Transporter belegt.
Zusammenfassend demonstrieren die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die ΔM500 Variante von SGLT3, welcher in ADHS-relevanten Hirnarealen exprimiert wird, dessen sub-stratinduzierte Natriumleitfähigkeit aufhebt und den Membraneinbau beeinträchtigen könnte, was in Wechselwirkung mit anderen genetischen ADHS Risikovarianten das Risiko für ADHS in Mutationsträgern beeinflussen kann.
Ziel der Doktorarbeit war die Implementierung eines Herzinfarktnetzes im ländlichen Raum mit Hilfe der FITT-STEMI-Studie und damit die Optimierung der Abläufe der Behandlungen und Verbesserung der Prognose der Patienten. Die Ergebnisse wurden quartalsweise mit den beteiligten Berufsgruppen wie Notärzten, Sanitätern, Personal der Intensivstation, den einweisenden Kliniken etc. besprochen und so ein Netzwerk aufgebaut. Dadurch konnte das Einzugsgebiet erweitert werden, die Primärtransporte nahmen von 54 auf 65 % und die telefonischen Infarktankündigungen von 43 auf 80 % zu, zudem konnte die door-to-catheter-Zeit bei Primärtransporten von 40 auf 23 min. gesenkt werden.
Das bekapselte, Gram-negative, diplokokkenförmige Bakterium Neisseria meningitidis (Nme) ist ein asymptomatischer Kommensale des oberen Nasenrachenraums im Men-schen. Gerade bei Kindern ist es dem humanspezifischen Pathogen in seltenen Fällen möglich, in den Blutstrom einzuwandern und lebensbedrohliche Krankheitsbilder wie Meningoenzephalitis und Sepsis auszulösen, welche als „Invasive Meningokokkener-krankung“ (IMD) zusammengefasst werden. Jährlich ereignen sich weltweit bis zu 1,2 Mio Fälle von IMD, welche aufgrund des fulminanten Verlaufs und der hohen Letalität gefürchtet sind. In der Bekämpfung der Nme-Sepsis ist das humane Komplementsystem von entscheidender Bedeutung. Vor diesem Hintergrund ist die protektive Rolle des lytischen (Membranangriffskomplex MAK) und opsonisierenden Arms (Opsonine iC3b und C1q) der Komplementkaskade gut dokumentiert. Dagegen ist der Beitrag des in-flammatorischen Arms (Anaphylatoxine C3a und C5a) in der Nme-Sepsis bisher unklar. Aus diesem Grunde wurde mit dieser Arbeit die Rolle des inflammatorischen Arms an-hand des Komplement C5a-Rezeptors 1 (C5aR1) in der Pathophysiologie der Nme-Sepsis am Mausmodell untersucht. Nach Etablierung des murinen, intraperitonealen In-fektionsmodells konnte ein schädlicher Effekt des C5aR1 in der Nme-Sepsis beobachtet werden. Aus der Abwesenheit des C5aR1 resultierte eine höhere Überlebensrate, ein besserer klinischer Zustand, eine niedrigere Bakteriämie und niedrigere Konzentrationen der pro-inflammatorischen Mediatoren IL-6, CXCL-1 und TNF-α. Im Hinblick auf den zellulären Pathomechanismus sprechen Ergebnisse dieser Arbeit dafür, dass der C5aR1 primär eine gesteigerte Freisetzung inflammatorischer Mediatoren durch verschiedene Zellpopulationen triggert (Zytokinsturm), wodurch sekundär Zellparalyse, steigende Bakteriämie und höhere Letalität bedingt sind. Durch Depletionsversuche und Immun-fluoreszenzfärbungen konnte, unabhängig vom C5aR1, eine allgemein protektive Rolle von neutrophilen Granulozyten und Monozyten/Makrophagen in der Nme-Sepsis beo-bachtet werden. Darüber hinaus präsentierte sich der zyklische C5aR1-Antagonist PMX205 als erfolgsversprechende Therapieoption, um Parameter einer murinen Nme-Sepsis zu verbessern. Weitere Untersuchungen sind nötig, um die Wirksamkeit dieser Substanz in der humanen Nme-Sepsis zu erforschen. Zudem könnte das murine, intrape-ritoneale Infektionsmodell zur Klärung der Rolle des C5aR2 in der Nme-Sepsis genutzt werden.
Bei der Teilung einer Zelle werden das Genom und die Zellbestandteile zwischen zwei Tochterzellen aufgeteilt. Dies erfordert verschiedene fein aufeinander abgestimmte Vorgänge. Unter anderem ist eine proteinreiche Struktur beteiligt, die 1891 entdeckt wurde: der Mittelkörper. In vorliegender Arbeit wurden gezielt gekennzeichnete Mittelkörperproteine analysiert und verschiedene Phasen des Transports unterschieden. Es erfolgten erstmals Messungen unter Nutzung der ZF1-Methode. Zudem wird anhand der ZF1-Technik nachgewiesen, dass im Rahmen der Zellteilung die Trennung der interzellulären Brücke zu beiden Seiten des Mittelkörpers stattfindet, woraufhin dieser nach extrazellulär abgegeben wird und über einen der Phagozytose ähnlichen und von Aktin abhängigen Mechanismus von einer Tochterzelle oder unverwandten Nachbarzelle aufgenommen wird.
In der vorliegenden Studie wurden Häufigkeit, Charakteristika und Einflussfaktoren von Überleben, funktioneller Kapazität, Atempumpenstörung und pulmonaler Hypertonie bei Sarkoidose analysiert. Insgesamt wurden die Daten von 182 mitteleuropäischen Patienten mit gesicherter Sarkoidose retrospektiv erfasst und der Überlebensstatus erhoben. Von 127 Patienten lagen die kompletten Ergebnisse der Diagnostik in der Missionsärztlichen Klinik Würzburg vor. Mit den Daten aller dieser Patienten wurden Überlebensanalysen, Prädiktionsanalysen und Korrelationsanalysen durchgeführt. Damit war die Studie eine der umfangreichsten, die sich mit mitteleuropäischen Sarkoidosepatienten und ihrem Krankheitsverlauf retrospektiv auseinandersetzte.
Von allen 179 im Follow-up erfassten Patienten sind 19 (11 männlich) im mittleren Alter von 68 Jahren verstorben (10%). Eine pulmonale Hypertonie wurde in 6 Fällen mittels Rechtsherzkatheter wenige Monate bis 3 Jahre vor dem Tod diagnostiziert und 7 verstorbene Patienten erfüllten die echokardiographischen Kriterien einer pulmonalen Hypertonie. Die Prävalenz der SAPH war insgesamt 10% (12 Patienten mit mPAP 39±10 mmHg), der echokardiographische Verdacht auf pulmonale Hypertonie bestand bei 22 (PASP > 36 mmHg) bzw. 15 (TRVmax > 2,8 m/s) Patienten. Funktionell relevant waren Rechtsherzfunktion (RA, TAPSE, NT-proBNP), Hämodynamik (PASP, TRVmax, mPAP), Ventilation (FEV1, VC) und Transferfaktor (r bzw. ß > 0,4 bzw. < -0,4, p < 0.05). Mortalitätsprädiktoren waren u.a. eine Gehstrecke < 338 m und eine V’O2peak ≤ 63,5 %/Soll (AUC > 0,8, p < 0.05). Bei 13 von 17 mit Mundverschlussdruckmessung untersuchten Patienten wurde eine Atempumpenstörung diagnostiziert. 7 der 13 Patienten hatten eine invasiv-diagnostizierte SAPH. Die 13 Patienten zeigten eine erhöhte Atempumpenlast (P0.1 0,56[0,38-0,66] kPa) und 12 der 13 Patienten auch eine erhöhte respiratorische Kapazität (P0.1/PImax 12,0[7,5-19,5]%) und Atemfrequenz (BF 23[19-24]/min). Die Atemmuskelkraft war nur bei einer Patientin pathologisch gemäß den Grenzwerten von Koch et al. Die Atempumpenlast bzw. die respiratorische Kapazität hing stark vom pulmonalarteriellen Druck ab (mPAP, PVR, PASP, TRVmax korrelierten sehr gut mit P0.1 bzw. P0.1/PImax). SAPH-Patienten und Patienten ohne pulmonale Hypertonie zeigten signifikante Unterschiede in Bezug auf Atemmuskelkraft und Atempumpenlast. Die echokardiographischen Lungenhochdruck-Parameter hatten starke prädiktive Eigenschaften (100% Sensitivität, Spezifität) bezüglich der Entwicklung einer Atempumpenstörung (PASP ≥ 40 mmHg, TRVmax ≥ 2,9 m/s). Innerhalb des Lungenhochdruck-Kollektivs war der Zusammenhang zwischen Atempumpenlast und Parametern der pulmonalen Hypertonie und der Einfluss auf funktionelle Kapazität und Ventilation zudem wesentlich stärker (r > 0,8 bzw. < -0,8, p < 0.05).
Die Prävalenz der SAPH ist hoch, das Auftreten mit eingeschränktem Überleben und funktioneller sowie Atempumpeneinschränkung assoziiert. Der Verlauf der Sarkoidose wird von dem Auftreten einer pulmonale Hypertonie, einer Atemlasterhöhung und einer Einschränkung der funktionellen Kapazität beeinflusst. Die bisher gefundenen Daten sollten an größeren Populationen bestätigt oder korrigiert werden. Sarkoidose-Mortalitäts- sowie SAPH-Prädiktoren könnten im klinischen Alltag in Form von Therapiekontroll- und Screeningparametern von Nutzen sein und das Management der Sarkoidosepatienten erleichtern.